Bài thuyết trình: Các phương pháp chuyển gen

Chia sẻ: VŨ ĐỨC LỘC ĐỨC LỘC | Ngày: | Loại File: PPT | Số trang:32

Thêm vào BST

Báo xấu

290
lượt xem 31
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Chuyển nạp gen là quá trình những đoạn ADN ngoại lai, mã hóa một thông tin di truyền nhất định, có thể được tách ra từ thực vật, vi khuẩn hay động vật, được chuyển sang một nền di truyền mới. Vậy có những phương pháp chuyển gen nào, quá trình diễn ra như thế nào, mời các bạn cùng tham khảo nội dung bài bài thuyết trình "Các phương pháp chuyển gen". Hy vọng đây là tài liệu tham khảo hữu ích cho các bạn.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài thuyết trình: Các phương pháp chuyển gen

LOGO Các phương pháp chuyển gen Nhóm sv thực hiện: 1. Nguyễn Thị Hồng 2. Nguyễn Thị Ngát 3. Phạm Thị Huyền 4. Phạm Thị Thu Hiền 5. Lê Thị Yến
Khái niệm chuyển nạp gen  Chuyển nạp gen là quá trình những đoạn ADN ngoại lai, mã hóa một thông tin di truyền nhất định (tính trạng), có thể được tách ra từ thực vật, vi khuẩn hay động vật, được chuyển sang một nền di truyền mới. Nó bao gồm cả việc tạo ra những cây hữu dục bình thường và có biểu hiện gen mới chuyển nạp.
Các phương pháp chuyển gen Chuyển gen trực Chuyển gen gián tiếp tiếp Kỹ thuật Chuyển Chuyển Chuyển Chuyển chuyển Chuyển Gen trực Chuyển Gen Gen nhờ Gen nhờ Gen Gen nhờ tiếp nhờ kỹ Kỹ thuật Gen nhờ nhờ súng bắn thông vsv đất thuật Xung Virus Silicon gen qua Agrobacterium siêu âm điện carbide ống phấn
1.1. Phương pháp trực tiếp chuyển gen thông qua ống phấn (nuôi cấy mô)  Được đề xuất lần đầu tiên năm 1988 trên cây lúa bởi nhóm Ray Wu đại học Cornell (Mỹ) dựa trên sự kế thừa công trình của Duan và Chen (TQ, 1985) với tỷ lệ hạt chuyển gen/hạt thí nghiệm là 20%.  Ở Việt Nam, phương pháp này đang được viện Nghiên cứu cây bông và viện CNSH thử nghiệm ở quy mô lớn trên cây bông. www.themegallery.com
Trên lúa: tiến hành từ 1-2 giờ sau khi hoa nở với CADN = 50 µg/ml 1.1. Phương pháp trực tiếp chuyển gen thông qua ống phấn (nuôi cấy mô) www.themegallery.com
1.2.Chuyển gen bằng súng bắn gen Nguyên tắc chung: Sử dụng các viên đạn có kích thước nhỏ nhưng tỷ trọng cao để đạt gia tốc cao, dưới tác dụng của 1 lực nén xuyên qua các vỏ và màng tế bào đưa lớp ADN bọc ngoài vào tế bào và tiếp cận với bộ gen của tế bào.
Chuyển gen bằng súng bắn gen Các hạt hình cầu bằng vàng hoặc tungsten, đk 1-1,5µm được bao bọc bằng các vecto tái tổ hợp chứa ADN cần chuyển nạp (đã được ngưng kết với CaCl2 hoặc polythylene glycol). Tốc độ hạt đạt 300 - 600 m/s Mật độ sử dụng các hạt không gây hư hại nghiêm trọng đến tế bào.
1.2. Chuyển gen bằng súng bắn gen Ưu điểm:  + Dễ dàng tiến hành  + Đối tượng nhận gen có thể rất đa dạng (ở dạng mô, phôi, tế bào và tế bào trần) Nhược điểm: Cây chuyển gen khó tái sinh
1.3. Chuyển gen nhờ kỹ thuật điện xung (electroporation ) • Kỹ thuật điện xung (electroporation) là một phương pháp cơ học được sử dụng để đưa các phân tử phân cực vào trong tế bào chủ qua màng tế bào. • Trong phương pháp này, một xung điện cao thế trong khoảnh khắc (vài phần nghìn giây) có khả năng làm rối loạn cấu trúc màng kép phospholipid, tạo ra các lỗ thủng tạm thời cho phép các phân tử DNA ngoại lai từ môi trường xâm nhập vào bên trong tế bào.
1.3. Chuyển gen nhờ kỹ thuật điện xung (electroporation )  Kỹ thuật điện xung dựa trên trạng thái tương đối yếu của các tương tác kỵ nước của phospholipid kép và khả năng tập hợp lại một cách tự động của nó sau khi bị rối loạn (Purves, 2001).  Vì vậy, một xung điện chớp nhoáng có thể gây ra rối loạn ở các vị trí của màng một cách nhất thời, làm cho các phân tử phân cực có thể đi qua, nhưng sau đó màng có thế đóng kín lại nhanh chóng và tế bào không bị ảnh hưởng gì cả.  Các tế bào chủ và DNA ngoại lai được tạo thành dịch huyền phù và cho vào trong một cuvette nhựa có điện cực.
1.3. Chuyển gen nhờ kỹ thuật điện xung (electroporation ) Cuvette nhựa có cực Máy xung gen (Gene Pulser Xcell Total System- Biorad – Mỹ)
Ứng dụng của kỹ thuật điện xung a. Biến nạp DNA: Các gen đặc hiệu có thể được tạo dòng trong plamid và sau đó plasmid này được đưa vào tế bào chủ để nghiên cứu cấu trúc và chức năng của gen và protein. b. Chuyển plasmid trực tiếp giữa các tế bào:  Tế bào vi khuẩn đã chứa plasmid có thể được ủ với một dòng khác không mang plasmid nhưng lại có đặc tính mong muốn khác.  Ðiện áp của xung điện sẽ tạo ra các lỗ, cho phép một số plasmid đi ra khỏi tế bào và lại đi vào tế bào khác.  Sau đó các tế bào mong muốn sẽ được chọn lọc bằng tính kháng thuốc kháng sinh hoặc bằng phương pháp tương tự khác (Withers, 1995).  Kiểu chuyển gen này cũng có thể được thực hiện giữa các loài khác nhau. Vì vậy, một lượng lớn plasmid sinh trưởng trong các khuẩn lạc vi khuẩn được nhân lên một cách nhanh chóng và sau đó được chuyển vào các tế bào nấm men bằng kỹ thuật xung điện để nghiên cứu (Gunn, 1995).
Ứng dụng của kỹ thuật điện xung c. Dung hợp tế bào đa kích thích: Sự tạo thành các lỗ thủng trên màng xảy ra do xung điện chớp nhoáng tạo ra cho thấy đa kích thích sự dung hợp tế bào (Weber và Berrg, 1995). d. Phân phối thuốc qua da: Chỉ khi xung điện gây ra các lỗ tạm thời trên màng sinh chất, các lỗ tương tự đa tạo ra ở màng lipid kép của lớp da chết ở phía ngoài cùng. Các lỗ này cho phép thuốc đi qua da đến các mô đích. Các bệnh nhân thích phương pháp này hơn phương pháp tiêm (không cần kim tiêm) và có thể tránh được các vDesign ấn đInc. ề phân hủy hoặc hấp thu không đúng của liệu pháp uống thuốc (oral medication) trong hệ tiêu hóa (Praustmitz, 1993).
Ứng dụng của kỹ thuật điện xung e. Liệu pháp hóa điện khối u ung thư (cancer tumor electrochemotherapy):  Các nhà khoa học đang nghiên cứu tiềm năng của kỹ thuật xung điện để tăng tính hiệu quả của liệu pháp hóa học.  Khi sử dụng kỹ thuật xung điện để biến nạp DNA, xung điện này sẽ phá vỡ màng tế bào ung thư và làm tăng lượng thuốc đi đến các vị trí.  Một số nghiên cứu cho rằng đã làm giảm sự phát triển khối u khi áp dụng phương pháp này cho các tế bào ung thư ở hệ thống mô hình động vật (Maeda, 1998). f. Liệu pháp gen:  Kỹ thuật xung điện cho phép các vector mang các gen quan tâm được biến nạp qua da đến các mô đích.  Khi đa hợp nhất vào các tế bào của cơ thể, các protein được tổng hợp từ các gen này có thể thay thế gen sai hỏng và vì vậy đa điều trị các rối loạn di truyền (Inovio, 2002).
1.4. Kỹ thuật chuyển gen nhờ silicon carbide  Silicon carbide là những vật liệu dạng sợi do hãng Arco Metals sản xuất. Sợi silicon carbide có đường kính rất nhỏ khoảng 0,6 µm và dài khoảng 10 - 80 µm. Khi lắc một hỗn hợp huyền phù tế bào đơn và plasmid tái tổ hợp mang gen mong muốn, gen chọn lọc với silicon carbide trên máy lắc vortes khoảng 5 giây,16% các tế bào sẽ bị thủng và các ADN ngoại lai có thể xâm nhập. Nuôi cấy tế bào tái sinh thành 41% mô sẹo và cây, chọn 55% lọc để tách ra những cây đã chuyển gen.  Thường huyền phù tế bào đơn được thu hoạch vào ngày 45% 50% thứ 5 hoặc thứ 6 sau khi cấy truyền là giai đoạn tốt nhất để thực hiện quy trình chuyển gen.
1.5. Phương pháp chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm Nguyên tắc: Sau khi tách, protoplast được xử lý nhẹ bằng siêu âm có hiện diện của DNA ngoại lai. Sóng siêu âm giúp DNA đi vào tế bào và thể hiện. Các bước: 1.Tách protoplast từ mô thịt lá. Treo protoplast đã tinh sạch trong môi trường có chứa 21% sucrose. 2.Cắm đầu siêu âm của máy phát siêu âm ngập độ 3mm trong huyền phù protoplast và cho máy siêu âm phát với tần số 20 KHz theo từng nhịp ngắn 110 millisecond. Tổng thời gian tác động siêu âm từ 500-900 millisecond.
1.5. Phương pháp chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm 3. Protoplast được nuôi trên đĩa Petri trong môi trường thích hợp để xác định tỷ lệ chết do siêu âm phá vỡ màng. Ở điều kiện nói trên, khoảng 30-50% protoplast bị chết. Số protoplast còn lại tiếp tục phân chia và tái sinh. 4. Nuôi cấy invitro để tái sinh cây 5. Chọn lọc cây và đưa ra trồng ở môi trường ngoài
2.1. Phương pháp chuyển gen nhờ virus • Ưu điểm: Virus dễ xâm nhập và lây lan trong cơ thể thực vật • Tiêu chuẩn virus làm vecter chuyển gen + Hệ gen của virus phải là ADN + VR có khả năng di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác qua các lỗ của vách tế bào + Có khả năng mang được ADN mới, sau đó chuyển gen này vào tế bào thực vật + Có phổ ký chủ rộng (trên nhiều loại cây trồng) + Không gây tác hại đáng kể cho thực vật + Có khả năng tải được các đoạn ADN gắn vào. Tuy nhiên, việc chuyển gen nhờ virus rất ít được sử dụng
2.2 Chuyển gen nhờ vi sinh vật đất Agrobacterium  Agrobacterium là các vi khuẩn đất nhuộm gram (-)  Gây ra các triệu chứng bệnh khi xâm nhiễm  Có 4 loại chính nhưng trong đó A.tumefaciens (gây bệnh u thân) được sử dụng nhiều nhất trong việc chuyển gene
Bộ gene của vi Ti - plasmid khuẩn Vi khuẩn đất Agrobacterium