Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 Đại học Đà Nẵng năm 2010
366
ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP
GLUCOSE OXIDASE NGOẠI BÀO CỦA CÁC CHỦNG NẤM MỐC
PHÂN LẬP TỪ MÔI TRƯỜNG TỰ NHIÊN
EVALUATING THE ABILITY OF MOLDS ISOLATED FROM NATURAL SOURCES
TO PRODUCE EXTRACELLULAR GLUCOSE OXIDASE
SVTH: Nguyễn Phan Ái Nhi, Nguyễn Thị Hồng Thu
Lớp 05H2B, Khoa Hoá, Trường Đại học Bách Khoa
GVHD: TS. Đặng Minh Nhật
Khoa Hóa, Trường Đại học Bách Khoa
TÓM TẮT
Hoạt tính của enzyme glucose oxidase sinh tổng hợp từ 22 chủng nấm mốc phân lập từ
các nguồn tự nhiên khác nhau đã được đánh giá. Trong đó, chọn ra chủng nấm mốc M12 phân lập
từ chanh có khả năng sinh enzyme GOD ngoại bào hoạt tính cao nhất. Nghiên cứu này sử dụng
chủng nấm mốc đó khảo sát ảnh hưởng của nồng độ các thành phần môi trường nuôi cấy đến
hoạt tính enzym. Các thí nghiệm được thực hiện với sự thay đổi nồng độ saccharose; peptone. Kết
quả xác định hàm lượng saccharose biến thiên nhiều trong khoảng 40-100g/l, peptone là 10-20g/l.
ABSTRACT
Glucose oxidase activity of 22 molds isolated from various natural sources was
determined. We chose one mold (M21 from lemon) which produces the highest extracellular
glucose oxidase activity. The research uses this mold to investigate concentrations of culture
media components to enzyme activity. Experiments were done with different concentrations of
sucrose; peptone. The result reveals concentration of sucrose fluctuates much in 40-100g/l;
peptone 10-20g/l; respectively.
1. Mở đầu
Glucose oxidase (GOD, β-D-glucose: oxygen, 1-oxidoreductase, EC 1.1.3.4) là
enzyme xúc tác quá trình oxi hóa β-D-glucose thành acid gluconic với sự tham gia của
phân tử oxi như chất nhận điện tử, đồng thời giải phóng ra hydro peroxide (H2O2) [1].
GOD được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất bột trứng sấy để loại bỏ
glucose và trong bộ cảm biến glucose dùng cho bệnh nhân tiểu đường để kiểm tra lượng
đường trong máu [2]. Nhiều ứng dụng của nó đã được phát triển như: loại bỏ oxi trong nước
ép trái cây, thức uống đóng hộp, trong xốt mayonnaise để ngăn sự trở mùi; cải thiện màu sắc,
mùi vị, thời hạn sử dụng của nhiều nguyên liệu thực phẩm; giảm độ cồn của rượu; ứng dụng
trong công nghiệp dệt như để tẩy trắng [1]; sử dụng như một thành phần của kem đánh răng
[2], trong quá trình sản xuất acid gluconic, và như chất bảo quản thực phẩm [3].
Trong nghiên cứu này chúng tôi phân lập nấm mốc từ các nguồn tự nhiên khác
nhau và đánh giá khả năng sinh tổng hợp enzyme GOD ngoại bào từ các chủng đó, đồng
thời cũng khảo sát ảnh hường của thành phần môi trường đến sự sinh tổng hợp này.
2. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1. Nguyên liệu
Các chủng vi sinh vật (VSV) từ phòng thí nghiệm và VSV phân lập từ những nguồn
Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 Đại học Đà Nẵng năm 2010
367
tự nhiên như: bánh tổ, bắp, bí đỏ, cam, chanh, chuối, cơm, đậu tương, mận, nho, lạc, xoài.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phân lập vi sinh vật bằng phương pháp cấy trên môi trường đặc
Đem vật phẩm (mẫu vật đã để lên mốc) giã nhỏ, hòa vào trong 200ml nước cất vô
trùng, hút 0.1 ml dịch cho vào đĩa petri có môi trường Czapek. Dùng que trang trải đều khắp
mặt thạch. Ủ ở nhiệt độ 300C trong 3-7 ngày. Chọn khuẩn lạc đứng tách biệt dùng que cấy
lấy một ít VSV cấy lên các đĩa petri khác, làm tương tự cho đến khi thu được khuẩn lạc
thuần chủng, dùng que cấy lấy một ít bào tử khuẩn lạc đó cấy vào ống thạch nghiêng.
2.2.2. Lên men sinh tổng hợp enzyme GOD
Tiến hành lên men trong môi trường lỏng với thành phần (g/l): (NH4)2SO4 0.4;
KH2PO4 0.4; MgSO4.7H2O 0,1; saccharose 100; peptone 15; CaCO3 40. Đun sôi môi trường
cho tan hết, điều chỉnh pH 6.5 – 6.9. Lấy 70 ml môi trường vào mỗi bình nón 250 ml, hấp
tiệt trùng ở 1210C trong 20 phút, làm nguội xuống nhiệt độ môi trường và cấy với 3 vòng
que cấy VSV. Bình nón được nuôi 70h trên máy lắc với tốc độ 175 vòng/phút. Sau lên men,
canh trường VSV được ly tâm 15 phút (5200 vòng/phút) để tách riêng phần lỏng và sinh
khối VSV, phần lỏng dùng để xác định hoạt tính enzyme tiết ra ngoài môi trường [1].
2.2.3. Xác định hoạt tính enzyme GOD bằng phương pháp chuẩn độ [4]
Đây là được sử dụng phương pháp phổ biến để xác định hoạt tính của GOD. Trong
phương pháp này, 1 ml dung dịch enzyme được thêm vào 25 ml đệm CH3COONa 60 mM
pH 5.6 chứa 2% β-D-glucose. Hỗn hợp được lắc 1h trong không khí ở 300C trên máy lắc,
tốc độ 200 vòng/phút. Phản ứng dừng lại bởi thêm vào 20ml dung dịch NaOH 0.1N. Hỗn
hợp đó đem chuẩn độ với dung dịch chuẩn HCl 0.1N. Mẫu trống (không có enzyme) thực
hiện tương tự dưới điều kiện thí nghiệm đó. Hoạt tính của GOD xác định bởi công thức:
60
1000..
0NVV
(1)
Trong đó: V0 là thể tích HCl dùng để chuẩn độ mẫu trống.
V là thể tích HCl dùng để chuẩn độ mẫu thí nghiệm.
N là nồng độ của dung dịch HCl chuẩn.
Một đơn vị hoạt tính enzyme được định nghĩa là lượng enzyme có thể oxi hóa 1.0
μmol β-D-glucose thành axit D-gluconic và H2O2 trong 1 phút ở pH 5.6 và nhiệt độ 300C.
2.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường đến hoạt tính enzyme GOD [1]
Chọn 2 thành phần môi trường để nghiên cứu là: saccharose, peptone. Sau đó, tiến
hành lên men vi sinh vật ở các nồng độ saccharose khác nhau (g/l): 20; 40; 60; 80; 100;
120. Chọn nồng độ saccharose cho hoạt tính enzyme GOD cao nhất, cố định nồng độ
saccharose đó trong các quá trình lên men tiếp theo với các nồng độ peptone khác nhau
(g/l): 0; 2; 5; 10; 15; 20; 30.
3. Kết quả và thảo luận
3.1. Các chủng vi sinh vật (kết quả cho trong bảng 1)
VSV từ phòng thí nghiệm và các nguồn tự nhiên được kí hiệu M1 đến M22
Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 Đại học Đà Nẵng năm 2010
368
Bảng 1. Các chủng sinh vật từ phòng thí nghiệm và phân lập từ các nguồn tự nhiên
Nguồn phân lập
Tên
Nguồn phân lập
Tên
Mẫu vi sinh từ
phòng thí nghiệm
M1, M2
Chuối
M13, M14, M15, M16, M17
Bánh tổ
M3, M4, M5
Cơm
M18
Bắp
M6, M7
Đậu tương
M19
Bí đỏ
M8, M9
Mận
M20
Cam
M10, M11
Nho
M21
Chanh
M12
Lạc
M22
3.2. Vi sinh vật M12 sinh tổng hợp enzyme GOD ngoại bào hoạt tính cao nhất
Hình 1. Chủng nấm mốc M12dưới kính hiển vi
3.3. Hoạt tính enzyme GOD (kết quả cho trong bảng 2)
Bảng 2. Hoạt tính enzyme GOD của các chủng vi sinh vật
Vi sinh vật
Hoạt tính
Vi sinh vật
Vi sinh vật
Hoạt tính
M1
0.7222
M6
M14
0.5000
M2, M7, M18, M20
0.0000
M8
M15, M22
0.4444
M3
0.7778
M9, M10
M16
0.1667
M4, M21
0.2222
M11
M17
0.6667
M5, M13
0.6111
M12
M19
0.6111
Các chủng vi sinh vật
Hình 2. Đồ thị hoạt tính enzyme GOD của các chủng vi sinh vật
Từ kết quả thu được trong bảng 2 và được biểu diễn trên hình 1 cho thấy các chủng
VSV M2, M7, M18, M20 không có hoạt tính. Phần lớn các chủng VSV có hoạt tính
enzyme GOD nhỏ hơn 1 và các chủng VSV có hoạt tính enzyme GOD cao nhất là chủng
M12, M3, M1 được phân lập từ các nguồn tự nhiên lần luợt là chanh, bánh tổ và VSV từ
phòng thí nghiệm. Do vậy, chủng M12 được chọn để nghiên cứu ảnh hưởng của thành
Hoạt tính enzym
Chủng nấm mốc M12 có đặc điểm hình thái giống với
chủng Aspergillus: đầu sợi nấm sinh sản phình to ra,
cuống của đỉnh bào tử đơn bào, các tế bào hình chai và
chuỗi đỉnh bào tử tỏa đều trên đầu sợi nấm sinh sản
như những tia nước đi xa từ vòi tưới.
Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 Đại học Đà Nẵng năm 2010
369
phần môi trường đến hoạt tính enzyme GOD.
3.4. Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến hoạt tính enzyme GOD
3.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ saccharose
U/ml
Nồng độ saccharose
Hình 3. Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ saccharose lên hoạt tính enzyme GOD
Đồ thị cho thấy khi tăng hàm lượng saccharose, hoạt tính enzyme tăng lên và đạt
giá trị cực đại ở nồng độ saccharose là 60 g/l, sau đó, hoạt tính enzyme giảm nhẹ. Điều này
có thể giải thích là do có thể tồn tại một số nhân tố ức chế trong môi trường nuôi cấy. Hoạt
tính enzyme dao động mạnh trong khoảng nồng độ 40-100g/l.
3.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ peptone
Hình 4. Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ peptone lên hoạt tính enzyme GOD
(saccharose được giữ cố định ở 60 g/l)
Đồ thị cho thấy nồng độ peptone ảnh hưởng rõ rệt lên sự tạo thành GOD: khi không
có peptone trong môi trường nuôi cấy, VSV không có khả năng sinh enzyme GOD; khi
tăng hàm lượng peptone, hoạt tính enzyme tăng và đạt giá trị cực đại ở nồng độ peptone là
15 g/l, sau đó, hoạt tính giảm. Hoạt tính enzyme dao động mạnh trong khoảng10-20 g/l.
4. Kết luận
Sử dụng phương pháp cấy trên môi trường đặc đã phân lập được 22 chủng vi sinh
vật từ các nguồn tự nhiên và mẫu vi sinh của phòng thí nghiệm. Trong đó, chủng M12 tỏ ra
có khả năng sinh enzyme GOD ngoại bào hoạt tính cao nhất. Chủng VSV này được sử
dụng trong các thí nghiệm tiếp theo để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ saccharose,
Hoạt tính enzym
Hoạt tính enzyme
Nồng độ peptone
Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 Đại học Đà Nẵng năm 2010
370
peptone đến hoạt tính enzyme GOD và nhận thấy rằng những khoảng biến thiên hoạt tính
enzyme mạnh nhất đối với nồng độ saccharose là 40-100 g/l, peptone là 10-15 g/l.
5. Đề nghị
Nếu có điều kiện và thời gian nghiên cứu chúng tôi sẽ khảo sát thêm một số vấn đề:
+ Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ CaCO3 lên hoạt tính enzyme sinh bởi M12.
+ Tối ưu hóa các điều kiện môi trường lên men để sinh enzyme hoạt tính cao nhất.
+ Sử dụng phương pháp quang phổ để xác định hoạt tính enzyme GOD.
+ Định danh chủng M12 có khả năng sinh enzyme GOD ngoại bào hoạt tính cao.
+ Khảo sát khả năng sinh enzyme nội bào của chủng vi sinh vật được nghiên cứu.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] D. G. Hatziuikolaou và B. J. Macris (1995), ―Factors regulating production of glucose
oxidase by Aspergillus niger‖, Elsevier Science Inc, 17, (6/1995), tr.530-34.
[2] Maurizio Petruccioli, Federico Federici, Christopher Bucke, và Tajalli Keshavarz
(1999), ―Enhancement of glucose oxidase production by Penicillium variabile P16‖,
Elsevier Science Inc, 24, (15/5/1999), tr. 397.
[3] Sandip B. Bankar, Mahesh V. Bule, Rekha S. Singhal, Laxmi Ananthanarayan
(2009), ―Glucose oxidase — An overview‖, Elsevier Inc, 27, (15/8/2009), tr. 489-501.
[4] Tongbu Lu, Xinyu Peng, Huiying Yang, và Liangnian Ji (1996), ―The
production of glucose oxidase using the waste myceliums of Aspergillus niger
and the effects of metal ions on the activity of glucose oxidase‖, Elsevier Science
Inc, 19, (10/1996), tr. 339-340.