Độc tính cấp của acid gambogic trên động vật thực nghiệm

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> ĐỘC TÍNH CẤP CỦA ACID GAMBOGIC<br /> TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM<br /> Trần Thanh Tùng1, Trần Thị Thu Thủy2, Nguyễn Thị Thanh Loan1<br /> 1<br /> <br /> Trường Đại học Y Hà Nội<br /> Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam<br /> <br /> 2<br /> <br /> Nghiên cứu thực hiện nhằm đánh giá độc tính cấp của acid gambogic dùng đường uống trên động vật<br /> thực nghiệm. Nghiên cứu độc tính cấp được tiến hành theo Hướng dẫn của Tổ chức Y tế Thế giới. Chuột<br /> nhắt trắng chủng Swiss được uống thuốc thử acid gambogic với liều tăng dần để xác định liều thấp nhất gây<br /> chết 100% chuột (LD100) và liều cao nhất không gây chết chuột (LD0). Liều gây chết 50% chuột (LD50) của<br /> acid gambogic và khoảng tin cậy 95% được tính dựa theo phương pháp Litchfied - Wilcoxon. Kết quả nghiên<br /> cứu cho thấy liều 600 mg/kg là mức liều thấp nhất gây chết 100% chuột và liều 100 mg/kg là liều cao nhất<br /> không gây chết chuột. Ngoài ra, liều LD50 được xác định là 281,58 mg/kg với khoảng tin cậy 95% là [277,99<br /> mg/kg - 285,18 mg/kg].<br /> Từ khóa: Acid gambogic, độc tính cấp, động vật thực nghiệm<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Acid gambogic là thành phần chính trong<br /> nhựa cây Đằng hoàng (Garcinia hanburyi<br /> Hook. f., thuộc họ Guttiferae), một cây thuốc<br /> đông y phân bố đặc hữu ở vùng Đông Nam Á<br /> trong đó có Việt Nam [1]. Mặc dù được phân<br /> lập và xác định cấu trúc từ những năm 60 của<br /> thế kỷ trước nhưng đến năm 2004 hoạt tính<br /> chống ung thư của acid gambogic mới được<br /> chú ý. Các nghiên cứu in vitro và in vivo đã chỉ<br /> ra acid gambogic có tác dụng trên nhiều loại<br /> ung thư như ung thư gan, ung thư dạ dày,<br /> ung thư phổi và ung thư vú [2 - 7]. Cơ chế tác<br /> dụng của acid gambogic có liên quan đến gây<br /> độc tế bào, ức chế tăng sinh, thúc đẩy quá<br /> trình tự chết của tế bào bằng cách hoạt hóa<br /> enzym caspase 3, ức chế sự gắn kết của protein anti-apoptotic với peptid [7 - 9]. Hiện nay,<br /> <br /> trên thế giới chưa có công trình nào công bố<br /> về công nghệ phân lập acid gambogic ở qui<br /> mô công nghiệp mà chỉ có một số phương<br /> pháp chiết xuất ở qui mô phòng thí nghiệm.<br /> Trong nghiên cứu này, acid gambogic được<br /> phân lập từ nhựa cây Đằng hoàng trồng ở<br /> Phú Quốc, Kiên Giang tại Viện Hóa học các<br /> hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học<br /> và Công nghệ Việt Nam.<br /> Đến nay, chưa có nghiên cứu nào tại Việt<br /> Nam và trên thế giới xác định độc tính của<br /> acid gambogic dùng theo đường uống được<br /> chiết xuất từ nhựa cây Đằng hoàng. Nhằm<br /> xác định tính an toàn của acid gambogic,<br /> nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu:<br /> Đánh giá độc tính cấp của acid gambogic<br /> đường uống trên động vật thực nghiệm.<br /> <br /> II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> Địa chỉ liên hệ: Nguyễn Thị Thanh Loan, Bộ môn Dược lý,<br /> Trường Đại học Y Hà Nội<br /> Email: thanhloanfr89@gmail.com<br /> Ngày nhận: 12/4/2018<br /> Ngày được chấp thuận: 28/5/2018<br /> <br /> TCNCYH 114 (5) - 2018<br /> <br /> 2.1. Vật liệu nghiên cứu<br /> Thuốc nghiên cứu<br /> Acid gambogic được phân lập từ nhựa cây<br /> <br /> 9<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> Đằng hoàng ở Phú Quốc, Kiên Giang vào<br /> <br /> tiếtu) và số lượng chuột chết trong vòng 72<br /> <br /> tháng 12/2015, với hiệu suất là 5% tại Viện<br /> <br /> giờ sau khi uống thuốc thử. Tất cả chuột chết<br /> <br /> Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn<br /> <br /> được mổ để đánh giá tổn thương đại thể. Từ<br /> <br /> lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Acid<br /> <br /> đó xây dựng đồ thị tuyến tính để xác định<br /> <br /> gambogic được chiết xuất từ nhựa cây bằng<br /> <br /> LD50 của thuốc thử. Sau đó tiếp tục theo dõi<br /> <br /> dung môi methanol với độ tinh khiết là 92%.<br /> <br /> tình trạng của chuột đến hết ngày thứ 14 sau<br /> <br /> Thuốc thử được hòa tan trong nước để cho<br /> <br /> khi uống thuốc thử.<br /> <br /> chuột uống.<br /> Hoá chất và máy móc phục vụ nghiên<br /> cứu<br /> - Kim đầu tù cho chuột uống.<br /> - Cân điện tử nhãn hiệu của hãng YMC.<br /> Co.Ltd, Nhật Bản.<br /> - Cốc chia vạch, bơm kim tiêm 1ml.<br /> <br /> 3. Xử lý số liệu<br /> Các số liệu nghiên cứu được xử lý thống<br /> kê theo phương pháp xác định LD50 theo<br /> phương pháp Litchfied - Wilcoxon.<br /> 4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu<br /> Nghiên cứu được tiến hành tại Bộ môn<br /> Dược lý – Trường Đại học Y Hà Nội vào tháng<br /> <br /> Động vật thực nghiệm<br /> <br /> 7/2017.<br /> <br /> Chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả hai<br /> <br /> III. KẾT QUẢ<br /> <br /> giống khỏe mạnh, trọng lượng 20g ± 2g do<br /> Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp.<br /> <br /> Chuột<br /> <br /> nhắt<br /> <br /> trắng<br /> <br /> được<br /> <br /> uống<br /> <br /> acid<br /> <br /> Động vật thí nghiệm được nuôi 7 ngày trước<br /> <br /> gambogic với liều tăng dần từ liều 100 mg/kg<br /> <br /> khi nghiên cứu và trong suốt thời gian nghiên<br /> <br /> đến liều 600 mg/kg. Liều 600 mg/kg được xác<br /> <br /> cứu trong điều kiện phòng thí nghiệm với đầy<br /> <br /> định là mức liều thấp nhất gây chết 100%<br /> <br /> đủ thức ăn chuẩn và nước uống.<br /> <br /> chuột và liều 100 mg/kg là liều cao nhất không<br /> <br /> 2. Phương pháp<br /> Nghiên cứu độc tính cấp của thuốc thử<br /> acid gambogic được tiến hành trên chuột nhắt<br /> trắng theo đường uống và xác định LD50 theo<br /> phương pháp Litchfied - Wilcoxon [10 - 12]:<br /> <br /> gây chết chuột (gây chết 0% chuột). Kết quả<br /> nghiên cứu độc tính cấp theo liều của acid<br /> gambogic dùng đường uống được thể hiện<br /> qua bảng 1.<br /> Theo dõi sau 72 giờ và trong suốt 14 ngày<br /> nhận thấy các lô chuột uống acid gambogic<br /> <br /> - Chuột nhắt trắng nhịn đói qua đêm, được<br /> <br /> liều 100 mg/kg không xuất hiện các dấu hiệu<br /> <br /> chia thành các lô khác nhau, mỗi lô 10 con.<br /> <br /> bất thường. Dấu hiệu chậm vận động xuất<br /> <br /> Cho chuột uống thuốc thử với liều tăng dần để<br /> xác định liều thấp nhất gây chết 100% chuột<br /> và liều cao nhất không gây chết chuột (gây<br /> chết 0% chuột).<br /> <br /> hiện trên các lô chuột uống acid gambogic<br /> liều từ 120 mg/kg đến liều 360 mg/kg. Lô<br /> chuột bị tiêu chảy và chậm vận động bắt đầu<br /> từ mức liều 480mg/kg. Thời điểm chết của<br /> <br /> - Theo dõi tình trạng chung của chuột,<br /> <br /> chuột được nhận thấy trong vòng 24 giờ đầu<br /> <br /> quá trình diễn biến bắt đầu có dấu hiệu<br /> <br /> tiên sau khi uống thuốc thử với các mức liều<br /> <br /> nhiễm độc (như nôn, co giật, kích động, bài<br /> <br /> khác nhau.<br /> <br /> 10<br /> <br /> TCNCYH 114 (5) - 2018<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> Bảng 1. Kết quả nghiên cứu độc tính cấp theo liều của acid gambogic dùng đường uống<br /> Lô<br /> chuột<br /> <br /> n<br /> <br /> Liều dùng đường uống của<br /> acid gambogic (mg/kg)<br /> <br /> Số lượng<br /> chuột chết<br /> <br /> Dấu hiệu bất thường khác<br /> <br /> Lô 1<br /> <br /> 10<br /> <br /> 100<br /> <br /> 0<br /> <br /> Không<br /> <br /> Lô 2<br /> <br /> 10<br /> <br /> 120<br /> <br /> 1<br /> <br /> Không<br /> <br /> Lô 3<br /> <br /> 10<br /> <br /> 240<br /> <br /> 3<br /> <br /> Không<br /> <br /> Lô 4<br /> <br /> 10<br /> <br /> 360<br /> <br /> 6<br /> <br /> Không<br /> <br /> Lô 5<br /> <br /> 10<br /> <br /> 480<br /> <br /> 8<br /> <br /> Lô 6<br /> <br /> 10<br /> <br /> 600<br /> <br /> 10<br /> <br /> Chuột chậm vận động,<br /> tiêu chảy<br /> Chuột chậm vận động,<br /> tiêu chảy<br /> <br /> Bảng 2. Kết quả xác định LD50 của acid gambogic dùng đường uống<br /> theo phương pháp Litchfied - Wilcoxon<br /> Liều dùng acid<br /> gambogic<br /> <br /> Số lượng<br /> chuột chết/<br /> <br /> Tỷ lệ<br /> chuột<br /> <br /> đường uống<br /> (mg/kg)<br /> <br /> Tổng số<br /> chuột mỗi lô<br /> <br /> chết<br /> (%)<br /> <br /> (Y)<br /> <br /> 100 mg/kg<br /> <br /> 0/10<br /> <br /> 0<br /> <br /> 3,04<br /> <br /> 120 mg/kg<br /> <br /> 1/10<br /> <br /> 10<br /> <br /> 3,72<br /> <br /> 240 mg/kg<br /> <br /> 3/10<br /> <br /> 30<br /> <br /> 4,48<br /> <br /> 360 mg/kg<br /> <br /> 6/10<br /> <br /> 60<br /> <br /> 5,00<br /> <br /> 480 mg/kg<br /> <br /> 8/10<br /> <br /> 80<br /> <br /> 5,84<br /> <br /> 600 mg/kg<br /> <br /> 10/10<br /> <br /> 100<br /> <br /> 6,96<br /> <br /> Probit<br /> <br /> LD50 (mg/kg)<br /> <br /> 281,58<br /> <br /> Khoảng tin cậy<br /> 95% (mg/kg)<br /> <br /> [277,98 - 285,18]<br /> <br /> Kết quả bảng 2 và biểu đồ 1 cho thấy: Liều gây chết 50% chuột hay LD50 được xác định là<br /> 281,58 mg/kg. Khoảng tin cậy 95% của LD50 là 277,99 mg/kg - 285,18 mg/kg.<br /> <br /> TCNCYH 114 (5) - 2018<br /> <br /> 11<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> Probit (tỷ lệ chuột chết (0%)<br /> <br /> 7,50<br /> <br /> y = 4,312x - 5,5627<br /> R2 = 0,9328<br /> <br /> 1,80<br /> <br /> 2,00<br /> <br /> 2,20<br /> <br /> 2,40<br /> <br /> 2,60<br /> <br /> 2,80<br /> <br /> 3,00<br /> <br /> Log (liều dùng acid gambogic đường uống (mg/kg))<br /> Biểu đồ 1. Đồ thị tuyến tính để xác định LD50 của acid gambogic dùng đường uống<br /> <br /> IV. BÀN LUẬN<br /> Độc tính cấp (Acute toxicity) của thuốc là<br /> <br /> 30 phút trong 24 giờ đầu, sau đó theo dõi<br /> <br /> độc tính xảy ra khi dùng liều thử duy nhất<br /> <br /> hằng ngày trong 14 ngày sau khi uống thuốc<br /> <br /> dùng một lần [10]. Nghiên cứu độc tính cấp<br /> <br /> thử về ăn uống, hoạt động thần kinh, đi lại, leo<br /> <br /> nhằm cung cấp thông tin cho việc xếp loại<br /> <br /> trèo, bài tiết ... [3]. Nếu động vật chết, động<br /> <br /> mức độ độc của thuốc thử, dự đoán triệu<br /> <br /> vật được mổ để đánh giá đại thể tổn thương<br /> <br /> chứng và dự kiến biện pháp điều trị ngộ độc<br /> <br /> của các cơ quan [10; 14].<br /> <br /> cấp; thiết lập mức liều cho những thử nghiệm<br /> <br /> Nghiên cứu duy nhất về độc tính cấp của<br /> <br /> độc tính và tác dụng cũng như phạm vi an<br /> <br /> acid gambogic được thực hiện trên thế giới là<br /> <br /> toàn của thuốc nghiên cứu tiếp theo. Do vậy,<br /> <br /> nghiên cứu của Quinglong Guo và cộng sự<br /> <br /> thử độc tính cấp cần xác định được liều an<br /> <br /> vào năm 2006. Tuy nhiên, trong nghiên cứu<br /> <br /> toàn; liều dung nạp tối đa; liều gây ra độc tính<br /> <br /> này, acid gambogic được sử dụng theo<br /> <br /> có thể quan sát được; liều thấp nhất có thể<br /> <br /> đường tiêm tĩnh mạch. Kết quả nghiên cứu<br /> <br /> gây chết động vật thí nghiệm; liều LD50 (nếu<br /> <br /> của Quinglong Guo và cộng sự cho thấy tất cả<br /> <br /> có thể xác định được); những triệu chứng ngộ<br /> <br /> các chuột thí nghiệm có một số thay đổi về<br /> <br /> độc điển hình có thể quan sát được trên động<br /> <br /> hành vi như chậm chạp, giảm đáp ứng với các<br /> <br /> vật và khả năng hồi phục [13]. LD50 là một<br /> <br /> kích thích từ bên ngoài. Không có sự thay đổi<br /> <br /> thông số quan trọng để đánh giá độc tính của<br /> <br /> bệnh lý nào được nhận thấy ở chuột nhắt.<br /> <br /> thuốc. Liều có tác dụng dược lý thường vào<br /> <br /> Chuột chết được nhận thấy chủ yếu trong<br /> <br /> khoảng 1/10 liều LD50 (trong giới hạn từ 1/20<br /> <br /> vòng 24 giờ đầu tiên sau khi uống thuốc thử.<br /> <br /> đến 1/5 của LD50). Do đó nên xác định LD50<br /> <br /> Giá trị LD50 của acid gambogic dùng theo<br /> <br /> ngay từ khi nghiên cứu được bắt đầu. Theo<br /> <br /> đường tiêm tĩnh mạch chuột nhắt được xác<br /> <br /> Tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh tế (OECD<br /> <br /> định qua nghiên cứu là 45,993 mg/kg với<br /> <br /> - Organisation for Economic Co-operation and<br /> <br /> khoảng tin cậy 95% là 43,181 mg/kg - 48,450<br /> <br /> Development), động vật thực nghiệm cần<br /> <br /> mg/kg. Ngoài ra, nghiên cứu của Quinglong<br /> <br /> được theo dõi sau khi cho uống thuốc thử mỗi<br /> <br /> Guo và cộng sự cũng đã xác định được liều<br /> <br /> 12<br /> <br /> TCNCYH 114 (5) - 2018<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> thấp nhất gây chết 100% khi dùng đường tiêm<br /> <br /> uống nên chưa tính được chỉ số điều trị của<br /> <br /> tĩnh mạch là 60 mg/kg [14]. Hiện nay, trên thế<br /> <br /> thuốc thử. Tuy nhiên, liều LD50 cao gấp 7 lần<br /> <br /> giới, acid gambogic được dùng theo hai<br /> <br /> liều dùng trong độc tính bán trường diễn<br /> <br /> đường gồm đường uống và đường tiêm tiêm<br /> <br /> không gây độc trên chuột với một thuốc<br /> <br /> tĩnh mạch. Tuy nhiên, các thông số về dược<br /> <br /> chống ung thư cũng đã chứng minh được<br /> <br /> động học của acid gambogic chưa được<br /> <br /> một phần tính an toàn của thuốc thử.<br /> <br /> nghiên cứu cụ thể. Vì vậy, chưa có sự quy đổi<br /> nào giữa liều dùng đường uống và liều dùng<br /> đường tiêm tĩnh mạch. Đến nay, trên thế giới<br /> cũng như tại Việt Nam, chưa có công trình<br /> nghiên cứu về LD50 của acid gambogic dùng<br /> theo đường uống. Đây là nghiên cứu đầu tiên<br /> thực hiện xác định giá trị LD50 của acid<br /> gambogic dùng đường uống.<br /> <br /> Trong nghiên cứu này, ngoài xác định<br /> được LD50, nghiên cứu còn chỉ ra liều thấp<br /> nhất gây chết 100% chuột (LD100) là 600 mg/<br /> kg, và liều cao nhất không gây chết chuột<br /> (LD0) là 100 mg/kg. Một thông số rất quan<br /> trọng trong chọn liều dùng trên lâm sàng là<br /> LD0 hay còn gọi là liều NOAEL (No observed<br /> adverse effect level), đây là mức liều cao nhất<br /> <br /> Trong nghiên cứu độc tính bán trường<br /> <br /> mà không gây bất kỳ tai biến nào có thể quan<br /> <br /> diễn, liều dùng của acid gambogic được dùng<br /> <br /> sát được. Liều NOAEL là một giá trị quan<br /> <br /> trên chuột cống trắng chủng Wistar là 20 mg/<br /> <br /> trọng để có thể xác định được liều dùng trên<br /> <br /> kg/ngày và 30 mg/kg/ngày. Như vậy, liều LD50<br /> <br /> lâm sàng và đưa ra các khuyến cáo về việc sử<br /> <br /> trong thử nghiệm độc tính cấp gấp 7 lần liều<br /> <br /> dụng thuốc trên lâm sàng [14]. Các nghiên<br /> <br /> thử độc tính bán trường diễn. Cùng với thử<br /> <br /> cứu về tác dụng của acid gambogic trên thế<br /> <br /> độc tính cấp và độc tính bán trường diễn, một<br /> <br /> giới chỉ ra rằng acid gambogic có độc tính<br /> <br /> thông số khác cũng được xác định nhằm đánh<br /> <br /> chấp nhận được, hoạt tính chống ung thư<br /> <br /> giá tổng quan hơn tác dụng và độc tính của<br /> <br /> chọn lọc và khả năng là một tác nhân hóa trị<br /> <br /> thuốc đó là chỉ số điều trị (Therapeutic index).<br /> <br /> tiềm năng. Như vậy, tính chọn lọc của acid<br /> <br /> Chỉ số điều trị là tỷ số giữa liều chết trung bình<br /> <br /> gambogic giải thích được phần nào kết quả<br /> <br /> (LD50) và liều tác dụng dược lý có tác dụng<br /> <br /> nghiên cứu về tính an toàn của thuốc thử.<br /> <br /> trên 50% số động vật thí nghiệm (ED50). Đây<br /> là một chỉ số quan trọng nhằm quyết định xem<br /> có nên đưa thuốc sử dụng trên người hay<br /> không. Nếu chỉ số điều trị càng lớn thì phạm vi<br /> điều trị càng lớn và độc tính càng thấp [10].<br /> Thông thường, các thuốc thử có chỉ số điều trị<br /> lớn hơn 10 mới được đưa vào thử nghiệm<br /> lâm sàng. Tuy nhiên, một số thuốc chống ung<br /> thư mặc dù có chỉ số điều trị nhỏ hơn 10<br /> nhưng vẫn được xem xét đưa vào các thử<br /> <br /> V. KẾT LUẬN<br /> Kết quả nghiên cứu thử độc tính cấp trên<br /> động vật thực nghiệm của acid gambogic<br /> dùng theo đường uống cho thấy:<br /> - Liều 600 mg/kg là mức liều thấp nhất gây<br /> chết 100% chuột.<br /> - Liều 100 mg/kg là liều cao nhất không<br /> gây chết chuột (gây chết 0% chuột).<br /> <br /> nghiệm trên người sau khi cân nhắc lợi ích<br /> <br /> - Liều gây chết 50% chuột hay LD50 là<br /> <br /> và nguy cơ. Hiện nay, chúng tôi chưa có dữ<br /> <br /> 281,58 mg/kg. Khoảng tin cậy 95% của LD50<br /> <br /> liệu về ED50 của acid gambogic dùng đường<br /> <br /> là 277,99 mg/kg - 285,18 mg/kg.<br /> <br /> TCNCYH 114 (5) - 2018<br /> <br /> 13<br /> <br />