TR NG Đ I H C S PH M THÀNH PH H CHÍ MINH ƯỜ Ạ Ọ Ư Ạ Ố Ồ
KHOA HÓA H CỌ ----------
BÁO CÁO Đ TÀI NGHIÊN C U KHOA H C Ọ Ứ Ề
CHUYÊN NGÀNH HÓA H U CỮ Ơ
KH O SÁT THÀNH PH N HÓA H C C A
Ọ Ủ
Ầ
Ả
LOBARIA PULMONARIA (LOBARIACEA)
Đ A Y Ị
THU HÁI
T NH LÂM Đ NG
Ở Ỉ
Ồ
ng d n: Ths. D ng Thúc Huy ươ
ướ ự
Giáo viên h ẫ Sinh viên th c hi n: ị ng Th Di m ệ Bùi Th Thùy An ị ễ ươ
Tr Nguy n Công D ng ươ Nguy n Th Giang ọ Lê H ng B o Ng c ễ ễ ồ ị ả
TP. H Chí Minh, tháng 4 năm 2014 ồ
DANH M C HÌNH Ụ
Hình 1. M t s đ a y d ng b t (crustose) . ộ ố ị ạ ộ
Hình 2. M t s đ a y hình lá (foliose) ộ ố ị
Hình 3. M t s đ a y d ng s i (fructicose) ộ ố ị ạ ợ
Hình 4. Đ a y Lobaria amplissima ị
Hình 5. Đ a y Lobaria virens ị
Hình 6. Đ a y Lobaria srobiculata ị
Hình 7. Đ a y Lobaria pulmonaria đ c thu hái t i t nh Lâm Đ ng ị ượ ạ ỉ ồ
DANH M C B NG Ụ Ả
L I C M N Ờ Ả Ơ ****
Đ hoàn thành Đ Tài Nghiên C u Khoa H c này, đ u tiên em xin chân ứ ể ề ầ ọ thành c mả
n giáo viên h ng d n là Th y D ng Thúc Huy, ơ ướ ươ ẫ ầ ữ gi ng viên chuyên nghành hóa h u ả
c khoa hóa, tr ơ ườ ng Đ i H c S Ph m TP.HCM, đã h ạ ư ạ ọ ướ ặ ng d n chúng em làm đ tài này, đ c ề ẫ
bi t chúng em xin chân thành c m n PGS. Ts. Nguy n Kim Phi Ph ng và Ths. Nguy n Th ệ ả ơ ụ ễ ễ ị
M Dung đã tr c ti p h ng d n chúng em làm đ tài nghiên c u này. Đ có nh ng thi ự ế ỹ ướ ứ ữ ề ể ẫ ế ị t b
đo đ t và làm th c nghi m, chúng em cũng chân thành cám n Khoa Hóa – Tr ự ệ ạ ơ ườ ọ ng Khoa H c
T Nhiên đã cho chúng em s d ng đ hoàn thành đ tài nghiên c u này. ử ụ ự ứ ể ề
Cu i l i em xin chúc quý th y cô luôn d i dào s c kh e đ ti p t c c ng hi n cho s ố ờ ỏ ể ế ụ ố ứ ế ầ ồ ự
nghi p giáo d c và luôn là t m g ng sáng cho chúng em noi theo. ụ ệ ấ ươ
Em xin chân thành c m n! ả ơ
TP. HCM, Ngày 22 Tháng 04 Năm 2014
Nhóm SV th c hi n đ tài ự ệ ề
Trang
1. Đ T V N Đ Ặ Ấ Ề
Đ a y là m t d ng c th ph c t p đ c t o nên t nhi u thành ph n khác nhau. ơ ể ộ ạ ứ ạ ị ượ ạ ừ ề ầ
Thành ph n chính trong đ a y th t o ra ngu n th c ăn cho ầ ị ườ ng là n m. N m không th t ấ ể ự ạ ứ ấ ồ
mình nên chúng th ườ ấ ng s ng c ng sinh v i m t thành ph n khác ho c s ng ho i sinh. N m ặ ố ầ ạ ố ộ ớ ộ
trong đ a y (thu c gi ng c ng sinh v i m t thành ph n khác, thành ph n này có ộ ị ớ i N m) th ấ ườ ầ ầ ộ ớ ộ
[17]
kh năng t o ra ngu n dinh d ng thông qua quá trình quang h p. Đôi khi thành ph n này là ả ạ ồ ưỡ ầ ợ
i là vi khu n lam, cũng có khi là bao g m c hai lo i trên. t o, khi khác l ả ạ ẩ ả ạ ồ
ể M i loài đ a y c n đi u ki n s ng và phát tri n khác nhau. M t s đ a y ch phát tri n ộ ố ị ệ ố ề ể ầ ỗ ị ỉ
trên giá th có tính acid, m t s khác phát tri n trên giá th có tính baz ho c trung tính. Các ể ộ ố ể ể ặ
nhi t đ , đ m, ánh sáng…đ u có nh h ng đ n s sinh tr y u t ế ố ệ ộ ộ ẩ ề ả ưở ế ự ưở ể ủ ng và phát tri n c a
các loài đ a y. Nh có các đi u ki n s ng đa d ng mà đ a y có m t kh p n i trên th gi i, t ệ ố ặ ở ề ạ ờ ị ị ế ớ ừ ắ ơ
[1]
nh ng môi tr ng quen thu c (trong r ng, trên t ng…) đ n nh ng môi tr ữ ườ ừ ộ ườ ữ ế ườ ắ ng s ng kh c ố
nghi ệ t (hai vùng c c, đ nh núi, sa m c…). ỉ ự ạ
Đ a y tăng tr ng t 0.1 đ n 1 ị ưở ng v i m t t c đ r t ch m. Đ a y d ng b t tăng tr ậ ộ ố ộ ấ ạ ớ ộ ị ưở ừ ế
mm/năm, đ a y d ng lá tăng tr ng t ạ ị ưở ừ 2-4 cm/năm. Đ a y r t nh y c m v i ô nhi m không khí ạ ả ễ ấ ớ ị
[4]
nên có th xem đ a y nh m t lo i ch th t ng không khí. Do đó ngày nay ư ộ ị ự ể ạ ị ỉ nhiên v ch t l ề ấ ượ
ph i đi xa kh i thành ph vài d m chúng ta m i có th tìm th y đ a y. ể ả ặ ấ ỏ ố ớ ị
[17]
Đ a y phát tri n v i nhi u hình d ng khác nhau, d a vào đó mà đ a y đ c phân thành ự ể ề ạ ớ ị ị ượ
các lo i khác nhau nh ng th ng th y nh t có 3 d ng chính ư ạ ườ ấ ấ ạ
* Crustose lichen: Đ a y d ng b t m n. Loài đ a y này có d ng trông gi ng nh b t m n dính ị ư ộ ạ ạ ộ ố ị ị ị
r t ch c vào đá, cây c i, v a hè ho c trong đ t, th ấ ắ ặ ấ ố ỉ ườ ỏ ng r t khó đ tách chúng ra kh i ể ấ
nh ng giá th này mà không làm t n h i đ n giá th . ể ạ ế ữ ể ổ
* Foliose lichen: Đ a y d ng phi n lá. Loài đ a y này th ng có d ng nh lá, tán c a chúng có ế ạ ị ị ườ ư ủ ạ
th phân ra thành nhi u thùy (lobes). Th ng chúng g n v i giá th (nh ng không quá ể ề ườ ư ể ắ ớ
ch t) thông qua nh ng c u trúc khác nhau, m t trong s đó là c u trúc trông nh r gi ư ễ ả ữ ặ ấ ấ ộ ố
g i là rhizine. ọ
* Fructicose lichen: Đ a y d ng s i. Loài đ a y này th ng có ti t tròn, phân nhi u nhánh, ạ ợ ị ị ườ ế ề
trông nh m t chùm lông bám trên giá th ho c cũng có khi gi ng nh nh ng s i dây ư ộ ư ữ ể ặ ợ ố
buông thõng trên các cây l n.ớ
Trang
Bacidia inundata Nectriopsis physciicola Pertusaria multipuncia
[12]
c ch p b i i Ireland ) ( nh đ ả ượ ụ ở Ballingeary và County Cork t ạ
Hình . M t s đ a y d ng b t (crustose)
ộ ố ị
ộ
ạ
Lobaria pulmonaria Menegazzia terebrata Sticta canariensis
c ch p b i i Ireland ) ( nh đ ả ượ ụ ở Ballingeary và County Cork t ạ
[12]
Hình . M t s đ a y hình lá (foliose)
ộ ố ị
Cetraria aculeate Ramalina cuspidate Usnea wasmuthii
c ch p b i i Ireland ) ( nh đ ả ượ ụ ở Ballingeary và County Cork t ạ
[12]
Hình . M t s đ a y d ng s i (fructicose)
ộ ố ị
ợ
ạ
2. N I DUNG NGHIÊN C U Ộ Ứ
[4]
H Lobariaceae bao g m các loài đ a y có tán r ng, đ ườ ọ ộ ng kính có th lên đ n 50 ể ế ị cm ho c h n. H đ a y này có g n 800 loài và đ c chia thành 3 chi chính. ồ ầ ọ ị ượ ặ ơ - Chi Sticta
- Chi Lobaria
Trang
- Chi Pseudocyphellaria
Tuy nhiên hi n nay, Vi t Nam ch a có nghiên c u hoá h c nào v ệ ở ệ ư ứ ọ ề các loài đ a yị
thuộc các chi này. Bên c nh đó ạ , tại rừng Bidoup thuộc tỉnh Lâm Đồng, chúng tôi phát hiện
thấy có nhi u loài đ ề ịa y thuộc chi Lobaria. Trong đó có một s ố loài phát triển mạnh với số
ã ch n các loài đ lượng nhi u. Do đó, chúng tôi đ ề ọ ịa y thu c chi này làm đ i t ố ượng nghiên cứu. ộ
2.1. T ng quan v chi Lobaria ổ ề
2.1.1. Đ c đi m chung ể ặ
Đ a y thu c chi Lobaria có d ng hình lá, kích th c l n, các thuỳ th ng phân nhánh, ộ ị ạ ướ ớ ườ
có ph n rìa bo tròn không s c c nh. B m t tr n nh n ho c có các n p g p d ng l i. Màu ề ặ ơ ắ ạ ế ầ ẵ ặ ấ ạ ướ
[17]
ng khô ráo hay m t. M t d i màu tr ng ho c xám s c thay đ i tuỳ thu c vào môi tr ắ ộ ổ ườ ẩ ướ ặ ướ ặ ắ
nh t, có g n r gi g i là rhizines. ắ ễ ả ọ ạ
2.1.2. Phân bố
Các loài đ a y thu c chi này th ng đ c tìm th y t ho c có nhi u bóng ộ ị ườ ượ n i m ấ ở ơ ẩ ướ ề ặ
râm.[17]
2.1.3. Mô t th c v t m t s loài đ a y thu c chi Lobaria ả ự ậ ộ ố ộ ị
2.1.3.1. Lobaria amplissima
Mô t th c v t ả ự ậ
Thu c d ng fructicose, thuỳ r ng t 5 đ n 30 mm, đ ng kính t ộ ạ ộ ừ ế ườ ừ ầ 15 đ n 30 cm, ph n ế
[17]
rìa bo tròn. Trong môi tr ng m t có màu xanh lá, môi tr ng khô ráo có màu xám tr ng. ườ ẩ ướ ườ ắ
B m t tr n láng ho c g n sóng. ề ặ ơ ặ ợ
Trang
Hình . Đ a y
Lobaria amplissima[12]
ị
Phân bố
Lobaria amplissima th ng đ c tìm th y trên v cây, đ c bi t là nh ng cây r ng lá. ườ ượ ặ ấ ỏ ệ ụ ữ
Đôi khi loài đ a y này còn đ ị ượ c tìm th y trên nh ng t ng đá (ngo i tr ữ ạ ừ ấ ả ạ đá vôi). Chúng nh y
2 trong không khí l n h n 30
μg/m3. c m v i s ô nhi m và s bi n m t khi n ng đ CO ả ẽ ế ớ ự ễ ấ ộ ồ ơ ớ
Chúng th ng phân b t i vùng có khí h u ôn đ i, n i ít nhi u m t. ườ ố ạ ề ẩ ướ [17] ậ ớ ơ
2.1.3.2. Lobaria virens
Mô t th c v t ả ự ậ
Đ a y thu c d ng foliose, đ ộ ạ ị ườ ể ng kính có th đ t đ n 30 cm, bám khá ch t vào giá th . ể ạ ế ặ
Thuỳ r ng t 0.5 đ n 3 cm, ph n rìa bo tròn, n m tách r i, ti p giáp ho c ch ng chéo lên ộ ừ ế ế ằ ặ ầ ờ ồ
xám đ n xanh lá trong môi tr ng khô ráo đ n m nhau. Màu s c thay đ i t ắ ổ ừ ế ườ ế ẩ ướ ề ặ t. B m t
khá tr n láng, đôi khi có g n sóng. M t d i màu nâu nh t, đ c bao ph b ng m t l p lông ặ ướ ơ ợ ạ ượ ộ ớ ủ ằ
t .ơ [17]
Hình . Đ a y
Lobaria virens[12]
ị
Phân b :ố
Trang
Lobaria virens th ng đ ườ ượ ẻ c tìm th y trên thân cây s i, cây tr n bì, cây du hay cây d , ấ ầ ồ
[17]
đôi khi chúng còn đ c tìm th y trên nh ng t ng đá râm mát ho c trên các vách đá. Đây là loài ượ ữ ặ ấ ả
đ a y ph bi n t ị ổ ế ừ khu v c Đ i Tây D ng cho đ n Na Uy. ươ ự ế ạ
2.1.3.3. Lobaria srobiculata
Mô t th c v t ả ự ậ
Đ a y d ng foliose, đ ng kính kho ng 20 cm. Thuỳ r ng t 1 đ n 3 cm, ph n rìa bo ạ ị ườ ả ộ ừ ế ầ
tròn có d ng răng c a. B m t xù xì không tr n láng. Trong môi tr ng khô ráo, b m t có ề ặ ư ạ ơ ườ ề ặ
th thay đ i t màu xám đ n xanh d ng nh t. M t d . Túi bào ổ ừ ể ế ươ ặ ướ ạ i màu nâu nh t và có lông t ạ ơ
ban đ u có hình n m tay sau đó không có hình d ng nh t đ nh. Các h t đ c phát tán đi t t ử ấ ị ạ ượ ầ ắ ạ ừ
túi bào t ử ể ạ ự ố đ t o s s ng m i có màu xám l c. ớ ụ [17]
Hình . Đ a y
Lobaria srobiculata[12]
ị
Phân bố
Lobaria srobiculata th ng đ ườ ượ c tìm th y trên nh ng t ng đá (ngo i tr ữ ạ ừ ả ấ ặ đá vôi) ho c
[17]
trên nh ng thân cây không có nh a. Chúng đ c tìm th y nh ng n i m t, có khí h u ôn ự ữ ượ ấ ở ơ ẩ ướ ữ ậ
c tìm th y m t vài n i t i châu Âu. đ i và l nh. Ngoài ra chúng còn đ ớ ạ ượ ấ ở ộ ơ ạ
Trang
2.1.4.1. Các h p ch t ch a N: ợ
ứ
ấ
Lobaria 2.1.4. Các nghiên c u hóa h c v chi ứ ọ ề
2.1.4.2. Depside – Tridepside:
Sticticin (1) đ Lobaria virens[19] ượ c tìm th y trong ấ
Meta–scrobiculin (2) và para–scrobiculin (3) đ Lobaria ượ scrobiculata[6]. 4-O-methylgyrophoric acid (4) đ c tìm th y trong ấ Lobaria dissecta[7]. ượ c tìm th y trong ấ
meta-Scobiculin (2) para-Scobiculin (3) 4-O-methylgyrophoric acid (4)
2.1.4.3. Depsidone:
Cryptostictic acid (5) và methylstictic acid (6) đ Lobaria oregana[13]. ượ c tìm th y trong ấ
Stictic acid (7) đ Lobaria retigera (Bory) Trev[19] và isidiophorin (8) đ ượ c tìm th y trong ấ cượ
tìm th y trong Lobaria isidiophora Yoshim[19]. ấ
Trang
2.1.4.4. Sesterterpenoid:
2.1.4.5. Triterpenoid:
Retigeranic acid A (9) và retigeranic acid B (10) đ Lobaria isidiosa.[19] ượ c tìm th t trong ấ
Lobaria retigera.[19] ượ c tìm th y trong ấ Retigeric acid A (11) và retigeric acid B (12) đ
2.2. Đ i t ng nghiên c u: Đ a y Lobaria pulmonaria ố ượ ứ ị
2.2.1. Mô t th c v t ả ự ậ
Lobaria pulmonaria là đ a y có d ng lá, có thuỳ r ng, khi còn t i có màu xanh lá và ạ ộ ị ươ
[2]
khi khô có màu nâu nh t. B m t có d ng l i v i các m t l i trũng sâu, m t d i màu ề ặ ạ ạ ướ ớ ắ ướ ặ ướ
g i là rhizines. tr ng ho c nâu nh t có g n các r gi ạ ễ ả ọ ắ ắ ặ
2.2.2. Phân bố
Lobaria pulmonaria phân b r ng nh ng khu v c có khí h u m t, l ậ ẩ ướ ượ ố ộ ự ữ ng m a cao ư
[10] Loài đ a y này đ c bi
i châu Âu, châu Á, B c M và châu Phi. t ạ ắ ỹ ặ ị ệ ễ t nh y c m v i ô nhi m ạ ả ớ
không khí nên hi n nay, Lobaria pulmonaria đang d n bi n m t t ệ ấ ạ ế ầ ữ i Châu Âu cũng nh nh ng ư
khu v c xây d ng khu công nghi p. ự ự ệ [21] Ngoài ra loài đ a y này cũng đã đ ị ượ c nuôi c y trong ấ
phòng thí nghi m đ ph c v cho nhi u nghiên c u. ể ụ ụ ệ ề ứ [23]
Trang
Lobaria pulmonaria khi m i thu hái (hình trái) và sau khi ph i khô
Hình . Đ a y
ơ
ị
ớ (hình ph i)ả 2.2.3. Các nghiên c u v ho t tính sinh h c ọ ứ ề
ạ
Lobaria pulmonaria đ c s d ng làm th c ph m hay m ph m. Ngoài ra loài đ a y ượ ử ụ ự ẩ ẩ ỹ ị
này còn đ ượ ử ụ ư ệ c s d ng trong các bài thu c dân gian đ đi u tr các b nh khác nhau nh b nh ể ề ệ ố ị
chàm, các b nh v đ ề ườ ệ ng hô h p, ph i, viêm kh p. ổ ớ [9] Trong y h c Th Nhĩ Kỳ s d ng ử ụ ấ ọ ổ
Lobaria pulmonaria nh m t thu c tr nhu n tràng và r i lo n hô h p. ư ộ ậ ạ ố ố ị ấ [19]
Năm 2003, Suleyman H và nh ng c ng s c c a loài ữ ộ ự[11] đã công b d ch chi ố ị t n ế ướ ủ
Lobaria pulmonaria có đ c tính kháng viêm nimesulide và indomethacin. ặ
t Năm 2004, Fehmi Odabasoglu cùng các c ng ộ sự[11] đã công b d ch chi ố ị ế methanol c aủ
Lobaria pulmonaria và Ussea longissima có kh năng ch ng oxi hóa. ả ố
Năm 2009, Basak Karakus và nh ng c ng s ữ ộ ự[3] đã công b d ch chi ố ị ế ủ t methanol c a
Lobaria pulmonaria có kh năng c ch chu t – m t tác nhân gây t n th ế indomethacin ứ ả ở ộ ộ ổ ươ ng
niêm m c d dày. ạ ạ
Ngoài ra vào năm 1999, EMEA[20] - the European Agency for the evaluation of medicinal
products cũng đã công b v vi c c s d ng đ ch bi n th c ăn ố ề ệ Lobaria pulmonaria đ ượ ử ụ ế ế ứ ể
trong lĩnh v c thú y. ự
2.2.4. Các nghiên c u hóa h c ọ ứ
Cho đ n ngày nay, v n còn r t ít các bài báo nghiên c u thành ph n hoá h c c a loài đ a y ọ ủ ứ ế ẫ ấ ầ ị
này. Siegfried huneck và Isao Yoshimura[19] đã công b trong loài ố Lobaria pulmonaria có ch aứ
d n xu t c a acid rhizonic nh rhizonaldehide ẫ ấ ủ ư (13) và rhizonyl alcohol (14), các depsidone như
4,2’- di-O-methoxyconnorstictic acid (15), vesuvianic acid (16) pulmonarianin (17) và các
(18), fecosterol (19), stigmasterol (20), ergosterol-5α,8α-peroxide (21). steroid nh episterol ư
Năm 1975, S.Catalano và nh ng c ng s ữ ộ ự[11] đã công b tìm th y m t depside là gyrophoric ấ ố ộ
acid (31) trong loài Lobaria pulmonaria.
Trang
Năm 1999, EMEA[20] the European Agency for the evaluation of medicinal products cũng đã
(31) và tenuiorin (32) trong loài đ a y này. công b v s có m t c a gyrophoric acid ặ ủ ố ề ự ị
[2] đã công b loài
Năm 1994, Antonio G.Gonzalez và nh ng c ng s c a ông Lobaria ự ủ ữ ộ ố
pulmonaria có ch a các depsidone nh stictic acid (22), hypostictic acid (23), cryptostictic acid ư ứ
(24), methylstictic acid (25), norstictic acid (26) và m t lo i m i đ c tác gi ớ ượ ạ ộ ả kí hi u s 10 ệ ố
(27).
Năm 2012, Boris Pejin[5] và nh ng c ng s c a ông đã cô l p đ ữ ự ủ ậ ộ ượ ớ c m t depsidone m i ộ
(28) t ợ ừ Lobaria pulmonaria. Th nghi m kh năng c ch acetylcholinesterase cho th y h p ử ứ ệ ế ả ấ
ch t này không có ho t tính nh ng d n su t diacetate c a h p ch t này l ẫ ư ủ ấ ạ ấ ấ ợ ạ ứ i có kh năng c ả
ch ế ở ồ n ng đ 1 μg/mL. ộ
Năm 2010, Fadime Atalay[8] và các c ng s c a ông đã cô l p đ c t ự ủ ậ ộ ượ ừ Lobaria pulmonaria
các depsidone nh stictic acid (22), isidiophorin (29), pulmonarianin (30), vesuvianic acid (16), ư
d n su t c a acid rhizonic nh rhizonaldehyde ẫ ấ ủ ư (13), rhizonyl alcohol (14) và steroid như
ergosterol-5α, 8α- peroxide (21).
D n xu t c a rhizonic acid : ấ ủ ẫ
Depsidone:
Trang
Steroid:
Trang
Depside:
2.3. M c đích nghiên c u ứ ụ
Các h p ch t depside và depsidone đã đ ấ ợ ượ ẩ c nghiên c u là có ho t tính kháng khu n, ứ ạ
kháng oxi hóa m nhạ [14][8], là nh ng h p ch t đ c tr ng có nhi u trong đ a y. Các nghiên c u ứ ấ ặ ữ ư ề ợ ị
hóa h c trên chi ọ Lobaria cũng cho th y có s hi n di n c a nh ng h p ch t này. Bên c nh đó, ệ ủ ự ệ ữ ấ ạ ấ ợ
chúng tôi nh n th y loài đ a y Lobaria pulmonaria thu c chi Lobaria phát tri n khá nhi u ấ ậ ị ộ ề ở ể
ng nghiên c u. r ng Bidoup – Lâm Đ ng. Do đó, chúng tôi ch n loài đ a y này làm đ i t ừ ố ượ ồ ọ ị ứ
Loài đ a y này đ ị ượ ạ c đ nh danh b i nhóm nghiên c u c a Giáo s J.Boustie thu c đ i ủ ư ứ ộ ở ị
ng đ i h c Khoa H c T h c Rennes 1 Pháp và Th c sĩ Võ Th Phi Giao khoa sinh h c, tr ọ ạ ọ ị ườ ạ ọ ọ ự
Nhiên, đ i h c Qu c gia thành ph H Chí Minh. ạ ọ ố ồ ố
M c tiêu c a đ tài là kh o sát thành ph n hoá h c c a các h p ch t cô l p đ ủ ề ọ ủ ụ ả ấ ậ ầ ợ ượ ừ c t
Lobaria pulmonaria. loài đ a y ị
c sau: T loài đ a y đã thu hái ti n hành th c hi n các b ế ự ừ ệ ị ướ
- Đi u ch các lo i cao. ế ề ạ
t. - Cô l p các h p ch t tinh khi ợ ậ ấ ế
- Xác đ nh c u trúc hoá h c c a các h p ch t cô l p đ c. ọ ủ ậ ượ ấ ấ ợ ị
2.4. Ph ng pháp nghiên c u ươ ứ
Ti n hành đi u ch cao methanol c a loài đ a y ủ ế ề ế ị ộ Lobaria pulmonaria. T 1.4 kg b t ừ
c 140g cao thô methanol. khô đã đi u ch đ ề ế ượ
T cao này ti n hành gi i ly l n l t v i các dung môi có đ phân c c tăng d n đ ừ ế ả ầ ượ ớ ự ầ ộ ể
phân chia cao thô methanol thành 5 phân đo n khác nhau. Đ c ký hi u là: n-Hexan, EA1, ạ ượ ệ
EA2, EA3, EA4 và Me. Quy trình ti n hành đi u ch và cô l p các h p ch t đ c trình bày ấ ượ ế ế ề ậ ợ
trong s đ 1. ơ ồ
B ng các ph ng pháp hóa lý, đã cô l p đ c 5 h p ch t t cao EA1 và EA2. ằ ươ ậ ượ ấ ừ ợ
Trang
c, s y khô, ử ạ ớ ướ ấ R a s ch v i n xay nhuy nễ
Trích v i methanol, đu i dung môi ớ ổ
S c ký c t v i h dung môi có đ phân ộ ắ c c tăng d n (H, EA, M) ự ộ ớ ệ ầ Đu i dung môi ổ
S Đ .
ơ ồ Quy trình chung đi u ch và cô l p các h p ch t c a đ a y Lobaria pulmonaria
ấ ủ ị
ề
ế
ậ
ợ
3. K T QU VÀ BÀN LU N Ả Ậ Ế
3.1. K t qu ả ế
T cao EA1 chúng tôi đã cô l p đ c 4 h p ch t kí đ c kí hi u là LOBA1, LOBA5A, ậ ượ ừ ấ ợ ượ ệ
LOBA 9, LP1 t ng ng v i các h p ch t ươ ấ methyl orsellinate, ergosterol-5,8-peroxide, methy ứ ợ ớ
-orcinolcarboxylate, orcinol. T cao EA2 đã cô l p đ c 1 h p ch t là methylstictic acid đ ừ ậ ượ ấ ợ ượ c
1H-
ng pháp hóa lý kí hi u là LOBA7. C u trúc các h p ch t đ ấ ấ ượ ệ ợ c xác đ nh d a vào các ph ự ị ươ
NMR, 13C-NMR, HMBC, HSQC, MS.
C u trúc c a các h p ch t cô l p đ c: ậ ượ ủ ấ ấ ợ
Orcinol (LP1) Methyl orsellinate (LOBA1) Methy -orcinolcarboxylate (LOBA9)
Trang
Ergosterol-5,8-peroxide (LOBA5A) Methylstictic acid (LOBA7)
Trang
3.2. Bàn lu nậ
3.2.1. H p ch t LP1 ấ ợ
- D ng d u màu vàng. ầ ạ
- Ph ổ 1H-NMR: Ph l c 1. ụ ụ
- Ph ổ 13C-NMR: Ph l c 2. ụ ụ
3 và t
phân tích là 1:1 t i δ Phổ 1H-NMR cho 2 tín hi u mũi đ n v i t l ớ ỉ ệ ệ ơ ạ H = 2.14 ppm và
6.15 ppm. T i δạ H = 2,14 ppm là vùng tín hi u c a nhóm CH ệ ủ i δạ H =6,15 ppm là 3 tín hi uệ
c a vòng th m. ủ ơ
ng t δ Phổ 13C-NMR cho 4 tín hi u cacbon vòng th m trong vùng t ệ ơ tr ừ ườ ừ C =100.5
ppm đ n 159.2 ppm, m t tín hi u c a nhóm methyl g n trên vòng th m t i δ ệ ủ ế ắ ơ ộ ạ C = 21.3 ppm .
So sánh d li u ph c a h p ch t LP1 v i orcinol nh n th y có s t ổ ủ ợ ữ ệ ự ươ ậ ấ ấ ớ ng đ ng. Do ồ
đó đ ngh h p ch t LP1 là orcinol v i công th c nh sau ị ợ ứ ư ề ấ ớ
[18]
So sánh d li u ph c a LP1 và Orcinol ổ ủ
ữ ệ
Orcinol (LP1)
ORCINOL (Aceton – d6)
B ng . ả LP1 (Acetone – d6)
V trí ị
6.14 (s) 6.15 (s)
6.14 (s) 6.15 (s)
140.4 108.2 159.2 100.5 159.2 108.2 21.3 139.2 107.1 158.3 99.8 158.3 107.1 21.2
6.14 (s) 2.14 (s) - - 6.15 (s) 2.14 (s) 8.10 (s) 8.10 (s)
3.2.2. H p ch t LOBA1 1 2 3 4 5 6 7 3- OH 5 - OH ợ ấ
- Tinh th hình kim, màu tr ng. ể
ắ (cid:176) C ệ ộ - Nhi t đ nóng ch y: 144 - Ph ổ 1H-NMR: Ph l c 3. ả ụ ụ
- Ph ổ 13C-NMR: Ph l c 4. ụ ụ
Phổ 1H-NMR c a h p ch t LOBA1 ủ ợ ấ cho tín hi uệ mũi đ n ơ c a m t ộ nhóm methyl g nầ ủ
methoxyl t nhóm –COO- ở δH = 2.45 ppm, m t nhóm ộ iạ δH = 3.91 ppm, hai tín hi u mũi đôi-đôi ệ
c aủ proton vòng th mơ ghép meta t iạ δH 6.14 (1H, 2.1 Hz) và 6.17 (1H, 2.1 Hz).
Trang
- t
ng t Phổ 13C-NMR cho 6 tín hi uệ carbon c a vòng th m trong vùng t ủ ơ tr ừ ườ ừ δC =
- t
101.6 ppm đ nế 166.2 ppm, m t tín hi u c a nhóm –COO ộ ủ ệ ủ i ạ δC 172.9 ppm và tín hi u c a ệ
carbon methyl g n nhóm –COO ầ i ạ δC 24.1 ppm.
So sánh d li u ph c a h p ch t LOBA1 v i ữ ệ ổ ủ ớ methyl orsellinate nh n th y có s ấ ậ ấ ợ ự
ng đ ng. Do đó đ ngh h p ch t LOBA1 là t ươ ị ợ ề ấ ồ methyl orsellinate v i công th c nh sau ớ ứ ư
[15]
Methyl orsellinate (LOBA1)
B ng .
ả
So sánh d li u ph c a h p ch t LOBA1 v i Methyl orsellinate ấ
ổ ủ ợ
ớ
ữ ệ LOBA1 (Acetone – d6)
Methyl orsellinate (Methanol – d4) V trí ị
1 105.3 106.0
2 163.4 163.9
3 101.9 101.6 6.23 (1H, d, 2.5 Hz) 6.14 (1H, d, 2.1 Hz)
4 166.4 166.2
5 112.7 112.3 6.28 (1H, d, 2.5 Hz) 6.17 (1H, d, 2.1 Hz)
6 144.2 144.8
7 172.9 173.6
8 24.1 2.45 (s) 2.40 (s) 24.5
2 - OH 11.58 (s)
3.91 (s) 52.1 3.86 (s) 52.3 7 – OCH3
0C.
3.2.5. H p ch t LOBA 9 ấ ợ
ể ệ ộ
- Tinh th màu tr ng. ắ - Nhi t đ nóng ch y: 144 ả - Ph ổ 1H-NMR : Ph l c 5. ụ ụ
- Ph ổ 13C-NMR : Ph l c 6. ụ ụ
3 g n nhóm –COO- t
i Phổ 1H-NMR cho m t tín hi u mũi đ n c a nhóm CH ủ ệ ộ ơ ầ ạ δH =
3 n m g n 2 nhóm –OR t
2.45 ppm, 1 tín hi u mũi đ n c a nhóm CH i ủ ệ ơ ằ ầ ạ δH = 2.05 ppm, 1 tín
3 t
hi u mũi đ n c a nhóm –OCH i ơ ủ ệ i ạ δH = 3.92 ppm, 1 tín hi u OH ki m n i t ố ạ δH = 11.98 ppm ệ ề
i vùng δH 6.35 ppm. và m t tín hi u c a pronton H-5 t ệ ủ ộ ạ
ng δC=101 - Phổ 13C-NMR cho 6 tín hi uệ carbon c a vòng th m trong vùng t ủ ơ tr ừ ườ
- t
3 t
166 ppm, m t tín hi u c a nhóm –COO ệ ủ ộ i ạ δC 173.2 ppm, 1 tín hi u c a nhóm –OCH ệ ủ i ạ δH =
Trang
i vòng th m t i 57.7 ppm và hai tín hi u c a nhóm methyl g n t ệ ủ ắ ạ ơ ạ vùng δH = 2.43 ppm và δH =
2.05 ppm. So sánh d li u ph c a h p ch t LOBA9 v i ổ ủ ợ ữ ệ ấ ớ methy -orcinolcarboxylate nh n th y ấ ậ
có s t ng đ ng. Do đó đ ngh h p ch t LOBA9 là m ự ươ ị ợ ề ấ ồ ứ ethy -orcinolcarboxylate v i công th c ớ
Methy -orcinolcarboxylate (LOBA9)
nh sauư
B ng .
ả
So sánh d li u ph c a h p ch t LOBA9 v i ổ ủ ợ
ữ ệ
ấ
ớ methy -orcinolcarboxylate[22]
Methy -orcinolcarboxylate (CDCl3) LOBA9 ((CH3)2CO) V trí ị
1 104.5 105.2
2 163.7 163.1
3 109.2 108.6
4 160.6 158.1
5 111.2 6.35 (s) 6.20 (s) 110.6
6 140.2 140.2
7 173.2 172.6
8 23.8 2.45 (s) 2.43 (s) 24.0
9 7.7 2.10 (s) 2.05 (s) 7.6
12.02 (s) 2 – OH 11.98 (s)
5.39 (s) 4 – OH
3.92 (s) 3.92 (s) 51.7 51.8 7-OCH3
3.2.3. H p ch t LOBA 5A ấ ợ
- Tinh th hình kim màu tr ng. ể ắ
0C.
t đ nóng ch y : 183 ả
- Nhi ệ ộ - -23,9 (CHCl3) - Ph ổ 1H-NMR : Ph l c 7. ụ ụ
- Ph ổ 13C-NMR : Ph l c 8. ụ ụ
Trang
Phổ 1H-NMR cho các tín hi u t p trung t ệ ậ ừ δH = 0.8 ppm đ n ế 2.1 ppm, 1 tín hi u mũi ệ
đa c a proton H-3 t i ủ ạ δH 3.97 ppm và hai tín hi u mũi đôi-đôi c a hai proton H-22 và H-23 t ủ ệ ạ i
δH 5.15 ppm và δH 5.23 ppm. Đây là các tín hi u đ c tr ng c a h p ch t sterol có khung s ệ ủ ợ ư ặ ấ ườ n
i stigmasterol. Ngoài ra, phổ 1H-NMR còn cho 2 tín hi u proton olefin H-6 và H-7 t ệ ạ δH 6.49
ppm và δH 6.23 ppm.
i Ph ổ 13C-NMR cho các tín hi u đ c tr ng c a carbon C-3 có g n OH t ủ ư ệ ắ ặ ạ δC = 66.6
i ppm, hai tín hi u c a C-22 và C-23 t ệ ủ ạ δC = 135.4 ppm và 132.5 ppm và tín hi u c a 2 carbon ệ ủ
olefin C-6, C-7 t i ạ δC = 135.6 ppm và 130.9 ppm. Đ c tr ng c a h p ch t sterol có khung s ủ ợ ư ấ ặ ườ n
stigmasterol. Tuy nhiên, t c p có g n – i ạ δC = 79.6 ppm và 82.3 ppm có 2 tín hi u 2 carbon t ệ ứ ấ ắ
So sánh d li u ph c a h p ch t LOBA5A v i ổ ủ ợ
ữ ệ
ớ ergosterol-5,8-peroxide nh nậ
ấ
th y có s t
ng đ ng. Do đó đ ngh h p ch t LOBA5A là
ự ươ
ấ
ị ợ
ề
ấ
ồ
ergosterol-5,8-peroxide v iớ
công th c nh sau.
ứ
ư
O–.
Ergosterol-5,8-peroxide (LOBA5A)
Trang
B ng .
ả
So sánh d li u ph c a h p ch t LOBA5A v i ổ ủ ợ
ấ
ớ Ergosterol-5,8-peroxide[8]
ữ ệ LOBA5A (chlorofrom – d6)
Ergosterol-5,8-peroxide (chlorofrom – d6) V trí ị
1 34.9 34.9
2 30.3 30.3
3.97 (m) 3.89 (m) 3 66.6 66.6
4 37.1 37.1
5 82.3 82.4
6.23 (d, 8.5 Hz) 6 135.6 135.7
6.49 (d, 8.5 Hz) 6.48 (d, 8.6 Hz) 7 130.9 130.9
8 79.6 79.6
9 51.3 51.3
10 37.1 37.2
11 23.6 23.6
12 39.5 39.6
13 44.7 44.8
14 51.9 51.9
15 20.8 20.8
16 28.8 28.8
17 56.4 56.4
18 13.0 0.82 (s) 0.80 (s) 13.1
19 18.3 0.87 (s) 0.86 (s) 18.4
20 39.8 39.9
21 21.0 1.00 (d, 7 Hz) 0.98 (d, 6.6 Hz) 21.1
5.12 (dd, 15.4, 8.05 Hz) 22 135.4 5.15 (dd, 15.5, 8.0 Hz) 135.4
5.20 (dd, 15.2, 7.5 Hz) 23 132.5 5.23 (dd, 15.5, 7.5 Hz) 132.5
24 42.9 43.0
25 33.2 33.3
Trang
0.81 (d, 6.6 Hz) 26 0.81 (d, 6.5 Hz) 19.9 19.9
0.82 (d, 6.5 Hz) 0.81 (d, 6.6 Hz) 27 20.1 20.2
0.91 (d, 7.0 Hz) 0.89 (d, 7.0 Hz) 28 17.7 17.8
Trang
3.2.4. H p ch t LOBA7 ấ ợ
- Tinh th hình kim màu tr ng ể ắ
- Nhi t nóng ch y ệ ả : 2500C.
- Ph ổ MS : Ph l c 9. ụ ụ
- Ph ổ 1H-NMR : Ph l c 10. ụ ụ
- Ph ổ 13C-NMR : Ph l c 11. ụ ụ
- Ph ổ HMBC : Ph l c 12. ụ ụ
i vùng δH = 2.30 Phổ 1H-NMR c a h p ch t LOBA7 cho ợ ủ ấ tín hi uệ hai nhóm methyl t ạ
ppm và 2.56 ppm. Và hai tín hi u mũi đ n c a hai nhóm methoxy t i vùng δH = 4.0 ppm và 3.7 ơ ủ ệ ạ
ppm đ c tr ng cho khung depside – depsidone. Ngoài ra ph ư ặ ổ 1H-NMR cho ba tín hi u proton ệ
i vùng δH = 10.5 ppm. i ạ δH 6.4 ppm, 6.7 ppm, 7.8 ppm và tín hi u c a m t nhóm -CHO t t ệ ủ ộ ạ
ng t Ph ổ 13C-NMR cho tín hi u c a 15 carbon trong vùng t ủ ệ tr ừ ườ ừ δC = 103 ppm đ nế
169 ppm c a khung depside – depsidone. Ngoài ra, t i vùng t ủ ạ tr ừ ườ ủ ng cao cho tín hi u c a ệ
- t
i nhóm –CH3 g n trên vòng th m và g n 2 nhóm -OR t ắ ầ ơ ạ δC = 9.3 ppm và m t tín hi u c a – ủ ệ ộ
CH3 g n trên vòng th m và g n m t nhóm –COO ắ ầ ơ ộ i ạ δC = 22.4 ppm.
S c ký l p m ng c a h p ch t LOBA7 cho m t v t màu vàng có UV khi hi n hình ộ ế ủ ệ ấ ắ ợ ỏ ớ
b ng vanillin, là v t đ c tr ng c a h p ch t depsidone. Đ ng th i ph MS có m/z = 401 mu ằ ủ ợ ế ặ ư ấ ồ ờ ổ
phù h p v i công th c phân t C ứ ớ ợ ử 20H16O9 c a h p ch t có khung depsidone. ấ ủ ợ
3 có t
T ng quan HMBC cho th y proton c a nhóm –OCH ng quan v i m t carbon ươ ủ ấ ươ ớ ộ
-.
methine, đ ng th i proton c a nhóm methine này cũng cho t ng quan v i nhóm –COO ủ ồ ờ ươ ớ
So sánh d li u ph c a h p ch t LOBA7 v i ữ ệ ổ ủ ớ methylstictic acid nh n th y có s ấ ậ ấ ợ ự
ng đ ng. Do đó đ ngh h p ch t LOBA7 là t ươ ị ợ ề ấ ồ methylstictic acid v i công th c nh sau ớ ứ ư
Methylstictic acid (LOBA7)
B ng . ả So sánh d li u ph c a h p ch t LOBA7 v i ổ ủ ợ ữ ệ ấ ớ methylstictic acid[16]
V trí ị Methylstictic acid (chlorofrom – d6) LOBA7 (chlorofrom – d6)
Trang
1 114.5 113.9
2 162.9 160.1
3 115.1 114.6
4 163.7 163.6
5 112.1 6.74 (s) 6.73 (s) 112.0
6 151.5 151.7
7 160.9 169.3
8 22.4 2.56 (s) 2.54 (s) 22.1
9 187.0 10.50 (s) 10.47 (s) 187.3
1’ 107.9 107.2
2’ 152.6 152.0
3’ 121.6 121.4
4’ 149.6 149.3
5’ 132.2 131.6
6’ 138.7 132.2
7’ 169.7 169.0
8’ 103.1 6.401(s) 6.38 (s) 102.3
9’ 9.3 2.30 (s) 2.27 (s) 9.1
56.8 3.97 (s) 3.95 (s) 56.5 4-OCH3
7.90 (s) 2’-OH 7.87 (brs)
58.0 3.70 (s) 3.68 (s) 57.5 8’-OCH3
Trang
4. K T LU N Ậ Ế
T 1,4 kg đ a y Lobaria Pulmonaria (Lobariacea) ừ ị ở ỉ ề t nh Lâm Đ ng, chúng tôi đã đi u ồ
ch 140g cao chia thành các phân đo n. T cao thô ban đ u ti n hành s c ký c t v i h dung ộ ớ ệ ừ ế ế ạ ắ ầ
môi tăng d n, thu đ c 6 phân đo n cao: n-Hexan, EA1, EA2, EA3, EA4, Me. ầ ượ ạ
c 4 h p ch t là: ừ ậ ượ ấ ợ
T cao EA1 chúng tôi đã cô l p đ Orcinol (LP) Methyl orsellinate (LOBA1) Methy -orcinolcarboxylate (LOBA9)
Ergosterol-5,8-peroxide (LOBA5A)
T cao EA2 chúng tôi đã cô l p đ c 1 h p ch t là: ậ ượ ừ ấ ợ
Methylstictic acid (LOBA7)
Vì gi i h n c a đ tài nên chúng tôi m i ch kh o sát cao EA1, EA2. Trong t ng lai ớ ạ ủ ề ả ớ ỉ ươ
chúng tôi s ti p t c kh o sát các cao còn l ẽ ế ụ ả ạ i nh m tìm các h p ch t có ho t tính sinh h c. ấ ạ ằ ợ ọ
TÀI LI U THAM KH O Ả Ệ
[1]. Anne Bauwens, 2003, les lichens et la qualité de l’air, ULC-Université catholique de
Louvain, 1-45.
[2]. Antonio G. Gonzalez, Jaime Bermejo Barrrera, Elsa Ma Rodriguez and Consuelo
E.Hernandez Padron. 1994, Depsidones from Lobaria pulmonaria and their
chemotaxonomic importance, Biochemical Systematics and Ecology, Vol. 22, No. 6, 583–
586.
[3]. Basak Karakus, Fehmi Odabasoglu, Ahmet Cakir, Zekai Halici, Yasin Bayir, Mesut Halici,
Ali Aslan and Halis Suleyman, 2009, The effects of methanol extract of Lobaria
pulmonaria, a lichen species, on indometacin – induced gastric mucosal damage, oxidative
stress and neutrophil infiltration. Phytotherapy Research, Vol. 23, 635–639.
[4]. Bibiana Moncada, Robert Lucking and Luisa Betancourt – Macuase,2013, Phylogeny of the
Lobariaceae (lichenized Ascomycota: Peltigerales) with a reappraisal of the genus
Lobariella, The Lichenologist, Vol. 45, No. 2, 203–263.
[5]. Boris Pejin, Giuseppina Tommonaro, Carmine Iodice, Vele Tesevic, Vlatka Vajs, and
Salvatore De rose, 2012, A new lichen depsidone from Lobaria pulmonaria, Digest
Journal of Nanomaterial and Biostructures, Vol. 7, No. 4, 1663–1666.
Trang
[6]. Chicita F. Culberson, 1967, The structure of scrobiculin, a new lichen depside in Lobaria
scrobiculata and Lobaria amplissima, Phytochemistry, Vol 6, No. 5, 719–725.
[7]. Chicita F. Culberson, 1969, Chemical studies in the genus Lobaria and the occurrence of a
new tridepside, 4-O-methylgyrophic acid, American Bryological and Lichenological
Society, Vol. 72, No. 1, 19–27.
[8]. Fadime Atalay, Mesut Bunyami Halici, Ahmet Mavi Ahmet Cakir, 2011, Antioxidant
phenolics from Lobaria pulmonaria (L.) Hoffm and Usnea longissima Ach. lichen species,
Turk. J. Chem. Vol. 35, 647–661.
[9]. Fehmi Odabasoglu, Ali Aslan, Ahmet Cakir, Halis Suleyman, Yacin Karagoz, Mesut Halici
and Yasin Bayir, 2004, Comparison of antioxidant activity and phenolic content of three
lichen species, Phytotherapy Research, Vol. 18, 938–941.
[10]. Geiser L, McCune B., 1997, Macrolichens of the Pacific Northwest, Oregon State
University Press.
[11]. H. Suleyman, F. Odabasoglu, A. Aslan, A. Cakir, Y. Karagoz, F. Gocer, M. Halici and Y.
Bayir, 2003, Anti-inflammatory and antiulcerogenic effects of the aqueous extract of
Lobaria pulmonaria (L). Hoffm, Phytomedicine, Vol. 10, No. 6, 552–557.
[12]. Http://www.irishlichens.ie, (22/02/2014)
[13]. John A. Elix and Tor Tonsberg, 2006, Notes on the chemistry of Scandinavian Lobaris
species, Graphis Scrippta, Vol. 18, 27–28.
[14]. Luo, Heng, Yoshikazu Yamamoto, Yanpeng Liu, Jae Sung Jung, Hyung-Yeel Kahng, Young
Jin Koh and Jae-Seoun Hur, 2010, The in vitro antioxidant properties of Chinese highland
lichens, Journal of Microbiology and Biotechnology, Vol. 20, No. 11, 1524–1528.
[15]. LI Xue-Feng, JIN Hui-Zi, YANG Ming, CHEN Gang, ZHANG Wei-Dong, 2008, A New
Methyl Orsellinate Glycoside from the Aerial Parts of Rhododendron primulaeflorum,
Chinese Journal of Natural Medicines, Vol. 6, 336-338.
[16]. Panagiota Papadopoulou , Olga Tzakou , Constantinos Vagias , Panagiotis Kefalas and
Vassilios Roussis, 2007, β-Orcinol Metabolites from the Lichen Hypotrachyna revoluta,
Vol. 12, 997-1005
[17]. Pascale Tiévant, 2001, Guide des lichens, Delachaux et Niestlé, Vol. 1, 1-302.
[18]. S. Huneck, I. Yoshimura, 1996, Identification of Lichen Substances , Springer.
[19]. Siegfried Huneck, Isao Yoshimura, 1977, Identification of lichen substances, Springer –
Verlag Berlin Heidelberg, 1–498.
Trang
[20]. The European Agency for the evaluation of medicinal products, 1999, Committee for
veterinary medicinal products, 1-2.
[21]. Thomas Schneider, Emanuel Schmid, João V. de Castro Jr., Massimiliano ardinale, Leo
Eberl, Martin Grube, Gabriele Berg and Kathrin Riedel, 2011, Structure and function of
the symbiosis partners of the lung lichen (Lobaria pulmonaria L. Hoffm) analyzed by
metaproteomics, proteomics 2011, Vol. 11, 2753
[22]. Tr ươ ễ ng Bích Ngân, Ph m Văn C ng, Doel D. Soejarto, Đoàn Th Mai H ng, Nguy n ườ ươ ạ ị
Văn Hùng, 2009, Nghiên c u thành ph n hóa h c cây m c h ng lá dài, T p chí Hóa ộ ươ ứ ầ ọ ạ
h cọ , T. 47 (4A), 405 - 408
[23]. William C. Denison, 1988, Culturing the lichen Lobaria oregano and L.pulmonaria on
nylon monofilament, The New York Botanical Gaden, Vol. 80, No. 6, 811.
Trang
PH L C Ụ Ụ
Trang
1. Ph l c 1 ụ ụ
2. Ph l c 2 ụ ụ
Trang
3. Ph l c 3 ụ ụ
4. Ph l c 4 ụ ụ
Trang
5. Ph l c 5 ụ ụ
6. Ph l c 6 ụ ụ
7. Ph l c 7 ụ ụ
Trang
8. Ph l c 8 ụ ụ
Trang
9. Ph l c 9 ụ ụ
Trang
10. Ph l c 10 ụ ụ
Trang
11. Ph l c 11 ụ ụ
12. Ph l c 12 ụ ụ
Trang
Trang
