Các kỹ thuật chuyển gen: Tổng hợp và phân loại

ể

ỹ

ậ Các k thu t chuy n gen

ỹ ậ ể ạ

ậ ư ộ ế các plasmid trong t ủ ế i và tái b n chúng v i b gen c a t ệ ớ ộ ặ ổ

ế ớ ủ ơ ể ủ ặ ệ ể ể ấ ặ

ỹ ạ ộ K thu t chuy n gen (gép gen) là k thu t đ a m t gen l (m t đo n AND ạ ồ ạ ở ủ ế ặ ủ t n t ,ARN) vào t bào ch làm gen l bào ch ho c ủ ả ế ủ ồ ạ ộ ắ bào ch , t n t g n b gen t bào ch . Gen ổ ợ ạ ộ ế bào ch ho t đ ng t ng h p các protein đ c hi u gây bi n đ i các lan trong t ể ữ ặ đ c đi m đã có ho c làm xu t hi n nh ng đ c đi m m i c a c th chuy n gen.

ử ụ ườ ố

ồ ậ ộ ử ậ ươ ơ i ta ng pháp này s d ng r ng rãi cho các gi ng cây tr ng, v t nuôi. Ng ầ ộ ng và m t ph n

ố ượ ể ố Ph ướ ba ngũ c c đ ộ ươ ế ớ ả c tính ngày nay trên th gi i có kho ng h n m t n a đ u t ừ ữ nh ng gi ng có chuy n gen. c dùng t

ủ ế ứ ể Có 2 hình th c chuy n gen ch y u :

ể ồ ươ ự ế Chuy n gen tr c ti p g m các ph ng pháp :

ậ ỹ + K thu t siêu âm

ệ ỹ ậ + K thu t đi n xung

ậ ỹ + K thu t PEG

ậ ỹ + K thu t vi tiêm

ậ ắ ỹ + K thu t b n gen

ệ ể ậ ằ ố ỹ + K thu t chuy n gen b ng cách s c đi n

ể ế ồ ươ Chuy n gen gián ti p g m các ph ng pháp :

ể ờ + Chuy n gen nh Agrobacterium Tumefaciens

ể ờ + Chuy n gen nh virut và phage

ươ

ế

I.Các ph

ể ng pháp chuy n gen gián ti p

ờ ể 1. Chuy n gen nh Agrobacterium Tumefaciens

Nguyên lý chung :

ậ ấ ươ ệ th c v t là ph

ở ự ậ ả ẩ ổ ế ự ậ ả ệ ấ ộ ờ

ị ờ ử ụ ể Nh s d ng vi sinh v t đ t Agrobacterium (là vi khu n Gram âm) đ ệ ể chuy n gen ng pháp hi u qu và ph bi n nh t hi n ạ ắ nay nh vào kh năng g n gen ngo i lai vào h gen th c v t m t cách ấ ổ chính xác và n đ nh nh t.

Ư ể u đi m :

ả ị Gen ít b đào th i .

ố ượ ệ ượ ứ ế ẫ ặ ả ơ ng b n sao ít h n nên tránh hi n t ng c ch l n nhau và câm l ng

S l ẫ l n nhau.

ồ ạ ề ữ ự ụ ệ i b n v ng trong c th th c v t do s ph thu c ch t ch vào h

ẽ ặ ặ ộ

ỏ ổ ợ ố ụ ượ ơ ể ự ậ ươ ệ ẽ ễ ị ự ầ ờ ộ ụ ng pháp khác gen ph c thu c ch t ch vào ư IS hai đ u nh ng d b tách t nh 2 trình t

T n t ữ th ng protein Vir còn e nh ng ph h p chuyên bi c tái t m c tiêu đ ngay sau đó.

ượ Nh ể c đi m :

ớ ạ ổ ấ Có ph t n công gi i h n.

ỏ ự ư ả ầ ạ và cây hai lá m m nh ng l i không gây kh i

ế ầ ầ ấ ộ

ố ộ ề ơ ế ệ ơ ố Gây kh i u cho c cây kh a t u cho cây m t lá m m (do cây 1 lá m m thu c nhóm ti n hóa nh t, nó tích lũy nhi u c ch kháng b nh h n).

ờ ể ế 2. Chuy n gen gián ti p nh virut

ờ ễ ậ i do virut d xâm nh p và lây lan trong

ể ự ậ ồ ể ề ạ ớ ơ

ậ ủ ả ậ ợ ể Chuy n gen nh virut có th thu n l ờ ơ ể ộ c th đ ng v t và th c v t đ ng th i có th mang đo n AND l n h n nhi u so ớ v i kh năng c a plasmid.

ầ ẩ Tuy nhiên c n có các tiêu chu n sau :

ủ ệ ả + H gen c a virut ph i là ADN.

ể ừ ế ế t bào này sang t bào khac qua các l ỗ ở

ế ả +Virut có kh năng di chuy n t vách t bào.

ượ ể ạ ớ ế ả + Có kh năng mang đ c đo n ADN m i sau đó chuy n gen này vào t bào.

ủ ộ ố + Có ph ký ch r ng.

ạ ể + Không gây tác h i đáng k .

ươ

ự ế

II.Các ph

ể ng pháp chuy n gen tr c ti p

ể ằ 1.Chuy n gen b ng súng gen

Nguyên lý :

ỏ ằ ạ ữ c c c

ị ể ứ ặ ầ ế ướ ự bào. Các vi

ượ ạ ộ ạ ạ ắ ỏ

ộ ạ ớ ạ ạ ớ ự ẹ ằ

ắ ạ

ầ ớ ầ ớ ố ạ i b i m t t m thép m n, viên đ n

ấ ơ ẽ ẩ ộ ấ ế ắ

ể ấ ể ể ầ ị bào. Sau khi b n, tách các ổ bào và nuôi c y invitro đ tái sinh cây. Các gen c n chuy n có th tái t

ạ ớ ớ ậ ố ớ ể ớ ệ ệ ạ Ngâm nh ng viên đ n nh (vi đ n) b ng vàng ho c tungsten có kích th ỏ ớ nh v i dung d ch có ch a đo n ADN ngo i lai c n chuy n vào t ạ đ n này đ c làm khô trên m t đĩa kim lo i m ng. Đĩa kim lo i này g n vào ướ ặ ậ ệ ầ c đ u m t viên đ n l n b ng nh a ho c v t li u nh . Viên đ n l n có kích th ắ ừ v a khít đ u nòng súng b n gen. Khi b n áp su t h i s đ y viên đ n đi v i t c ọ ớ ị ữ ạ ở đ l n. T i đ u súng viên đ n l n b gi l ỏ ế ụ nh ti p t c di chuy n v i v n t c l n xuyên vào t ế mô, t ạ ợ h p vào h gen t o ra h gen m i.

Ư ể u đi m :

ộ ầ ượ ễ ắ ể ế Thao tác d dàng b n m t l n đ c nhi u t bào.

ể ắ ệ ạ Nguyên li u đ b n đa d ng.

ượ Nh ể c đi m :

ầ ố ế ạ ổ ấ ị T n s bi n n p n đ nh th p.

ạ ờ ứ Dùng nghiên c u các gen t m th i.

ể ệ ằ 2.Chuy n gen b ng xung đi n

Nguyên lý :

ờ ế Ở ệ ắ ỗ ế đi n th cao trong th i gian ng n có th t o ra các l trên màng t ầ bào tr n

ườ ể

ớ ị ể ạ ậ ng có th xâm nh p vào bên trong ổ ợ bào. Ng i ta chuaant b protoplast v i các plasmid tái t h p đã mang gen

ườ ố ầ ể ế (protoplast) làm cho ADN bên ngoài môi tr ế t mong mu n c n chuy n vào t bào.

ệ ả ấ

ệ ể ạ

ấ ấ

ế ế ầ ế ị ế t b xung đi n t o đi n th cao k t qu làm màng t bào tr n xu t ậ ệ ắ ỗ ủ th ng t m th i giúp cho các plasmid có th xâm nh p và g n vào h ườ ng nuôi c y ế ệ ạ ờ ệ ọ ọ ể ườ ượ ạ Dùng thi hi n các l gen. Sau quá trình xung đi n đem plasmid nuôi c y trong môi tr ợ thích h p, môi tr ng ch n l c đ tách các protoplast đã đ c bi n n p.

ọ ọ ể ế ấ Ti p theo nuôi c y invitro tái sinh và ch n l c chuy n gen.

ể ằ 3.Chuy n gen b ng vi tiêm

ế ể ng pháp này s d ng vi kim tiêm và kính hi n vi đ đ a ADN nh ng t

ế ế ạ ừ ữ ể ư ạ protoplast và cây bi n n p

ử ụ ạ ể ừ ạ ươ ấ ị ừ Ph bào nh t đ nh nh m t o ra các dòng bi n n p t ả kh m t ằ phôi phát tri n t h t.

Ư ể u đi m :

ố ư ượ ư ế T i u l ng ADN đ a vào t bào.

ế ị ượ ư ạ ế Quy t đ nh đ c đ a ADN vào lo i t bào nào.

ể ể ậ ộ ượ Có th quan sát m t cách chính xác vào t n nhân và có th quan sát đ c.

ỏ ư ạ ấ ế ể ặ ạ bào ki u phôi m c dù h n

ế ề ố ượ ế Các t ch v s l ấ bào có c u trúc nh nh h t ph n và t ể ng cũng có th tiêm chính xác.

ể ấ ẻ ế ế ọ ố Có th nuôi c y riêng l các t ạ bào vi tiêm và bi n n p vào m i gi ng cây.

ượ Nh ể c đi m :

ỗ ầ ỉ ượ ộ ế ộ ớ M i l n ch tiêm đ c m t phát v i m t t bào.

ỏ ộ Thao tác trong khi làm đòi h i đ chính xác cao.

ờ ỹ ể ậ 4.Chuy n gen nh k thu t siêu âm

ỹ ể ế ể

ậ ế ớ ầ ổ ợ ạ bào tr n protoplast. Sau khi t o ố h p mang gen mong mu n

ạ ỗ ợ K thu t siêu âm dùng đ chuy n gen vào t ộ protoplast ti n hành tr n protoplast v i plasmid tái t ề ể ạ đ t o h n h p d ng huy n phù.

ợ ể ể ọ

ườ ọ ọ ể ng thích h p ch n l c đ ấ c chuy n vào gen. Nuôi c y invitro đ tái sinh. Ch n ườ ư Sau khi siêu âm đem protoplast nuôi trong môi tr ượ tách các protoplast đã đ ọ l c và đ a ra ngoài môi tr ng.

ể ằ ươ 5.Chuy n gen b ng ph ọ ng pháp hóa h c

ươ ư ể

ờ ấ ổ ể ậ ạ ị

ế ọ ng pháp chuy n gen nh ch t hóa h c nh : polyethylene glycol (PEG) . Ph ặ Khi có m t protoplast b thay đ i và protoplast có th thu nh n ADN ngo i lai bên trong t bào.

ớ ụ ể ả

ự ậ ạ ớ ầ ắ ớ ng l n protoplast đã kh c

ụ ượ ạ ế ủ ư Có th áp d ng v i nhi u lo i th c v t nh ng kh năng chuy n gen v i t n ố ượ ố s gen th p. Tuy nhiên v i kh năng t o ra s l ph c đ ề ể ấ ớ c h n ch c a ph ạ ả ươ ng pháp này.

ố ể ấ ự ế 6.Chuy n gen tr c ti p qua ng ph n

ươ ể ấ Là ph ng pháp chuy n gen không qua nuôi c y invitro.

ắ ủ ạ ầ

ấ ể ạ ọ

ng pháp này là ADN ngo i lai chuy n vào cây theo đ u ng ph n chui vào nh y cái. Th i gian chuy n gen vào lúc h t ph n m c qua vòi ụ ấ ể ử ả ố ờ ể ụ vào th tinh, t

ự ợ ử ư ụ ế ở ươ Nguyên t c c a ph ố ụ ắ ầ ư nh y và lúc b t đ u đ a tinh t đúng khi quá trình th tinh t nh t là s chuy n gen x y ra ch a phân chia. ấ bào h p t noãn và cho t

ự ỉ ả ụ ấ bào sinh d c cái duy nh t và khi tái

ẽ ở ộ ế ể Do s chuy n gen ch x y ra m t t ả ể sinh cây s không hình thành th kh m.