Báo cáo môn học CNCB Thịt & Thủy sản: Ứng dụng áp suất cao trong bảo quản và chế biến thịt

Chia sẻ: Nguyen Thi My Hanh | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:52

Thêm vào BST

Báo xấu

161
lượt xem 31
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Báo cáo môn học CNCB Thịt & Thủy sản với đề tài "Ứng dụng áp suất cao trong bảo quản và chế biến thịt" trình bày nghiên cứu bảo quản và chế biến thịt bằng phương pháp sử dụng áp suất cao nhằm giúp công tác bảo quản và chế biến thịt đạt năng suất và chất lượng thực phẩm cao hơn.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Báo cáo môn học CNCB Thịt & Thủy sản: Ứng dụng áp suất cao trong bảo quản và chế biến thịt

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP. HỒ CHÍ MINH KHOA KĨ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BÁO CÁO MÔN HỌC CNCB THỊT & THỦY SẢN Đề tài ỨNG DỤNG ÁP SUẤT CAO TRONG BẢO QUẢN VÀ CHẾ BIẾN THỊT GVHD: Th.S Nguyễn Thị Hiền SVTH : HC07TP NĂM HỌC 2010- 2011 1
MỞ ĐẦU Theo xu hướng toàn cầu hóa, các nhà sản xuất các sản phẩm thịt đang phải cạnh tranh gay gắt với nhau. Để giữ vững và nâng cao vị trí c ủa h ọ, các công ty thực phẩm và thịt cần quan tâm đến sự thay đổi trong thói quen mua s ắm và tiêu thụ sản phẩm của người tiêu dùng, cũng như quan điểm và nhu cầu của họ. Nhu cầu của người tiêu dùng thay đổi liên tục nh ưng m ột vài quan đi ểm chính không thay đổi. Nhìn chung, người tiêu dùng luôn đòi h ỏi ch ất l ượng cao và sự tiện dụng của các sản phẩm thịt, với mùi vị tự nhiên. Bên c ạnh đó, h ọ còn yêu cầu sự an toàn và các sản phẩm phải tự nhiên không bổ sung ph ụ gia nh ư các chất bảo quản, chất giữ ẩm… Để đáp ứng tất cả những yêu cầu này mà không làm gi ảm đ ộ an toàn th ực phẩm cần phải áp dụng các công nghệ mới trong công nghi ệp th ực ph ẩm nói chung và trong công nghiệp thịt nói riêng. Hơn nữa, các s ản ph ẩm th ịt đóng gói chân không dạng lát mỏng và dạng ướp là những dòng s ản ph ẩm có nhu c ầu gia tăng rất cao trong vài năm gần đây. Những sản phẩm này có kh ả năng nhi ễm khuẩn trước khi đóng gói. Vì thế, giải pháp c ần thi ết là ứng d ụng các k ỹ thu ật mới cho các dòng sản phẩm trên. Hiện nay, m ột vài công ngh ệ m ới đang đ ược nghiên cứu trong đó áp suất cao là m ột ph ương pháp có ti ềm năng ứng d ụng r ất cao. Áp suất cao là một kỹ thuật rất hứa hẹn đối với các sản ph ẩm th ịt và nó cho thấy tiềm năng trong việc phát triển các dòng sản ph ẩm m ới tiêu th ụ ít năng lượng. 2
1. Lịch sử phát triển: Giáo sư PW Bridgman (1914), một người tiên phong trong v ật lý áp su ất cao, báo cáo về albumin lòng trắng trứng và lòng đ ỏ b ị đông t ụ d ưới áp su ất th ủy tĩnh cao 500-600 MPa mà không có sự phân rã của lớp vỏ. Điều này cho thấy rằng áp suất thủy tĩnh cao (cao áp) là một công cụ hữu ích cho ch ế bi ến th ực ph ẩm thay vì xử lý nhiệt. Tuy nhiên ứng dụng của áp suất cao đ ể ch ế bi ến th ực ph ẩm đã gần như bỏ qua cho đến khi sự khởi đầu của dự án "Phát tri ển áp su ất cao lên men sử dụng Dense-Mass" được hỗ trợ bởi Bộ Nông nghiệp, Lâm nghi ệp và Thuỷ sản (1989) tại Nhật Bản . Đặc biệt, các nhà khoa học về thịt ở Úc đã ti ến hành áp dụng áp suất cao kể từ đầu những năm 1970 (Macfarlane 1973; Bouton, Ford, Harris, Macfarlane, O'Shea 1977). Kể từ khi khởi phát của các dự án tại Nhật Bản, việc áp dụng áp suất cao để chế biến thực phẩm đã thu hút nhi ều s ự chú ý ở Nhật Bản và Châu Âu bởi vì những thay đ ổi trong đ ặc tính c ủa nguyên liệu thực phẩm gây ra bởi áp suất trong các ph ương th ức khác nhau t ừ nhi ệt (Cheftel 1992 ; Hayashi 1992; Johnston 1995; Knorr 1996). M ột s ố loại th ực ph ẩm được chế biến bằng việc sử dụng áp suất đã có m ặt trên thị trường. (Suzuki 2002). Nhìn chung, áp suất cao sử dụng trong khoảng 100-600 MPa tại nhi ệt đ ộ phòng. Áp suất cao làm phá hủy các tế bào sinh d ưỡng c ủa vi khu ẩn và vô ho ạt enzyme, nhưng không làm thay đổi đặc điểm bề ngoài của sản ph ẩm và gi ữ l ại một số vitamins. Tuy nhiên, khả năng chịu đựng của vi sinh vật rất khác nhau ph ụ thuộc vào giống và loại thịt được xử lý. Ảnh hưởng c ủa x ử lý áp su ất cao cũng phụ thuộc vào áp suất sử dụng, nhiệt độ và thời gian. Sử dụng áp su ất cao có th ể gây ra những biến đổi đặc biệt về cấu trúc của sản phẩm và kh ả năng này có th ể được sử dụng để phát triển một dòng sản phẩm mới hoặc gia tăng ch ức năng c ủa một số thành phần nào đó. Vì thế, để có thể áp dụng kỹ thuật này trên quy mô công nghi ệp v ới các nghiên cứu từ phòng thí nghiệm cần tiến hành: Thi ết l ập các đi ều ki ện x ử lý t ốt 3
nhất cho mỗi loại sản phẩm. Kết hợp áp suất cao với các hệ th ống đóng gói m ới, các chất kháng khuẩn có nguồn gốc tự nhiên, enzyme… 2. Ảnh hưởng của áp suất cao trong công nghiệp thịt Ảnh hưởng của áp suất cao lên các thành phần dinh dưỡng trong thịt Thịt là môi trường tốt cho sự phát triển của vi sinh vật, thành ph ần hóa h ọc của thịt chủ yếu là nước, protein (15-21%), chất béo (0,5-25%), các vitamin (giàu vitamin nhóm B) và các oligonutrient. Theo quan đi ểm vật lý, khi gia tăng áp su ất sẽ có một ảnh hưởng vật lý lên các phân tử làm chúng ti ến lại g ần nhau h ơn d ẫn đến sự chuyển pha, sự chuyển pha này có thể đ ảo ngược l ại sau khi gi ảm áp. Điều này là những gì đã xảy ra với nước và chất béo. Theo quan điểm hóa học, áp suất cao tác động nhẹ hơn so với nhiệt độ. Các liên kết c ộng hóa tr ị không b ị phá vỡ nhưng các liên kết yếu như liên kết hydro và liên k ết k ỵ nước có th ể b ị bi ến đổi bất thuận nghịch (Cheftel, 1995). Ảnh hưởng của áp suất lên nước chủ yếu bao gồm sự giảm nhi ệt đ ộ nóng chảy và gia tăng sự ion hóa dẫn đến sự giảm pH. Những bi ến đ ổi này là thu ận nghịch theo áp suất. Nhưng chúng góp phần làm bi ến đ ổi nh ững đ ặc đi ểm c ủa sản phẩm được xử lý áp suất cao. Calpastatin bị ức chế tại áp suất t ừ 200MPa tr ở lên trong khi calpain bị thoái hóa ở áp suất trên 400MPa. Tại áp suất thấp hơn 200MPa các lysosome bị phá vỡ, kh ả năng t ự phân gia tăng và thịt mềm hơn. Cathepsin H và aminopeptidase b ị vô ho ạt ở áp su ất t ừ 200MPa trở lên và cathepsin D bị vô hoạt khi áp suất đạt t ới 500MPa (Montero & Gomez-Guillen, 2002). Các vitamin và đường trong thịt không b ị bi ến đ ổi b ởi áp suất cao nhưng các polysaccharide có thể bị bi ến đ ổi. Nhìn chung, s ự hình thành gel bị ức chế bởi áp suất cao vì áp suất cao có thể bi ến đ ổi nhi ệt đ ộ chuy ển pha từ sol đến gel. Sự đông lại có thể được tạo ra bởi áp suất và sau đó gel t ạo thành sẽ mềm và sáng hơn.. Cấu trúc chính của protein bị ảnh h ưởng nh ẹ bởi áp su ất cao, sự biến đổi các liên kết yếu có thể làm bi ến tính protein ho ặc ng ược l ại làm 4
hoạt hóa enzyme. Các ảnh hưởng này rất khác nhau phụ thuộc vào lo ại protein và điều kiện của quá trình xử lý. Áp suất cao mang lại sự chuyển pha thuận nghịch cho lipid t ừ l ỏng thành rắn dẫn đến sự đông lại. Nếu là một hỗn hợp lipid, áp suất cao có th ể t ạo ra s ự phân tách các pha khác nhau bằng việc phá h ủy các tế bào membrane. Cheah và Ledward (1996) cũng nghiên cứu các ảnh hưởng của áp suất về quá trình oxy hóa chất béo trong cơ bắp băm nhỏ. Trên cơ sở dựa vào số đo c ủa acid thiobarbituric (TBA), họ chỉ ra rằng trị giá TBA không tăng trong c ơ bắp băm nh ỏ ti ếp xúc v ới áp suất cao lên đến 200 MPa, sau đó hơi tăng lên khi áp suất là 300 MPa, và tăng rõ rệt khi 800 MPa. Áp suất cao trên 300 MPa đến 400 MPa s ẽ làm gi ảm myoglobin và oxymyoglobin, Fe2+ myoglobin trở thành Fe3+ metmyoglobin và protein globin bị biến tính., từ đó làm gia tăng quá trình oxy hóa lipid. Ngoài ra, nguyên nhân của sự gia tăng còn có thể do các kim lo ại trong th ịt n ằm trong các muối phospholipids hoặc muối acid hữu cơ với kim lo ại. Vì th ế trong quá trình áp suất cao, các ion kim loại (có thể là Fe và Cu) đã gi ải thoát ra kh ỏi các ph ức ch ất này và xúc tác phản ứng oxy hóa chất béo. Ho ặc s ự gia tăng oxy hóa ch ất béo trong thịt ở áp suất cao có thể do sự thay đổi c ấu tạo c ủa hemoprotein làm b ộc l ộ các nhóm heme xúc tác oxy hóa chất béo. Ngược lại, Orlien và Hansen (2000) đã báo cáo quá trình oxy hóa lipid ở áp suất cao không liên quan đ ến vi ệc gi ải phóng các nonheme sắt hay hoạt tính xúc tác c ủa metmyoglobin, nh ưng có th ể liên quan đến sự phá hủy membrane. Theo Cheftel và Culioli (1997), sự oxy hóa gây ra bởi áp su ất có th ể đ ược hạn chế các quá trình công nghệ cho các sản phẩm th ịt, b ằng cách đóng gói s ản phẩm hay sử dụng các chất chống oxy hóa. Loại bỏ oxy hoặc thêm dioxide carbon (CO2) trước khi xử lý áp suất cao để ngăn chặn quá trình oxy hóa lipid. Ảnh hưởng của áp suất cao đến độ mềm thịt Khi một con vật được giết mổ, quá trình co c ứng s ẽ phát tri ển trong vòng vài giờ với sự co của các sợi cơ và làm tăng độ nhớt của thịt. Miếng th ịt sau đó s ẽ mềm nhưng hương vị bị giảm sút đáng kể, và thịt đó thì không phù h ợp cho n ấu ăn và chế biến vì độ nhớt cao và khả năng giữ nước thấp. Nếu th ịt đ ược gi ữ ở nhiệt độ thấp trong một vài ngày, thịt trở nên mềm mại và gi ữ trạng thái đó trong 5
vài tuần tiếp theo. Vì vậy, quá trình sử dụng rộng rãi nh ất cho th ịt v ới c ải ti ến của hương vị và mùi được gọi là conditioning và aging. Nếu những miếng thịt dai, đặt biệt là từ những con đ ộng vật già có th ể được làm mềm bởi áp suất cao thì áp suất cao có tiềm năng l ớn trong vi ệc t ận thu nguồn nguyên liệu từ thịt của các con vật già, tránh lãng phí. Một thử nghiệm để tăng độ mềm của thịt bởi áp suất cao l ần đầu tiên được thực hiện bởi Macfarlane (1973) ở Úc. Một điều rất quan trọng là ph ải l ựa chọn thời gian nào của thịt sau khi giết m ổ thích h ợp cho vi ệc áp d ụng áp su ất cao. 2.2.1. Ảnh hưởng của áp suất cao lên cơ trước giai đoạn tê cứng: Macfarlane (1973) đã thực hiện các phép đo khác nhau trên các c ơ Biceps femoris tại 100 MPa trong 2-4 phút. Kết quả cho th ấy các c ơ rút ng ắn kho ảng 35% so với các cơ không được xử lý áp suất. Tuy nhiên các phép đo l ực c ắt ch ỉ ra rằng áp suất làm tăng độ mềm của thịt. Kết quả nghiên cứu của Macfarlane cho thấy rằng việc s ử d ụng áp su ất cao trong vài phút ở nhiệt độ môi trường đã làm gi ảm l ực c ắt lên c ơ tr ước tê. Phương pháp làm tăng độ mềm cho thịt bởi áp suất cao cũng đã đ ược báo cáo trong các tài liệu của Macfarlane (Macfarlane, Mckenzie, Turner, và Jones năm 1981; Macfarlane và Morton 1978) và những người khác (Elgasim và Kennick 1982; Kennick, Elgasim, Holmes, và Meyer 1980; Riffero và Holmes 1983). 2.2.2. Ảnh hưởng của các quá trình xử lý nhiệt và áp su ất cao lên c ơ sau giai đoạn tê cứng Mặc dù việc sử dụng áp suất tác động lên c ơ trước tê c ứng là m ột cách hiệu quả trong việc xử lý độ dai của thịt. Quá trình còn có ti ềm năng áp d ụng cho thịt sau tê cứng. Bouton et al. (1977) chứng minh rằng c ơ sau tê c ứng c ủa trâu, bò sẽ không đạt được biến đổi như vậy khi sử dụng lực cắt t ương t ự, trừ khi s ử dụng áp suất cao ở nhiệt độ cao. Họ nói rằng khi áp suất là 150 MPa ở 60 oC trong 30 phút là cần thiết để cải thiện giá trị cắt. Locker và Wild (1984) cũng cho rằng áp suất- nhiệt (PH) có hiệu quả trong vi ệc gi ữ m ềm th ịt sau m ột th ời gian đáng kể tại một nhiệt độ cao. 6
Macfarlane (1985) đã trình bày một đề án bao gồm vi ệc áp suất làm phân giải các protein và mức độ mềm thịt bằng cách kết h ợp áp suất v ới nhi ệt đ ộ. Trong đề án của mình, các protein bị phân giải bởi áp suất cao là bi ến tính và không thể kết hợp bằng cách xử lý nhiệt, kết quả là làm m ềm th ịt. Vi ệc s ử d ụng PH thì hiệu quả trong việc khắc phục độ dai. Tuy nhiên, quá trình này có ảnh hưởng không tốt cho thịt do màu nâu tạo ra bởi áp suất và nhiệt. 2.2.3. Cải thiện độ mềm của cơ sau tê cứng bằng cách s ử dụng áp suất cao. Từ góc độ của các ứng dụng thương mại khi sử dụng áp suất cao, đ ộ mềm của cơ sau tê cứng thì quan trọng hơn c ơ trước tê c ứng. Suzuki, Kim, Honma, Ikeuchi, và Saito (1992) đo độ cứng và đ ộ đàn h ồi c ủa c ơ b ắp vai sau tê cứng thu được từ một con bò sữa già khi sử dụng áp suất cao t ừ 100-300 MPa trong 5 phút bằng máy Rheo Meter (Fudoh Công ty, Nh ật B ản. K ết qu ả cho th ấy không có sự khác biệt đáng kể nào về độ đàn h ồi. Đi ều này cho th ấy c ơ sau tê cứng có thể được làm mềm bằng áp suất cao mà không cần x ử lý nhi ệt. Vi ệc s ử dụng P-H trong thời gian dài được Macfarlane đề xuất (1985), còn nh ững ng ười khác (Bouton et al 1977;. Riffero và Holmes 1983) thì cho r ằng không c ần thi ết phải kết hợp với nhiệt độ trong việc làm mềm cơ sau tê c ứng n ếu áp su ất s ử dụng cao hơn so với trong thí nghiệm. 2.2.4. Cơ chế làm mềm và sự gia tăng những biến đổi của th ịt khi sử dụng áp suất cao Ta biết rằng thịt của con vật sau khi chêt sẽ bị mềm sau m ột kho ảng th ời gian nhất định do những thay đổi xảy ra trong c ơ, chủ yếu là do tác đ ộng c ủa các protease nội sinh: - Sự suy yếu của tương tác actin-myosin - Phân mảnh của tơ cơ thành các phân đoạn ngắn do Z-line tan rã - Sự thoái hóa của các sợi đàn hồi bao gồm connectin (còn gọi là titin) - Suy yếu của mô liên kết. Để làm rõ cơ chế gây ra áp suất làm mềm thịt hoặc việc tăng t ốc các bi ến đổi của thịt, các đối tượng sau đây đã được xem xét: 7
- Áp suất ảnh hưởng lên tương tác của actin-myosin - Áp suất ảnh hưởng đến sự phân mảnh của tơ cơ, - Áp suất ảnh hưởng đến sự chuyển đổi α-connectin thành β -connectin - Áp suất ảnh hưởng lên mô liên kết 2.2.4.1. Các ảnh hưởng từ sự tương tác của actin-myosin. Quá trình tương tác của actin-myosin và cơ c ấu c ủa các s ợi c ơ đ ược bi ến đổi trong thời gian con vật sau khi chết được minh ch ứng b ằng nh ững thay đ ổi trong hoạt tính ATPase của tơ cơ. Ouali (1984) báo cáo rằng ho ạt tính ATPase gia tăng tại cường độ ion thấp (khoảng dưới 0,2 M KCl), trong khi nó gi ảm ở nh ững cường độ cao hơn (0,3 M hoặc cao hơn) khi gia tăng th ời gian b ảo qu ản. Ông k ết luận rằng giá trị nghiêng (giá trị xác định s ự nh ạy c ảm với c ường đ ộ ion) có th ể là một thông số chỉ thị chính xác về m ức độ lão hóa c ủa c ấu trúc các s ợi c ơ và được thể hiện bằng các chỉ số sinh hóa của Miofibrillar Aging (BIMA). Nishiwaki, Ikeuchi, và Suzuki (1996) đo hoạt tính của ATPase (c ường đ ộ ion là khoảng 0,06-0,32 M KCl) của các c ơ được x ử lý bằng áp su ất cao (30-300 MPa, 5 phút) và ở 4oC trong 7 ngày. Sự thay đổi giá trị BIMA đ ược hi ển thị trong hình 8.1. Đối với cơ được xử lý như trên, giá trị BIMA tăng d ần v ới s ự gia tăng của thời gian lưu trữ và đạt khoảng 2,5 lần so với các c ơ c ủa con v ật ch ết (hình 8,1). Giá trị BIMA của các tơ cơ gia tăng khi tăng áp su ất lên 200 MPa và đ ạt đ ến mức giống như của các tơ cơ để ở 4oC trong 7 ngày. Tuy nhiên, khi áp suất cao hơn (300 MPa) sẽ làm sụt giảm đáng kể giá trị của BIMA. Sự thay đổi cấu trúc của các sợi mỏng gây ra bởi áp suất là y ếu t ố chính ảnh hưởng đến giá trị BIMA thu được trong các s ợi c ơ khi s ử d ụng áp su ất cao trong một thời gian ngắn (5 phút). Những thay đ ổi cấu trúc m ạnh m ẽ đ ược quan sát từ những sợi cơ được xử lý áp suất , những thay đ ổi đó không quan sát th ấy trong các sợi cơ không xử lý bằng áp suất. K ết quả này g ợi ý r ằng vi ệc áp d ụng áp suất cao cho các sợi cơ là nguyên nhân gây ra nh ững thay đ ổi trong ho ạt tính của ATPase và giá trị BIMA của các sợi cơ. 8
Hình 1: Ảnh hưởng của áp suất cao và thời gian lên giá trị BIMA 2.2.4.2. Ảnh hưởng đến sự phân mảnh của tơ cơ Các tơ cơ khi sử dụng các điều kiện đồng hóa thì ngắn hơn và t ạo ra những khúc cơ ngắn hơn là của những miếng thịt sau khi gi ết m ổ (Takahashi, Fukazawa, và Yasui 1967) và sự phá vỡ các tơ cơ tại Z-line thì liên quan đ ến s ự gia tăng đ ộ mềm thịt (Davey và Gilbert 1967; Fukazawa và Yasui 1967; Takahashi et al 1967). Do đó sự phân mảnh các sợi tơ cơ được coi là hữu d ụng đ ể d ự đoán s ự m ềm c ủa thịt (Calkins và Davis năm 1980; Olson, Parrish, và Stromer 1977). 9
Suzuki, Watanabe, Iwamura, Ikeuchi, và Saito (1990) cho th ấy m ức đ ộ phân mảnh trong tơ cơ từ các bắp thịt trâu, bò với áp suất (100-300 MPa, 5 phút) trong hình 8.2. Mức độ phân mảnh được thể hiện như tỷ lệ phần trăm c ủa s ố c ơ t ơ đoạn gồm 1-4 sarcomeres (khúc cơ) để tổng số tơ cơ dưới kính hi ển vi t ương phản pha. Mức độ phân mảnh, thì ít hơn 10% so với các c ơ bắp không đ ược x ử lý áp suất, đã được tăng tốc bằng cách tăng áp lên h ơn 30%, 70%, 80%, và 90% tương ứng tại 100, 150, 200, và 300 MPa. Mức độ phân mảnh, 80% đ ến 90%, trên mức tối đa của các phân mảnh của tơ cơ trong các c ơ t ự nhiên. T ừ các k ết qu ả của sự phân mảnh này là sự tiếp xúc ngắn của các c ơ sau tê c ứng trong đi ều ki ện áp suất cao có vẻ là hữu ích cho quá trình làm mềm thịt. Hình 2: Ảnh hưởng của áp suất cao lên mức độ phá vỡ tơ cơ Các yếu tố đặc trưng trong những báo cáo của Suzuki et al. (1990) đó là tác động của áp suất cao đến cấu trúc myofibrillar (s ợi c ơ t ơ) sau tê c ứng trong các bắp thịt trâu, bò. Trong tơ cơ được xử lý tại 100 MPa, quá trình co c ủa các sarcomere được quan sát, và sự khác biệt trong mật đ ộ gi ữa các A-band và I-band trở nên đồng nhất so với các mẫu bình thường (không qua xử lý). Đánh d ấu s ự vỡ 10
của cấu trúc dạng sợi của I-band và sự biến m ất c ủa các M-line đ ược quan sát trong tơ cơ của các cơ bắp tại tại áp suất 150 MPa. Trong t ơ c ơ c ủa các c ơ b ắp tại 200 MPa, mạch liên tục cấu trúc của sarcomere đã gần nh ư hoàn toàn b ị m ất, với tấm A-và I-sợi trải rộng trên các khúc c ơ này. S ự bi ến m ất c ủa M-line và s ự dày lên của Z-line, có thể là do sự co rút c ủa I-filament, đã đ ược quan sát. S ự phân tách của các A-band, thêm vào đó nhiều thay đổi đã được đề cập và được quan sát trong tơ cơ của các cơ bắp tại áp suất 300 MPa. Chiều dài c ủa các sarcomere(khúc cơ), được xử lý tại 100 MPa, dường nh ư đã dần dần ph ục h ồi với sự gia tăng áp suất, vì những mất mát ngày càng nhi ều c ủa k ết c ấu liên t ục. Như đã đề cập, phân mảnh của tơ cơ có nguồn gốc từ sự đ ứt đoạn c ủa t ơ c ơ t ại Z-line, trong khi các Z-line từ tơ cơ bị phân m ảnh trong các c ơ b ắp đ ược x ử lý áp suất vẫn còn nguyên vẹn. Mặc dù việc xử lý áp suất cho các cơ sau tê c ứng di ễn ra trong th ời gian ngắn (5 phút) và nhiệt độ thấp (khoảng 10 oC), thì sự thay đổi siêu cấu trúc (ultrastructure) của tơ cơ phù hợp với những báo cáo c ủa Macfarlane và Morton (1978) và Locker và Wild (1984). Việc áp dụng áp suất cao đ ược bi ết là ảnh hưởng của tình trạng kết hợp của cả hai actin và myosin, đó là nh ững thành ph ần chủ yếu của tơ cơ. Một số báo cáo mô tả sự khử polymer c ủa actin-F (Ikkai và Ooi 1966; Ivanov, Bert, và Lebedeva 1960; O'Shea, Horgan, và Macfarlane 1976), myosin polymer (Josephs và Harrington 1966, 1967, 1968), và actomyosin (Ikkai và Ooi 1969) dưới áp suất cao đã được công bố. Mặc dù nó không rõ li ệu s ự kh ử polymer của actin-F xảy ra trong cơ và sự suy thoái c ủa các s ợi-I. (t ức là, s ự kh ử polymer của F-actin do áp suất cao) có thể là m ột trong nh ững nguyên nhân c ủa sự phân mảnh. Một khả năng làm tăng tốc sự phân m ảnh c ủa t ơ c ơ và đông t ụ của các myofibrillar protein tại nơi phân tách đã đ ược Macfarlane đ ề ngh ị (1985) có thể làm tăng độ mềm của thịt khi sử dụng áp suất cao. Từ những quan sát và phân tích ultrastructural SDS-PAGE c ủa t ơ c ơ (d ữ liệu không được hiển thị, Suzuki et al 1990)., Cơ chế cho s ự rối lo ạn trong c ấu trúc liên tục của tơ cơ gây ra bởi áp suất trong các điều kiện khác nhau. 2.2.4.3. Ảnh hưởng từ sự chuyển đổi α-Connectin thành β - Connectin 11
Nghiên cứu gần đây cho thấy một cách rõ ràng rằng một protein, th ường được gọi là connectin (còn gọi là titin) duy trì tính đàn h ồi và tính ổn đ ịnh c ơ h ọc của cơ xương. Lúc chết, các α-connectin (khoảng 3.000 kDa) tồn tại cùng với một lượng nhỏ các phân đoạn phụ của nó, β-connectin (khoảng 2.000 kDa; Maruyama, Kimura, Yoshidomi, Sawada, và Kikuchi 1984; Wang, McClure và Tu 1979). Hình 3: Biểu diễn kết quả chạy điện di trong gel 2% polyacrylamide chứa 0,1% SDS và 0,5% agarose. Chú thích: - α = α-connectin - β = β-connectin - 1200k = 1200 kDa peptide 12
- N = nebulin - M = chuỗi myosin lớm Bởi vì khi sử dụng áp suất cao không tạo nên các chuỗi peptid , do đó nó được quan tâm để giải thích những nghi ngờ rằng tại sao vi ệc chuy ển đ ổi α- connectin thành β-connectin được gây ra bởi áp suất. Có hai lý thuyết về c ơ ch ế tách connectin; một là sự phân hủy protein bởi calpain (protease làm tăng ho ạt tính Ca2+) và cathepsin D (Kim et al 1993, 1995;. Suzuki, Kim, và Ikeuchi 1996), và hai là các phản ứng trực tiếp của ion Ca 2+ (Tatsumi, Hattori, và Takahashi năm 1996). Báo cáo của Kim et al. (1993) cho thấy rằng hiệu quả c ủa áp su ất cao lên các connectin trong isolated myofibrils (cơ riêng bi ệt) t ương t ự nh ư c ủa connectin trong cơ bắp, được quan sát những phân tích c ủa SDSPAGE. H ọ tìm th ấy hai lo ại chất ức chế protease, 1 mM leupeptin và 1 mM E64, hoàn toàn ngăn ch ặn s ự suy thoái của connectin (100-400 MPa cho 5 phút), m ặc dù các t ơ c ơ bên trong đ ều có sự hiện diện của 3mM CaCl 2. Như vậy giả thiết về sự suy thoái của connectin do tác động trực tiếp của các ion canxi dưới áp suất cao nh ư v ậy là không th ể xảy ra. Kết quả này chứng minh sự tham gia c ủa m ột s ố protease n ội sinh, đ ặc biệt là calpain, trong việc chuyển đổi α-connectin thành β-connectin. Điều này có thể được giải thích bằng cách giả sử rằng s ự m ẫm cảm c ủa connectin đối với calpain được tăng rõ rệt bởi vi ệc áp d ụng các áp su ất, nh ưng khả năng của calpain để thủy phân connectin được giảm dần với tăng áp su ất. Nó đã được chứng minh rằng áp suất cao 100 MPa ho ặc cao h ơn thì s ẽ làm tăng tính mẫm cảm đến quá trinh proteolysis (phân hủy Protein). B ởi vì n ồng đ ộ ion canxi trong dung dịch sarcoplasmic là gần tối ưu để kích ho ạt calpain do vi ệc hình hành từ lưới sarcoplasmic trong khi sử dụng áp suất cao (Suzuki, Okamoto, Ikeuchi, và Saito1993, 1994), mức độ chuyển đổi của α-connectin thành β-connectin được cho là chủ yếu liên quan đến sự phụ thuộc áp suất c ủa các thay đ ổi c ấu trúc c ủa α-connectin và sự vô hoạt của calpain. Cơ chế cho việc chia connectin dưới áp suất cao có lẽ là gi ống nh ư trong cơ suốt quá trình xử lý (Kim et al 1995). S ự gia tăng c ủa nh ững h ợp ch ất đ ược trích ly từ connectin có thể cho thấy được những thay đ ổi v ề ch ất l ượng c ủa c ấu trúc connectin trong cơ gây ra bởi áp suất (Suzuki et al 1987). 13
2.2.4.4. Ảnh hưởng của các mô liên kết Độ mềm của thịt thì phụ thuộc vào hai thành phần khác nhau: đ ộ dai và đ ộ dẻo dai của actomyosin. Độ dẻo dai của actomyosin là do các protein myofibrillar, trong khi độ dai do sự hiện diện của các mô liên kết. Nói chung, nó đ ược ch ấp nhận rằng những thay đổi của các mô liên kết trong quá trình b ảo quản th ịt thì thấp hơn so với những biến đổi trong myofibrillar protein. Một vài báo cáo mô tả những ảnh hưởng của áp suất đ ến mô liên k ết cũng như là đối với protein tơ cơ. Ratcliff, Bouton, Ford, Harris, và Macfarlane (1977) cho thấy rằng mặc dù sử dụng P-H có hiệu quả trong vi ệc lo ại b ỏ đ ược tính dai của tơ cơ (độ dai actomyosin), độ mềm của các mẫu được x ử lý thì đ ược h ạn chế bởi độ dai của các mô liên kết. Macfarlane et al. (1981) cũng cho th ấy m ột s ự chuyển tiếp do thiếu vắng của các actin-F, nhưng mà do các mô liên k ết đã không được thay đổi trong thermograms (biểu đồ nhiệt độ) c ủa c ơ đã đ ược s ử lý b ằng áp suất. Beilken, Macfarlane, và Jones (1990) cho rằng áp suất đi ều trị ở các nhiệt độ khác nhau, từ 40 C° đến 80°C có rất ít hoặc không có biến đổi rõ rệt về sự dẻo dai hơn là để tăng nhiệt độ bằng xử lý nhiệt làm gi ảm đ ộ dai. Suzuki, Watanabe, Ikeuchi, Saito, và Takahashi (1993) báo cáo rằng không có s ự khác bi ệt đáng k ể trong siêu cấu trúc (ultrastructure), điện di, nhi ệt đ ộ hòa tan, và thermogram (bi ểu đồ nhiệt độ) của phân quét calorimetry (đo nhiệt l ượng) (DSC) phân tích c ủa các collagen bắp phân lập từ một con bò sữa già đã đ ược quan sát trong s ố các m ẫu cơ không được xử lý áp suất và các cơ được xử lý áp (100-400 MPa, 5 phút). Ảnh hưởng của áp suất vào nhiệt độ biến tính và enthalpy theo thermogram đ ược th ể hiện trong bảng 1. Gần đây Nishimura, Hattori, và Takahashi (1995) cho rằng s ự suy y ếu c ủa các mô liên kết trong cơ, endomysium (vỏ nội c ơ) và perimysium (màng c ơ), gây ra trong quá trình thì tương quan với sự m ềm th ịt bằng cách s ử d ụng kính hi ển vi điện tử để quét . Ueno, Ikeuchi và Suzuki (1999) mô liên k ết trong các c ơ đã qua chế biến và xử lý áp suất bằng kính hiển vi quét đi ện t ử. Trong suốt thời gian xử lý, sự suy yếu cấu trúc của các endomysium và perimysium và s ự phá v ỡ các c ấu trúc tổ ong đã xuất hiện. Trong cơ được xử lý áp suất, bi ến d ạng c ủa c ấu trúc t ổ ong của endomysium được tăng lên với sự gia tăng c ủa áp su ất tác đ ộng lên các 14
cơ bắp, và mở rộng mạng lưới của endomysium đã đ ược quan sát trong các m ẫu cơ tại 400 MPa. Hiện nay, kết luận đó không ph ải là ch ắc ch ắn rằng các áp su ất gây ra những thay đổi cơ cấu trong các mô liên kết d ẫn đ ến m ột s ố hi ệu ứng đáng kể đến độ mềm của thịt. Nhưng nếu muốn hiểu rõ thêm thì ph ải nghiên c ứu sâu hơn nữa để làm rõ vấn đề này. Bảng 1: Ảnh hưởng của áp suất lên tình trạng biến tính của collagen trong cơ Nhiệt độ biến tính (oC) To TP TC ∆ H (mJ/mg) Control 62.40 ± 1.03 65.65 ± 0.67 68.70 ± 0.65 15.00 ± 1.40 100 MPa 62.13 ± 0.66 65.35 ± 0.25 68.95 ± 0.64 15.53 ± 1.65 150 MPa 62.58 ± 1.03 66.05 ± 0.88 68.80 ± 0.64 15.78 ± 1.80 200 MPa 62.80 ± 1.65 66.03 ± 0.99 68.73 ± 0.72 16.93 ± 1.10 300 MPa 62.68 ± 0.63 65.90 ± 1.23 68.95 ± 0.83 15.50 ± 1.65 To = Nhiệt độ bắt đầu biến tính; Tp = nhiệt độ biến tính nhiều nhất; Tc = Nhiệt độ kết thúc biến tính, ∆ H = enthalpy của biến tính, mJ/mg khối lượng khô. Nguồn: Suzuki, Wantanabe, Ikenchi, Saito, and Takahashi (1993). Ảnh hưởng của áp suất cao lên vi sinh vật Tốc độ và động học vô hoạt vi sinh vật phụ thuộc vào m ột vài thông s ố như: loại vi sinh vật, cường độ áp suất, thời gian, nhiệt đ ộ, pH, hoạt tính n ước và thành phần thực phẩm. Nhìn chung, sự ức chế càng tốt khi áp suất càng cao. 2.3.1. Sự phá hủy của áp suất lên vi sinh vật: Sự ức chế vi sinh vật bởi áp suất cao có lẽ là do tác đ ộng c ủa nhi ều y ếu tố kết hợp lại. Áp suất cao không ức chế hoặc phá h ủy m ột vị trí nào đó trong t ế bào hoặc một chức năng của tế bào., mà sự chết của tế bào là bởi nh ững hư h ỏng nhiều hoặc tích tụ bên trong tế bào (Simpson & Gilmour, 1997). Màng tế bào là mục tiêu chính của sự phá hủy, ch ủ yếu qua vi ệc làm r ối loạn sự vận chuyển các chất của màng tế bào do hậu quả c ủa sự kết tinh phospholipid. Các chức năng khác của tế bào bị ảnh h ưởng bởi áp su ất bao g ồm: sự thay đổi trao đổi ion, thành phần acid béo, hình thái h ọc c ủa ribosome, hình thái học tế bào, biến tính protein và ức chế hoạt tính enzyme, sự mất ổn định của việc sao chép DNA, sự hình thành không bào…Sự khác nhau về tính ch ất c ủa màng t ế 15
bào có thể là một nhân tố quan trọng trong việc xác định ảnh h ưởng c ủa áp suất hoặc stress lên vi sinh vật. Trong một vài hệ vi sinh vật, ng ười ta cho r ằng s ự phá hủy là do rối loạn sự vận chuyển protein qua màng t ế bào (Vogel, Molina- Guiterrez, Ulmer, Winter, & Ganzle, 2001). Đây có th ể là c ơ chế chung làm cho t ế bào chết. Nhìn chung, các tế bào chết gia tăng khi tăng áp su ất nh ưng nó không tuân theo động học bậc 1. 2.3.2. Khả năng chịu áp suất cao của vi sinh vật Nhìn chung, các vi khuẩn gram dương chịu được áp suất cao h ơn vi khu ẩn gram âm. Hình thái tế bào cũng ảnh hưởng đến tác đ ộng c ủa áp su ất, vi khu ẩn hình que bị ảnh hưởng nhiều hơn hình cầu. Các tế bào ở pha phát tri ển d ễ b ị ảnhh hưởng hơn các tế bào ở pha ổn định. Bảng 2: Sự tiêu diệt vi sinh vật bởi áp suất Ít mẫn cảm Dễ mẫn cảm Bào tử Tế bào sinh dưỡng Gram dương Gram âm Tế bào trong pha ổn định Tế bào trong pha phát triển Bacillus, Clostridium, Staphylococcus, Yersinia, Vibrio, Salmonella, parasites Listeria, Escherichia coli O157:H7 aw thấp aw cao pH acid Nhiệt độ cao Có thuốc kháng sinh Nguồn: Masoliver và Grebol. Nhiệt độ có vai trò quan trong trong việc ức chế vi sinh vật bằng áp suất cao. Tại nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển, sự ức chế sẽ thấp hơn so với các nhiệt độ khác. Độ chảy màng có thể bị phá vỡ dễ dàng hơn tại nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tối ưu. Khi các tế bào được làm sốc lạnh trước khi dùng áp suất cao, chúng có khả năng chịu áp tốt hơn. Điều này được giải thích là do s ự duy trì đ ộ ch ảy màng của tế bào ở nhiệt độ thấp. Sự thích nghi của màng ở nhi ệt đ ộ thấp đ ược th ực hiện bằng việc thay đổi độ phân nhánh và làm giảm chi ều dài c ủa các acid béo màng, vì thế làm cho vi sinh vật chịu được áp suất t ốt h ơn (Wemekamp- 16
Kamphuis, Karatzas, Wouters, & Abee, 2002). Các protein t ạo ra trong quá trình sốc lạnh có thể bảo vệ tế bào trước áp suất cao. Sự khác nhau về ảnh hưởng của áp suất lên các gi ống gây bệnh c ủa m ột vài loài (Listeria monocytogenes; Staphylococcus aureus; Escherichia coli và Salmonella typhimurium) đã được báo cáo bởi m ột vài tác gi ả (Alpas, Kalchayanand, Bozoglu, Sikes, Dunne, & Ray, 1999; Simpson & Gilmour, 1997). 2.3.3. Ảnh hưởng của thực phẩm lên khả năng chịu áp su ất cao của vi sinh vật Theo Archer (1996), 2 ảnh hưởng chính của thực ph ẩm lên đ ộ an toàn vi sinh là: ảnh hưởng của thành phần thực phẩm trong suốt quá trình x ử lý và ảnh hưởng sau xử lý trong suốt quá trình phục hồi của vi sinh vật. Khả năng chịu áp suất của vi sinh vật có thể bị tác đ ộng bởi nhi ều y ếu t ố môi trường và bên trong, bản chất của môi trường là quan tr ọng nh ất. K ết qu ả đạt được trong môi trường tổng hợp hoặc môi trường đệm không th ể k ết lu ận ngay tức khắc về tình trạng của thành phần thực phẩm. Như đã bi ết, thành ph ần thực phẩm có độ acid thấp như thịt (bảng 1) và sữa (Garcıa-Graells, Masschalck, và Michiels, 1999), có khuynh hướng bảo vệ vi khuẩn ch ống lại ảnh h ưởng c ủa áp suất cao so với môi trường đệm phosphate. Bảng 3: Sự giảm lượng vi khuẩn sau khi xử lý áp suất 500 MPa, 40 oC trong 10 phút Giống Dung dịch đệm Mẫu thịt Phosphate Carnobacterium pisciola 5.79 4.67 LMG2739 6.79 4.67 Enterococcus faecium CTC492 7.23 3.97 Escherichia coli CTC1007 5.53 5.54 Escherichia coli CTC1018 5.78 4.51 Escherichia coli CTC1023 7.01 3.98 Lactobacillus sakei CTC494 6.33 4.22 Lactobacillus sakei CTC746 6.33 3.91 Leuconostom carnosum CTC747 7.92 4.55 Listeria innocua CTC1014 5.60 3.84 Pediococcus acidilactici F 4.75 1.29 Staphylococcus carnosus LHT2012 Nguồn: Garriga (chưa xuất bản) 17
Khả năng chịu áp suất cao của vi khuẩn có th ể đ ược gia tăng đáng k ể khi được xử lý trong môi trường giàu dinh dưỡng chứa các chất như carbohydrate, các chất này có thể bảo vệ vi khuẩn khỏi sự hư hại (Hoover et al., 1989). S ự có m ặt của carbohydrate và protein trong thể nhũ tương th ực ph ẩm làm gia tăng kh ả năng chịu áp suất của một vài vi sinh vật (Simpson và Gilmore, 1997). Sau khi so sánh sự ức chế vi khuẩn trong các sản phẩm thịt ở các hoạt tính n ước khác nhau (b ảng 2). Dựa trên bảng ta thấy mức độ chết của Staphylococcus aureus và vi khuẩn acid lactic trong thịt đùi lợn khô là thấp nhất n ếu so v ới th ịt bò ướp và th ịt đùi l ợn nấu chín. Trong thực tế, khả năng chịu áp suất cao của vi sinh v ật s ẽ gia tăng khi giảm hoạt tính nước. Bảng 4: So sánh sự tiêu diệt vi khuẩn Staphylococcus aureus và lactic acid bacteria (LAB) bằng 600 MPa, 31oC trong 6 phút Loài Sản phẩm được đóng gói chân không Thịt bò ướp Jambon nấu chín Jambon muối hun khói Ban dùng HHP Ban dùng HHP Ban dùng HHP đầu đầu đầu Staph. aureus 3.62 0.95 3.70 2.58 2.74 2.19 Độ giảm 2.67 1.12 0.55 LAB 4.94 0.95 5.63 1.06 4.23 2.65 Độ giảm 3.99 4.57 1.58 Aw 0.985 0.987 0.890 Nguồn: Garriga et al Vi khuẩn dễ nhạy cảm với pH gần tối ưu sau khi xử lý nhi ệt ho ặc áp suất. vì thế, không chỉ pH thấp làm gia tăng s ự ức ch ế trong quá trình x ử lý mà còn ức chế sự phát triển tế bào bị tổn thương bởi nhiệt ho ặc áp suất. Ngoài ảnh hưởng của pH thì không có ảnh hưởng đáng kể nào gây ra bởi các acid h ữu c ơ. Điều này có thể là do áp suất chỉ ảnh hưởng chủ yếu lên s ự ion hóa và các acid hữu cơ là những chất ức chế đặc thù dưới dạng không hòa tan. Acid sorbic tác động giống như acid hữu cơ, nhưng nó cũng tác đ ộng đ ến màng t ế bào c ủa vi khuẩn, và tác động sẽ nhiều hơn khi kết hợp với áp suất (Mackey, Forestiere, và Isaacs, 1995). 2.3.4. Ảnh hưởng của loại thiết bị lên hiệu quả ức chế vi sinh vật của áp suất cao 18
Các thiết bị áp suất và môi trường khác nhau có th ể tạo ra nh ững k ết qu ả khác nhau về những vi khuẩn sống sót trong suốt giai đo ạn b ảo quản. H ơn n ữa, sự khác nhau về thời gian, nhiệt độ, áp suất trong quá trình th ực t ế t ại các v ị trí khác nhau của thùng áp suất có thể dẫn đến m ột s ự ức ch ế vi sinh v ật không đồng nhất tại các vị trí khác nhau đó. Trái với quá trình thanh trùng hay ti ệt trùng cổ điển, điểm tới hạn của áp suất cao là ở gần vỏ thi ết bị, bởi vì s ự truy ền nhi ệt xảy ra giữa vỏ thiết bị và khối chất lỏng, dẫn đến sự giảm nhiệt đ ộ s ản ph ẩm nằm ở gần vỏ thùng. Ảnh hưởng của thời gian tăng áp, t ốc đ ộ xả áp và nhi ệt đ ộ của quá trình vẫn chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ. M ột t ốc đ ộ gi ảm áp chậm có thể làm giảm hiệu quả của quá trình và do đó vi ệc gi ảm áp ph ải đ ược thực hiện nhanh. Sản phẩm thịt đùi lợn đã chín và bao gói được x ử lý bằng áp su ất t ại 600MPa trong 6 phút tại 31 oC trong 2 thiết bị khác nhau (A và B), số lượng vi khuẩn lactic trong suốt giai đoạn bảo quản lạnh đã được đánh giá (hình sau). Hình 4: Động học phát triển của vi khuẩn lactic trong jambon chín theo th ời gian Trong mẫu của thiết bị A, số lượng vi sinh vật luôn n ằm dưới hàm l ượng phát hiện trong suốt thời gian lưu mẫu (120 ngày, 4 oC). Các mẫu trong thiết bị B được giữ dưới điểm phát hiện trong 30 ngày bảo quản, khi k ết thúc th ời gian l ưu trữ thì số lượng của chúng khoảng 10 8cfu/g. Trong một thí nghiệm tương tự (bảng 3) so sánh ảnh hưởng của áp suất lên các mẫu đùi l ợn khô đ ược c ấy 19
Listeria monocytogenes, và trong 2 thiết bị khác nhau (A và C) t ại 600MPa, 31 oC trong 6 phút. Bảng 5: So sánh sự tiêu diệt Listeria monocytogenes trong 2 thiết bị khác nhau Thời gian Thiết bị A Thiết bị C Trước khi dùng HHP 2.71 a 2.75a 1 ngày sau khi qua HHP 0/2b 3/3b 30 ngày sau khi qua HHP 0/3b 3/3b b 60 ngày sau khi qua HHP 0/3 3/3b 120 ngày sau khi qua HHP 0/3b 2/3b Nguồn: Garriga et al. a log10 cfu g-1. b Số lượng mẫu có Listeria monocytogenes trong 10 g/số lượng mẫu thử ban đầu. Qua thí nghiệm thấy rằng mẫu trong thiết bị A đã vô ho ạt hoàn toàn Listeria monocytogenes (trong 10g) trong suốt giai đoạn tồn trữ (120 ngày). Trong khi ở thiết bị C thì mầm bệnh vẫn hiện diện trong suốt thời gian tồn trữ. Sự khác nhau này không phải là do mẫu vì các mẫu đ ược lấy t ừ m ột nguồn và được chuẩn bị giống nhau nhưng chỉ khác thi ết bị. Do đó có ý ki ến cho rằng cần thiết lập các cách thức chuẩn bị mẫu cho các thi ết bị áp su ất trước khi kiểm tra thí nghiệm. Ảnh hưởng của áp suất cao đến các cấu tử hương. Như ta đã biết thịt có hương vị tương tự như huyết thanh hoặc huy ết, khi có thay đổi về nhiệt để sản xuất sẽ ảnh hưởng đến hương vị (th ường có ảnh hưởng tốt). Mùi vị của bắp thịt nấu chín thì phong phú h ơn là các b ắp th ịt có mùi tự nhiên. Hầu hết các cấu tử tạo nên hương vị và "meaty flavor" bao g ồm m ột lượng đường khử (thường là glucose), một nguồn axit amin và peptide, và h ợp chất làm tăng hương vị (taste enhancer)(ví dụ như inosinic acid; Baines và Mlotkiewicz 1984). Nói chung có thể chấp nhận rằng h ầu h ết các thành ph ần này làm cho các mô cơ bắp tăng thời gian bảo quản, do ph ản ứng hóa h ọc c ủa các thành phần nhất định của cơ. Rất ít thông tin về các ảnh hưởng của áp suất cao đến các cấu tử tạo mùi và hương vị cho thịt. Trong báo cáo của Suzuki, Homma, Fukuda, Hirao, Uryu, và Ikeuchi (1994) cho thấy rằng số lượng của các peptide và axit amin d ường nh ư tăng lên khi ta x ử 20