BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
_________________________________________
LÊ THẾ TÂM
NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CHẤT LỎNG TỪ TRÊN NỀN OXIT SẮT SIÊU THUẬN TỪ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG CHỤP ẢNH CỘNG HƯỞNG TỪ MRI Chuyên ngành: Hóa vô cơ Mã số: 9 44 01 13 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội - 2019
Luận án được hoàn thành tại: Phòng Vật liệu Nano y sinh, Viện Khoa học vật liệu, Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam.
Phòng Kỹ thuật Điện-Điện tử, Viện Kỹ thuật nhiệt đới, Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam.
Trung tâm thực hành thí nghiệm trường Đại học Vinh.
Người hướng dẫn khoa học: Phản biện 1: ..................................................... Phản biện 2: ..................................................... Phản biện 3: .....................................................
Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Học viện tổ chức tại Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi giờ ngày tháng năm 2019
Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: Thư viện Quốc gia Hà Nội, Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ, Thư viện Viện Khoa học vật liệu, Thư viện Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
MỞ ĐẦU
Gần đây các ứng dụng của hạt nano từ trong các ứng dụng y sinh, đặc biệt là trong chẩn đoán hình ảnh bằng kỹ thuật cộng hưởng từ MRI đã thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới. Hiện nay trong chẩn đoán hình ảnh bằng chụp cộng hưởng từ MRI, các tác nhân tương phản Tl đã trở thành thương phẩm truyền thống, đó là phức của ion thuận từ có trị số mômen spin lớn như Gd3+ (có 7 điện tử chưa ghép cặp). Các ion Gd3+ này được kết hợp với các phân tử như DTPA (axit dietylentriamin penta axetic) và tạo ra các cấu trúc dạng phức vòng chelat Gd-DTPA. Trong quá trình hồi phục, sự tương tác giữa mômen từ của proton với mômen từ của các ion thuận từ khiến cho thời gian T1 bị giảm, nhờ vậy tốc độ hồi phục R1 tăng lên. Nồng độ các tác nhân là khác nhau trong mỗi vùng mô tế bào, do vậy mang lại hiệu quả tương phản trên ảnh chụp MRI. Trong khoảng gần 20 năm nay, cùng với sự phát triển của công nghệ nano hạt nano sắt oxit (iron oxide - IO) đang được nghiên cứu mạnh và thực tế đến nay đã có nhiều dòng sản phẩm thương mại chất tăng mức độ tương phản MRI dùng loại vật liệu sắt oxit này, chứng minh rằng các sắt oxit-MRI có thể cho chất lượng tăng mức độ tương phản tốt hơn cả loại Gd-DTPA vì hạt sắt oxit có hệ số cảm từ lớn hơn. Các chất IO-MRI có thể làm giảm cả T1 và T2, tăng được tốc độ hồi phục MRI chụp theo cả 2 chế độ chụp MRI trọng Tl và trọng T2. Các yêu cầu quan trọng đối với sản phẩm tăng tương phản ảnh MRI là hạt nano từ tính phải có độ phân bố hạt tương đối đều và từ độ bão hòa đủ lớn, và chất bọc phải có độ tương hợp sinh học tốt. Trong khi một số sản phẩm thương mại trên thế giới như Resovist dùng chất bọc là dextran, với hạt lõi cỡ 65 nm tạo ra từ độ bão hòa khoảng 65 emu/g. Các sản phẩm với cỡ hạt trong vùng 20-40nm như AMI-227: Sinerem/Combidex là thích hợp với bạch huyết và xương. Trong khoảng 10 năm gần đây người ta đang nghiên cứu để chế tạo các hạt nano siêu thuận từ với cỡ hạt nhỏ hơn 20 nm (còn được gọi là loại siêu nhỏ nếu cỡ hạt D<10 nm) và đặc biệt là các hạt sắt oxit có đánh dấu từ nhằm mục đích chụp ảnh MRI hướng đích (targeted imaging).
1
Tại Việt Nam, cho đến nay việc chế tạo các hạt nano nói chung và hạt nano từ nói riêng đã được tập trung nghiên cứu theo hai phương diện: Nghiên cứu cơ bản và nghiên cứu định hướng ứng dụng. Các kết quả nghiên cứu sâu sắc được công bố chủ yếu từ các cơ sở nghiên cứu mạnh như: Trường Đại học Quốc gia Hà Nội, Đại học Bách khoa Hà Nội và Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam. Việc tổng hợp vật liệu nano từ đa phần được thực hiện trong môi trường nước và bằng các phương pháp tổng hợp như phương pháp đồng kết tủa, phương pháp thủy nhiệt, phương pháp vi sóng và phương pháp tổng hợp điện hóa siêu âm. Do tổng hợp trong môi trường nước nên các hạt nano từ chế tạo được có chất lượng chưa cao, các hạt không đồng đều về cỡ hạt và không đồng nhất về hình dạng và vì vậy chúng bị hạn chế sử dụng cho các ứng dụng in vivo trong y sinh như dùng làm thuốc tương phản trong chẩn đoán hình ảnh bằng kỹ thuật chụp cộng hưởng từ MRI, đốt nóng cảm ứng từ v.v, ngoài ra chính sự không đồng đều đó còn ảnh hưởng ngay cả đến kết quả nghiên cứu các tính chất từ của chúng. Do đó, cho đến nay việc lựa chọn các điều kiện trong quá trình chế tạo chất lỏng từ tính nano Fe3O4 nhằm chế tạo ra các hạt có cỡ hạt bé, có sự phân bố đều, đồng nhất về hình
dạng, độ bền cao, từ tính cao và có khả năng tương thích sinh học cao, nhờ đó có khả năng ứng dụng làm thuốc tương phản trong chẩn đoán hình ảnh bằng kỹ thuật chụp cộng hưởng từ MRI, tạo ra các trị số tối ưu của các xung TR, TE khi chụp theo chế độ T1, T2, đồng thời xác định trị số hồi phục r1, r2 để đánh giá chất lượng của chất lỏng từ làm thuốc tương phản trong chẩn đoán hình ảnh bằng kỹ thuật chụp cộng hưởng từ MRI vẫn đang đòi hỏi những nghiên cứu tiếp tục một cách toàn diện và có hệ thống.
Xuất phát từ tình hình nghiên cứu về vật liệu nano từ trên thế giới cũng như ở Việt Nam, căn cứ vào tiềm lực nghiên cứu, đào tạo tiến sĩ của Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam, dưới sự hướng dẫn của tập thể các nhà khoa học giàu kinh nghiệm, chúng tôi lựa chọn đề tài “Nghiên cứu chế tạo chất lỏng từ trên nền oxit sắt siêu thuận từ định hướng ứng dụng chụp ảnh cộng hưởng từ MRI” để thực hiện cho nội dung luận án này. Đối tượng nghiên cứu của luận án:
Hệ chất lỏng từ trên nền oxit sắt siêu thuận từ
Mục tiêu nghiên cứu của luận án:
Mục tiêu của luận án nhằm xây dựng được qui trình chế tạo chất lỏng từ tính kích thước nano trên nền oxit sắt (kích thước hạt đồng đều và từ độ bão hòa cao) với công nghệ ổn định; nghiên cứu đặc trưng các tính chất từ của các hạt nano từ; đánh giá độc tính và thử nghiệm tác động lên tế bào, hướng tới mục đích làm thuốc tăng tương phản trong chẩn đoán hình ảnh bằng kỹ thuật chụp ảnh cộng hưởng từ MRI, ứng dụng trong xác định chính xác mô bệnh ung thư. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án:
Bản thân việc tổ chức thực hiện đề tài đã có ý nghĩa quan trọng đối với phát triển một hướng khoa học công nghệ đa ngành là Công nghệ nano cho Y học. Sẽ có sự trao đổi học thuật, học hỏi lẫn nhau giữa các nhóm nghiên cứu trong các ngành xưa nay xem như độc lập với nhau. Về mặt khoa học, từ độ của hệ hạt từ cho ứng dụng y sinh bị ảnh hưởng rất mạnh bởi nhiều yếu tố mà cơ chế của các ảnh hưởng này vẫn là vấn đề chưa được nghiên cứu một cách cơ bản.
Đối với ứng dụng chẩn đoán và điều trị bệnh ung thư, công nghệ nano nói chung đang tạo một kỳ vọng lớn, đó là có thể đóng góp vào việc giải quyết vấn đề chẩn đoán bệnh sớm và thuốc đưa tới đích hay vùng can thiệp được khu trú tại đích. Đề tài thực hiện có đặt mục tiêu dùng chất lỏng từ nâng cao được độ tương phản chụp ảnh cộng hưởng từ hạt nhân (CHTHN), có thể góp phần phân tích mô ung thư giai đoạn sớm. Phương pháp nghiên cứu:
2
Luận án được tiến hành bằng phương pháp thực nghiệm kết hợp với kỹ thuật tính toán bằng số. Mẫu nghiên cứu được chế tạo bằng phương pháp thủy nhiệt và phân hủy nhiệt. Nghiên cứu cấu trúc của mẫu bằng các kỹ thuật nhiễu xạ tia X (XRD), hiển vi điện tử (FESEM, TEM và HRTEM). Tính chất từ của vật liệu được khảo sát bằng các phép đo từ trên hệ từ kế mẫu dung (VSM). Sử dụng phương pháp phổ hấp thụ hồng ngoại (FTIR), phân tích trọng lượng (TGA) để đánh giá sự có mặt của các nhóm chức trên bề mặt hạt và sự suy giảm khối lượng của lớp polymer bọc hạt từ. Kỹ thuật tán xạ laze động (DLS) xác định kích thước thủy động và độ bền của chất lỏng từ. Thực nghiệm đánh giá độc tính qua thí nghiệm in-vitro. Phương pháp chụp ảnh MRI trọng
1. Tổng hợp thành công hạt nano từ Fe3O4 có kích thước hạt đồng đều và từ độ
T1, trọng T2 dùng cho các nghiên cứu tăng độ tương phản ảnh các mẫu vật liệu chế tạo (trên máy 1.5T MRI scanner, SIEMENS MAGNETOM, Germany). Nội dung nghiên cứu của luận án:
2. Chế tạo thành công các mẫu chất lỏng từ có độ bền cao trên nền hạt Fe3O4 tổng
bão hòa cao bằng phương pháp thủy nhiệt và phân hủy nhiệt.
3. Nghiên cứu đánh giá độc tính và độ bền của hệ chất lỏng từ. 4. Nghiên cứu khả năng ứng dụnglàm chất tăng cường độ tương phản ảnh trong
hợp bằng hai phương pháp trên.
kỹ thuật chụp cộng hưởng từ MRI. Bố cục của luận án:
Luận án có 137 trang (chưa bao gồm tài liệu tham khảo, phụ lục), bao gồm phần
mở đầu, 5 chương nội dung và kết luận.
Các kết quả chính của luận án được công bố trong 09 công trình được công bố, trong đó gồm có 01 bài báo thuộc danh sách SCI đã được đăng, 01 bài thuộc danh sách SCI đã gửi và đang phản biện, 05 bài báo trên tạp chí Quốc gia, 01 bài báo đăng trong kỷ yếu hội nghị Khoa học Quốc gia, và đã đăng kí 01 sở hữu trí tuệ (SC) đã được công bố trên tập A Công báo sở hữu công nghiệp. Kết quả chính của luận án:
Đã khảo sát ảnh hưởng và tối ưu hóa các điều kiện công nghệ lên cấu trúc và tính chất từ của hệ hạt nano Fe3O4 bọc chitosan (CS) chế tạo bằng phương pháp thủy nhiệt. Đã chế tạo thành công chất lỏng từ trên nền hạt Fe3O4 bằng phương pháp phân hủy nhiệt bằng cách chuyển pha và bọc bằng polyme PMAO. Mẫu chất lỏng Fe3O4@PMAO có độ bền cao trong các điều kiện khác nhau, các hạt đơn phân tán, kích thước đồng đều.
Đã đánh giá độc tính của chất lỏng từ trên mẫu tiêu biểu với các dòng tế bào khác nhau, kết quả đều cho chỉ số IC50 tốt. Mẫu chất lỏng chế tạo không có khả năng gây độc tế bào, đây là cơ sở để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo trên động vật.
Đã xác định độ hồi phục CHTHN của 2 hệ Fe3O4@CS, Fe3O4@PMAO cho thấy các hệ chế tạo đều cho giá trị r2 cao đạt trên 150 mM-1s-1 đối với mẫu Fe3O4@PMAO, cao hơn cả chất thương phẩm Resovist. Các chất này, khi đưa thử nghiệm chụp ảnh MRI đều thể hiện tiềm năng tốt cho ứng dụng làm tăng độ tương phản.
3
Đã nghiên cứu in-vitro, ex-vivo và in-vivo khả năng tăng tương phản MRI cho thấy nhiều chất lỏng từ của nhóm đề tài chế tạo đều thể hiện tính tăng tương phản tốt. Áp dụng hệ Fe3O4@PMAO cho khối u rắn dưới da và u gan, cho thấy tiềm năng cho phép quan sát hình dáng và cấu trúc chi tiết khối u, hỗ trợ cho chẩn đoán và điều trị.
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ VẬT LIỆU FERIT SPINEL VÀ PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN HÌNH ẢNH BẰNG KỸ THUẬT CHỤP MRI
1.1. Cấu trúc và tính chất từ của vật liệu ferit spinel 1.1.1. Cấu trúc của vật liệu ferit spinel
Ferit spinel là thuật ngữ dùng để chỉ loại vật liệu có cấu trúc hai phân mạng mà các tương tác giữa chúng là phản sắt từ hoặc ferit từ. Một đơn vị ô cơ sở của ferit spinel (với hằng số mạng tinh thể a 8,4 nm) được hình thành bởi 32 nguyên tử O2- và 24 cation (Fe2+, Zn2+, Co2+, Mn2+, Ni2+, Mg2+, Fe3+ và Gd3+). Trong một ô cơ sở có 96 vị trí cho các cation (64 ở vị trí bát diện, 32 ở vị trí tứ diện). Số cation ở vị trí bát diện nhiều hơn ở vị trí tứ diện (A), cụ thể có 16 cation chiếm ở vị trí bát diện (B) trong khi đó ở vị trí tứ diện chỉ có 8 cation (bao gồm cation hóa trị 2+ hoặc 3+). 1.1.2. Tính chất từ của vật liệu ferit spinel
Theo lý thuyết trường phân tử, nguồn gốc từ tính trong vật liệu ferit spinel là do tương tác trao đổi gián tiếp giữa các ion kim loại (ion từ tính) trong hai phân mạng A và B thông qua các ion ôxy. 1.1.3. Từ tính của vật liệu từ dạng hạt kích thước nano mét
Hiện tượng (hay trạng thái) siêu thuận từ xảy ra đối với các chất sắt từ có cấu tạo bởi các hạt tinh thể nhỏ. Khi kích thước hạt lớn, hệ sẽ ở trạng thái đa đômen (tức là mỗi hạt sẽ cấu tạo bởi nhiều đômen từ). Khi kích thước hạt giảm dần, chất sẽ chuyển sang trạng thái đơn đômen, có nghĩa là mỗi hạt sẽ là một đômen. Khi kích thước hạt giảm quá nhỏ, năng lượng định hướng (mà chi phối chủ yếu ở đây là năng lượng dị hướng từ tinh thể nhỏ hơn nhiều so với năng lượng nhiệt, khi đó năng lượng nhiệt sẽ phá vỡ sự định hướng song song của các momen từ) và khi đó momen từ của hệ hạt sẽ định hướng hỗn loạn như trong chất thuận từ. 1.2. Tình hình nghiên cứu vật liệu nano từ trong và ngoài nước
Tại Việt nam, một số nhóm nghiên cứu ở Viện Khoa học vật liệu, Trung tâm Đào tạo Quốc tế về Khoa học vật liệu - Trường ĐH Bách khoa Hà nội và ĐH Quốc gia Hà nội (ĐHQGHN) cũng đã có công bố về chế tạo các hạt nano từ cho ứng dụng y sinh và cho các nghiên cứu cơ bản. 1.3 . Các phương pháp chế tạo chất lỏng từ 1.3.1. Các phương pháp tổng hợp vật liệu nano từ
4
Với các ứng dụng trong y sinh, vật liệu thường được chế tạo bằng một số phương pháp hoá học như phương pháp đồng kết tủa, solgel, vi nhũ tương, thủy nhiệt, phân hủy nhiệt, vi lưu, v.v.. Các phương pháp hóa học có thể tạo ra các hạt nano với độ đồng nhất khá cao và tạo môi trường thuận lợi để có thể bọc hạt và chuyển pha các hạt từ môi trường dầu sang môi trường nước. Mỗi phương pháp nêu trên đều có những đặc điểm khác nhau.
1.3.2. Các công nghệ bọc hạt trong dung môi nước
Đối với các hạt nano được tổng hợp bằng phương pháp hóa học trong dung môi nước thì việc bọc hạt hay chức năng hóa bề mặt hạt nano sau khi chế tạo là một yếu tố rất quan trọng để có thể vừa đảm bảo được tính chất từ cũng như tính tương hợp sinh học. Khi bề mặt được bọc và chức năng hóa, các hạt nano dễ dàng phân tán trong một dung môi phù hợp và trở thành những hạt keo đồng nhất gọi là chất lỏng từ. 1.3.3. Các quy trình chuyển pha từ dung môi hữu cơ sang dung môi nước
Để thu được các hạt nano từ có chất lượng cao, việc chế tạo mẫu thường được tiến hành trong dung môi hữu cơ ở nhiệt độ sôi cao như: benzyl ther, phenyl ether, octadecene… Do đó, trước khi có thể sử dụng trong y sinh, các hạt nano từ này cần phải được chuyển từ dung môi hữu cơ sang dung môi nước thông qua các quy trình chuyển pha (phase transfer process). 1.4. Ứng dụng của hệ hạt nano từ trong y sinh
Các hạt nano từ có tiềm năng ứng dụng trong rất nhiều các lĩnh vực khác nhau. Trong y sinh, các hạt nano từ có thể được sử dụng để tách chiết các phân tử sinh học dùng từ trường, các chất dẫn thuốc hướng đích, các chất làm tăng độ tương phản trong kỹ thuật chụp ảnh cộng hưởng từ (MRI) và ứng dụng đốt từ bằng từ trường trong điều trị bệnh ung thư. Tuy nhiên, luận án này tập trung nghiên cứu định hướng ứng dụng hạt nano từ Fe3O4 làm chất tăng cường ảnh cộng hưởng từ hạt nhân (MRI).
CHƯƠNG 2. KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM
2.1. Tổng hợp hệ chất lỏng từ Fe3O4@CS tổng hợp bằng phương pháp thủy nhiệt
Hệ hạt nano chất lỏng từ Fe3O4@CS được tổng hợp bằng phương pháp thủy nhiệt
theo sơ đồ hình 2.1.
5
Hình 2.1. Quy trình tổng hợp hệ chất lỏng từ Fe3O4@CS.
2.2. Tổng hợp hệ hạt nano Fe3O4@OA/OLA bằng phương pháp phân hủy nhiệt
Hệ hạt nano Fe3O4@OA/OLA được tổng hợp bằng phương pháp phân hủy nhiệt
theo sơ đồ hình 2.2.
Hình 2.2. Quy trình chế tạo hạt nano Fe3O4@OA/OLA.
2.3. Chuyển pha hạt nano từ từ dung môi hữu cơ sang nước
Quá trình chuyển pha hạt nano từ từ dung môi hữu cơ sang nước được thực hiện
theo sơ đồ hình 2.3.
Hình 2.3. Quy trình bọc và chuyển pha bằng PMAO.
2.4. Các phương pháp đặc trưng
6
Nghiên cứu cấu trúc của mẫu bằng các kỹ thuật nhiễu xạ tia X, hiển vi điện tử. Tính chất từ được khảo sát bằng các phép đo từ trên hệ từ kế mẫu rung. Sử dụng phổ
hấp thụ hồng ngoại, phân tích trọng lượng để đánh giá sự có mặt của các nhóm chức trên bề mặt hạt và sự suy giảm khối lượng của lớp polymer bọc hạt từ. Kỹ thuật tán xạ laze động xác định kích thước thủy động và độ bền của chất lỏng từ. 2.5. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm
Trong các nghiên cứu thực nghiệm hoá học và công nghệ hoá học, có rất nhiều các bài toán thực nghiệm được mô tả thành bài toán cực trị: xác định điều kiện tối ưu của quá trình, thành phần tối ưu của hỗn hợp… Quy hoạch hoá thực nghiệm cho phép thay đổi đồng thời tất cả các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình đồng thời cho phép đánh giá định lượng các hiệu ứng cơ bản và các hiệu ứng tương tác đồng thời của các yếu tố, từ đó tối ưu hóa được các yếu tố công nghệ. 2.6. Đánh giá độc tính của chất lỏng từ lên tế bào ung thư
Đánh giá khả năng gây chết tế bào ung thư và tế bào lành của chất lỏng từ chế tạo.
2.7. Thử nghiệm khả năng làm chất tương phản trong kỹ thuật chụp anh MRI
Thực nghiệm chụp ảnh MRI trọng T1, trọng T2 dùng cho các nghiên cứu tăng độ tương phản ảnh các mẫu vật liệu chế tạo (trên máy 1.5T MRI scanner, SIEMENS MAGNETOM, Germany).
CHƯƠNG 3. NGHIÊN CỨU HỆ CHẤT LỎNG TỪ TRÊN NỀN OXIT SẮT TỔNG HỢP BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỦY NHIỆT
3.1. Thực hiện quy hoạch thực nghiệm bậc hai ba mức tối ưu
Mức độ
Thời gian STT
7
Bảng 3.1. Ma trận thực nghiệm và kết quả tổng hợp chất lỏng từ theo từng thí nghiệm Nhiệt độ ủ mẫu 180 180 120 120 107,57 192,43 150 150 150 150 150 150 150 Nồng độ Fe3+ 0,1 0,25 0,25 0,10 0,17 0,17 0,17 0,17 0,07 0,28 0,17 0,17 0,17 B + - + - 0 0 -1,414 1,414 0 0 0 0 0 C - + + - 0 0 0 0 -1,414 1,414 0 0 0 A + + - - -1,414 1,414 0 0 0 0 0 0 0 4,00 2,00 4,00 2,00 3,00 3,00 1,59 4,41 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00 Từ độ bão hòa (emu/g) 34,73 53,22 61,89 57,26 55,38 63,21 61,4 60,07 46,67 59,96 66,67 63,32 64,68 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
0.05
Yếu tố Giá trị F
0.04
0.03
l
0.02
e u a v - p
0.01
0
35.75 10.64 7.31 30.64 9.27 76,96 5,83 33,46 21,85 107,69 Giá trị p prob > F 0,0068a 0,0038a 0,0457b 0,0116b 0,0308b 0,0031a 0,0346b 0,0103b 0,0185b 0,0019a
B
2 C
2 C B
C B
2 A A
C A
B A
Mô hình A B C AB AC BC A2 B2 C2 R2=0,9908
Variable
Hình 3.2. Kết quả phân tích ANOVA tối ưu quá trình tổng hợp các yếu tố (a có ý nghĩa độ tin cậy α= 0,01; bcó ý nghĩa độ tin cậy α=0,05)
Hình 3.3. Đồ thị bề mặt đáp ứng biểu diễn sự tác động của từng cặp yếu tố (AB, AC) đến giá trị từ độ và mức độ mong muốn theo các cặp tương tác.
Phân tích sự phù hợp của mô hình và sự có ý nghĩa của mô hình được đánh giá qua phân tích ANOVA (hình 3.2) và các chỉ số tương quan. Sự có ý nghĩa của các hệ số hồi quy được kiểm định bởi chuẩn F, với các giá trị p< 0,05 cho biết các hệ số hồi quy có ý nghĩa. Như vậy, ở hình 3.2 cho thấy giá trị “Model- F-value” là 35,75, mô hình hoàn toàn có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 99,08%. Với tất cả các yếu tố nhiệt độ ủ mẫu, thời gian, nồng độ Fe3+ và từng cặp các yếu tố này đều có giá trị p<0,05 cho biết từng yếu tố này cũng tương tác với nhau và đều có ý nghĩa (hình 3.2) điều này được minh họa rõ hơn khi quan sát bề mặt đáp ứng ở hình 3.3.
8
Hình 3.4 mô tả đường fit theo hàm Langevin của các mẫu ở điều kiện tối ưu M11 - M13 tại từ trường 10 kOe. Từ hình này cho thấy số liệu thực nghiệm trên đường đo
M(H) của tất cả các mẫu được đo ở nhiệt độ 300K gần trùng khớp theo hàm Langevin với độ chính xác cao (R2 > 0,998).
Hình 3.4. Đường M(H) fit theo hàm Langevin của mẫu tại điều kiện tối ưu
3.2. Đặc trưng về cấu trúc và hình thái của hạt nano từ tính Fe3O4@CS
(a) (b) (c)
Hình 3.5. Ảnh nhiễu xạ tia X (a) và phổ FTIR (b) và giãn đồ TGA của vật liệu nano Fe3O4, CS và vật liệu nano Fe3O4@CS (c)
Hình 3.5a cho thấy tất cả các vạch nhiễu xạ của các mẫu đều trùng vạch chuẩn của Fe3O4 với cấu trúc spinel. Việc kết hợp với Chitosan làm các pic của mẫu nano Fe3O4@CS có độ nhiễu hơn các pic của mẫu Fe3O4 tinh khiết tuy nhiên không làm thay đổi cấu trúc tinh thể. Hình 3.5b (a) cho thấy, trên phổ hồng ngoại của mẫu Fe3O4@CS xuất hiện các dao động đặc trưng liên quan đến các nhóm chức của hạt Fe3O4 và lớp vỏ bọc CS. Điều này chứng tỏ rằng các hạt nano Fe3O4 đã được bọc bởi CS.
9
Trên ảnh TEM (hình 3.6), các hạt có dạng hình cầu với kích thước nhỏ từ 12-18 nm và tương đối đồng đều, các hạt sau khi bọc Fe3O4@CS có kích thước lớn hơn so với hạt Fe3O4 trước khi bọc. Tuy nhiên các hạt khi phân tán trong nước chưa được dạng đơn phân tán, các nhóm có hiện tượng co nhóm lại với phần lớp vỏ hữu cơ chitosan khoảng 21,5% (hình 3.5c).
Hình 3.6. Ảnh TEM hạt Fe3O4@CS điều chế ở điều kiện tối ưu chế tạo bằng phương pháp thủy nhiệt.
3.3. Đặc trưng về độ bền của hệ chất lỏng từ Fe3O4@CS
Hình 3.7. Giản đồ phân bố kích thước hạt (DLS) của chất lỏng từ Fe3O4@CS tại các giá trị pH (a) và nồng độ muối NaCl khác nhau (b)
Bằng việc xác định độ bền của mẫu chất lỏng Fe3O4@CS trong môi trường trường sinh lý cho thấy mẫu chất lỏng có độ bền cao trong dải pH rộng, thời gian dài và có độ bền khi nồng độ muối lên tới 300 mM. Điều này cho thấy, mẫu chất lỏng Fe3O4@CS có tính chất phù hợp trong điều kiện y sinh. 3.4. Thử nghiệm đánh giá độc tính của hệ chất lỏng từ Fe3O4 bọc chitosan
10
Hình 3.8. Tỷ lệ sống sót của tế bào Sarcoma 180 sau khi ủ trong 48 tiếng với Fe3O4@CS. Dãy đồng độ thử nghiệm: (C1): 500 µg/ml, (C2): 250 µg/ml, (C3): 125 µg/ml, (C4): 62,5 µg/ml, (C5): 30,25 µg/ml and (C6): 15,125 µg/ml. Các giá trị được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD) (a); Hình thái tế bào Sarcoma 180 quan sát dưới kính hiển vi soi ngược. CA: đối chứng sinh học. CB: Đối chứng dung môi DMSO
Kết quả của thử nghiệm MTT được thể hiện trong hình 3.8, qua đó, chất lỏng nano từ Fe3O4@CS không gây độc cho tế bào Sarcoma 180 với 83% - 106% tế bào sống sót sau khi ủ 48 tiếng với chất lỏng nano từ với các nồng độ 15.125 µg/ml và 30.25 µg/ml. Khi tiến hành tăng nồng độ hạt nano lên tới 62.5 µg/ml, 125 µg/ml, 250 và 500 µg/ml, tỷ lệ tế bào sống sót giảm xuống tương ứng là 66.1%, 38.4%, 17.8% và 2.8135%. Theo đó, độc tính của chế phẩm nano từ Fe3O4@CS có tính chất tuyến tính với nồng độ khi sự gia tăng nồng độ chất lỏng từ dẫn tới việc làm giảm sự sinh trưởng của tế bào. Từ kết quả thử nghiệm in vitro thu được cũng như so sánh với các công bố gần đây, có thể kết luận rằng vật liệu nano từ bọc chitosan Fe3O4@CS không gây độc lên dòng tế bào ung thư chuột Sarcoma 180.
CHƯƠNG 4: NGHIÊN CỨU HỆ CHẤT LỎNG TỪ TRÊN NỀN OXIT SẮT TỔNG HỢP BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN HỦY NHIỆT
4.1. Ảnh hưởng của dung môi và nhiệt độ lên tính chất của hạt Fe3O4
Hình 4.1. Giản đồ XRD của các mẫu Fe3O4 được chế tạo ở các nhiệt độ phản ứng khác nhau trong các dung môi khác nhau
11
Bằng việc khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nhận thấy mẫu được chế tạo ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ dung môi cho các hạt có kích thước nhỏ, không đồng đều, biên hạt không rõ nét. Dung môi dibenzyl ether cho các hạt không đồng nhất về hình dạng, kích thước không đồng đều so với dung môi octadecene. Các hạt có kích thước đồng đều với biên hạt rõ nét hơn khi nhiệt độ phản ứng được tăng lên 300 đến 310 oC và 320 oC. Điều này cho thấy nhiệt độ và bản chất của dung môi là yếu tố quan trọng trong quá trình hình thành và phát triển hạt.
Hình 4.1. Đường cong từ hóa và đường cong từ hóa phóng đại trong vùng từ trường nhỏ dùng để xác định Hc của các mẫu ở các nhiệt độ trong các dung môi khác nhau Giá trị từ độ bão hòa Ms tăng từ 51 emu/g (OIO-DIO1) đến 59 emu/g (OIO-DIO2) và 62 emu/g (OIO-DIO3) khi thay đổi nhiệt độ phản ứng từ 270oC đến 310oC (hình 4.1c). 4.2. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng lên cấu trúc và tính chất từ
Hình 4.2. Ảnh TEM của các hạt mẫu Fe3O4 được chế tạo ở các thời gian khác nhau ở nhiệt độ phản ứng 310 oC
Hình 4.2 cho thấy trong tất cả các mẫu đều có mặt các hạt hình cubic và hình cầu với kích thước tương đối đồng đều. Kích thước hạt trung bình (DXRD) của các mẫu tăng từ 5,2 nm đến 11,2 nm tương ứng với thời gian phản ứng tăng từ: 0,5 giờ đến 2 giờ. Nhìn vào ảnh TEM chúng ta nhận thấy biên hạt trở nên rõ nét hơn khi thời gian phản ứng tăng.
Hình 4.3. Đường cong từ hóa và đường cong từ hóa phóng đại trong vùng từ trường nhỏ dùng để xác định Hc của các mẫu ở các thời gian khác nhau
12
Hình 4.3 là các đường cong từ hóa của các mẫu Fe3O4 chế tạo với các thời gian phản ứng khác nhau. Như vậy, bằng việc thay đổi thời gian phản ứng, các mẫu hạt nano Fe3O4 đơn pha có kích thước từ 7,52 nm đến 13,15 nm tương ứng với giá
trị từ độ tăng từ 53 emu/g đến 65 emu/g đã được chế tạo. Tuy nhiên, thời gian kéo dài có thể dẫn đến kích thước hạt lớn do đó giá trị lực kháng từ lớn và có thể không đạt được trạng thái siêu thuận từ. 4.3. Chế tạo chất lỏng từ chứa hạt nano từ tính Fe3O4 bọc bằng PMAO
(a) (b)
Hình 4.4. Ảnh mẫu Fe3O4 trước và sau khi chuyển pha trong (a) và ảnh HRTEM của hạt Fe3O4 trước khi bọc PMAO trong dung môi hexane và hạt Fe3O4 bọc bởi PMAO trong nước (b)
Hình 4.4a là ảnh chụp của mẫu trước và sau khi chuyển pha bằng PMAO trong dung môi n-hexane và nước. Có thể thấy mẫu trước khi bọc PMAO phân tán rất tốt trong hexane và hoàn toàn không phân tán trong nước. Sau khi bọc PMAO, bề mặt của các hạt Fe3O4 trở thành hydrophilic và phân tán tốt trong nước, không phân tán trong hexane. Như vậy, có thể nhận định rằng lớp polyme đã bao phủ lên bề mặt các hạt và giúp chúng ổn định, phân tán tốt trong nước.
Hình 4.5. Ảnh TEM của các mẫu Fe3O4@PMAO pha loãng ở các nồng độ khác nhau Quan sát ảnh TEM và HR-TEM trên hình 4.4 và hình 4.5 cho thấy các mẫu sau khi bọc vẫn có cả dạng hình cầu, với kích thước hạt phân bố đồng đều. Kích thước hạt của các mẫu sau khi bọc đều lớn hơn so với kích thước hạt của mẫu ban đầu, tương ứng với kích thước trung bình là 9,6 nm và 12,1 nm.
13
Hình 4.6. Đường M(H) ở nhiệt độ phòng của các mẫu Fe3O4, Fe3O4@PMAO (a) và phổ FTIR của Fe3O4 với lớp vỏ bọc OA, OLA và PMAO (b)
Từ hình 4.6 có thể thấy, số liệu thực nghiệm trên đường đo M(H) của mẫu chưa bọc (Fe3O4) và mẫu chất lỏng chứa hạt Fe3O4@PMAO khớp hoàn toàn theo hàm Langevin, có thể cho rằng các mẫu chất lỏng từ này có tính chất siêu thuận từ ở nhiệt độ phòng.
Hình 4.7. Gía trị thế zeta và hình ảnh mẫu chất lỏng từ Fe3O4@PMAO sau 1
tháng chế tạo (a) 3 tháng (b) và sau 6 tháng chế tạo (c)
Khả năng đáp ứng về độ bền trong môi trường sinh lý cơ thể cũng là một trong những yêu cầu đối với hạt nano từ cho ứng dụng y sinh. Như chúng ta đã biết nồng độ muối trong cơ thể duy trì trong khoảng 165 ÷ 180 mM, độ pH 7,5. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành khảo sát độ bền của mẫu chuyển pha trong môi trường muối sinh lý với nồng độ lần lượt là 100 mM, 200 mM, 250 mM và 300 mM với pH là 7,5. Kết quả khảo sát cho thấy các hạt bọc PMAO tổng hợp được hoàn toàn đáp ứng yêu cầu về độ bền cho mục đích y sinh.
Hình 4.8. Gía trị thế zeta và hình ảnh mẫu chất lỏng từ Fe3O4@PMAO ở các nồng độ muối khác nhau 4.4. Thử nghiệm đánh giá độc tính của hệ chất lỏng từ Fe3O4 chuyển pha và bọc bằng PMAO
14
Hình 4.9. Kết quả độc tính của hệ nano từ Fe3O4@PMAO trên ba dòng tế bào ung thư người Hep-G2, MCF-7 và RD cùng 1 dòng tế bào lành của khỉ Vero. Nồng độ của Fe3O4@PMAO trong đồ thì này là 25 ug/ml; DMSO được dùng làm đối chứng dung môi và chất chuẩn pha trong DMSO được dùng làm đối chứng dương. Hình ảnh tế bào quan sát dưới kính hiển vi Optika 4083.B1 với vật kính 40X.
Độc tính trên tế bào của hệ vật liệu nano từ PMAO được đánh giá trên ba dòng tế bào ung thư người Hep-G2, MCF-7, RD và một dòng tế bào lành từ khỉ Vero bằng phương pháp Sulforhodamine B (SRB). Kết quả phân tích SRB trên bốn dòng tế bào được biểu diễn trong hình 4.9 cho thấy DMSO tại nồng độ thử nghiệm không có tác động gây độc trên tế bào với 100% tế bào tăng sinh trong khi chất chuẩn ở mẫu đối chứng dương lại gần như diệt toàn bộ tế bào ung thư chỉ sau 72h và gây ức chế tăng sinh mạnh đối với tế bào lành. So sánh với kết quả của đĩa ủ với hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PMAO, nhận thấy các giá trị gần như không thay đổi nhiều so với đối chứng dung môi với tỷ lệ tế bào tăng sinh trên dòng tế bào Hep-G2, MCF-7, RD và Vero lần lượt là 95.45%, 99.64%, 99.63% vào 100%. Qua đó kết luận rằng hệ vật liệu Fe3O4@PMAO hoàn toàn không có tác dụng gây độc lên bốn dòng tế bào này. Điều này cho thấy vật liệu Fe3O4@PMAO có tiềm năng lớn trong ứng dụng chẩn đoán hình ảnh và điều trị ung thư.
CHƯƠNG 5: ĐẶC TRƯNG ĐỘ HỒI PHỤC R1, R2, THỬ NGHIỆM ĐỘC TÍNH VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘ TƯƠNG PHẢN ẢNH BẰNG KỸ THUẬT CHỤP ẢNH CỘNG HƯỞNG TỪ MRI
5.1. Đánh giá độ hồi phục r1, r2 của hệ chất lỏng từ
Hình 5.1 và hình 5.2 là ảnh cộng hưởng từ của mẫu chất lỏng từ Fe3O4@PMAO ở các nồng độ: 2,5 µg/ml, 5,0 µg/ml, 10 µg/ml, 15 µg/ml, 25 µg/ml và 30 µg/ml theo chế độ trọng T1, T2 ở các điều kiện chụp giá trị TR, TE khác nhau.
TE = 12; TR = 100 TE = 12; TR = 200 TE = 12; TR = 400 Hình 5.1. Hình ảnh chụp cộng hưởng từ hạt nhân của hệ nano từ ở chế độ T1W, TR= 100 ms (a), TR =200 ms (b), TR =400 ms (c), TE =12 ms đối với các mẫu (A) hệ nano từ Fe3O4@PMAO trong môi trường agar 2%, (B) Hệ nano từ Fe3O4@CS trong môi trường agar 2%. Nồng độ sắt từ trong mỗi giếng là (1) 2,5 µg/ml, (2) 5,0 µg/ml, (3) 10,0 µg/ml, (4) 15,0 µg/ml, (5) 25,0 µg/ml và (6) 30,0 µg/ml.
TE = 11; TR = 3970 TE = 23; TR = 3970 TE = 34; TR = 3970
15
TE = 57; TR = 3970 TE = 91; TR = 3970 TE=113;
TR=3970
TE = 91; TR = 3970
Hình 5.2. Hình ảnh chụp cộng hưởng từ hạt nhân của hệ nano từ ở chế độ T2W, TE =11 ms (a), TE =23 ms (b), TE = 34 ms (c), TE= 57 ms (d), TE =91 ms (e), TE =113 ms (f), TR =4000 ms đối với các mẫu (A) hệ nano từ Fe3O4@PMAO trong môi trường agar 2%, (B) Hệ nano từ Fe3O4@CS trong môi trường agar 2%. Nồng độ sắt từ trong mỗi giếng là (1) 2,5 µg/ml, (2) 5,0 µg/ml, (3) 10,0 µg/ml, (4) 15,0 µg/ml, (5) 25,0 µg/ml và (6) 30,0 µg/ml.
Từ hình 5.1 và hình 5.2 ta thấy, mẫu đối chứng agar 2% có ảnh mầu trắng là mẫu có nồng độ C = 0 µg/ml (không có nồng độ của mẫu chất lỏng Fe3O4@PMAO). Sáu ảnh thứ tự từ trắng đến đen đặt trong các giếng theo chiều từ trái sang phải là của các mẫu có nồng độ tương ứng: 2,5; 5; 10; 15; 25; và 30 µg/ml. Sự tương phản thay đổi rất rõ ràng khi thay đổi một lượng nhỏ nồng độ của mẫu Fe3O4@PMAO. Các chất tương phản ảnh MRI có tác động giống nhau là làm tăng giá trị tín hiệu chế độ chụp ảnh trọng T1 (tăng tốc độ hồi phục dọc R1) và làm giảm tín hiệu chế độ chụp trọng T2 (giảm tốc độ hồi phục ngang R2). Nghịch đảo của các thời gian hồi phục T1, T2 là tốc độ hồi phục R1, R2. Tuy vậy, khả năng tăng hay giảm tín hiệu này lại phụ thuộc vào độ hồi phục ri (i = 1,2, tương ứng cho hồi phục dọc và hồi phục ngang) của từng chất lỏng từ cụ thể. Độ hồi phục ri của các chất lỏng từ có thể xác định từ quan hệ tuyến tính giữa tốc độ hồi phục Rx:
R1,2 = 1/T1,2 = Ro1,2 + r1,2.C (5.1)
Hình 5.3. Đường cong hồi phục T2 (suy giảm về 0) đo cho các mẫu chất lỏng
16
từ Fe3O4@PMAO (a) Fe3O4@CS (b) ở các nồng độ khác nhau.
(a) (b)
Hình 5.4. Tốc độ hồi phục ngang (a) và hồi phục dọc (b) của mẫu chất lỏng từ
Fe3O4@PMAO (a) và Fe3O4@CS (b).
Bảng 5.1. .Việc làm khớp hàm phụ thuộc của R1 và R2 vào nồng độ mẫu chất lỏng theo biểu thức (5.1) cho thấy sự phụ thuộc này là tuyến tính. Từ bảng 5.1, ta thấy rằng mẫu chất lỏng từ chuyển pha, bọc bằng PMAO và bọc bằng CS của chúng tôi cho độ hồi phục ngang cao hơn hẳn giá trị của chất thương phẩm Resovist và một số sản phầm thương mại. Như vậy, đúng như mong muốn, chất lỏng từ hạt siêu thuận từ trên nền Fe3O4 của chúng tôi có thể sử dụng làm chất tăng tương phản chụp ảnh MRI theo chế độ trọng T2 tốt được.
5.2. Đánh giá khả năng tăng tương phản ảnh chụp cộng hưởng từ in vitro trong các môi trường khác nhau
5.2.1. Đánh giá khả năng tương phản trong môi trường nước của hệ chất lỏng từ và sản phẩm thương mại Resovist.
(a) (b)
17
Hình 5.5. Hình ảnh chụp cộng hưởng từ hạt nhân của hệ nano từ ở chế độ T2W, TE= 62 ms (a), TE =75 ms (b), TR =4000 ms đối với các mẫu (A) hệ nano từ Fe3O4@PMAO trong môi trường nước, (B) Hệ nano từ Fe3O4@Dextran (Resovist) trong môi trường nước, (C) Hệ nano từ Fe3O4@CS trong môi trường agar 2%, (D) Mẫu đối chứng (không có hạt từ) trong môi trường nước. Nồng độ sắt từ trong mỗi giếng là (1) 5,0 µg/ml, (2) 10,0 µg/ml, (3) 15,0 µg/ml, (4) 30,0 µg/ml, (5) 45,0 µg/ml. Khi loại bỏ ảnh hưởng của những yếu tố như protein và lipid từ tế bào, hình ảnh MRI trên môi trường nước cho thấy Fe3O4 bọc polyme PMAO cho độ tương phản tốt hơn ở T2, resovist cho độ tương phản tốt hơn ở T1.
TE=15; TR=100 (a) TE=15; TR=400 (b) Hình 5.6. Hình ảnh chụp cộng hưởng từ hạt nhân của hệ nano từ ở chế độ T1W trong môi trường nước, TR= 100 ms (a), TR =400 ms (b), TE =15 ms đối với các mẫu (A) hệ nano từ Fe3O4@PMAO trong môi trường nước, (B) Hệ nano từ Fe3O4@Dextran (Resovist) trong môi trường nước, (C) Hệ nano từ Fe3O4@CS trong môi trường nước, (D) Mẫu đối chứng (không có hạt từ) trong môi trường nước. Nồng độ sắt từ trong mỗi giếng là (1) 5,0 µg/ml, (2) 10,0 µg/ml, (3) 15,0 µg/ml, (4) 30,0 µg/ml, (5) 45,0 µg/ml.
Từ hình 5.5 ta thấy, mẫu đối chứng nước cất ở dãy giếng (cột dọc) cuối cùng có ảnh màu trắng là mẫu có nồng độ C=0 µg/mL (không có nồng độ của mẫu chất lỏng Fe3O4@CS, Fe3O4@PMAO, Resovit). 3 dãy giếng ngang từ trên xuống được chuẩn bị ứng với nồng độ của các mẫu Fe3O4@PMAO, Resovist và mẫu Fe3O4@CS thủy nhiệt có nồng độ tương ứng: 5, 10, 15, 30 và 45 µg /ml. Sự tương phản thay đổi rất rõ ràng khi thay đổi một lượng nhỏ nồng độ của các mẫu Fe3O4@CS, Fe3O4@PMAO cũng như sản phẩm thương mại Resovist. Sự khác biệt trong tương phản ảnh ở chế độ chụp T2W (Hình 5.5) được thể hiện rất rõ ràng. Có thể thấy rõ tín hiệu tối tăng dần theo nồng độ vật liệu nano có trong các giếng so với đối chứng sinh học (giếng 6) cũng như so sánh giữa các mẫu khác nhau. Ở những nồng độ cao như 30 µg/ml của mẫu chất lỏng từ Fe3O4@PMAO tín hiệu tối gần như chiếm toàn bộ giếng, thậm chí không còn thấy tín hiệu màu sáng (giếng số 4) khi chụp ở chế độ TE, TR thích hợp, điều đó cho thấy hệ chất lỏng từ Fe3O4@PMAO có giá trị từ độ bão hòa cao hơn sẽ cho cường độ tương phản ảnh tốt hơn. Giữa hai mẫu Fe3O4@CS chế tạo bằng phương pháp thủy nhiệt và Resovist thì khi chụp ở chế độ T2W thì đều cho sự tương phản so với mẫu đối chứng, hình ảnh tương phản tương đương nhau. 5.2.2. Đánh giá khả năng tương phản trong môi trường pH thay đổi của hệ chất lỏng từ và sản phẩm thương mại Resovist.
18
TE=34; TR=3970 (c) TE=57; TR=3970 (d) Hình 5.7. Hình ảnh chụp cộng hưởng từ hạt nhân của hệ nano từ ở chế độ T2W trong môi trường pH khác nhau, TE= 11 ms (a), TE = 23 ms (b), TE =34 ms (c), TE =57 ms (d) đối với các mẫu (A) hệ nano từ Fe3O4@PMAO, (B) Hệ nano từ Fe3O4@Dextran (Resovist). Nồng độ sắt từ trong mỗi giếng 45,0 µg/ml trong môi trường có (1) pH =2, (2) pH =3, (3) pH =7, (4) pH =9, (5) pH =12.
Hình ảnh MRI trên môi trường pH khác nhau cho thấy Fe3O4 bọc polyme cho độ tương phản tốt hơn ở T2 và cường độ tín hiệu giảm mạnh tại pH=7, mẫu resovist cho độ tương phản tốt ở T2, cường độ tín hiệu thấp hơn (giếng số 3).
TE=12; TR=100 (a) TE=12; TR=200 (b) TE=12; TR=400 (c) Hình 5.8. Hình ảnh chụp cộng hưởng từ hạt nhân của hệ nano từ ở chế độ T1W trong môi trường pH khác nhau, TR= 100 ms (a), TR = 200 ms (b), TR =400 ms (c), TE =12 ms đối với các mẫu (A) hệ nano từ Fe3O4@PMAO, (B) Hệ nano từ Fe3O4@Dextran (Resovist). Nồng độ sắt từ trong mỗi giếng 45,0 µg/ml trong môi trường có (1) pH =2, (2) pH =3, (3) pH =7, (4) pH =9, (5) pH =12.
Sự khác biệt trong tương phản ảnh ở chế độ chụp T2W (Hình 5.7) được thể hiện rõ ràng hơn so với ở chế độ trọng T1 (T1W) (Hình 5.8). Có thể thấy rõ tín hiệu hầu như không thay đổi khí tăng giá trị pH của môi trường từ 2 đến 12. Ở môi trường sinh lý của mẫu chất lỏng từ Fe3O4@PMAO tín hiệu tối gần như chiếm toàn bộ giếng, thậm chí không còn thấy tín hiệu mầu sáng (giếng số 3) khi chụp ở chế độ TE, TR thích hợp, điều đó cho thấy hệ chất lỏng từ Fe3O4@PMAO cho cường độ tương phản ảnh tốt, tương đương với sản phẩm thương mại Resovist phù hợp trong ứng dụng MRI. 5.2.3. Đánh giá khả năng tương phản trong môi trường có nồng độ muối thay đổi của hệ chất lỏng từ và sản phẩm thương mại Resovist.
TE=57; TR=3970 (a) TE=75; TR=3970 (b) TE=87; TR=3970 (c) Hình 5.9. Hình ảnh chụp cộng hưởng từ hạt nhân của hệ nano từ ở chế độ T2W trong môi trường nồng độ muối khác nhau, TE =57 ms (a), TE =75 ms (b), TE 87 ms (c), TR =3970 ms đối với các mẫu (A) Hệ nano từ Fe3O4@Dextran (Resovist), (B) Hệ nano từ Fe3O4@PMAO, (C) Mẫu đối chứng (không có hạt từ) trong môi trường nước. Nồng độ sắt từ trong mỗi giếng 45,0 µg/ml trong môi trường có nồng độ muối khác nhau (1) 50 mM, (2) 100 mM, (3) 150 mM, (4) 200 mM.
19
Hình ảnh MRI trên môi trường có nồng độ muối khác nhau cho thấy Fe3O4 bọc polyme và mẫu mẫu resovist đều cho độ tương phản tốt hơn ở T2 và cường độ tín hiệu tốt ngay tại môi trường có nồng độ muối cao (200 Mm). Điều này cho thấy, mẫu chất lỏng Fe3O4@PMAO có tính chất phù hợp trong điều kiện y sinh.
TE=12; TR=100 (a) TE=12; TR=400 (b) Hình 5.10. Hình ảnh chụp cộng hưởng từ hạt nhân của hệ nano từ ở chế độ T1W trong môi trường nồng độ muối khác nhau, TR= 100 ms (a), TR =400 ms (b), TE =12 ms đối với các mẫu (A) Hệ nano từ Fe3O4@Dextran (Resovist), (B) Hệ nano từ Fe3O4@PMAO, (C) Mẫu đối chứng (không có hạt từ) trong môi trường nước. Nồng độ sắt từ trong mỗi giếng 45,0 µg/ml trong môi trường có nồng độ muối khác nhau (1) 50 mM, (2) 100 mM, (3) 150 mM, (4) 200 mM.
5.3. Khảo sát khả năng ứng dụng chất lỏng từ trên động vật thí nghiệm 5.3.1. Thử nghiệm in-vivo đánh giá khả năng ứng dụng hệ chất lỏng từ tính nano Fe3O4 làm thuốc tương phản trong kỹ thuật cộng hưởng từ MRI trên động vật
Các hình ảnh MRI trên thỏ trước và sau khi tiêm chất lỏng từ được chụp ở các kiểu chụp khác nhau (SAGITAL và CORONAL), chụp theo chế độ T1 (hồi phục dọc) và chụp theo chế tộ T2 (hồi phục ngang) thể hiện qua hình 5.11 đến hình 5.12.
Hình 5.11. Khả năng tăng tương phản hình ảnh chụp cộng hưởng từ trên mô gan của hệ nano Fe3O4@PMAO ở chế độ T1W (SAGITAL) trên thỏ, TE= 9,2 ms, TR =659 ms đối với (A) Thỏ trước khi tiêm chất lỏng từ, (B) Thỏ sau khi tiêm chất lỏng từ. Hình 5.11 và hình 5.12 cho thấy hình ảnh các bộ phân của thọ trước khi tiêm hầu như đều có một màu xám, không phân biệt rõ được vùng ranh giới của các bộ phân nội quan của Thỏ. Sau khi tiêm chất lỏng từ Fe3O4@PMAO cho thấy hình ảnh theo chế độ trọng T1 có sự thay đổi cường độ tương phản không đáng kể.
20
Hình 5.12. Khả năng tăng tương phản hình ảnh chụp cộng hưởng từ trên mô gan của hệ nano Fe3O4@PMAO ở chế độ T2W (SAGITAL) trên thỏ, TE= 94 ms, TR =3571 ms đối với (A) Thỏ trước khi tiêm chất lỏng từ, (B) Thỏ sau khi tiêm chất lỏng từ.
Kết quả cho thấy, sau thời gian 10 phút tiêm thuốc (mẫu chất lỏng từ Fe3O4@PMAO) các cơ quan nội tạng của thỏ trên ảnh MRI đã thể hiện rõ ràng hơn so với ảnh MRI trước khi tiêm thuốc. So với ảnh MRI chụp theo chế độ T1 thì ảnh MRI chụp theo chế độ T2 cho độ tương phản rõ nét hơn nhiều. Tại vị trí mô gan, khi chụp theo chế độ ảnh trọng T1 với TR=659 ms, TE=9,2 ms với xung spin-echo thì độ sáng tối hình ảnh tại mô gan hầu như không thay đổi với tỉ lệ cường độ tín hiệu trước khi tiêm Ia=325 và cường độ tín hiệu sau khi tiêm Ib=369. Trong khi khi chụp ảnh theo trọng T2 (TR=3571 ms, TE=94 ms với trình tự xung turbo spin echo - TSE) thì độ sáng tối hình ảnh tại mô gan thay đổi với tỉ lệ cường độ tín hiệu giảm Ia/Ib=2,3 lần.
Hình 5.13. Khả năng tăng tương phản hình ảnh chụp cộng hưởng từ của hệ nano Fe3O4@PMAO ở chế độ T2W (CORONAL) trên thỏ, TE= 112 ms, TR =7500 ms đối với (A) Thỏ trước khi tiêm chất lỏng từ, (B) Thỏ sau khi tiêm chất lỏng từ. (a) Trước tiêm, (b) sau tiêm 30 phút, (c) sau tiêm 60 phút.
Từ hình 5.13 cho thấy, sau thời gian 30 phút tiêm thuốc (mẫu chất lỏng từ Fe3O4@PMAO) hình (B), các cơ quan nội tạng của thỏ trên ảnh MRI đã thể hiện rõ ràng hơn hơn so với ảnh MRI trước khi tiêm thuốc (hình A) Cụ thể khi lấy một diện tích tại mô gan trước và sau khi tiêm tương ứng là 1,6 -1,8 cm2 thì cường độ tín hiệu giảm từ 88,1 xuống 35,8 (tương ứng giảm 2,46 lần so với trước khi tiêm). Điều đó cho thấy chất lỏng từ có khả năng làm thay đổi độ tương phản rất mạnh. Với các ảnh MRI được chụp ở thời gian 60 phút (C) cũng cho ảnh rõ nét như ảnh MRI ở thời gian 30 phút (B). 5.3.2. Thử nghiệm in-vivo đánh giá khả năng ứng dụng hệ chất lỏng từ tính nano Fe3O4 làm thuốc tương phản trong chẩn mô bệnh ung thư bằng kỹ thuật cộng hưởng từ MRI trên động vật
Khối u rắn dưới da 15 ngày tuổi ở đùi của chuột. Khối u đặc, chưa hoại tử và có cấu trúc tương đối đồng nhất. Chúng tôi tiến hành chụp MRI và thu được hình ảnh chụp ở thời điểm ngay sau khi tiêm trực tiếp hệ chất lỏng từ Fe3O4@PMAO vào khối u chuột và tiêm theo tĩnh mạch (Hình 5.14 và hình 5.15). Để đánh giá sự phân bố của hệ nano Fe3O4@PMAO trong khối u rắn dưới da chuột, khối u sau khi được tiêm hệ nano từ sẽ được theo dõi theo thời gian dưới góc chụp 90o theo kiểu Axial và Coronal.
21
Ở Hình 3.9, thấy rõ được khối u của chuột C, F, G. Khối u của chuột C, E, F, G có độ tương phản cao hơn nhiều (tối hơn) so với khối u của chuột B. Cường độ tín hiệu tại khối u thay đổi từ 284,6 xuống 249 tương ứng với chuột F và G. Điều đó cho thấy chất lỏng từ đã bắt đầu lan đều trên khắp khối u và đã làm thay đổi cường độ tín hiệu. Trong khi đối với chuột C, mặc dù đưa chất lỏng từ theo tĩnh mạch những cũng đã có sự thay đổi tín hiệu tại khối u rõ ràng, cụ thể cường độ tín hiệu tại chuột đối chứng ung thư B là 296,5 giảm xuống 226,8.
22
Hình 5.14. Khả năng tăng tương phản hình ảnh chụp cộng hưởng từ của hệ nano Fe3O4@PMAO ở chế độ T2W (CORONAL) trên chuột, TE= 91 ms, TR =3970 ms trên chuột. Với kích thước hai chiều trung bình khoảng 15x10 mm, trong điều kiện bình thường, gần như không quan sát được sự có mặt của khối u trên cơ thể chuột. Tuy nhiên, sau khi tiêm hệ nano từ Fe3O4@PMAO, có thể nhận thấy một vùng tối màu có hình dạng tương tự khối u xuất hiện trên ảnh chụp (Hình 3.9). Như vậy, sự có mặt của hạt nano từ đã hỗ trợ hệ thống chụp cộng hưởng từ 1,5T phát hiện được khối u ngay ở nồng độ vật liệu thấp (0,18 mg hạt từ). (Hình 3.10). Như vậy lượng tiêm 0,18 mg hạt từ cho phép phát hiện khối u trên hình ảnh nhưng chưa đủ để hệ nano có thể phát tán ra toàn bộ khối u trong thời gian 15 phút, tín hiệu chụp cho thấy vật liệu nano gần như bao phủ toàn bộ khối u vào thời điểm 30 phút sau khi tiêm và duy trì liên tục trong gần 1h sau đó (Hình 3.10).
Hình 5.15. Khả năng tăng tương phản hình ảnh chụp cộng hưởng từ của hệ nano Fe3O4@PMAO ở chế độ T2W (AXIAL) trên khối u chuột sau khi tiêm tiêm trực tiếp khối u, TE= 91 ms, TR =3970 ms trên chuột. (a) không tiêm, (b) ngay sau tiêm, (c) sau 15 phút, (d) sau 30 phút.
Với lượng hạt nano từ tiêm vào khối u, hình ảnh cho thấy có sự lan rộng của vật liệu theo thời gian (Hình 5.15). Kết quả thu được trên ảnh MRI cho thấy sau khi tiêm trực tiếp chất lỏng từ vào khối u thì xuất hiện vùng tối màu rõ rệt, khác biệt so với chuột đối chứng ung thư không tiêm, đồng thời thấy rõ độ tương phản vùng khối u, vành khối u, kích thước khối u sau khi tiêm 30 phút. Để chứng minh cho sự tập trung của hạt từ tại khối u, hình 3.9 và hình 5.15 dạng bảng màu sắc cho thấy sự xuất hiện màu tím ứng với cường độ tín hiệu giảm→ điều này cho phép sử dụng hệ chất lỏng từ ứng dụng trong việc chuẩn đoán ung thư và hỗ trợ trong điều trị. Sau 30 phút tiêm hạt từ vào khối u, vùng đen trong khối u của chuột D, F rộng hơn nhiều so với thời điểm ngay sau khi tiêm (Hình 5.15)→ Các hạt nano từ sau khi được tiêm vào khối u thì có xu hướng lan rộng ra toàn khối u. Khi đưa chất lỏng từ vào khối u chuột qua tiêm tĩnh mạch chuột.
Hình 5.16. Khả năng tăng tương phản hình ảnh chụp cộng hưởng từ của hệ nano Fe3O4@PMAO ở chế độ T2W (AXIAL) trên khối u chuột sau khi tiêm theo tĩnh mạch, TE= 91 ms, TR =3970 ms trên chuột. (a) không tiêm, (b) sau 2 giờ, (c) sau 12 giờ, (d) sau 24 giờ.
23
Qua hình 5.16, ta thấy độ tương phản của hình ảnh khi chụp MRI khối u ở các chuột chưa có sự khác biệt nhiều. Kết quả thu được trên ảnh MRI cho thấy sau khi tiêm chất lỏng từ vào chuột theo tĩnh mạch đuôi thì sau 2 giờ vẫn chưa quan sát được những vùng tối màu rõ, điều đó cho thấy lượng hạt nano đến được với khối u rắn rất ít sau khi tiêm tĩnh mạch sau một thời gian ngắn. Điều này có thể giải thích do khi tiêm theo tĩnh mạch các hạt nano từ sẽ theo hệ tuần hoàn đến các cơ quan được coi là đích đến của sắt trong cơ thể là gan, thận, lách và bạch huyết, cụ thể tại vị trí các mô này cho thấy sự giảm tín hiệu rõ rệt sau khi tiêm chất lỏng từ (hình 5.16), còn các mô và cơ quan khác như khối u nếu không có gắn phân tử hướng đích thì sẽ cần thời gian lâu hơn để chất lỏng từ tuần hoàn theo máu tới.
Tuy nhiên, sau thời gian 12 giờ sau khi tiêm thấy xuất hiện các điểm đen trong vùng khối u ở chuột D, và gần như tối đen vùng khối u ở chuột E sau 24 giờ. Điều đó cho thấy có một lượng rất ít hạt từ đến được vị trí khối u chuột sau khi tiêm một thời gian ngắn hạt từ qua tĩnh mạch chuột. Vùng đen ở khối u thu được sau 12 giờ trở đi cho phép xác định rõ vùng khối u, vành của khối u và cấu trúc chiều sâu của khối u→ điều này cho phép sử dụng hệ chất lỏng từ ứng dụng trong việc chuẩn đoán ung thư và hỗ trợ trong điều trị. Tuy nhiên khi đưa chất lỏng từ vào trực tiếp khối u cho độ tương phản của khối u trong ảnh chụp MRI cao hơn so với đưa chất lỏng từ vào tĩnh mạch chuột trong thời gian ngắn.
KẾT LUẬN CHUNG
Từ các kết quả nghiên cứu chi tiết và các thảo luận thích hợp, một số kết luận
chính được rút ra như sau:
1. Đã chế tạo thành công chất lỏng từ trên nền hạt Fe3O4 bằng phương pháp thủy nhiệt bọc bằng polyme tự nhiên chitosan (CS). Đã tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất từ. Mẫu chất lỏng Fe3O4@CS có độ bền cao trong môi trường sinh lý.
2. Đã chế tạo thành công chất lỏng từ trên nền hạt Fe3O4 bằng phương pháp phân hủy nhiệt bằng cách chuyển pha và bọc bằng polyme PMAO. Mẫu chất lỏng Fe3O4@PMAO có độ bền cao trong các điều kiện khác nhau, các hạt đơn phân tán, kích thước đồng đều.
3. Khảo sát độc tính cho thấy các hệ Fe3O4@CS, Fe3O4@PMAO đều cho chỉ số
IC50 tốt. Mẫu chất lỏng chế tạo không có khả năng gây độc tế bào.
4. Đã xác định độ hồi phục CHTHN của 2 hệ Fe3O4@CS, Fe3O4@PMAO cho thấy các hệ chế tạo đều cho giá trị r2 cao đạt trên 150 mM-1s-1 đối với mẫu Fe3O4@PMAO, cao hơn cả chất thương phẩm Resovist. Các chất này, khi đưa thử nghiệm chụp ảnh MRI đều thể hiện tiềm năng tốt cho ứng dụng làm tăng độ tương phản.
5. Nghiên cứu in-vitro, ex-vivo và in-vivo khả năng tăng tương phản MRI cho thấy nhiều chất lỏng từ của nhóm đề tài chế tạo đều thể hiện tính tăng tương phản tốt. Áp dụng hệ Fe3O4@PMAO cho khối u rắn dưới da và u gan, cho thấy tiềm năng cho phép quan sát hình dáng và cấu trúc chi tiết khối u ở các giai đoạn, hỗ trợ cho chẩn đoán và điều trị.
24
6. Các kết quả nghiên cứu đã được trình bày công bố trong 09 bài báo khoa học (02 bài báo trên tạp chí ISI trong đó 01 bài đã được đăng và 01 bài đang gửi phản biện, 08 trên tạp chí chuyên ngành và hội nghị quốc qia). Đã đăng ký 1 bằng sở hữu trí tuệ (đã chấp nhận đơn, đã công bố trên công báo sở hữu trí tuệ tập A số 365) về qui trình công nghệ chế tạo và thử nghiệm chất lỏng từ trong MRI.
DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ
1. Vu Thi Thu, An Ngoc Mai, Le The Tam, Hoang Van Trung, Phung Thi Thu, Bui Quang Tien, Nguyen Tran Thuat, Tran Dai Lam. Fabrication of PDMS-Based microfluidic devices: Appliaction for synthesis of magnetic nanoparticles. Journal of electronic materials (SCI), Q2, IF2017 1.579. Vol 45, Issue 5, 2016, pp 2576-2581. DOI 10.1007/s11664-016-4424-6. 2. Le The Tam, Nguyen Hoa Du, Le Trong Lu, Phan Thi Hong Tuyet, Nguyen Quoc Thang, Nguyen Thi Ngoc Linh, Nguyen Thi Hai Hoa, Tran Dai Lam. Magnetic Fe3O4 nanoparticle imaging T2 contrast agent synthesized by optimized hydrothermal method. Submited to Royal Society of Chemistry Advances (SCI), 2019, Q1, IF2017 2.936 (Under Review). 3. Trần Đại Lâm, Lê Thế Tâm, Lê Trọng Lư, Vương Thị Kim Oanh, Đỗ Hùng Mạnh, Nguyễn Xuân Phúc, Phạm Hồng Nam, Trần Đại Lâm. Quy trình chế tạo hệ chất lỏng từ tính nano Fe3O4 để làm thuốc tương phản trong chẩn đoán hình ảnh bằng kỹ thuật cộng hưởng từ MRI. Sở hữu trí tuệ (Sáng chế). Số đơn SC 1-2018-01215. Đã chấp nhận đơn hợp lệ và đã công bố trên công báo sở hữu công nghiệp số 365/T8, tập A: 58762 4. Le The Tam, Nguyen Hoa Du, Tran Dai Lam, Le Thi Nhan, Nguyen Van Toan. Study on some factor of magnetic fluid chitosan-coated Fe3O4 nanoparticles fabrication via hydrothermal method for Biomedicine, 2016. Viet Nam Journal of science and technology, Vol 54, 2C, 2016, pp 341-347. 5. Le The Tam, Vuong Thi Kim Oanh, Nguyen Hoa Du, Tran Dai Lam. Optimization of co-precipitation reaction involving main experimental factors on crystallite size of chitosan-coated magnetic nanoparticles Fe3O4 by response surface method with central composite designs. Vietnam Journal of Chemistry, No 5e1,2 (54), 2016, 207- 211. 6. Nguyen Hoa Du, Le The Tam, Tran Dai Lam, Phan Thi Hong Tuyet, Tran Thi Huong. Optimization factors affected saturation Magnetic fluid Chitosan-coated Fe3O4 in co-precipitation reaction by Response surface method with central composite designs, 2016. Viet Nam Journal of science and technology, Vol 54, 2B, 2016, pp 142-148. 7. Le The Tam, Vuong Thi Kim Oanh, Nguyen Hoa Du, Le Trong Lu, Le Hai Dang, Nguyen Thi Hai Hoa, Le Ngoc Tu, Tran Dai Lam. Magnetic resonance imaging (MRI) application of Fe3O4 based ferrofluid synthesized by thermal decomposition using poly (maleic anhydride -alt-1-octadecene) (PMAO). Viet Nam Journal of Science and Technology, Vol 56, 1A, 2018, pp 174-182. 8. Le The Tam, Tran Dai Lam, Nguyen Hoa Du, Phan Thi Hong Tuyet, Nguyen Quoc Thang. Synthesis, characterization and MRI application of Fe3O4 liquid was synthesized by hydrothermal with using Sodium Alginate. Proceedings of the the Scientific Conference Chemical, Material and Environmental Engineering for Sustainable Development (CME2018), in Quy Nhon City Vietnam, pp 49-56. 9. Lê Thế Tâm, Nguyễn Hoa Du, Nguyễn Quốc Thắng, Phan Thị Hồng Tuyết, Lê Trọng Lư, Nguyễn Thị Ngọc Linh, Võ Kiều Anh, Phạm Hồng Nam, Trần Đại Lâm. Chế tạo chất lỏng từ tính chứa Fe3O4@PMAO cho ứng dụng MRI điều chế bằng phương pháp phân hủy nhiệt. Tạp chí Hóa học, Viện Hàn lâm KHCN Việt Nam (2018). Vol 56(6e2), pp 63-69.
