Xây dựng quy trình realtime PCR phát hiện Neisseria meningitidis

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:4

Thêm vào BST

Báo xấu

3
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu đã xây dựng thành công quy trình realtime PCR có khả năng phát hiện nhanh và chính xác Neisseria meningitidis với ngưỡng phát hiện 100 copy/p.ư, tương đương với bộ kit thương mại hiện có trên thị trường.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Xây dựng quy trình realtime PCR phát hiện Neisseria meningitidis

vietnam medical journal n01 - APRIL - 2020 XÂY DỰNG QUY TRÌNH REALTIME PCR PHÁT HIỆN NEISSERIA MENINGITIDIS Hồ Hữu Thọ1, Nguyễn Đình Ứng1, Nguyễn Văn Chuyên1, Nguyễn Văn Ba1, Nguyễn Trọng Chính1 TÓM TẮT không được chẩn đoán và điều trị kịp thời bệnh có khả năng thành dịch, ảnh hưởng lớn đến trẻ 12 Viêm màng não do cầu khuẩn Neisseria meningitidis (viêm màng não mô cầu) là một vấn đề em và thanh thiếu niên với tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử sức khỏe nghiêm trọng trên toàn thế giới, trong đó vong cao do các biến chứng của bệnh, đặc biệt châu Phi và châu Á là vùng dịch tễ lưu hành cao của là tổn thương thần kinh vĩnh viễn[2]. Ở Việt bệnh. Ở Việt Nam chương trình vắc xin phòng bệnh chưa được đánh giá và đưa vào chương trình phòng Nam, bệnh viêm màng nãomô cầu là bệnh xếp bệnh quốc gia nên việc giám sát, phát hiện và tiên thứ 6 trong 10 bệnh truyền nhiễm có tỷ lệ tử lượng dịch bệnh viêm màng não mô cầu là hết sức vong cao nhất. Tuy nhiên, chương trình vắc xin cần thiết. Gần đây, kỹ thuật reatime PCR được ứng phòng bệnh chưa được đánh giá và đưa vào dụng rộng rãi hứa hẹn là công cụ chẩn đoán tác nhân chương trình phòng bệnh quốc gia nênviệc giám gây bệnh với nhiều ưu điểm nổi bật. Trong nghiên cứu sát, phát hiện và tiên lượng dịch bệnh viêm này, nhóm nghiên cứu đã xây dựng thành công quy trình realtime PCR có khả năng phát hiện nhanh và màng não mô cầu là hết sức cần thiết. chính xác Neisseria meningitidis với ngưỡng phát hiện Với sự phát triển của các kỹ thuật phân tử 100 copy/p.ư, tương đương với bộ kit thương mại hiện cho phép phân tích vi khuẩn gây viêm màng não có trên thị trường. Độ nhạy, độ đặc hiệu quy trình từ mẫu nuôi cấy phân lập và không phân lập, realtime PCR đã xây dựng được đánh giá và so sánh đều khẳng định được ca bệnh [3], các nghiên với bộ kit thương mại (Primerdesign) cho kết quả cứu trong nước có xu hướng tập trung vào các tương đương (100%). Từ khóa: Neisseria meningitidis, realtime PCR phương pháp sinh học phân tử như PCR và multiplex PCR khuếch đại đặc hiệu gen đích SUMMARY N.meningitidis[4]. Nhìn chung các nghiên cứu DEVELOPMENT OF A REALTIME PCR PROTOCOL vẫn còn nhiều hạn chế về độ nhạy, độ đặc hiệu FOR DETECTION OF EISSERIA MENINGITIDIS hay lựa chọn gen đích chưa phù hợp. Kỹ thuật Meningococcal meningitis is a serious health PCRsử dụng trong các nghiên cứu phát hiện các problem worldwide and predominant in Asia and sản phẩm qua phân tích trên gel agarose nênyêu Africa. In Vietnam, the vaccination program has not cầu mở các ống PCR chứa sản phẩm sau khuếch been evaluated and included in the national disease prevention program, so the monitoring, detection and đại làm tăng đáng kể nguy cơ nhiễm không gian prognosis of meningococcal disease are extremely phòng thí nghiệm và cũng rất tốn thời gian. Việc necessary. Recently, real-time PCR is a widely used lựa chọn gen đích ctrAdẫn đến có thể bỏ sót một molecular method for detection ofNeisseria tỷ lệ đáng kể (>16%) người mang mầm bệnh meningitidiswith many outstanding advantages. In this không triệu chứng [5], trong khi có nhiều ý kiến study, we have successfully established a real-time cho rằng bệnh viêm màng não xâm lấn xảy ra PCR assay capable of fast and accurate detection of Neisseria meningitidis with the lower detection limit chủ yếu ở những người mang mầm bệnh không 100 copies per reaction, equivalent to the available triệu chứng trước đó [6]. commercial kit. The sensitivity and specificity of our Gần đây, kỹ thuật realtime PCR đã và đang real-time PCR assaywere evaluated and compared to được đưa vào sử dụng rộng rãi trong các lĩnh the commercial kit (Primerdesign) for equivalent vực khác nhau, đặc biệt trong chẩn đoán sớm results (100%). Keywords: Neisseria meningitidis, realtime PCR tác nhân gây bệnh. Kỹ thuật cho phép phân tích kết quả sau mỗi chu trình nhiệt của phản ứng do I. ĐẶT VẤN ĐỀ đó dễ dàng thực hiện và tiết kiệm thời gian hơn Viêm màng não mô cầu là bệnh nhiễm trùng so với PCR. Realtime PCR được biết đến là kỹ cấp tính do vi khuẩn Neisseria meningitidis gây thuật khuếch đại acid nucleic với độ nhạy và độ ra với phạm vi phân bố trên toàn cầu[1]. Nếu đặc hiệu cao [7]. Chính vì những lý do thực tiễn trên, nhóm 1Học viện Quân y nghiên cứu tến hành xây dựng quy trình realtime Chịu trách nhiệm chính: Nguyễn Văn Ba PCR phát hiện Neisseria meningitidis đặc hiệu Email: bsnguyenvanba@yahoo.com gen đích sodC, có tính bảo tồn cao, đặc hiệu với Ngày nhận bài: 8/2/2020 N.meningitidis và ít nhạy cảm với biến đổi kháng Ngày phản biện khoa học: 1/3/2020 nguyên hơn ctrA[8]. Quy trình realtime PCR đã Ngày duyệt bài: 19/3/2020 42
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 489 - THÁNG 4 - SỐ 1 - 2020 xây dựng được đánh giá khả năng ứng dụng (biến tính ở 94℃ 15s, gắn mồi 63℃ 30s và kéo trong chẩn đoán bệnh viêm màng não mô cầu dài 72℃ 30s), tín hiệu huỳnh quang được thu qua xác định độ nhạy, độ đặc hiệu và so sánh nhận ở bước kéo dài qua kênh FAM. với bộ kit thương mại hiện có trên thị trường. Phản ứng realtime PCR(Primerdesign): phản ứng được thực hiện với 10µl PrecisionPLUS 2X II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU qPCR Master Mix, 1µl Orientia tsutsugamushi 1. Vật liệu. Các mẫu bệnh phẩm dương tính primer/probe mix, 5µl template và 4µl nước. giả định (10 mẫu) với các nồng độ cao, trung Phản ứng được thực hiện trên thiết bị máy bình và thấp khác nhau do nhóm nghiên cứu Rotor-GeneQ với chu trình nhiệt gồm các bước: chuẩn bị:8 x 108, 5 x 108, 5 x 107, 8 x 105, 5 x biến tính ban đầu 95℃ trong 2 phút, sau đó là 105, 8 x 104, 5 x 104, 5 x 103, 8 x 102, 5 x 102 50 chu kỳ gồm 2 bước (biến tính ở 95℃ 10s, và copy/p.ư (TP1-TP10) thu nhận tín hiệu 60℃ 60s qua kênh FAM). Phản Các mẫu âm tính với N.meningitidis (10 mẫu) ứng đối chứng dương sử dụng DNA chứng được thu thập tại Phòng Công nghệ gen và Di dương do bộ kit cung cấp, đối chứng âm nước. truyền tế bào, Viện nghiên cứu Y dược học Quân sự, học viện Quân Y III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Các chủng vi sinh vật thường gặp trong chẩn 1. Thiết kế primer/probe đặc hiệu gen đoán phân biệt viêm màng não mô cầu, gồm 10 đich sodC. Trình tự primer/ probe trong phản chủng: Leptospira interrogan serovar Pomona, ứng realtime PCR phát hiện N.meningitidis được Leptospira interrogan serovar Australis do Viện Y thiết kế đặc hiệu gen đích sodC.Bộ primer/probe học dự phòng Quân đội cung cấp, Dengue virus, được đánh giá khả năng bắt cặp đặc hiệu và các Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter thông số cần thiết bằng công cụ BLAST, kết quả baumannii, Enterobacter aerogenes, Klebsiella cho thấy sự bắt cặp rất tốt. Kết quả thực hiện pneumoniae, Orientia tsutsugamushi, phản ứng realtime PCR với cặp primer/probe đã Streptococcus pneumonia, Haemophilus influenza thiết kế cho thấy cường độ tín hiệu huỳnh quang do Khoa Vi sinh, Học viện Quân Y cung cấp và thời gian thu nhận tín hiệu khá tốt. Bộ kit Neisseria meningitidis Superoxide Bảng 2: Trình tự primer, probe đặc hiệu dismutase (sodC) gene (Primerdesign) có độ đặc gen đích sodC hiệu 100% với một loạt các trình tự gen Primer/ DNA sequence (5’-3’) N.meingitidis. Trong điều kiện PCR tối ưu, bộ kit probe phát hiện N.meningitidis có hiệu suất bắt cặp rất Forward GCGGTCACTGGGATCCTAAA cao > 95% và có thể phát hiện ít hơn 100 bản primer sao gen đích. Reverse GTTGCTGTGCCATCATGCAA Các hóa chất, sinh phẩm và thiết bị dùng primer trong tách chiết DNA và phản ứng realtime PCR Probe ACCCATGGCAAGATGATGCACACT 2. Phương pháp. Tách chiết DNA: DNA từ 2. Tối ưu nồng độ mồi. các mẫu dịch não tủy được tách chiết bằng bộ kit QiAmp DNA Mini Kit (QIAGEN) theo quy trình của nhà sản xuất (Spin Protocol) Thiết kế primer, probe cho phản ứng realtime PCR: sodC là gen đích có tính bảo tồn cao trong các chủng Neisseria meningitidis gây bệnh và không gây bệnh được chọn làm gen đích thiết kế primer, probe cho phản ứng realtime PCR. Các trình tự primer, probe được thiết kế và phân tích tương đồng với các trình tự khác sử dụng công cụ Primer 3. Hình 1: Kết quả tối ưu nồng độ primer Phản ứng realtime PCR: tổng thể tích phản phản ứng realtime PCR phát hiện ứng realtime PCR sử dụng là 20µl với 5µl DNA N.meningitidis Neisseria meningitidis, nồng độ mồi và probe tối Tiến hành khảo sát các nồng độ mồi khác ưu lần lượt là 0.2µM và 0.1µM. Chât phụ gia nhau (0.1, 0.2, và 0.4µM) trong phản ứng DMSO 2.5% được bổ sung để để cải thiện hiệu realtime PCR khuếch đại gen đích sodC phát hiện suất phản ứng, thể tích còn lại là nuclease-free Neisseria meningitidis. Nồng độ mồi 0.2µM là water. Chu trình nhiệt gồm các bước: biến tính nồng độ thấp nhất mà tại cùng điều kiện phản ban đầu 95℃ trong 15 phút, sau đó là 45 chu kỳ ứng như nhau, đối chứng dương cho tín hiệu 43
vietnam medical journal n01 - APRIL - 2020 khuếch đại sớm nhất (Hình 1) được chọn là nồng realtime PCR đã xây dựng và quy trình realtime độ mồi tối ưu. PCR của bộ kitNeisseria meningitidis Superoxide 3. Tối ưu nồng độ probe. Chúng tôi tiến dismutase (sodC) gene (Primerdesign), mỗi nồng hành khảo sát nồng độ probe từ 0.05-0.2 µM, độ được lặp lại 10 lần. Kết quả cho thấy quy kết quả được trình bày chi tiết trên hình 2. So trình realtime PCR do nhóm nghiên cứu xây sánh về giá trị Ct cho thấy phản ứng với nồng độ dựng có khả năng phát hiện 10/10 lần lặp lại probe 0.2µMcho đường tín hiệu khuếch đại sớm nồng độ 100 copy/p.ư, tương đương với quy nhất (23.52 chu kỳ), tuy nhiên chỉ sớm hơn 0.7 trình realtime PCR của bộ kit thương mại chu kỳ so với phản ứng nồng độ probe 0.1µM. (Primerdesign). Kết quả đánh giá ngưỡng phát Do vậy, nồng độ probe 0.1µMđược chọn là nồng hiện chi tiết được trình bày trên hình 3. độ tối ưu cho phản ứng realtime PCR phát hiện 5. Đánh giá và so sánh độ nhạy, độ đặc N.meningitidis- nồng độ vừa đảm bảo hiệu suất hiệu với bộ kit thương mại Primerdesign phản ứng với tín hiệu khuếch đại sớm vừa phù Độ nhạy, độ đặc hiệu quy trìnhrealtime PCR hợp về kinh tế. lần lượt được đánh giá trên DNA các mẫu dương tính giả định; DNA các mẫu âm tính với Neisseria meningitidisvà các chủng vi sinh vật thường gặp trong chẩn đoán phân biệt (đã mô tả ở trên). Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu quy trình realtime PCR đã xây dựng được so sánh với bộ kit thương mại Neisseria meningitidis Superoxide dismutase (sodC) gene kit qua một loạt các phản ứng realtime PCR tương ứng. Hình 2: Kết quả tối ưu nồng độ probe phản ứng realtime PCR phát hiện N.meningitidis 4. Ngưỡng phát hiện tương đương với bộ kit thương mại hiện có trên thị trường Hình 4: Kết quả đánh giá độ nhạy quy trình realtime PCR phát hiện N.meningitidis Đánh giá quy trình realtime PCR do nhóm nghiên cứu xây dựng (A) và bộ kit thương mại (B) trên các mẫu dương tính giả định Hình 3: Kết quả đánh giá ngưỡng phát hiện quy Quy trình realtime PCR đã xây dựng không trình realtime PCR phát hiện N.meningitidis phát hiện bất kỳ mẫu nào trong 10 mẫu âm tính A – ngưỡng phát hiện quy trình realtime PCR với N.meningitidis và trên 10 mẫu DNA các do nhóm nghiên cứu xây dựng, chủng vi sinh vật khác thường gặp trong chẩn B – ngưỡng phát hiện bộ kit thương mại đoán phân biệt, tương đương với độ đặc hiệu Panel dải nồng độ plasmid tái tổ hợp 100%. Quy trình realtime PCR (PrimerDesign) N.meningitidis nồng độ 102 – 104 copy/p.ư được cũng cho kết quả đánh giá độ đặc hiệu tương sử dụng để đánh giá ngưỡng phát hiện quy trình đương (Bảng 2). 44
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 489 - THÁNG 4 - SỐ 1 - 2020 Bảng 3: So sánh độ đặc hiệu của từng chẩn đoán phân biệt não mô cầu cho thấy độ quy trình đặc hiệu cao (100%) như mô tả của nhà nhà Độ đặc hiệu (%) xuất. Quy trình realtime PCR do nhóm nghiên Primerd cứu xây dựng cũng cho kết quả tương tự khi Mẫu đánh giá Realtim không có bất kỳ một kết quả dương tính giả nào esign e PCR được xác nhận. Kết quả đánh giá độ nhạy trên kit Đánh giá trên mẫu các mẫu dương tính giả định cũng cho kết quả bệnh phẩm âm tính 100 100 tốt tương tự. Như vậy, quy trình realtime PCR với N.meningitidis phát hiện N.meningitidis có độ nhạy, độ đặc hiệu Đánh giá trên các vi tương đương với bộ kit thương mại hiện có trên sinh vật có thể gây 100 100 thị trưởng. Điều này cho thấy khả năng ứng triệu chứng tương tự. dụng của quy trình đã thiết lập là tương đương Đánh giá trên các mẫu dương tính giả định với bộ kit thương mại hiện hành. Bộ kit thương nồng độ khác nhau (TP1-TP10) cho thấy quy mạiNeisseria meningitidis Superoxide dismutase trình realtime PCR đã xây dựng có khả năng phát (sodC) gene (Primerdesign) với giá thành cao sẽ hiện 10/10 mẫu bệnh phẩm dương tính giả định trở thành vấn đề kinh tế lớn trong trường hợp (Hình 4), tương đương với độ nhạy 100%. Độ dịch bệnh não mô cầu bùng phát và trong quá nhạy này là tương đương với quy trình realtime trình giám sát dịch tễ học người lành mang PCR bộ kit thương mại hiện hành chủng tại Việt Nam, quy trình realtime PCR do (PrimerDesign). nhóm nghiên cứu xây dựng sẽ giúp tiết kiệm chi phí trong chẩn đoán và giám sát dịch bệnh mà IV. BÀN LUẬN vẫn mang lại hiệu quả tương đương với bộ kit Do mức độ nghiêm trọng của bệnh viêm thương mại hiện có. màng não mô cầu bao gồm tỷ lệ tử vong ca Không giống những nghiên cứu trong nước bệnh cao và khả năng để lại di chứng, chẩn trước đây, nhóm nghiên cứu lựa chọn sodC thay đoán lâm sàng và xét nghiệm sớm là rất quan vì ctrA là gen đích đặc hiệu phát hiện trọng. Các phương pháp nuôi cấy được xem là N.meningitidis. Gene đích sodC là gene mã hóa tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán viêm màng não cho enzyme xúc tác chuyển đổi anion gốc mô cầu yêu cầu quá nhiều thời gianđể thực hiện superoxide thành hydro peroxide, ngăn chặn một và kết quảcó thể bị ảnh hưởngnếu bệnh nhân chuỗi phản ứng sản xuất các gốc hydroxyl tự do đãđược điều trị bằng kháng sinh trước đó. Ứng độc hại nhằm bảo vệ vi khuẩn nên ít nhạy cảm dụng quy trình xét nghiệm sinh học phân tử với biến đổi kháng nguyên như ctrA (capsular realtime PCR sẽ giúp cải thiện đáng kể tỷ lệ phát transport gene). sodC được biết đến là quan hiện bệnhtrong các phòng thí nghiệm và giảm trọng với sự tồn tại của sinh vật in vivo, đặc hiệu thời gian cần thiết để xác nhận bệnh viêm màng với N.meningitidis, có tính bảo tồn cao, và có nãomô cầu. mặt trong các groupable và nongroupable Nhóm nghiên cứu đã xây dựng thành công N.meningitidis (não mô cầu thường xuất hiện quy trình realtime PCR phát hiện N.meningitidis trong vòm họng của người mang mầm bệnh với ngưỡng phát hiện 100 copy/p.ư, tương không triệu chứng). Điều này có nghĩa là quy đương với bộ kit thương mại hiện có trên thị trình realtime PCR được thiết lập không những trường (Primerdesign). Tất cả các nồng độ trong có thể áp dụng trong chẩn đoán phát hiện não panel nồng độ bao gồm 104 copy/p.ư, 103 mô cầu mà còn có thể ứng dụng trong giám sát copy/p.ư và 102 copy/p.ư đều cho tín hiệu dịch chủ động, giám sát người lành mang chủng. khuếch đại 10/10 lần lặp lại mỗi nồng độ. Các giá trị Ct của cùng một nồng độ của quy trình V. KẾT LUẬN realtime PCR do nhóm nghiên cứu chế tạo sớm Nhóm nghiên cứu đã xây dựng thành công hơn so với bộ kit thương mại (Hình 1), điều này quy trình realtime PCR phát hiện Neisseria có thể giải thích do hiệu suất mồi bắt cặp khác meningitidis với ngưỡng phát hiện, độ nhạy và nhau và chu trình nhiệt mỗi quy trình phản ứng độ đặc hiệu tương đương với bộ kit thương mại là khác nhau. Ngưỡng phát hiện này là phù hợp hiện có trên thị trường. để ứng dụng trong phát hiện N.meningitidis quy TÀI LIỆU THAM KHẢO mô phòng thí nghiệm. 1. Batista, R.S., et al., Meningococcal disease, a Kết quả đánh giá quy trình phản ứng bộ kit clinical and epidemiological review. Asian Pac J thương mại (Primerdesign) trên các mẫu âm tính Trop Med, 2017. 10(11): p. 1019-1029. và các chủng vi sinh vật khác thường gặp trong 2. Strelow, V.L. and J.E. Vidal, Invasive 45