T¹P CHÝ Y häc viÖt nam tẬP 544 - th¸ng 11 - QuyỂN 2 - sè ĐẶC BIỆT - 2024
201
XÁC NHẬN GIÁ TRỊ SỬ DỤNG XÉT NGHIỆM PHÁT HIỆN VIRUS
HIV, HCV & HBV BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL TIME PCR
Phạm Thị Lê1, Phan Thị Mỹ Kim1, Lê Minh Hiếu1,
Nguyễn Thị Kiều1, Hồng Thị Kiều Dẫn1,
Nguyễn Thị Kim Quyên1, Trần Nhựt Điền1
TÓM TẮT24
Mục tiêu: Kiểm tra xác nhận giá trị sử dụng
xét nghiệm Cobas MPX phát hiện virus HIV,
HCV, HBV trên hệ thống PCR tự động tại Trung
Tâm Truyền Máu- Bệnh viện Ch Rẫy.
Đối tượng và phương pháp: Tiến hành xác
nhận các thông số độ đúng, độ nhạy, độ đặc hiệu
và giới hạn phát hiện (LoD) của xét nghiệm
Cobas MPX cho HIV-RNA, HCV-RNA và
HBV-DNA theo hướng dẫn của nhà sản xuất. So
sánh độ tương quan của xét nghiệm Cobas MPX
và xét nghiệm Cobas TaqScreen MPX Test.
Kết quả: Nghiên cứu xác định độ đúng, độ
nhạy, độ đặc hiệu của xét nghiệm Cobas MPX
đều là 100%, LoD của xét nghiệm cho HIV-1
nhóm M, HCV và HBV lần lưt là 25.7 IU/mL,
7.0 IU/mL và 1.4 IU/mL với tỷ lệ có phản ứng
lần lưt là 100%, 100% và 95.8%. Độ tương
đồng giữa xét nghiệm Cobas MPX và xét nghiệm
Cobas TaqScreen MPX Test là 100%.
Kết luận: Xác nhận giá trị sử dụng của xét
nghiệm Cobas MPX phát hiện HIV-RNA, HCV-
RNA và HBV-DNA phù hp với tuyên bố của
nhà sản xuất.
1Trung tâm Truyền máu Chợ Rẫy
Chịu trách nhiệm chính: Phạm Thị Lê
SĐT: 0946112444
Email: october1988le@gmail.com
Ngày nhận bài: 30/7/2024
Ngày phản biện khoa học: 01/8/2024
Ngày duyệt bài: 30/9/2024
Từ khóa: Realtime PCR, NAT, Cobas MPX,
LoD
SUMMARY
PERFORMANCE VERIFICATION OF
REALTIME PCR METHOD FOR THE
DETECTION OF HIV, HCV & HBV
VIRUSES
Objective: Check to confirm the value of
using the Cobas MPX test to detect HIV, HCV,
HBV viruses on the automatic PCR system at the
Blood Transfusion Center - Cho Ray Hospital.
Subjects and Methods: Confirm the
correctness, sensitivity, specificity and limit of
detection (LoD) parameters of the Cobas MPX
assay for HIV-RNA, HCV-RNA, and HBV-
DNA according to the manufacturer's
instructions. Correlation Comparison of Cobas
MPX Test and Cobas TaqScreen MPX Test.
Results: The study determined that the
accuracy, sensitivity and specificity of the Cobas
MPX test were all 100%, and LoD of the test for
HIV-1 group M, HCV and HBV was 25.7
IU/mL, 7.0 IU/mL and 1.4 IU/mL, respectively,
with a response rate of 100%, 100% and 95.8%,
respectively. The similarity between the cobas
MPX test and the TaqScreen MPX Test is 100%
Conclusion: Verifiation of the Cobas MPX
test detects HIV-RNA, HCV-RNA, and HBV-
DNA in accordance with the manufacturer's
claims.
Keywords: Realtime PCR, NAT, Cobas
MPX, LoD
KỶ YẾU CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU
202
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Các bệnh truyền nhiễm qua truyền máu
vẫn là mối quan tâm hàng đầu đối với an
toàn truyền máu, đặc biệt là virus HBV,
HCV và virus HIV gây suy giảm miễn dịch ở
ngưi. Để giảm nguy cơ lây truyền virus qua
đưng máu, xét nghiệm acid nucleic (NAT)
trong sàng lọc ngưi hiến máu rút ngắn thi
gian cửa sổ âm tính về huyết thanh học. Xét
nghiệm Cobas MPX là xét nghiệm Realtime
PCR định tính cho phép phát hiện đồng thi
và phân biệt HIV, HCV và HBV(2). Với các
đặc tính kỹ thuật phức tạp, xét nghiệm Cobas
MPX cần đưc xác nhận và kiểm soát đưc
chất lưng nghiêm ngặt. Do đó nghiên cứu
của chúng tôi với các mục tiêu cụ thể như
sau:
- Xác nhận giới hạn phát hiện (LoD), độ
đúng, độ nhạy, độ đặc hiệu của xét nghiệm
Cobas MPX phát hiện HBV, HCV, HIV dựa
trên các mẫu chuẩn đã biết trước nồng độ.
- So sánh độ tương quan của xét nghiệm
Cobas MPX và xét nghiệm Cobas TaqScreen
MPX Test.
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Mẫu thử dương tnh từ chương trnh
ngoại kiểm, mẫu thử có kết quả dương tnh
từ phng xét nghiệm tham chiếu và mẫu thử
có kết quả âm tnh từ nguồn hiến máu.
Tiêu chuẩn lựa chọn:
+ Mẫu có kết quả âm tính: 30 mẫu huyết
tương chống đông bằng EDTA âm tính 3
mục tiêu với xét nghiệm Cobas TaqScreen
MPX Test.
+ Mẫu có kết quả dương tnh: 10 mẫu
huyết tương chống đông bằng EDTA dương
tính HBV-DNA và 10 mẫu huyết tương
chống đông bằng EDTA dương tnh HIV-
RNA với xét nghiệm Cobas TaqScreen MPX
Test, 10 mẫu huyết tương chống đông bằng
EDTA dương tnh HCV-RNA với xét
nghiệm Alinity m HCV.
+ Chọn mẫu chuẩn đã xác định nồng độ:
2 mẫu huyết tương chống đông bằng EDTA
dương HBV-DNA với xét nghiệm Alinity m
HBV, 2 mẫu huyết tương chống đông bằng
EDTA dương tnh HCV-RNA với xét
nghiệm Alinity m HCV, 2 mẫu mẫu huyết
tương chống đông bằng EDTA dương tnh
HIV-RNA từ chương trnh ngoại kiểm NRL
của Roche. Các mẫu có nồng độ khoảng 103-
105 (IU/mL)
+ Thể tích yêu cầu 2-3 ml huyết tương
mỗi mẫu.
Phương pháp nghiên cứu
Thiết kế nghiên cứu
Xác nhận giá trị sử dụng của phương
pháp xét nghiệm PCR định tnh trên hệ thống
tự động.
Quy trình thực hiện
Xác định LoD: bằng cách kiểm tra độ
pha loãng theo tiêu chuẩn của Roche. Giới
hạn phát hiện của HIV-1 Nhóm M, HCV và
HBV lần lưt là 25.7 IU/mL, 7.0 IU/mL và
1.4 IU/mL(2)
+ Pha loãng mẫu dương tnh HBV có
nồng độ gốc 1.38E+04 và 1.30E+05 IU/mL
pha loãng theo hệ số 100 với huyết tương
EDTA âm tính về nồng độ LOD và chạy lặp
lại 4 lần/mẫu/ngày, chạy 3 ngày. Tính tỷ lệ
mẫu có phản ứng dương tnh HBV
+ Pha loãng mẫu dương tnh HCV có
nồng độ gốc 5.24E+04 và 1.78E+05 IU/mL
pha loãng theo hệ số 100 với huyết tương
EDTA âm tính về nồng độ LOD và chạy lặp
lại 4 lần/mẫu/ngày, chạy 3 ngày. Tính tỷ lệ
mẫu có phản ứng dương tnh HCV.
+ Pha loãng mẫu dương tnh HIV có
nồng độ gốc 4.17E+04 và 5.01E+05 IU/mL
pha loãng theo hệ số 100 với huyết tương
T¹P CHÝ Y häc viÖt nam tẬP 544 - th¸ng 11 - QuyỂN 2 - sè ĐẶC BIỆT - 2024
203
EDTA âm tính về nồng độ LOD và chạy lặp
lại 4 lần/mẫu/ngày, chạy 3 ngày. Tính tỷ lệ
mẫu có phản ứng dương tnh HIV.
Xác định độ đúng, độ nhy, độ đặc hiu
và so sánh độ tương quan:
Đánh giá hiệu năng xét nghiệm Cobas
MPX bằng cách thực hiện xét nghiệm: 10
mẫu dương tnh HBV-DNA, 10 mẫu dương
tính HCV-RNA, 10 mẫu dương tnh HIV-
RNA, 30 mẫu âm tính 3 mục tiêu.
Giá trị mẫu chuẩn (+)
Giá trị mẫu chuẩn (-)
Kết quả thực hiện (+)
a
b
Kết quả thực hiện (-)
c
d
+ Độ đúng đưc xác định thông qua độ
đồng thuận loại (CA: Categorical
Agreement) và độ phù hp (hệ số Kappa).
Xác định hệ số Kappa:
Phù hp hoàn toàn = 100
Phù hp thực tại = Ph hp quan sát -
Ph hp ngẫu nhiên
Phù hp tiềm ẩn = Ph hp hoàn toàn -
Ph hp ngẫu nhiên
+ Độ đặc hiệu (SP) của Cobas MPX đưc
đánh giá trong các mẫu huyết tương của
ngưi hiến tình nguyện.
+ Độ nhạy phân tch đưc xác định bằng
các tiêu chuẩn tham chiếu.
+ So sánh độ tương quan của xét nghiệm
Cobas MPX và xét nghiệm Cobas TaqScreen
MPX Test, v2.0 thông qua các giá trị tỷ lệ
dương tnh đồng thuận (PPA), tỷ lệ âm tính
đồng thuận (NAP), tỷ lệ đồng thuận tổng
quát (OPA).
Xử lý số liệu:
Phân tích và tính toán bằng phần mềm
Excel
Đánh giá kết quả
Đánh giá kết quả xác nhận LoD:
So sánh “Tỷ lệ mẫu có phản ứng” ở mỗi
mục tiêu với “Giới hạn tỷ lệ quan sát” trong
bảng 1:
Bảng 1: Đánh giá khả năng phát hin các quy trnh đo lường trong phòng xét
nghim(4)
Tổng số mẫu được đánh giá trong quy trình (mẫu)
Giới hạn tỷ lệ quan sát (%)
20
85
30
87
40
88
50
88
60
90
70
90
80
90
KỶ YẾU CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU
204
90
91
100
91
150
92
200
92
250
92
300
93
400
93
500
93
1000
94
Sử dụng “Giới hạn tỷ lệ quan sát” ứng
với tổng số mẫu gần nhất nếu như tổng số
không bằng đúng số mẫu trong bảng. “Tỷ lệ
mẫu có phản ứng” bằng hoặc lớn hơn “Giới
hạn tỷ lệ quan sát” th quy trnh đánh giá là
thành công.
Đánh giá kết quả xác định độ đúng: tiêu
chuẩn chấp nhận CA ≥ 90%
Giá trị yêu cầu: Độ nhạy 100%, độ đặc
hiệu ≥ 99.5%
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu đưc thực hiện từ ngày 08
tháng 05 đến 12 tháng 05 năm 2023 tại
phng xét nghiệm sàng lọc miễn dịch Trung
Tâm Truyền Máu – Bệnh viện Ch Rẫy.
Đạo đức nghiên cứu
Nghiên cứu vì mục đch khoa học trong
quá trình thực hiện nghiên cứu hoàn toàn
không can thiệp vào chẩn đoán và điều trị.
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Bảng 2: Kết quả đánh giá tỷ l phản ứng của HIV-1 Nhóm M, HCV và HBV
Virus
Nồng độ (IU/ml)
ước tính sau pha
loãng mẫu chuẩn
Số mẫu có
phản ứng
Số lần lặp
hợp lệ
Tổng số
mẫu
Tỷ lệ mẫu
có phản ứng
HIV-1
25.7
24
24
24
100%
HCV
7.0
24
24
24
100%
HBV
1.4
23
24
24
95.8%
Nhận xét: Kết quả cho thấy LoD ước tính sau khi pha loãng mẫu chuẩn của HIV-1 Nhóm
M, HCV, HBV trên 24 lần lặp lại xét nghiệm cho tỷ lệ mẫu có phản ứng lần lưt là 100%,
100% và 95.8% đều lớn hơn “Giới hạn tỷ lệ quan sát” trong bảng 1 là 85%.
Bảng 3: Kết quả đánh giá độ đúng, độ nhy, độ đặc hiu của xét nghim Cobas MPX
phát hin HBV-DNA, HCV-RNA và HIV-RNA, đánh giá độ tương quan
HBV
Cobas MPX
Dương tnh
Âm tính
Cobas TaqScreen MPX Test
Dương tnh
10
0
Âm tính
0
10
SP=100%, SE=100%, PPA=100%, NAP=100%, OPA=100%
T¹P CHÝ Y häc viÖt nam tẬP 544 - th¸ng 11 - QuyỂN 2 - sè ĐẶC BIỆT - 2024
205
HCV
Cobas MPX
Dương tnh
Âm tính
Cobas TaqScreen MPX Test
Dương tính
10
0
Âm tính
0
10
SP=100%, SE=100%, PPA=100%, NAP=100%, OPA=100%
HIV
Cobas MPX
Dương tnh
Âm tính
Cobas TaqScreen MPX Test
Dương tnh
10
0
Âm tính
0
10
SP=100%, SE=100%, PPA=100%, NAP=100%, OPA=100%
Nhận xét:
10/10 mẫu dương tnh riêng lẻ cho HIV-1
nhóm M, HCV, HBV và 30/30 mẫu âm tính
cả 3 mục tiêu kết quả không phản ứng cho
thấy độ nhạy là 100%, độ đặc hiệu là 100%
Độ đồng thuận loại CA=100%, hệ số
Kappa=1,0 ở mức đồng thuận cao: Phương
pháp xét nghiệm có độ đúng tương đương
với phương pháp tham chiếu.
Độ đồng thuận dương tnh (PPA) =
100%, độ đồng thuận âm tính (NAP) =
100%, độ đồng thuận tổng (OPA) = 100%
chứng minh hiệu năng của xét nghiệm Cobas
MPX và xét nghiệm Cobas TaqScreen MPX
Test tương đương nhau.
IV. BÀN LUẬN
Kiểm tra xác nhận giá trị sử dụng là sự
khẳng định bằng việc kiểm tra và đưa ra các
bằng chứng khách quan xác nhận lại giá trị
so với tiêu chuẩn hoặc công bố của hãng sản
xuất. Kết quả của xác nhận sử dụng để đánh
giá đáp ứng các điều kiện thực tế của phòng
xét nghiệm, là bước đầu quan trọng khẳng
định xét nghiệm đảm bảo các đặc tính về kỹ
thuật. Đây cũng là tiêu ch bắt buộc theo
quyết định 2429(1) (tiêu ch 3*) để các phòng
xét nghiệm đạt mức 3 trở lên và các phòng
xét nghiệm đạt ISO 15189. Xác nhận giới
hạn phát hiện (LoD), độ đúng, độ nhạy, độ
đặc hiệu của xét nghiệm Cobas MPX là cần
thiết và có giá trị ứng dụng thực tiễn.
Nghiên cứu thực nghiệm 60 mẫu huyết
tương EDTA đưc xác định âm tnh/ dương
tính bằng phương pháp so sánh với xét
nghiệm Cobas TaqScreen MPX Test đã đưc
khẳng định trước đó. Kết quả tất cả các mẫu
dương tnh với xét nghiệm Cobas TaqScreen
MPX Test cho thấy kết quả dương tnh với
Cobas MPX. Độ nhạy của Cobas MPX là
100% (30/30).
Tất cả các mẫu âm tính với HIV-1, HCV,
HBV với xét nghiệm Cobas TaqScreen MPX
Test, cũng đưc chứng minh là âm tính với
Cobas MPX. Do đó, độ đặc hiệu Cobas MPX
là 100% (30/30) (bảng 3). Nghiên cứu của
một số tác giả khác như tác giả Ha J(3) về độ
nhạy Cobas MPX ghi nhận tỷ lệ là 100%
(333/333), độ đặc hiệu Cobas MPX là 100%
(510/510) hoặc tác giả Susan A. Galel và
cộng sự(5) có kết quả độ đặc hiệu Cobas
MPX là 99.946% trong 11,203 mẫu.