vietnam medical journal n01 - APRIL - 2020
42
XÂY DỰNG QUY TRÌNH REALTIME PCR PHÁT HIỆN
NEISSERIA MENINGITIDIS
Hồ Hữu Th1, Nguyễn Đình Ứng1, Nguyễn Văn Chuyên1,
Nguyễn Văn Ba1, Nguyễn Trng Chính1
TÓM TẮT12
Viêm màng não do cầu khuẩn Neisseria
meningitidis (viêm màng não mô cầu) là một vấn đề
sức khỏe nghiêm trọng trên toàn thế giới, trong đó
châu Phi và châu Á là vùng dịch tễ lưu hành cao của
bệnh. Ở Việt Nam chương trình vắc xin phòng bệnh
chưa được đánh giá và đưa vào chương trình phòng
bệnh quốc gia nên việc giám sát, phát hiện và tiên
lượng dịch bệnh viêm màng não mô cầu là hết sức
cần thiết. Gần đây, kỹ thuật reatime PCR được ứng
dụng rộng rãi hứa hẹn là công cụ chẩn đoán tác nhân
gây bệnh với nhiều ưu điểm nổi bật. Trong nghiên cứu
này, nhóm nghiên cứu đã xây dựng thành công quy
trình realtime PCR có khả năng phát hiện nhanh và
chính xác Neisseria meningitidis với ngưỡng phát hiện
100 copy/p.ư, tương đương với bộ kit thương mại hiện
có trên thị trường. Độ nhạy, độ đặc hiệu quy trình
realtime PCR đã xây dựng được đánh giá và so sánh
với bộ kit thương mại (Primerdesign) cho kết quả
tương đương (100%).
Từ khóa:
Neisseria meningitidis, realtime PCR
SUMMARY
DEVELOPMENT OF A REALTIME PCR PROTOCOL
FOR DETECTION OF EISSERIA MENINGITIDIS
Meningococcal meningitis is a serious health
problem worldwide and predominant in Asia and
Africa. In Vietnam, the vaccination program has not
been evaluated and included in the national disease
prevention program, so the monitoring, detection and
prognosis of meningococcal disease are extremely
necessary. Recently, real-time PCR is a widely used
molecular method for detection ofNeisseria
meningitidiswith many outstanding advantages. In this
study, we have successfully established a real-time
PCR assay capable of fast and accurate detection of
Neisseria meningitidis with the lower detection limit
100 copies per reaction, equivalent to the available
commercial kit. The sensitivity and specificity of our
real-time PCR assaywere evaluated and compared to
the commercial kit (Primerdesign) for equivalent
results (100%).
Keywords
: Neisseria meningitidis, realtime PCR
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Viêm màng não mô cầu là bệnh nhiễm trùng
cấp tính do vi khuẩn Neisseria meningitidis gây
ra với phạm vi phân bố trên toàn cầu[1]. Nếu
1Học viện Quân y
Chịu trách nhiệm chính: Nguyễn Văn Ba
Email: bsnguyenvanba@yahoo.com
Ngày nhận bài: 8/2/2020
Ngày phản biện khoa học: 1/3/2020
Ngày duyệt bài: 19/3/2020
không được chẩn đoán và điều trị kịp thời bệnh
có khả năng thành dịch, ảnh hưởng lớn đến trẻ
em và thanh thiếu niên với tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử
vong cao do các biến chứng của bệnh, đặc biệt
là tổn thương thần kinh vĩnh viễn[2]. Ở Việt
Nam, bệnh viêm màng nãomô cầu là bệnh xếp
thứ 6 trong 10 bệnh truyền nhiễm có tỷ lệ tử
vong cao nhất. Tuy nhiên, chương trình vắc xin
phòng bệnh chưa được đánh giá và đưa vào
chương trình phòng bệnh quốc gia nênviệc giám
sát, phát hiện và tiên lượng dịch bệnh viêm
màng não mô cầu là hết sức cần thiết.
Với sự phát triển của các kỹ thuật phân tử
cho phép phân tích vi khuẩn gây viêm màng não
từ mẫu nuôi cấy phân lập và không phân lập,
đều khẳng định được ca bệnh [3], các nghiên
cứu trong nước có xu hướng tập trung vào các
phương pháp sinh học phân tử như PCR và
multiplex PCR khuếch đại đặc hiệu gen đích
N.meningitidis[4]. Nhìn chung các nghiên cứu
vẫn còn nhiều hạn chế về độ nhạy, độ đặc hiệu
hay lựa chọn gen đích chưa phù hợp. Kỹ thuật
PCRsử dụng trong các nghiên cứu phát hiện các
sản phẩm qua phân tích trên gel agarose nênyêu
cầu mở các ống PCR chứa sản phẩm sau khuếch
đại làm tăng đáng kể nguy cơ nhiễm không gian
phòng thí nghiệm và cũng rất tốn thời gian. Việc
lựa chọn gen đích ctrAdẫn đến có thể bỏ sót một
tỷ lệ đáng kể (>16%) người mang mầm bệnh
không triệu chứng [5], trong khi có nhiều ý kiến
cho rằng bệnh viêm màng não xâm lấn xảy ra
chủ yếu ở những người mang mầm bệnh không
triệu chứng trước đó [6].
Gần đây, kỹ thuật realtime PCR đã và đang
được đưa vào sử dụng rộng rãi trong các lĩnh
vực khác nhau, đặc biệt trong chẩn đoán sớm
tác nhân gây bệnh. Kỹ thuật cho phép phân tích
kết quả sau mỗi chu trình nhiệt của phản ứng do
đó dễ dàng thực hiện và tiết kiệm thời gian hơn
so với PCR. Realtime PCR được biết đến là kỹ
thuật khuếch đại acid nucleic với độ nhạy và độ
đặc hiệu cao [7].
Chính vì những lý do thực tiễn trên, nhóm
nghiên cứu tến hành xây dựng quy trình realtime
PCR phát hiện Neisseria meningitidis đặc hiệu
gen đích sodC, có tính bảo tồn cao, đặc hiệu với
N.meningitidis và ít nhạy cảm với biến đổi kháng
nguyên hơn ctrA[8]. Quy trình realtime PCR đã
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 489 - THÁNG 4 - SỐ 1 - 2020
43
xây dựng được đánh giá khả năng ứng dụng
trong chẩn đoán bệnh viêm màng não mô cầu
qua xác định độ nhạy, độ đặc hiệu và so sánh
với bộ kit thương mại hiện có trên thị trường.
II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Vật liệu. Các mẫu bệnh phẩm dương tính
giả định (10 mẫu) với các nồng độ cao, trung
bình và thấp khác nhau do nhóm nghiên cứu
chuẩn bị:8 x 108, 5 x 108, 5 x 107, 8 x 105, 5 x
105, 8 x 104, 5 x 104, 5 x 103, 8 x 102, 5 x 102
copy/p.ư (TP1-TP10)
Các mẫu âm tính với N.meningitidis (10 mẫu)
được thu thập tại Phòng Công nghệ gen và Di
truyền tế bào, Viện nghiên cứu Y dược học Quân
sự, học viện Quân Y
Các chủng vi sinh vật thường gặp trong chẩn
đoán phân biệt viêm màng não mô cầu, gồm 10
chủng: Leptospira interrogan serovar Pomona,
Leptospira interrogan serovar Australis do Viện Y
học dự phòng Quân đội cung cấp, Dengue virus,
Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter
baumannii, Enterobacter aerogenes, Klebsiella
pneumoniae, Orientia tsutsugamushi,
Streptococcus pneumonia, Haemophilus influenza
do Khoa Vi sinh, Học viện Quân Y cung cấp
Bộ kit Neisseria meningitidis Superoxide
dismutase (sodC) gene (Primerdesign) có độ đặc
hiệu 100% với một loạt các trình tự gen
N.meingitidis. Trong điều kiện PCR tối ưu, bộ kit
phát hiện N.meningitidis có hiệu suất bắt cặp rất
cao > 95% và có thể phát hiện ít hơn 100 bản
sao gen đích.
Các hóa chất, sinh phẩm và thiết bị dùng
trong tách chiết DNA và phản ứng realtime PCR
2. Phương pháp. Tách chiết DNA: DNA từ
các mẫu dịch não tủy được tách chiết bằng bộ
kit QiAmp DNA Mini Kit (QIAGEN) theo quy trình
của nhà sản xuất (Spin Protocol)
Thiết kế primer, probe cho phản ứng realtime
PCR: sodC là gen đích có tính bảo tồn cao trong
các chủng Neisseria meningitidis gây bệnh và
không gây bệnh được chọn làm gen đích thiết kế
primer, probe cho phản ứng realtime PCR. Các
trình tự primer, probe được thiết kế và phân tích
tương đồng với các trình tự khác sử dụng công
cụ Primer 3.
Phản ứng realtime PCR: tổng thể tích phản
ứng realtime PCR sử dụng là 20µl với 5µl DNA
Neisseria meningitidis, nồng độ mồi và probe tối
ưu lần lượt là 0.2µM và 0.1µM. Chât phụ gia
DMSO 2.5% được bổ sung để để cải thiện hiệu
suất phản ứng, thể tích còn lại là nuclease-free
water. Chu trình nhiệt gồm các bước: biến tính
ban đầu 95℃ trong 15 phút, sau đó là 45 chu kỳ
(biến tính ở 94℃ 15s, gắn mồi 63℃ 30s và kéo
dài 72℃ 30s), tín hiệu huỳnh quang được thu
nhận ở bước kéo dài qua kênh FAM.
Phản ứng realtime PCR(Primerdesign): phản
ứng được thực hiện với 10µl PrecisionPLUS 2X
qPCR Master Mix, 1µl Orientia tsutsugamushi
primer/probe mix, 5µl template và 4µl nước.
Phản ứng được thực hiện trên thiết bị máy
Rotor-GeneQ với chu trình nhiệt gồm các bước:
biến tính ban đầu 95℃ trong 2 phút, sau đó là
50 chu kỳ gồm 2 bước (biến tính ở 95℃ 10s, và
thu nhận tín hiệu 60℃ 60s qua kênh FAM). Phản
ứng đối chứng dương sử dụng DNA chứng
dương do bộ kit cung cấp, đối chứng âm nước.
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1. Thiết kế primer/probe đặc hiệu gen
đich sodC. Trình tự primer/ probe trong phản
ứng realtime PCR phát hiện N.meningitidis được
thiết kế đặc hiệu gen đích sodC.Bộ primer/probe
được đánh giá khả năng bắt cặp đặc hiệu và các
thông số cần thiết bằng công cụ BLAST, kết quả
cho thấy sự bắt cặp rất tốt. Kết quả thực hiện
phản ứng realtime PCR với cặp primer/probe đã
thiết kế cho thấy cường độ tín hiệu huỳnh quang
và thời gian thu nhận tín hiệu khá tốt.
Bảng 2: Trình tự primer, probe đặc hiệu
gen đích sodC
Primer/
probe
DNA sequence (5’-3’)
Forward
primer
GCGGTCACTGGGATCCTAAA
Reverse
primer
GTTGCTGTGCCATCATGCAA
Probe
ACCCATGGCAAGATGATGCACACT
2. Tối ưu nồng độ mồi.
Hình 1: Kết quả tối ưu nồng độ primer
phản ứng realtime PCR phát hiện
N.meningitidis
Tiến hành khảo sát các nồng độ mồi khác
nhau (0.1, 0.2, và 0.4µM) trong phản ứng
realtime PCR khuếch đại gen đích sodC phát hiện
Neisseria meningitidis. Nồng độ mồi 0.2µM là
nồng độ thấp nhất mà tại cùng điều kiện phản
ứng như nhau, đối chứng dương cho tín hiệu
vietnam medical journal n01 - APRIL - 2020
44
khuếch đại sớm nhất (Hình 1) được chọn là nồng
độ mồi tối ưu.
3. Tối ưu nồng độ probe. Chúng tôi tiến
hành khảo sát nồng độ probe từ 0.05-0.2 µM,
kết quả được trình bày chi tiết trên hình 2. So
sánh về giá trị Ct cho thấy phản ứng với nồng độ
probe 0.2µMcho đường tín hiệu khuếch đại sớm
nhất (23.52 chu kỳ), tuy nhiên chỉ sớm hơn 0.7
chu kỳ so với phản ứng nồng độ probe 0.1µM.
Do vậy, nồng độ probe 0.1µMđược chọn là nồng
độ tối ưu cho phản ứng realtime PCR phát hiện
N.meningitidis- nồng độ vừa đảm bảo hiệu suất
phản ứng với tín hiệu khuếch đại sớm vừa phù
hợp về kinh tế.
Hình 2: Kết quả tối ưu nồng độ probe phản
ứng realtime PCR phát hiện N.meningitidis
4. Ngưỡng phát hiện tương đương với
bộ kit thương mại hiện có trên thị trường
Hình 3: Kết quả đánh giá ngưỡng phát hiện quy
trình realtime PCR phát hiện N.meningitidis
A – ngưỡng phát hiện quy trình realtime PCR
do nhóm nghiên cứu xây dựng,
B – ngưỡng phát hiện bộ kit thương mại
Panel dải nồng độ plasmid tái tổ hợp
N.meningitidis nồng độ 102 – 104 copy/p.ư được
sử dụng để đánh giá ngưỡng phát hiện quy trình
realtime PCR đã xây dựng và quy trình realtime
PCR của bộ kitNeisseria meningitidis Superoxide
dismutase (sodC) gene (Primerdesign), mỗi nồng
độ được lặp lại 10 lần. Kết quả cho thấy quy
trình realtime PCR do nhóm nghiên cứu xây
dựng có khả năng phát hiện 10/10 lần lặp lại
nồng độ 100 copy/p.ư, tương đương với quy
trình realtime PCR của bộ kit thương mại
(Primerdesign). Kết quả đánh giá ngưỡng phát
hiện chi tiết được trình bày trên hình 3.
5. Đánh giá và so sánh độ nhạy, độ đặc
hiệu với bộ kit thương mại Primerdesign
Độ nhạy, độ đặc hiệu quy trìnhrealtime PCR
lần lượt được đánh giá trên DNA các mẫu dương
tính giả định; DNA các mẫu âm tính với Neisseria
meningitidisvà các chủng vi sinh vật thường gặp
trong chẩn đoán phân biệt (đã mô tả ở trên). Kết
quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu quy trình
realtime PCR đã xây dựng được so sánh với bộ
kit thương mại Neisseria meningitidis Superoxide
dismutase (sodC) gene kit qua một loạt các phản
ứng realtime PCR tương ứng.
Hình 4: Kết quả đánh giá độ nhạy quy trình
realtime PCR phát hiện N.meningitidis
Đánh giá quy trình realtime PCR do nhóm
nghiên cứu xây dựng (A) và bộ kit thương mại
(B) trên các mẫu dương tính giả định
Quy trình realtime PCR đã xây dựng không
phát hiện bất kỳ mẫu nào trong 10 mẫu âm tính
với N.meningitidis và trên 10 mẫu DNA các
chủng vi sinh vật khác thường gặp trong chẩn
đoán phân biệt, tương đương với độ đặc hiệu
100%. Quy trình realtime PCR (PrimerDesign)
cũng cho kết quả đánh giá độ đặc hiệu tương
đương (Bảng 2).
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 489 - THÁNG 4 - SỐ 1 - 2020
45
Bảng 3: So sánh độ đặc hiệu của từng
quy trình
Mẫu đánh giá
Độ đặc hiệu (%)
Realtim
e PCR
Primerd
esign
kit
Đánh giá trên mẫu
bệnh phẩm âm tính
với N.meningitidis
100
100
Đánh giá trên các vi
sinh vật có thể gây
triệu chứng tương tự.
100
100
Đánh giá trên các mẫu dương tính giả định
nồng độ khác nhau (TP1-TP10) cho thấy quy
trình realtime PCR đã xây dựng có khả năng phát
hiện 10/10 mẫu bệnh phẩm dương tính giả định
(Hình 4), tương đương với độ nhạy 100%. Độ
nhạy này là tương đương với quy trình realtime
PCR bộ kit thương mại hiện hành
(PrimerDesign).
IV. BÀN LUẬN
Do mức độ nghiêm trọng của bệnh viêm
màng não mô cầu bao gồm tỷ lệ tử vong ca
bệnh cao và khả năng để lại di chứng, chẩn
đoán lâm sàng và xét nghiệm sớm là rất quan
trọng. Các phương pháp nuôi cấy được xem là
tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán viêm màng não
mô cầu yêu cầu quá nhiều thời gianđể thực hiện
và kết quảcó thể bị ảnh hưởngnếu bệnh nhân
đãđược điều trị bằng kháng sinh trước đó. Ứng
dụng quy trình xét nghiệm sinh học phân tử
realtime PCR sẽ giúp cải thiện đáng kể tỷ lệ phát
hiện bệnhtrong các phòng thí nghiệm và giảm
thời gian cần thiết để xác nhận bệnh viêm màng
nãomô cầu.
Nhóm nghiên cứu đã xây dựng thành công
quy trình realtime PCR phát hiện N.meningitidis
với ngưỡng phát hiện 100 copy/p.ư, tương
đương với bộ kit thương mại hiện có trên thị
trường (Primerdesign). Tất cả các nồng độ trong
panel nồng độ bao gồm 104 copy/p.ư, 103
copy/p.ư và 102 copy/p.ư đều cho tín hiệu
khuếch đại 10/10 lần lặp lại mỗi nồng độ. Các
giá trị Ct của cùng một nồng độ của quy trình
realtime PCR do nhóm nghiên cứu chế tạo sớm
hơn so với bộ kit thương mại (Hình 1), điều này
có thể giải thích do hiệu suất mồi bắt cặp khác
nhau và chu trình nhiệt mỗi quy trình phản ứng
là khác nhau. Ngưỡng phát hiện này là phù hợp
để ứng dụng trong phát hiện N.meningitidis quy
mô phòng thí nghiệm.
Kết quả đánh giá quy trình phản ứng bộ kit
thương mại (Primerdesign) trên các mẫu âm tính
và các chủng vi sinh vật khác thường gặp trong
chẩn đoán phân biệt não mô cầu cho thấy độ
đặc hiệu cao (100%) như mô tả của nhà nhà
xuất. Quy trình realtime PCR do nhóm nghiên
cứu xây dựng cũng cho kết quả tương tự khi
không có bất kỳ một kết quả dương tính giả nào
được xác nhận. Kết quả đánh giá độ nhạy trên
các mẫu dương tính giả định cũng cho kết quả
tốt tương tự. Như vậy, quy trình realtime PCR
phát hiện N.meningitidis có độ nhạy, độ đặc hiệu
tương đương với bộ kit thương mại hiện có trên
thị trưởng. Điều này cho thấy khả năng ứng
dụng của quy trình đã thiết lập là tương đương
với bộ kit thương mại hiện hành. Bộ kit thương
mạiNeisseria meningitidis Superoxide dismutase
(sodC) gene (Primerdesign) với giá thành cao sẽ
trở thành vấn đề kinh tế lớn trong trường hợp
dịch bệnh não mô cầu bùng phát và trong quá
trình giám sát dịch tễ học người lành mang
chủng tại Việt Nam, quy trình realtime PCR do
nhóm nghiên cứu xây dựng sẽ giúp tiết kiệm chi
phí trong chẩn đoán và giám sát dịch bệnh mà
vẫn mang lại hiệu quả tương đương với bộ kit
thương mại hiện có.
Không giống những nghiên cứu trong nước
trước đây, nhóm nghiên cứu lựa chọn sodC thay
vì ctrA là gen đích đặc hiệu phát hiện
N.meningitidis. Gene đích sodC là gene mã hóa
cho enzyme xúc tác chuyển đổi anion gốc
superoxide thành hydro peroxide, ngăn chặn một
chuỗi phản ứng sản xuất các gốc hydroxyl tự do
độc hại nhằm bảo vệ vi khuẩn nên ít nhạy cảm
với biến đổi kháng nguyên như ctrA (capsular
transport gene). sodC được biết đến là quan
trọng với sự tồn tại của sinh vật in vivo, đặc hiệu
với N.meningitidis, có tính bảo tồn cao, và có
mặt trong các groupable và nongroupable
N.meningitidis (não mô cầu thường xuất hiện
trong vòm họng của người mang mầm bệnh
không triệu chứng). Điều này có nghĩa là quy
trình realtime PCR được thiết lập không những
có thể áp dụng trong chẩn đoán phát hiện não
mô cầu mà còn có thể ứng dụng trong giám sát
dịch chủ động, giám sát người lành mang chủng.
V. KẾT LUẬN
Nhóm nghiên cứu đã xây dựng thành công
quy trình realtime PCR phát hiện Neisseria
meningitidis với ngưỡng phát hiện, độ nhạy và
độ đặc hiệu tương đương với bộ kit thương mại
hiện có trên thị trường.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Batista, R.S., et al., Meningococcal disease, a
clinical and epidemiological review. Asian Pac J
Trop Med, 2017. 10(11): p. 1019-1029.
2. Strelow, V.L. and J.E. Vidal, Invasive