Đề tài: Khảo sát một số đặc điểm của loài Cordyceps sp. được tìm thấy tại Đà Lạt

̉ Ơ

̀Ơ

L I CAM  N

̀ ́ ̉ ̉ ̣ ̣ ̉ ̉ ̀ Đê hoan thanh đ  tàiề ̀ ́ : “Khao sat môt sô đăc điêm cua loai Cordyceps sp. đ cượ

̀ ́ ̀ ́ ̃ ́ ́ ̀ ̀ ̣ ượ ự ̃ ơ ̣ ̉ ̣ ̉ ̣ ” tac gia đa nhân đ ́ ́ c s  đong gop va giup đ  nhiêt tinh cua cac tim thây tai Đa Lat

̀ ́ ́ ́ ́ ̀ ̀ ̀ ̀ ̣ ̣ ́ thây giao, cô giao, cac anh chi, cac ban trong va ngoai nganh trong nhiêu năm qua. Tac

̀ ̉ ơ ̉ gia xin chân chân thanh cam  n:

̀ ̀ ̃ ̀ ̃ ươ ̣ ̣ ̣ ̉ ­ Ts. Tr ng Binh Nguyên ­ ́  Viên sinh hoc Tây Nguyên đa tân tinh chi dân va giup

́ ̀ ̀ ̀ ̀ ́ ự ̣ ̣ ̀ ̃ ơ đ  tôi trong qua trinh th c hiên va hoan thanh khoa luân nay.

̃ ̀ ̃ ̀ ́ ̣ ̉ ̣ ̣ ̣ ̣ ­ Cô  Vu Thi Liêu cung toan thê can bô, anh chi em trong Viên sinh hoc Tây

̃ ̀ ́ ̀ ̀ ̃ ́ ́ ̃ ư ̃ ơ ư ̣ ̣ ̣ ̣ ́ Nguyên đa nhiêt tinh giup đ  va tao moi điêu kiên cung nh  co nh ng đong gop

́ ́ ́ ́ ́ ̀ ̀ ́ ́ ư ư ̉ ̣ ̀ kiên th c hêt s c quy bau đê tôi hoan thanh khoa luân nay.

́ ̀ ́ ̃ ̀ ̀ ̃ ư ̣ ̣ ̣ ́ ̃ ­ Cac thây cô giao trong khoa sinh hoc đa day dô va truyên đat cho tôi nh ng kiên

́ ́ ́ ̀ ơ ư ̣ th c quy bau trong th i gian hoc tai tr ̀ ̣ ươ ng .

́ ̃ ́ ̀ ̀ ́ ̀ ̀ ̀ ơ ư ̣ ̣ Cuôi cung tôi xin chân thanh biêt  n bô me va nh ng ng ́ ̀ ươ   i thân cung ban be khoa

̀ ̃ ́ ̃ ̀ ̀ ơ ̣ ̣ ̣ ̣ ̣ 29 khoa sinh hoc tr ́ ̀ ươ ng Đai Hoc Đa Lat đa đông viên, giup đ  tôi hoan thanh khoa

̣ luân nay.̀

̀ PHAN NHA HOÃ

1

̀Ơ

L I CAM ĐOAN

̀ ́ ́ ̀ ̀ ́ ư ̃ ư ̉ ̉ ̣ Tôi cam đoan đây la công trinh nghiên c u cua tôi. Nh ng kêt qua va sô liêu

̀ ̀ ́ ́ ̀ ́ ̀ ư ượ ư ̣ ́ trong bai khoa luân nay ch a đ c ai công bô d ̀ ́ ́ ư ươ i bât c  hinh th c nao. Tôi hoan

̀ ̀ ̀ ự ̣ ̣ ́ toan chiu trach nhiêm tr ́ ươ c nha tr ̀ ̀ ươ ng vê s  cam đoan nay.

̀ ̀ ́ ̣ Đa Lat, ngay 22 thang 5 năm 2009

̉ ́ Tac gia

̀ PHAN NHA HOÃ

2

̣ ̣

MUC LUC

̣ ̉

DANH MUC BANG

ế ả ự ớ ữ ệ ả B ng 1.  K t qu  so sánh trình t ITS rDNA c a ủ Cordyceps sp.v i d  li u đã công

ố trên b

Genbank………………………………………………………………………….45

́ ̀ ́ ́ ưở ươ ̉ ̉ ̉ ̣ Bang 2: Anh h ng cua cac nguôn dinh d ̃ ng Cacbon khac nhau lên tôc đô sinh

ưở ̉ tr ng   cua   loai  ̀ Cordyceps  sp…………………………………………………………

46

3

́ ̀ ́ ́ ưở ươ ơ ̉ ̉ ̉ ̣ Bang 3 : Anh h ng cua cac nguôn dinh d ̃ ng Nit khac nhau lên tôc đô sinh

ưở ̉ tr ng cua ̀ loai Cordyceps sp.

………………………………………………………………...50

̀ ́ ́ ̀ ử ̃ươ ̉ ̉ ̉ Bang 4: Kha năng sinh bao t cua nâm Cordyceps sp. trên cac nguôn dinh d ng Nit ơ

́ khac nhau……………………………………………………………………………...54

́ ́ ̀ ưở ̣ ợ ̉ ̣ ̉ ́ Bang   5:   Tôc   đô   sinh   tr ng   cua   hê   s i   nâm Cordyceps  sp.   trên   cac   nông   đô ̣

saccharose khać

nhau……………………………………………………………………………...56

́ ̀ ưở ̣ ợ ̉ ̣ ̉ ̣ ̣ ́ Bang 6: Tôc đô sinh tr ́ ng cua hê s i nâm ́  Cordyceps sp. trên cac nông đô đam khac

nhau…………………………………………………………………………………...58

́ ́ ́ ́ ̣ ợ ở ̉ ̉ ̣ ̉ ́ Bang 7: Sinh khôi cua hê s i nâm Cordyceps sp. cac trang thai khac nhau cua môi

̀ươ tr ng dinh

ng̃ươ ………………………………………………….............................60 d

̣

DANH MUC HINH̀

4

ượ Hình   1: ấ  N m Cordyceps sp. đ c thu ậ th p ừ t ự  t

nhiên................................................38

ủ ể ề Hình   2: ấ   C u ạ t o   c a th chén trên   b ặ   m t ủ   c a th ể

túi....................................................39

ủ ể ở Lát ắ   c t ngang   c a th chén ậ   v t kính

Hình   3: 10×.......................................................39

ể 4: th ứ ch a bào ử  t

Các Hình túi.....................................................................................40

ử ở Các bào 5: t túi ụ ch p ậ v t kính

Hình 40×..................................................................40

ự ̉ ̉ ̀ Hinh 6. S nay ̀ mâm cua ̀ bao t ử

́ tui...............................................................................41

ử Hình 7: Các bào t vô tính ............................................................................................41

̀ ̀ ́ ̀ ̃ ̀ ̣ ợ ự ư ̉ ̉ ̣ Hinh   8.   S   phat   triên   cua   hê   s i   theo   chu   ky   tao   nên   nh ng   vong   đông

tâm................42

ủ ả ầ ườ Hình   9: ể   Các   m m   c a   qu   th   khi   nuôi   trong   môi   tr ng   dinh

ngưỡ .........................42 d

ả Hình   10. ế   K t qu gi ả i trình ự t ITS rDNA ồ   (m i

xuôi)....................................................43

ả Hình   11. ế  K t qu gi ả i trình ự t ITS rDNA ồ   (m i

ng cượ ).................................................44

̀ ́ ợ Hinh   12:   S i   nâm Cordyceps  sp.   khi   nuôi   trên   môi   tr ́ ́ ̀ ư   ươ ng   co   ch a

arabinose.............48

̀ ́ ợ Hinh   13:   S i   nâm Cordyceps  sp.   khi   nuôi   trên   môi   tr ́ ́ ̀ ư   ươ ng   co   ch a

glucose................48

̀ ́ ợ Hinh   14:   S i   nâm Cordyceps  sp.   khi   nuôi   trên   môi   tr ́ ́ ̀ ư   ươ ng   co   ch a

saccharose...........49

5

̀ ́ ợ Hinh   15:   S i   nâm Cordyceps  sp.   khi   nuôi   trên   môi   tr ́ ́ ̀ ư   ươ ng   co   ch a

mantose...............49

̀ ́ ợ Hinh   16:   S i   nâm Cordyceps  sp.   khi   nuôi   trên   môi   tr ́ ́ ̀ ư   ươ ng   co   ch a

(NH4)2SO4...........52

̀ ́ ợ Hinh   17:   S i   nâm Cordyceps  sp.   khi   nuôi   trên   môi   tr ́ ́ ̀ ư   ươ ng   co   ch a

pepton.................52

̀ ́ ́ ́ ợ ư Hinh   18:   S i   nâm Cordyceps  sp.   khi   nuôi   trên   môi   tr ̀ ươ ng   co   ch a   cao

̣ thit................53

4NO3............53

̀ ́ ́ ́ ợ Hinh 19: S i nâm Cordyceps sp. khi nuôi trên môi tr ̀ ư ươ ng co ch a  NH

̀ ́ ợ ̀ươ ̉ Hinh   20   :   S i   nâm Cordyceps sp.   nuôi   trên   môi   tr ng   long

̃ tinh ...............................61

̀ ́ ợ ̀ươ ̉ Hinh   21:   S i   nâm Cordyceps sp. nuôi   trên   môi   tr ng   long

̣ ̣ đông................................61

̀ ́ ̀ ́ ̣ ợ ̉ ́ Hinh 22 : Sinh khôi khô cua hê s i nâm Cordyceps sp. sau 10  ngay nuôi cây trong

̀ ̃ ̣ ̉ điêu kiên long tinh.......................................................................................................62

̀ ́ ́ ̀ ́ ̣ ợ ̉ Hinh 23: Sinh khôi khô cua hê s i nâm Cordyceps  sp. sau 10   ngay nuôi cây trong

̣ ̉ ̀ điêu kiên long

̣ đông...............................................................................................................62

6

Ở Ầ M  Đ U

̀ ́ ́ ̀ ́ ́ ̀ ướ ườ ượ ̣ ̉ Tr c đây ng ́ i ta xem nâm la môt đôi t ́ ng ma co thê xêp no vao nhom vi

́ ̀ ́ ̃ ̃ ́ ́ ́ ự ư ̣ ̉ ̣ ̣ ̣ ̉ sinh vât, cung co thê xêp vao gi ́ ơ i th c vât. Do nh ng đăc tinh đôc đao cua chung ma ̀

́ ̀ ́ ̀ ́ ượ ̉ ̣ ̣ theo   quan   điêm   hiên   đai,   nâm   đ c   xêp   vao   gi ́ ơ i   riêng   la   gi ́ ơ i   nâm   ­   Regnum

ữ Mycetoidem Fries (Syn. Regnum Fungi Conard; Mecetalia Takhtajan). Nh ng phát

ấ ự ệ ệ ẫ ớ ớ ộ ấ ấ hi n m i nh t d a trên các d n li u phân t ử ạ  l ậ   ầ i cho th y n m g n v i đ ng v t

ự ậ ơ h n th c v t.

́ ̀ ̀ ́ ̣ ươ ư ư ơ ̉ ̃ Nâm la nh ng c  thê di d ́ ̃ ̣ ươ ng, không ch a Chlorofin di d ́ ̃ ng băng cach hâp

́ ́ ̀ ̀ ́ ́ ự ̣ ̣ ̣ ̣ ̀ thu, no co vai tro quan trong trong t nhiên va cuôc sông sinh vât noi chung va con

7

̃ ́ ̀ ́ ́ ̀ ́ ư ở ̣ ng ́ ̀ ươ i noi riêng ́ ơ   [10].Vì thê, ngay nay nâm hoc tr  nên nganh nghiên c u hâp dân v i

̀ ̣ ̀ nhiêu nha khoa hoc.

́ ̀ ̃ ̀ ̀ ́ ́ ̀ ̀ ư ̣ ̣ ̣ ́ Nâm la môt trong nh ng sinh vât co nhiêu hinh dang, phong phu vê mau săc,

̀ ̀ ̀ ̃ ́ ́ ́ ̀ ̀ ̀ ̀ ư ̉ ̣ ̣ ̣ ự   đông đao vê thanh phân loai va nh ng đăc tinh sinh hoc đôc đao. Nâm la nguôn th c

̀ ̀ ́ ́ ́ ́ ́ ượ ̉ ̣ ̉ ̣ ̣ phâm, nguôn d c liêu qui gia la chê phâm trong trang tri nôi thât trong công nghiêp

́ ̀ ́ ̀ ̉ ̣ ̣ ̣ san xuât dung cu văn phong, trong môi tr ̀ ́ ươ ng sinh thai nâm la sinh vât di d ̃ ̣   ̣ ươ ng hoai

́ ́ ́ ̀ ́ ̀ ̀ ̀ ́ ́ ơ ự ̣ ̉ ̣ sinh, no co vai tro rât l n trong viêc thuc đây chu trinh tuân hoan vât chât t nhiên,

́ ́ ́ ́ ̀ ́ ̀ ̀ ̃ ư ơ ̣ ̣ khoang hoa cac chât h u c  lam sach môi tr ̀ ươ ng sinh thai va tăng đô phi nhiêu cho

đât.́ [7]

̃ ́ ̀ ́ ́ ư ợ ̣ ̣ ̣ ́ Tuy nhiên, bên canh nh ng măt co l ̃ ̣   i môt sô loai nâm cung gây không it thiêt

́ ́ ̃ ́ ́ ự ư ̣ ̣ ̉ ̉ hai cho con ng ̀ ươ i. Nâm ki sinh trên th c vât gây ra nh ng tôn thât đang kê cho năng

́ ̀ ́ ̀ ̣ ử ̣ ̣ ̣ ̣ ́ suât cây trông, nâm con ki sinh gây bênh cho con ng ̀ ́ ươ i, đông vât. Viêc s  dung nâm

̃ ̀ ̃ ́ ́ ̀ ự ẩ ư ̣ ̣ ̉ hoang dai lam th c ph m đôi khi cung gây ra nh ng hâu qua đang tiêc vi trong thiên

́ ̃ ́ ự ư ̣ ̣ nhiên   co   nh ng   loai   nâm   c c   đôc   nh : ư Amanita   phalloides,  Amanita   muscaria,

́ ́ ̀ ượ ̣ ́ Boletus santanas co chât đôc gây chêt ng ́ ̀ ươ ơ i v i liêu l ng nho. ̉ [10]

ộ ớ ấ ộ ấ   Nhóm n m ấ Cordyceps và các chi liên quan là m t nhóm n m thu c l p n m

ộ ề ề ồ ơ ở ̉ túi (Ascomycota) bao g m h n 450 loài thu c v  nhi u chi khác nhau. B i kha năng

̀ ̀ ́ ̀ ́ ̀ ́ ư ơ ̣ ̉ ̉ ̣ ́ ́   tiêu diêt côn trung va trong c  thê cua chung con ch a nhiêu chât quan trong co y

̃ ́ ̀ ́ ́ ̀ ̣ ượ ượ ̣ ̣ ̣ ́ ơ nghia rât l n vê măt d c liêu cho nên hiên nay no đang đ c cac nha khoa hoc trên

́ơ ́ thê gi i quan tâm.

ế ớ ề ơ ự ệ ả Nhi u n i trên th  gi i đã d a vào kh  năng ký sinh gây b nh cho côn trùng

ể ạ ừ ừ ả ả ấ ố ọ ẩ ủ c a nhóm n m này đ  t o ra các s n ph m thu c tr  sâu sinh h c, v a có kh  năng

ừ ệ ạ ừ ả ả ượ ấ ề ễ ườ phòng tr  sâu b nh l i v a đ m b o đ c v n đ  ô nhi m môi tr ng do d  l ư ượ   ng

ệ ự ữ ầ ả ậ ố ạ ộ ố thu c b o v  th c v t gây nên. Trong nh ng năm g n đây, t ủ   i m t s  vùng c a

ướ ợ ị ư ị ừ ệ ề ạ ấ n ệ c ta đã xu t hi n nhi u đ t d ch sâu b nh m nh nh  d ch sâu róm r ng thông

ề ả ồ ồ ườ ừ (Qu ng Nam, Lâm Đ ng), r ng đi u (Lâm Đ ng), các v n cà phê (Di Linh ­ Lâm

ạ ườ ồ ừ ồ ị ầ Đ ng); ve s u phá ho i v n cà phê, r ng cao su (Lâm Đ ng, Daklak), d ch châu

ử ữ ấ ằ ồ ệ ạ ớ ề ế ch u (Đ ng b ng sông C u Long) … gây ra nh ng thi t h i l n v  kinh t cho bà

ư ả ưở ừ ế ả ộ con nông dân cũng nh  làm  nh h ệ ng đ n công tác b o v  cây r ng. M t trong

8

ữ ả ữ ệ ồ ườ ử ụ nh ng gi ờ i pháp h u hi u đ ng th i cũng an toàn cho môi tr ố   ng, đó là s  d ng đ i

ệ ử ụ ủ ướ ả ẩ ọ ể kháng sinh h c. Tuy nhiên vi c s  d ng các s n ph m c a n c ngoài có th  chúng

ẽ ạ ặ ề ệ ắ ố ữ ự ể ấ ằ ta s  l i g p nh ng r c r i khác v  vi c m t cân b ng sinh thái do s  phát tri n quá

ứ ủ ư ườ ậ ộ ợ ố ươ ươ m c c a các loài nh p n i nh  tr ng h p  c b u vàng, cây Mai D ng…

ộ ứ ụ ủ ấ ả ọ ữ M t  ng d ng vô cùng quan tr ng n a c a nhóm n m này là kh  năng s ử

̀ ̀ ư ả ẩ ượ ự ứ ẩ ụ d ng chúng nh  các s n ph m d ́ c  và th c ph m ch c năng. Nhiêu loai nâm

́ ́ ́ ượ ử ̣ ̣ ̣ ̣ ̣ ̉ ̃ Cordyceps đa đ c s  dung cho muc đich y hoc tai Trung Quôc, Nhât Ban, Thai Lan,

̀ ủ ư ọ ổ ố Han Quôc... ́ Theo đánh giá c a y h c c  truy n Trung Qu c cũng nh  các nghiên ề

́ ́ ̀ ầ ấ ớ ơ ố ớ ụ ữ ̉ ứ c u g n đây cho th y có t i h n 20 tác d ng h u ích cua nhom nâm nay đ i v i con

ng i. ườ

́ ́ ́ ̀ ̃ ư ̣ ̣ ̉ ̀ Hiên nay Nhât Ban, Thai Lan, Han Quôc, Trung Quôc... la nh ng n ́ ́ ươ c rât quan

̃ ́ ̀ ́ ̀ ư ứ ề ấ tâm đên nh ng loai nâm nay. Tuy nhiên, ở ướ  n c ta các nghiên c u v  nhóm n m này

ư ượ ụ ể ư ế ề ẫ ậ ẫ v n ch a đ c ti n hành, chúng ta v n ch a có các ghi nh n c  th  nào v  thành

ủ ầ ấ ạ ệ ph n loài c a nhóm n m này t i Vi t Nam.

ệ ự ậ ộ ỉ ậ ồ ộ ơ Lâm Đ ng là m t t nh Tây nguyên là n i có h  th c v t, đ ng v t, côn trùng

ệ ấ ớ ở ủ ạ ồ ờ ớ ự vô cùng đa d ng. Đ ng th i cùng v i s  phong phú c a khu h  n m l n, đây hoàn

ự ộ ưở ể ế ề ả toàn là m t khu v c lý t ệ ấ   ứ ng đ  ti n hành các nghiên c u kh o sát v  khu h  n m

́ ư ề ặ ả ọ ể ký sinh côn trùng và kh o sát các đ c đi m sinh h c cũng nh  đánh gia ti m năng

ứ ụ ủ ấ ng d ng c a nhóm n m này.

́ ̀ ̀ ́ ̣ ̣ ̉ ̣ ̉ ́ Chung tôi tiên hanh đê tai: “ ̀ ̀ Nghiên c úư   môt sô đăc điêm sinh hoc cua loai

̀ ́ ̀ ́ ̀ ́ ́ ượ ư ̣ ̣ ̣ ̣ ̣   nhăm muc đich nghiên c u môt sô đăc Cordyceps  sp. đ c tim thây tai Đa Lat”

̀ ́ ̀ ư ể ̉ ̣ ̉ ̣ ̉ điêm sinh hoc cua loai ̀ Cordyceps sp. t ́ ̀ ấ   ư  đo tìm hi u tiêm năng  ng dung cua loai n m

̀ ́ ́ ̀ ượ ờ ̣ ̣ ̣ nay trong y d ồ c và trong đôi khang sinh hoc, đ ng th i tao nguôn nguyên liêu ban

́ ́ ư ứ ụ ̣ ̣ ầ đ u phuc vu cho cac nghiên c u  ng d ng sau này.

9

̀

̀

̉ ̣

PHÂN I: TÔNG QUAN TAI LIÊU

́

̀

́

Cordyceps

1.1. Vi tri hê thông va đăc điêm sinh hoc cua chi

̣ ̣ ̣ ̉ ̣ ̉

́ ́ ̣ ̣ ̉ Cordyceps 1.1.1. Vi tri hê thông cua chi

10

̀ ́ ơ ự ́ Chi nâm ́ Cordyceps co h n 450 loai khac nhau [13]. Tr ́ ̃ ư   ươ c đây, d a trên nh ng

̀ ̀ ̀ ́ ́ ́ ́ ́ ̀ ử ́ ư ̉ ̉ ̣ ̉ ̣ ̉ nghiên c u vê hinh thai cua thê tui (asci), đô day cua vach tui, câu tao cua bao t ́    tui

́ ̀ ̣ ố ư ng ́ ̀ ươ i ta xêp chung vao ho ̣ Clavicipitaceae trong hê th ng nh  sau:

̀ Ascomycota Nganh (phylum):

̀ Pezizomycotina Phân nganh  (subphylum):

L p ́ơ (class): Sordariomycetes

Bộ (odor): Hypocreales

̣ Clavicipitaceae Ho (familia):

Chi: Cordyceps

́ ̀ ̀ ̀ ̀ ́ ̃ ự ự ̣ ́ ự   Đên năm  2007, Gi­Ho Sung va công s  đa d a vao s  khac nhau vê hinh thai

́ ̀ ̃ ̀ ́ ́ ̃ ́ ́ ́ ̀ ử ơ ợ ̣ ̣ ̣ ̣ va cac dân liêu vê sinh hoc phân t đa săp xêp môt cach h p ly h n vê hê thông phân

́ ̀ ́ ̀ ̣ ̉ ̉ ̉ ̣ loai cua nhom  ́ ̀ Cordyceps. Theo quan điêm cua Sung thi cac loai thuôc nhom nay

̣ ượ đ ̀ c chia thanh 3 ho:

̀ ́ ̀ ̀ ̃ ́ ơ ư ̉ Ho ̣ Cordycipitaceae: V i chi chuân la chi ̀ Cordyceps, gôm nh ng loai co mau

́ ́ ́ ̀ ̀ ̀ ́ ́ ̣ ơ ử ̣ ̣ ̉ ̉ ̣ ̉ sang, chât đêm thit, thê qua dang chai, tui hinh tru v i đinh tui day, bao t ́  tui th ̀ ươ   ng

̀ ́ ̀ ́ ̀ ́ ̃ ́ ́ ở ̀ ơ ́ ơ ự ư ̣ ̣ ̣ co hinh tru, nhiêu vach, ́ ̀  giai đoan thanh thuc co s  lam r i cac kh p nôi gi a cac

́ ́ ̀ ̃ ̀ ̀ ́ ử ư ̣ ̣ ̣ ̀ bao t ̀ ̉    hoăc không, đai đa sô nh ng loai nay ki sinh trên âu trung va nhông cua

́ ́ ́ ở ̣ Lepidoptera va ̀Coleopera trong cac la muc, rêu hoăc d ́ ́ ̀ ̣ ươ i cac tâng đât.

̀ ́ ượ ự Ho  ̣ Ophiocordycipitaceae: Đ c đê xuât d a trên chi Ophiocordyceps  Petch.

̀ ́ ́ ̀ ̀ ́ ̀ ́ ́ ơ ̃ ư ́ ơ ̉ ̣ Đây la chi l n nhât cua nhom nâm ki sinh trên côn trung. Phân l n nh ng loai thuôc

́ ́ ́ ́ ̀ ́ ́ ̀ ́ ̀ ̣ ̣ ̣ ho nay co săc tô đen, chât thit dai, đan hôi, câu tao tui th ̀ ươ ng không nhô cao, chung

́ ̀ ́ ̉ ượ ươ ̣ ̉ ̣ O. th ̀ ươ ng ki sinh trong giai đoan con non cua cac vât chu đ c chôn d ́ ́ i đât (

̃ ̃ ́ ̀ ́ ̃ ư ̣ sinenes) hoăc trên gô muc ( ̀ ̣ O.  variabilis). Tuy nhiên, cung co nh ng loai ki sinh vao

́ ̀ ́ ưở ́ ưở ̣ ̉ ̣ ̉ giai đoan tr ng thanh cua vât chu (vi du: ̣ O. unilateralis   ki sinh trên kiên tr ng

́ ́ ̀ ̀ ưở ̉ ̣ thanh, ̀ O.  sphecocephalla ki sinh trên ong băp cay (wasps) tr ́   ng thanh). Thê đêm co

́ ̀ ̀ ̀ ̀ ̀ ̀ ượ ̣ ư ̉ ̣ ́ nhiêu hinh thai khac nhau, đ c gi ́ ơ i han t ̀  hinh chi, dai t ́ ợ   ơ i dang hinh chuy va s i

́ ̀ ́ ̀ ̀ ̀ ơ ượ ̣ ̀ ơ x  tuy theo loai. Môt chi m i đ ́ c đê xuât đo la chi ̃ư   Elaphocordyceps  gôm nh ng

11

́ ́ ̀ ̀ ̀ ̣ ̣ ̀ loai ̀ Cordyceps ma ki sinh trên chi nâm ́ Elaphomyces va môt vai loai ki sinh trên đông

́ ́ ́ ́ ́ ̀ ́ ́ ơ ̣ ̣ ̉ ̣ ợ vât chân kh p. Chung co đăc điêm s i cuông dai, it thit, co mau nâu tôi t ́ ̀ ơ   ơ i mau h i

́ ̀ ́ ́ ́ ́ ́ ượ ự ́ ơ ̉ ̣ ̣ ̉ ̣ ́ xanh, it mau trăng. Thê đêm đ c kêt nôi tr c tiêp v i vât chu hoăc gian tiêp thông

̀ ́ ́ ́ ́ ̃ ̀ ̃ ́ ư ợ ư ̣ ̣ ̣ ́ qua câu truc giông nh  s i nâm dang rê. Phân h u thu (fertile part) co dang chuy đên

́ ̀ ́ ̀ ̀ ̉ ượ ả ̣ ̣ ̣ ̣ ̀ dang cum đâu. Qu  thê đ ̀ ̀ c nhân chim môt cach hoan toan hoăc không hoan toan

́ ̀ ́ ̀ ̀ ̀ ́ ̀ ́ ́ ̣ ơ ử ự ̉ ̣ ̉ ̣ trong thê đêm. Tui hinh tru v i đinh tui day, bao t ̀ ́ ơ    tui hinh tru, đa vach, co s  lam r i

́ ̃ ́ ̀ ́ ơ ư ́ cac kh p nôi gi a cac bao t ử .

́ ̀ ́ ̣ ̣ ̉ Balansia, Ho  ̣ Clavicipitaceae: No bao gôm môt chi chinh công sinh trên co (

̀ ́ ̃ ̀ ư ̣ Claviceps, Epichloe...) va ki sinh trên nh ng loai sâu thuôc chi Hypocrella . Thêm vaò

́ ́ ́ ̀ ́ ̀ ́ ̀ ơ ượ ượ ượ ̣ đo co môt chi m i đ ́ c đê  xuât đo la chi ́ Metacordyceps co sô l ng loai đ c mô

̀ ̀ ́ ́ ́ ươ ̉ ̣ ̣ ̉ ̣ ̣ ư M. ̀ ta   con   gi ́ ̃ ơ i   han,   mâu   vât   con   t ̀ i   thi   thê   đêm   co   mau   trăng   (vi   du   nh

̀ ̀ ̀ ̀ ̃ ̃ ̀ ̀ ́ ơ ư ̣ yungmunensis) t ́ ́ ơ   i mau hoa ca, mau hông hoăc xanh. V i nh ng mâu khô thi hâu hêt

́ ́ ́ ́ ̀ ợ ̉ ̉ ̣ ̣ ̣ ̀ co mau đen ( M. taii). Kêt câu cua thê đêm la dang s i, không co thit nh ư Cordyceps s.

̀ ́ ́ ̀ ́ ượ ươ ̣ ̉ ̉ ̣ ̣ ̉ ̉ ̣ s., va vât chu cua chung th ̀ ươ ng đ c chôn d ́ i đât. Ho nay co đăc điêm: Thê đêm

̀ ̀ ̀ ́ ̀ ́ ̀ ́ ́ ́ ử ́ ̣ ơ ̣ ̣ ̣ ̣ ̉ co mau tôi hoăc sang, dang thit hoăc dai, tui bao t hinh tru v i đinh tui day. Bao t ử

́ ̀ ́ ́ ́ ́ ̃ ́ ̀ ̀ ơ ́ ơ ự ư ử ̣ ́ tui th ̀ ̀ ươ ng co hinh tru, đa vach, co s  lam r i cac kh p nôi gi a cac bao t ̣    hoăc

không.

́ ́ ̀ ư ậ ệ ̉ ̣ ̣ ̣ ̣ ̃ Nh  v y, theo quan ni m cua phân loai hoc hiên đai  thì nhom nâm nay se đ ượ   c

̀ phân   thanh   3   ho: ̣ Clavicipitaceae,   Ophiocordycipitaceae,   Cordycipitaceae.   T ngươ

̃ ́ ́ ơ ư ̣ ́ ́ ư ng v i môi ho co cac chi nh  sau:

Clavicipitaceae:  Conoidiocrella,   Hypocrella,  Metacordyceps,  Moelleriella,

Orbiocrella, Regiocrella, Samuelsia, Villosiclava.

Cordycipitaceae:  Ascopolyporus, Cordyceps, Hyperdermium, Torrubiella.

Ophiocordycipitaceae: Elaphocordyceps, Ophiocordyceps.

̣ ̉ ̣ ̉ Cordyceps 1.1.2. Đăc  điêm sinh hoc cua chi

ề ặ ả ấ ọ ờ ị Nhóm n m này có mang nhi u đ c tính sinh h c vô cùng thú v  nh  kh  năng

ả ể ệ ạ ộ ký sinh gây b nh cho côn trùng và hình thành nên các d ng qu  th  vô cùng đ c đáo.

ứ ạ ớ ự ở ữ ủ ộ ờ ấ Ngoài ra chúng còn s  h u m t vòng đ i r t ph c t p v i s  đan xen nhau c a các

12

̀ ́ ̀ ữ ả ử ậ ợ ̣ ̣ ̉ pha sinh s n vô tính và h u tính. Bao t ̀  tui khi găp điêu kiên thu n l i nay mâm,

̀ ̀ ̀ ́ ́ ́ ́ ́ ơ ợ ơ ơ ̣ ́   hinh thanh nên s i nâm s  câp, đ n nhân, đ n bôi, co vach ngăn phân nhanh, va phat

́ ̀ ́ ̀ ́ ̀ ̉ ự ̣ ợ ̉ ̣ ̣ ̉ ̉ ̣ ̀ triên manh, hê s i nay co thê th c hiên sinh san vô tinh nhiêu lân đê tao nên vô sô bao

́ ́ ̃ ̀ ̀ ́ ̣ ợ ư ̣ ̉ ̣ ử t ́ ở  vô tinh. Tiêp sau đo nh ng vung nhât đinh cua hê s i, trong điêu kiên thuân l ̣ ợ   i

̀ ̀ ́ ̀ ơ ơ ̉ ̉ ̉ cua môi tr ̀ ươ ng hinh thanh nên c  quan sinh san cai (ascogon) va c  quan sinh san

́ ́ ̀ ́ ̀ ̀ ́ ư ̣ ự đ c (antheredium) chung th ́ ̀ ̀ ơ   ươ ng hinh thanh t ng căp va sat nhau. Khi tiêp xuc v i

̀ ̃ ́ ́ ́ ̀ ̀ ́ ́ ̀ ự ̀ ư   nhau thi diên ra s  giao phôi sinh chât. Sau đo ascogon hinh thanh cac mâu lôi, t ng

̀ ̀ ̀ ̀ ́ ̀ ́ ́ ̀ ̀ ́ ́ ợ ̣ căp nhân va sinh chât đi vao cac mâu lôi va hinh thanh nên s i sinh tui. Cuôi cung ở

̀ ̀ ́ ̃ ́ ̀ ̀ ̀ ́ ́ ́ ̀ ̉ ợ ử ́ ư ̣ đâu tân cung cua s i sinh tui diên ra qua trinh hinh thanh tui co ch a cac bao t . Ngay

́ ́ ́ ́ ự ơ ượ ợ ̣ ̉ ̣ ư t ̃ ̀  khi co s  giao phôi, căp c  quan sinh san đa đ ơ c cac s i nâm đ n bôi bao quanh

́ ̀ ́ ́ ̀ ̀ ́ ́ ơ ợ ợ ̉ ̃ ư   chúng phat triên lên cung v i cac s i sinh tui hinh thanh nên cac s i ngang xen gi a

̀ ́ ́ ̃ ́ ̀ ư ́ ơ ̉ ̣ ̣ ̣ ̉ cac tui trong l p sinh san cung nh  bên chăt phia ngoai tao nên thê sinh bao t ử

(ascocarpe).

ệ ợ ấ ế ậ ấ ố   Khi n m  ấ Cordyceps  t n công v t ch , các h  s i n m xâm chi m và cu i ủ

ấ ề ủ ủ ế ể ả ậ ồ   cùng thay th  các mô c a v t ch , trong khi th  qu  thuôn dài (ch t n n bao g m

ề ợ ấ ụ ể ạ ặ ả ạ   nhi u s i n m sinh s n vô tính) có th  có d ng hình tr , phân nhánh ho c hình d ng

ứ ạ ể ả ỏ ổ ấ ề ph c t p. Ch t n n mang nhi u ề th  qu  túi ứ     nh  hình bình thót c , trong có ch a

ứ ấ ử ạ ợ ỉ ườ nhi u ề nang. Các nang n m này ch a các bào t nang d ng s i ch , thông th ng v ỡ

ả ẽ ể ễ ra thành các m nh và có l là các th  lây nhi m.

ộ ộ ớ ủ M t vài loài ả Cordyceps  có kh  năng tác đ ng t ậ   i hành vi c a côn trùng v t

ủ ế ả ắ ẳ ch . Ch ng h n, ạ Cordyceps unilateralis làm cho ki n ph i leo lên cây và g n mình

ướ ả ự ố ố ế ả ử ừ ể vào đó tr c khi ch t, đ m b o s  phân ph i t i đa các bào t ả ọ  th  qu  m c ra t t ừ

ơ ể c  th  côn trùng đã ch t. ế [15]

̀ ộ ố Các loai thu c chi này sinh s ng ch  y u t ủ ế ạ châu Á  (đáng chú ý là  Trung i

ậ ở ố ả Qu cố , Nh t B n ề ả , Tri u Tiên và Thái Lan). Chúng sinh sôi n y n  t t trong các khu

ề ạ ả ớ ừ r ng ôn đ i và nhi ệ ớ ẩ ướ [17]. Chúng có nhi u tr ng thái sinh s n vô tính, t đ i  m t

ẽ ộ trong  đó  Beauveria  (có  l g p  c ả Beauveria  bassiana,  Metarhizium  và  Isaria)  là

ế ế ừ ề ạ ấ ượ ử ụ ể ượ đ c bi t đ n nhi u nh t, do các d ng này t ng đ c s  d ng trong ki m soát sinh

ị ọ ố ớ d ch h i h c đ i v i ạ  do côn trùng.

13

ố ớ ấ ủ ấ ọ Theo công b  m i nh t c a các nhà n m h c Thái Lan, chi nâḿ Cordyceps có

̀ ́ ̃ ̀ ́ ́ ở ̉ ̉ ̉ ́ ơ t i khoang 450 loai khac nhau. Chi riêng ̀  Trung Quôc đa tim thây khoang 60 loai.

́ ́ ̀ ́ ́ ơ ư ượ ̉ Tuy nhiên, cho đên nay ng ̀ ươ i   ta m i chi nghiên c u đ ̀ c nhiêu nhât hai loai:

́ ̀ ư ́ Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc. va ̀Cordyceps militaris ( Lex Fr.) Link. Loai th  nhât

̀ ́ ̀ ̀ ̀ ̀ ̀ ư ̣ ̣ ̉ ̣ ̣ ̣ ̉ ̣ ̉ goi la đông trung ha thao, loai th  hai goi la nhông trung ha thao. Đông trung ha thao

ộ ạ ữ ấ ộ ộ ọ Cordyceps sinensis là m t d ng c ng sinh gi a m t loài n m túi có tên khoa h c là

ủ ấ ớ ộ ộ (Berk.) Sacc. v i sâu non ( u trùng) c a m t loài côn trùng thu c chi Hepialus.

ườ ủ ặ ấ Th ng g p nh t là sâu non c a loài Hepialus armoricanus. Ngoài ra còn 40 loài

ộ khác thu c chi Hepialus  cũng có th  b ể ị Cordyceps sinensis  ký sinh. Vào mùa đông

ắ ầ ế ế ấ ưỡ ấ n m b t đ u ký sinh vào sâu non và làm ch t sâu non vì ăn h t ch t dinh d ủ   ng c a

ư ộ ắ ầ ấ ấ ỏ ọ ỏ ươ ọ chúng. Mùa hè  m áp n m b t đ u m c ra kh i sâu nh  m t ng n c  và v n lên

ặ ấ ỏ kh i m t đ t.

ạ ả ố ườ ể Đông trùng h  th o khi còn s ng, ng ớ   i ta có th  trông rõ hình con sâu, v i

ư ấ ộ ỏ ọ ố đuôi là m t cành nh , m c lá. Khi s y khô, nó có mùi tanh nh  cá, đ t lên có mùi

ợ ấ ả ầ ạ ơ ố ọ   th m. Ph n "lá" hình d ng gi ng ngón tay, dài kho ng 4 ­ 11cm do s i n m m c

ư ừ ề ầ ằ ầ ố dính li n vào đ u sâu non mà thành. Đ u sâu non gi ng nh  con t m, dài ch ng 3­5

ườ ẫ ặ ả cm, đ ớ   ng kính kho ng 0,3 ­ 0,8 cm. Bên ngoài có màu vàng s m ho c nâu vàng v i

ả ằ ở ầ ỏ ơ ầ ầ ằ kho ng 20­30 v n khía, v n khía ỏ   ầ  g n đ u nh  h n. Ph n đ u có màu nâu đ ,

ư ằ ố ấ ả ư ặ ở ữ đuôi gi ng nh  đuôi con t m, có t t c  8 c p chân, nh ng 4 đôi ấ    gi a là rõ nh t.

ấ ệ ấ ọ ừ ộ Ch t đ m n m hình que cong m c ra t ơ  mình sâu non, dài h n sâu non m t chút.

ấ ệ ễ ẻ ắ ấ ộ ơ ầ Sâu non d  b  gãy, ru t bên trong căng đ y, màu tr ng h i vàng; ch t đ m n m khá

́ ộ ơ ỗ ̀ dai và bên trong ru t h i r ng, có màu trăng nga. [17]

ạ ả ủ ế ấ ở Đông trùng h  th o ch  y u tìm th y vùng núi cao trên 4.000m cao nguyên

ứ ạ ả ố Cordyceps sinensis ạ Thanh­T ng (Thanh H i­Tây T ng) và T  Xuyên (Trung Qu c).

̀ ́ ́ ́ ́ ̀ ̃ ́ ự ư ư ̣ ̣ ̉ ̣ ̣ ̣   la môt loai thuôc quy. Cac nghiên c u cô truyên cung nh  cac th c nghiêm hiên đai

́ ́ ̀ ́ ̀ ̀ ́ ư ́ ơ ̣ ̣ ̉ ̣ ̣ đêu xac đinh đông trung ha thao hâu nh  không co tac dung phu đôi v i ng ̀ ươ i va ̀

̣ ̣ đông vât. [17]

ộ ấ ọ ớ ồ M t vài loài trong chi Cordyceps là các ngu n hóa ch t sinh h c v i các tính

ấ ọ ượ ạ ả ch t   sinh   h c   và d c   h c ́ ọ   quy,   nh ủ   ư cordycepin;   d ng   sinh   s n   vô   tính   c a

14

ộ Cordyceps subsessilis (Tolypocladium inflatum) là ngu n c a ạ   ồ ủ cyclosporin — m t lo i

ậ ủ ơ ể ườ ấ ữ ấ ộ ượ d c ch t h u ích trong c y ghép các b  ph n c a c  th  ng i, do nó kìm hãm hệ

ễ ị ễ ặ ố ị mi n d ch (thu c ngăn ch n mi n d ch ) [12].

ọ ổ ủ ư ứ ề ố ầ   Theo đánh giá c a y h c c  truy n Trung Qu c cũng nh  các nghiên c u g n

̀ ́ ́ ấ ớ ơ ố ớ ụ ữ ̉ đây cho th y có t i h n 20 tác d ng h u ích cua nhom nâm nay đ i v i con ng ườ   i

nh :ư

ạ ụ ượ ố ớ ậ ố ­ Ch ng l ấ ủ i tác d ng x u c a các tân d ụ ố ớ ộ   c đ i v i th n, thí d  đ i v i đ c

ủ tính c a Cephalosporin .

ả ườ ặ ổ ợ ươ ệ ậ ­ B o v  th n trong tr ng h p g p t n th ế ng do thi u máu.

ạ ự ụ ồ ủ ệ ậ ố ­ Ch ng l ế i s  suy thoái c a th n, xúc ti n vi c tái sinh và ph c h i các t ế

ả ở ậ ể bào ti u qu n th n.

ế ế ạ ­ Làm h  huy t áp ở ườ  ng i cao huy t áp.

ạ ệ ượ ở ơ ố ­ Ch ng l i hi n t ế ng thi u máu c  tim.

ữ ổ ậ ủ ị ị ­ Gi n đ nh nh p đ p c a tim.

ườ ễ ệ ặ ị ­Tăng c ng tính mi n d ch không đ c hi u.

ế ệ ễ ặ ề ­ Đi u ti ị t tính mi n d ch đ c hi u.

ườ ự ủ ế ị ­Tăng c ự ng năng l c th c bào c a các t ễ  bào mi n d ch.

ườ ủ ộ ế ố ụ ượ ậ ươ ­Tăng c ng tác d ng c a n i ti t t ế  tuy n th ng th n và làm tr ng n ở

các nhánh khí qu n.ả

ườ ế ừ ờ ­Tăng c ị ng d ch ti ả t trong khí qu n và tr  đ m.

ậ ủ ơ ể ­ Làm ch m quá trình lão hoá c a c  th .

ế ệ ạ ậ ủ ổ ­ H n ch  b nh t t c a tu i già.

ự ư ủ ơ ể ố ­ Nâng cao năng l c ch ng ung th  c a c  th .

ạ ế ạ ố ­ Ch ng l ủ ơ ể i tình tr ng thi u oxygen c a c  th .

ườ ụ ư ­ Tăng c ơ ể ng tác d ng l u thông máu trong c  th .

15

ạ ủ ế ạ ố ớ ơ ể ­ H n ch  tác h i c a tia gamma đ i v i c  th .

ườ ụ ầ ầ ấ ­ Tăng c ng tác d ng an th n, tr n tĩnh th n kinh.

ườ ệ ề ế ồ ộ ườ ­ Tăng c ng vi c đi u ti t n ng đ  đ ng trong máu.

ơ ữ ộ ạ ả ố ­ Làm gi m cholesterol trong máu và ch ng x  v a đ ng m ch.

ộ ế ố ủ ế ụ ­ Xúc ti n tác d ng c a các n i ti t t (hormone).

ườ ứ ấ ấ ­ Tăng c ng ch c năng tiêu hoá và h p thu các ch t dinh d ngưỡ

Ứ ế ể ả ạ ẩ ậ ­  c ch  vi sinh v t có h i, k  c  vi khu n lao.

­ Kháng viêm và tiêu viêm.

̀

́

ụ ụ ả ạ ố ố ớ ­ Có tác d ng phòng ch ng các r i lo n tình d c cho c  2 gi i.

ưở

ươ

1.2. Anh h

ng cua cac nguôn dinh d

̃ ng

Cacbonhydrat, đam lên s

̉ ̉ ̣

ự

́

́

phat triên cua nâm.

̉ ̉

hydrat

̀ 1.2.1. Nguôn Cacbon

́ ́ ̀ ́ ̀ ́ ̀ ử ợ ̣ ̉ ̉ ́    Nâm s  dung nguôn Hydrat Cacbon đê tông h p nên cac thanh phân câu truc tê

̀ ́ ̀ ́ ̀ ́ ̀ ̀ ́ ượ ́ ơ ư ơ ̉ ̉ ̣ bao, trao đôi chât va năng l ́ ng trong tê bao va c  thê. Đôi v i t ng loai nâm khac

́ ̀ ́ ̀ ̀ ̀ ́ ́ ́ ̀ ̀ ̉ nhau thi yêu câu vê nguôn Cacbon khac nhau cho qua trinh sông cua chung vi chung

́ ́ ́ ́ ̀ ́ ́ ̀ ̀ ử ̣ ̉ ̣ ̣ ̣ co đăc điêm vê hinh thai, câu tao khac nhau do đo s  dung nguôn Cacbon rât đa dang

́ ́ ́ ́ ́ ̃ ́ ̀ ̀ ́ ư ư ̉ ̉ ̣ ̉ ̣ ma chu yêu la nh ng polyme cua cac loai đ ̀ ́ ̣ ươ ng ph c tap, chi co môt sô rât it cac

́ ́ ̀ ử ượ ư ̣ ̣ ̀ ợ h p chât Cacbon ma nâm không s  dung đ c nh  parafin, dâu mo ̉ [7] do vây nâḿ

́ ̀ ́ ́ ̀ ̣ ử ự ử ượ ́ ơ ̣ ̉ ̣ ̣ co s  phân biêt rât l n vê kha năng s  dung cac nguôn Cacbon, môt n a trong l ng

́ ́ ́ ̀ ượ ̣ ư ̣ ượ ̉ ̉ ̉ ̉ ̉ khô cua qua thê nâm đ c tao t ̀  Cacbon, co thê nâm đoi hoi môt l ́ ơ   ng Cacbon l n

́ ̀ ́ ́ ́ ́ ̀ ́ ́ ư ̣ ̣ ̀ ơ h n bât ky môt nguyên tô khac. Nâm cân nguôn Cacbon nh  môt yêu tô băt buôc ̣  [6].

́ ́ ́ ̀ ́ ́ ́ ơ ử ̣ ̣ ̀ Co y kiên cho răng glucose la loai đ ̀ ́ ̣ ươ ng đ n s  dung tôt nhât cho cac loai nâm ăn.

́ ̀ ́ ́ ̃ ư ơ ̣ ̣ Tuy   nhiên,   nhiêu   loai   nâm   cung   moc   tôt   trên   các   lo i   đ ̀ ạ ươ ng   đ n   khac   nh   D­

̀ ̀ ̃ ́ ư ư ̣ ̣ ở Chytridales, fructoza,   D­manoza   va   D­galactoza   tr ̀   nh ng   ngoai   lê   tim   thây

̀ Blastocladiales va Saproleguiales .

16

́ ̀ ́ ư ượ ̣ ̣ ̣ Cac loai polysaccarit nh  cenlulose, tinh bôt, glycogen đêu đ ử c nâm s  dung

̀ ́ ̀ ư ̉ ̀ va th ̀ ươ ng thi no thuy phân thanh oligosaccharide nh  mantose, saccharose, lactose,

̀ ̃ ́ ́ ̀ ́ ̀ ự ử ư ̣ ̉ ̣ ̀ ́   cellobiose nh ng cung co môt sô loai co kha năng s  dung tr c tiêp, điêu nay tuy

̀ ́ ́ ̀ ự ̣ ̣ ̉ ́ thuôc vao s  co măt cua cac enzyme cân thiêt. [6]

́ ́ ̀ ̃ ̀ ự ư ̉ ̉ ̣ ̉ Theo kêt qua nghiên c u cua Yu­Xiang Gu va công s  (2007) đa chi răng khi s ử

̀ ́ ́ ́ ̃ ̀ ̣ ̉ ̣ ̉ dung 4% đ ̀ ươ ng thi sinh khôi cua nâm Cordyceps militaris tăng manh va no se giam

̀ ̀ ̀ ̀ ̃ ự ợ ưở ̣ ̣ ̣ ̉ khi nguôn đ ̀ ươ ng bi can kiêt. Nguôn Cacbon la nguôn hô tr  cho s  sinh tr ng cua

́ ̀ ́ ́ ́ ́ ̀ ư ơ tê bao tôt h n so v i n ́ ơ ươ c chiêt khoai tây (t ̀ ̀  20,4 ± 1,3g đên 29,6 ± 1,4g vao ngay

́ ́ ̀ ́ ư ưở ̣ ự ử ươ ̉ ̣ ̣ ự th  5. S  sinh tr ng cua tê bao đat c c đai khi s  dung 20 % n ́ c chiêt khoai tây

́ ́ ́ ươ ̉ ̣ co bô sung 2 % đ ̀ ử ươ ng sucrose. Khi s  dung PG (20 % n ́ ̉  c chiêt khoai tây co bô

̀ ́ ́ ́ ơ ử ư sung 2 % đ ̀ ơ ươ ng glucose) thi cho sinh khôi thâp h n so v i khi s  dung PS nh ng no ́

̀ ̀ ́ ́ ̀ ́ ́ ̃ ự ợ ơ ̉ ̣ ̃ la nguôn Cacbon thich h p cho s  tich luy nucleoside va baz . Cac tac gia cung nhân

́ ̀ ̀ ́ ư ư ̣ thây răng khi nông đô glucose tăng t ̀ ̀  0,5 – 6 % thi sinh khôi tăng t ́ ̀  20,2 ± 1,5g đên

́ ự ơ ươ 31,2 ± 1,4g. Tuy nhiên s  tăng nucleoside và baz  không theo khuynh h ́ ng đo ma ̀

́ ượ ̣ ượ ̉ ́ sô l ng tôi đa cua adenosine, guanosine, cytidine, adenosine, uracid đat đ c khi s ử

̣ dung 2 % glucose.

̀ ơ 1.2.2. Nguôn Nit

́ ́ ̀ ́ ́ ́ ơ ợ ươ ̣ ̉ ̣ ̣ ử  Nâm s  dung Nit đê câu tao nên mang s i nâm d ́ ợ i dang cac h p chât kitin,

̀ ̀ ̀ ́ ́ ́ ̀ ơ ơ ̉ ̀ ngoai ra Nit ̀  con tham gia vao thanh phân câu truc cua tê bao, c  thê d ́ ̉ ươ ạ   i d ng

́ ̀ ́ ơ ̉ protein, enzyme, coenzyme... do đo Nit ̀  la nguôn dinh d ̃ ươ ng không thê thiêu đ ượ   c

́ ́ ́ ́ ̀ ́ ́ ở ̉ ử ơ ư ơ ̣ nâm. Nâm co thê s  dung cac nguôn Nit khac nhau nh : nit không khi, nitrat,

̀ ́ ̀ ̀ ́ ư ơ ư ̉ amon va Nit ơ ư ơ [6]. Nh ng không phai cac nguôn Nit ̃  h u c ợ  đêu thich h p nh  nhau

́ ̀ ́ ́ ̀ ̀ ̀ ́ ̀ ư ơ ử ̉ ̉ ̣ ̣ ̣ ́ cho tât ca loai nâm, nâm co thê đăc tr ng vê nguôn Nit ́    ma chung s  dung va môt sô

́ ́ ̃ ́ ̀ ử ự ơ ̉ ̣ ̉ ̣ ̣ tac gia khac đa phân loai nâm d a theo kha năng s  dung nguôn Nit ̣   . Do vây, viêc

̀ ́ ̀ ́ ơ ợ ượ ưở ̣ ̣ ̉ ̣ ̉ chon nguôn Nit ́  thich h p la rât quan trong đê đat chât l ng sinh tr ̣  ng cao cua hê

̀ ̀ ̀ ự ̉ ̉ ợ s i va s  hinh thanh qua thê.

́ ́ ̀ ̃ ̀ ự ư ̉ ̉ ̣ ̉ Theo kêt qua nghiên c u cua Yu­Xiang Gu va công s  (2007) đa chi ra răng: S ự

́ ̀ ́ ưở ự ợ ̉ ̉ ̉ ̉ ̣ anh h ́ ng cua pepton, cao nâm men (yeast extra) va s  kêt h p cua ca hai tai cac

17

́ ̀ ́ ́ ̀ ự ưở ́ ơ ̣ ̉ nông đô khac nhau lên s  sinh tr ng cua nâm Cordyceps militaris la không l n lăm.

̀ ́ ̀ ́ ̀ ơ ưở ự ̉ ́ Tuy   nhiên   cac   nguôn   Nit khac   nhau   anh   h ng   khac   nhau   lên   s   hinh   thanh

́ ̀ ̀ ́ ̀ ̃ ̀ ́ ự ơ ̣ ̣ ́ ̀ nucleosid va baz . Măc du s  khac nhau nay la  không dê nhân thây trong hâu hêt cac

́ ̀ ự ấ ợ ợ ̉ tr ̀ ̀ ươ ng h p. S  kêt h p cua 0,3% cao n m men (yeast extract) va 0,3% pepton la s ự

́ ́ ́ ̀ ̀ ̣ ự l a chon tôt nhât cho nâm Cordyceps militaris vê nguôn Cacbon.

́ ̀ ́ ̀ ́ ̀ ̀ ́ ơ ượ ử ̣ ̉ ̉ ̣ ̣ Nêu nguôn Nit ́   c s  dung riêng le thi co thê xac đinh gân đung nông đô tôi đ

̀ ́ ̀ ́ ̃ ́ ư ơ ự ư ̉ ̉ ̉ ̃ u cua môi nguôn Nit ̉    cho s  phat triên cua nâm. Khi dung nh ng muôi amon cua

́ ̀ ́ ̀ ́ ̀ ̃ ́ ́ ̀ ̃ ư ̣ ̣ ̣ cac acid manh, nông đô tôi  u th ̀ ươ ng thâp vi nông đô cao muôi amon se dân đên tinh

̣ ở ự ̣ ̣ ̉ ̣ trang ngô đôc b i s  giam pH trong dung dich ( 6).

́ ̀ ́ ̀ ợ ̃ ơ ư ơ ơ ơ ̣ Thông th ̀ ươ ng s i nâm tâp trung nguôn nit h u c  cao h n so v i nguôn Nit ơ

̀ ̃ ́ ̀ ơ ơ ư ơ ợ vô   c .   Nguôn   Nit h u   c   thich   h p   la   amino   acid   (arginin,   acid   glutamic,

̀ ̃ ́ ư ợ ̣ ̉ ̀ glycerin...), peptid, protein, ure, pepton la hôn h p ph c tap cua peptid va protein.

́ ̀ ́ ̀ ̀ ̀ ̃ ́ ư ́ ơ ơ ư Pepton ch a phân l n cac vitamin tan trong n ́ ươ c va la nguôn Nit h u ich đ ươ ử  c s

́ ̀ ́ ́ ́ ́ ư ̣ ̣ ̣ ̣ dung trong nuôi trông môt sô loai nâm đăc tr ng [7]. Cac amino acid không co gia tri ̣

́ ̀ ́ ́ ơ ự ư ươ Ả ưở ̣ ́ nh  nhau đôi v i s  dinh d ̃ ng nâm.  nh h ng môt amino acid lên qua trinh s ử

̀ ́ ̃ ̀ ́ ̃ ̀ ́ ư ư ̣ ̣   dung nh ng loai nâm khac nhau thi thay thê theo nh ng amino acid liên quan va loai

́ ̀ ́ ́ ́ ̀ ư ự ưở ̣ nâm đăc tr ng, th ̀ ươ ng thi asparamin cho s  sinh tr ng tôt nhât rôi đên glycine, acid

asparamic, acid lactic.

̀ ́ ự ơ ươ ươ ư ̉ ̣ ̉ S  thay đôi nông đô Nit trong môi tr ̀ ng dinh d ̀ ̃ ự   ng đ a đên s  thay đôi vê

̀ ̀ ̀ ́ ́ ́ ̀ ́ ̃ ̉ ượ ̣ ợ ̉ ̉ san l ́ ư   ng va thanh phân sinh hoa cua hê s i nâm. Do đo nhiêu tac gia đa nghiên c u

̀ ̀ ́ ̀ ̃ ́ ươ ̣ ̉ ̣ ̣ viêc bô sung đam vao môi tr ́ ̀ ng nuôi trông nâm va đa rut ra kêt luân sau: Amonium

́ ́ ́ ơ phosphat,   amonium   sulfat,   amonium   clorua...tôt   v i   nâm Pleurotus   ostreatus;

́ postassium nitrat đôi v i ́ơ Pleurotus sajor­caju, ure v i ́ơ Pleurotus florida...

18

́

́

́

ưở

ự

́ 1.3. Cac nhân tô sinh thai anh h

́ ́ ng đên s  phat triên cua nâm

.

̉ ̉ ̉

̣ ̣ 1.3.1. Nhiêt đô

̀ ́ ̀ ̣ ươ ự ư ̉ ̣ ̣ ̣ ̉ Nhin chung nâm đoi hoi nhiêt đô t ng t ́  nhau, nhiêt đô tôi  u khoang 25ºC,

́ ̀ ́ ̀ ́ ̀ ́ ̉ ư ư ̣ ̣ ̣ nhiêt đô tôi thiêu t ̀ ̣   0 – 5ºC. Trên 30ºC hâu hêt cac loai nâm ăn  a nhiêt trung binh bi

̀ ́ ơ ̣ ̣ ̣ ư Coprinus fimentanus va Volvariella thiêt hai, ngoai tr ̀ ̀  volvacea thích nghi v i điêu

́ ́ ́ ơ ̣ ́ ̣ ơ kiên nhiêt đ i. Đôi v i nâm Cordyceps sinensis  (Paecilomyces hepialis)  Cs­4  phat́

ở ̉ ̣ ̣ ́ triên tôt nhiêt đô 23ºC.

́ ̀ ̀ ̀ ̃ ự ưở ̣ ợ ̉ ̉ ̉ ̣ S  sinh tr ng cua hê s i va hinh thanh qua thê nâm ăn diên ra trong gi ́ ơ i han

́ ́ ̣ ự ự ưở ̣ ̣ ̣ ̣ ̣ ̉ dao đông nhiêt kha rông. Nhiêt đô c c thuân cho s  sinh tr ̀ ̣ ợ ng cua hê s i nâm va s ự

́ ̀ ̀ ̀ ̀ ́ ̉ ươ ơ ̉ ̉ ̣ ̣ ̉ ̉ hinh thanh qua thê khac nhau. Nhiêt đô đê hinh thanh qua thê th ̀ ̣   ng thâp h n nhiêt

́ ́ ưở ̣ ợ ự ̉ ợ ̣ ̣ ̉ ̣ ̣ ̣ đô sinh tr ̣  ng cua s i nâm. Cuôi giai đoan nuôi hê s i, s  thay đôi đôt ngôt nhiêt đô

̀ ́ ̃ ̉ ̉ ̉ se thuc đây ra nhiêu qua thê.

1.3.2 Đô pḤ

́ ̃ ́ ̀ ́ ́ ́ ́ ư ́ ư ở ̉ ̣ Cac nghiên c u đa chi ra răng đô pH thich  ng ̀ ́    cac nhom nâm khac nhau thi

̀ ̀ ́ ́ ́ ự ự ưở ̉ ợ ̣ ̣ khac nhau, nhin chung gia tri pH < 7 la c c thuân cho s  sinh tr ng cua s  nâm tuy

́ ̀ ̀ ́ ́ ́ ̣ ợ ưở ̉ ̣ nhiên hâu hêt hê s i nâm đêu co thê sinh tr ng đ ượ ở c gia tri pH > 7.

́ ́ ̀ ư ̉ ̉ ́ ư   Theo kêt qua nghiên c u cua M. Petre, M. X. Pen va L. X. Mao. Khi nghiên c u

́ ́ ưở ự ̉ ̉ ̉ ̉ Cordyceps sinensis (Paecilomyces ự s  anh h ng cua pH lên s  phat triên cua nâm

́ ̀ ́ ̀ ́ ̀ ở ̉ ̣ ̉ ́ ́ hepiali) Cs­4 thi cac tac gia nhân thây ́ ́  pH băng 5,5  thi nâm phat triên tôt nhât.

́ ́ ́ ̀ ự ưở ươ ự ̉ ̉ ̉ ̣ ̉ S  thay đôi pH co thê anh h ng đên gia tri cua nguôn dinh d ̀ ̃ ng va s  co ́

́ ̣ ̣ ̣ ̣ măt hay văng măt vi sinh vât canh tranh.

1.3.3.  S  thông khí ự

́ ́ ̀ ́ ́ ́ ự ơ ̉ ̣ ̣ ̉ ̀   Nâm la c  thê sông, cho nên trong hoat đông cua chung s  hô hâp đong vai tro

2 cho hoat đông hô hâp. Vi

́ ̀ ́ ̀ ̀ ̀ ̀ ́ ́ ̣ ̣ ̣ ̣ ́ rât quan trong, do vây hâu hêt cac loai nâm đêu cân nhiêu O ́

̀ ́ ̀ ̀ ̀ ́ ư ử ưở ̣ ̣ ̉ ̉ ̉ du: nâm bao ng  giai đoan nay mâm cua bao t va sinh tr ̣ ợ ng cua hê s i co liên

́ ̀ ́ ̀ ̀ ̀ ̣ ợ ự ̣ ̣ ̉ ̉ quan đên nông đô CO ́ ư   2 cao, 22%. D a vao đăc điêm nay, khi u hê s i nâm bao ng  co

̀ ́ ̀ ́ ̀ ́ ́ ̀ ư ư ư ̉ ̣ ̉ ̣ ̣ ̣ thê đây kin đê duy tri nông đô CO ̣  2 cao, v a  c chê vi sinh vât canh tranh v a giup hê

19

́ ̀ ́ ̀ ư ở ư ơ ̣ ̣ ̉ ̉ ợ s i moc nhan; nh ng ́  giai đoan ra qua thê nâm bao ng  cân thông thoang h n cac

̃ ́ ́ ́ ́ ̃ ́ ̀ ̃ ́ ̣ ̉ ̉ ̣ ̣ ̣ nâm khac, nêu không mu nâm se dep, chân dai, dân đên qua thê nâm bi di dang.

̉ 1.3.4. Đô âṃ

́ ́ ́ ̀ ́ ́ ́ ́ ơ ̣ ̉ ̣ ̣ ̣ ̣ ̣ ̉ Đô âm la yêu tô rât quan trong, co liên quan mât thiêt đôi v i nhiêt đô. Đô âm

̀ ́ ́ ́ ̀ ́ ́ ự ở ưở ̣ ̉ ̉ qua cao hay qua thâp đêu gây tr  ngai cho s  sinh tr ̣  ng va phat triên cua nâm. Đô

̀ ̉ ̣ ̣ âm phân biêt thanh hai loai:

̣ ̉ ̉ + Đô âm cua không khi: ́

̀ ́ ́ ́ ̀ ̀ ́ ́ ư ượ ̣ ̣ ̉ ̀ ư Hâu hêt cac loai nâm trông đêu  a đô âm không khi cao; t c la l ơ   ng h i

̀ ́ ̀ ́ ́ ̀ ́ ̀ ̀ ơ ơ ̉ ̣ ́ ̣  ươ c trong không khi nhiêu. N i nao cang âm n i đo cang nhiêu nâm xuât hiên. Đô n

̀ ́ ́ ̀ ́ ợ ́ ơ ̉ âm thich h p la 70 – 90% đôi v i nâm trông.

ơ ̣ ̉ + Đô âm c  chât:́

̀ ̀ ́ ơ ư ̣ ̉ ̉ ̣ ̣ ̉ ̉ La đô âm cua nguyên liêu nuôi trông sau khi t ́ ươ i. Đô âm c  chât khoang t ̀  70

́ ̀ ̀ ̀ ự ợ ưở ̣ ợ ̉ ̉ ̀ – 80% va 80 – 95% la thich h p cho s  sinh tr ̀ ̉  ng cua hê s i va hinh thanh qua thê

̃ ̀ ́ ̀ ́ ́ ̣ ươ ươ ̣ ̉ ̉ ̣ ́ nâm. Đô âm cua nguyên liêu qua cao se lam cho tê bao nâm bi tr ng n ̃ ̀ ́   c va tan ra.

́ ́ ́ ́ ̃ ượ ̣ ̉ ̉ ̣ ̉ ̣ ̣ Ng c lai, khi co qua thê nêu thiêu đô âm trong nguyên liêu, tai nâm se bi teo [7]. Đăc̣

́ ̀ ́ ́ ́ ̀ ́ ợ ̣ ̣ biêt hâu hêt cac tr ̀ ̀ ươ ng h p trông nâm, ng ̀ ươ i ta đêu tranh không bi ung n ́ ̀ ̣  ươ c, vi đô

́ ̃ ́ ̀ ̉ ̣ âm qua cao mâm bênh dê phat sinh.

́ ̀ ̀ ́ ̀ ̀ ̀ ̀ ́ ư ư ̣ ̣ ̉ ̣ ̉ ̣ ̣ ̉ Vi vây, viêc điêu chinh đô âm cân hêt s c thân trong, phai tuy t ng loai nâm,

̀ ̀ ́ ́ ư ̣ ̉ ̉ tuy t ng giai đoan phat triên cua nâm.

20

̀

́

ƯƠ

PHÂN II: PH

́ Ư NG PHAP NGHIÊN C U

ượ

ư

́ 2.1. Đôi t

́ ng nghiên c u

̃ ́ ̀ ̀ ́ ứ ượ ̣ ̣ Mâu chung tôi nghiên c u đ c thu thâp tai vung nui Langbiang ­ Lâm Đông.

̀ ́ ̃ ượ ự ư ượ ̣ ̣ ̃ Mâu đ c thu thâp ngoai t ̀ ̀ ơ  nhiên theo nh ng th i gian nhât đimh va đ ́ c ghi chep

́ ̀ ̃ ́ ̀ ́ ̀ ́ ́ ư ượ ̣ ̉ ̣ ̣ ̣ cac đăc điêm dê mât nh  mau săc, mui vi... đ ́ c chup hinh theo cac goc đô khac

nhau.

̃ ̀ ̀ ượ ư ̣ ̣ ̣ ̣ Mâu nay hiên đang đ c l u tr ̃ ư ̣  tai phong công nghê vi sinh, Viên sinh hoc Tây

̀

́

̃

Nguyên.

ươ

2.2. Ph

ng phap thu mâu va bao quan

̉ ̉

̃ ̣ ̣ 2.2.1. Dung cu thu mâu t ươ i

́ ́ ́ ́ ự ̣ ̣ ̉ Dao nhon, tui nilon, hôp nh a, may anh, kinh lup…

́ ươ 2.2.2. Ph ̃ ng phap thu mâu

́ ́ ̀ ̀ ́ ̀ ̣ ̣ ̉ ̀     Đa sô cac loai thuôc chi nay th ́ ̀ ươ   ng moc trên xac cua côn trung năm trên la,

́ ́ ́ ̀ ́ ̃ ́ ̀ ̣ ̣ ̣ ́ ̉  ươ i đât hoăc trong cac hôc cây gô muc... vi vây khi thu hai chung tôi dung dao đê d

́ ́ ́ ̀ ̀ ̀ ́ ́ ơ ̣ ́ tach chung cung v i xac côn trung ma chung moc trên đo.

́ ̃ ử 2.2.3.  X  ly mâu

̃ ́ ̀ ́ ́ ́ ̀ ́ ơ ươ ̉ ̣ V i mâu t i sau khi quan sat, mô ta, chup hinh, ...chung tôi tiên hanh tach

́

́

́ ̀ ̃ ́ ́ ́ ́ ơ ̣ ̣ ̣ ̀ giông tai chô hoăc đem vê phong thi nghiêm tach giông s m.

ươ

2.3. Ph

̃ ng phap phân tich mâu

̣ ̣ ́ ̀ ư 2.3.1. Dung cu dung trong nghiên c u

̀ ̃ ̀ ́ ́ ̣ ̣ ̣ ́ 2.3.1.1. Dung cu dung trong phân tich cac dân liêu hinh thai

21

́ ́ ́ ́ ̀ ̀ ́ ̀ ́ ̉ ̣ ̣ ́ Lame, lamelles, kinh lup, kinh hiên vi, dâu kinh va cac vât liêu cân thiêt khac.

́ ̀ ́ ̣ ̣ ̉ ̣ 2.3.1.2. Dung cu dung đê tach va phân lâp giông

́ ̀ ́ ̀ ́ ̀ ̀ ́ ́ ̣ ̣ ̣ ̣ ̣  Côn 90ºC, ông nghiêm cac loai, binh tam giac, bêp gas, nôi hâp tiêt trung, dung cu

́ ́ ́ ́ ́ ̣ ̣ ̣ ̉ ̣ ̣ ̀ phân lâp, cac vât liêu cân thiêt đê pha chê môi tr ̀ ươ ng PGA, cac vât liêu khac...

́ ́ ̃ ươ ̣ 2.3.2. Ph ng phap phân tich mâu vât

́ ̀ ́ ̃ ́ ươ ̣ 2.3.2.1. Ph ́ ng phap phân tich cac dân liêu hinh thai

́ ́ ̀ ́ ́ ́ ́ ̃ ́ ơ ự ợ ̉ ̣ ̣ Quan sat băng măt th ̀ ̀ ươ ng, v i s  hô tr  cua kinh lup co đô phong đai 20 lân,

̀ ́ ́ ́ ́ ̀ ̀ ̀ ượ ̃ ư ̉ ̉ ̣ ̉ kinh hiên vi chung tôi lân l ̀ t xem xet va mô ta nh ng đăc điêm vê hinh thai, mau

́ ̀ ự săc,... theo trinh t sau:

̀ ̀ ́ ̉ ̉ ̣ ́ ­ Qua thê: Mau săc, hinh dang, kich th ́ ươ c…

̀ ́ ́ ́ ̀ ̣ ̉ ­ Cuông nâm: Hinh dang thăng hay cong queo; kich th ́ ̀ ươ c: chiêu dai, đ ̀ ươ   ng

̀ ̃ ́ ́ ́ ́ ̃ ̣ ̉ ́   kinh; bê măt cuông nhăn hay không nhăn; co lông hay không; co vay hay không co

vay…̉

́ ́ ̀ ̀ ̀ ̣ ̉ ́ ­ Thit nâm: Kich th ́ ươ c day mong, mau săc, don hay dai…

́ ̀ ́ ̀ ̉ ̣ ̀ ­ Thê dui trông: hinh dang, mau săc…

́ ̃ ́ ́ ươ ̣ ̉ 2.3.2.2. Ph ng phap phân tich cac dân liêu hiên vi

́ ́ ̀ ́ ́ ̉ ̣ ̀ ­ Thê  chen: hinh dang; kich th ̀ ́ ươ c: dai, đ ̀ ươ ng kinh; mau săc…

́ ́ ́ ̀ ̉ ̣ ̣ ­ Thê tui: Vi tri, kich th ́ ươ c, hinh dang…

́ ́ ́ ̀ ử ̣ ̣ ̀ ­ Bao t tui: Vi tri, kich th ́ ươ c, hinh dang…

́ ́ ́ ươ ̣ 2.3.2.3. Ph ̀ ng phap tach va phân lâp giông

́ ư ̉ ̣ Chuân bi môi tr ̀ ươ ng PGA theo công th c sau:

Agar: 15g.

Glucose: 20g.

́ ́ ươ N c chiêt 200g khoai tây.

22

ướ ừ ủ N c v a đ  1 lit.

́ ́ ̀ ́ ́ ả ươ ử ươ ̣ ̉ Phân lâp giông: Qu  thê nâm t i, r a băng n ̀ ́ c cât vô trung, sau đo kh ử

̀ ̀ ̀ ̀ ́ ̀ ̀ ượ ̣ ̉ ̃ ̀ trung măt ngoai băng côn 90ºC. Dung dao mô đa đ ̣ ử   ơ c thâm côn va h  qua ngon l a

̀ ̀ ́ ́ ̃ ́ ́ ̀ ́ ́ ́ ́ ở ư ́ ơ ̣ ̣ ̣ đen côn, tach lây mô thit bên trong nh ng vi tri kin đao it tiêp xuc v i nguôn bênh,

̀

̀

̀ ́ ̀ươ ̣ ́ sau đo cây vao môi tr ng thach.

́ ư ự

ưở

ươ

ơ

2.4. Nghiên c u s  anh h

ng cua nguôn dinh d

̃ ng Cacbon va Nit

lên

́

́

̉ ̉

̉ ̉

ự s  phat triên cua nâm

Cordyceps sp.

̣ ̣: 2.4.1. Dung cu

̃ ́ ́ ̀ ̀ ́ ́ ̣ ́ Binh tam giac, đia pettri, ông nghiêm, ông đong 500ml va 1000ml, côc rot 250ml

́ ̀ ̀ ́ ́ ̉ ̉ va 1000ml, bông không thâm n ́ ̀ ươ c, que cây, đen côn, tu cây, th ́ ́ ươ c đo, kinh hiên vi,

́ ́ ̣ ̀ nhiêt kê, giây quy...

2.4.2. Nguyên liệu:

6̉ H12O6),   saccharose

́ ̣ ­   Agar,   khoai   tây,   cac   loai   đ ̀ ươ ng   glucose   (C

(C6H22O11),mantose, arabinose.

4NO3, NH2SO4

́ ̣ ̣ ̣ ­  Cac loai đam: pepton, cao thit, NH

­  N ćươ .

́ ­  Giông nâm ́ Cordyceps sp.

́ ́ ́ ử ̣ ượ ư ̣ ̉ Giông nâm s  dung đê nuôi cây­ trên môi tr ̀ ươ ng đăc đ c gi ̃  trên môi tr ̀ ươ   ng

́ ở ̣ ̣ ̣ PGA (Potato – Glucose – Agar) trong ông thach nghiêng nhiêt đô 25ºC ± 1; pH  6,5.

́ ươ 2.4.3. Ph ́ ư ng phap nghiên c u

́ ́ ́ ́ ưở ̣ ợ ̣ ̉ ̣ ̉ 2.4.3.1. Thi nghiêm khao sat tôc đô sinh tr ng cua hê s i nâm Cordyceps sp.

̀ ́ ́ trên cac nguôn Cacbon khac nhau

́ ́ ́ươ ̀ Tiên hanh cac b c sau:

̀ươ ­ Pha môi tr ng:

̀ươ + Môi tr ng 1: Agar:           15g

23

Saccharose: 20g

N c: ́ươ           1 lit

̀ươ + Môi tr ng 2: Agar:                15g

Glucose:            20g

N c: ́ươ                1 lit

̀ươ + Môi tr ng 3: Agar:                  15g

Mantose:             20g

N c: ́ươ                  1 lit

̀ươ + Môi tr ng 4: Agar:                    15g

Arabinose:            20g

N c: ́ươ                    1 lit

̃ ́ ́ ̀ ́ ́ ơ ̉ ử ̣ ­  Đôi v i môi loai môi tr ́ ̀ ươ   ng ta tiên hanh đun sôi nho l a, cho đên khi tan hêt

́ ́ ̀ ̀ ̀ ̀ ́ ̉ agar, sau đó  bô sung đ ̀ ̀ ươ ng vao khuây đêu cho tan hêt đ ̀ ươ ng rôi rot vao binh tam

giać

́ ̀ ử ́ ­  Hâp kh  trung: 121 ºC; 1,2atm, 45 phut.

̉ ­ Đô môi tr ̀ ươ ng:

́ ̀ ́ ̀ ̀ ́ ̀ ̀ ư ượ ử ̉ ̉ Lây môi tr ̀ ươ ng v a đ ̀ c hâp kh  trung (con long) đem vao phong cây đô vao

̀ ́ ̃ ̀ ̃ ̣ ̣ đia petri va lăc ngang nhe nhe. Môi loai môi tr ̀ ̃ ươ ng 7 đia.

̀ ượ ̣ ươ ư ơ ̣ ̉ ̉ Môi tr ̀ ươ ng cân đ c gi ̃ ư ở nhiêt đô th ̀ ng  30 ± 2 ºC t ̀  12 – 24 gi ̀  đê kiêm

̀ ̃ ́ ́ ̀ ơ ̉ ̃ tra nhiêm đông th i cung đê cho bay b t h i n ̃ ́ ơ ơ ươ c trên năp đia.

24

́ ̃ ̀ ư ̣ ­ Cây giông ́ Cordyceps sp. t ̀ ̀ ́  ông thach nghiêng vao đia petri va đem nuôi.

́ ́ ́ ́ ́ ưở ̣ ợ ̣ ̉ ̣ ­ Quan sat và so sanh tôc đô sinh tr ng cua hê s i nâm qua cac loai môi tr ̀ ươ   ng

́ ́ ́ ̣ ̀ khac nhau va rut ra kêt luân.

́ ́ ́ ́ ưở ̣ ợ ̣ ̉ ̣ ̉ 2.4.3.2. Thi nghiêm khao sat tôc đô sinh tr ng cua hê s i nâm Cordyceps sp.

4NO3, (NH4)2SO4, pepton, cao thit.̣

́ ̀ ́ ơ trên cac nguôn Nit khac nhau: NH

́ ̀ươ ­ Pha chê môi tr ng:

4NO3 :    5g

̀ươ Môi tr ng 1: NH

Agar:          15g

N c: ́ươ         1 lit

̀ươ Môi tr ng 2: (NH4)2SO4:  5g

Agar:           15g

N c: ́ươ 1 lit

̀ươ Môi tr ng 3: Cao thiṭ  : 5g

Agar: 15g

N c: ́ươ 1 lit

̀ươ Môi tr ng 4: Pepton : 5g

Agar: 15g

N c:́ươ 1 lit

25

́ ́ ̀ ́ ́ ́ ơ ̣ ̃ Đôi v i môi loai môi tr ̀ ̉ ử ươ ng tiên hanh đun sôi nho l a cho đên khi tan hêt agar

̀ ́ ̀ ́ ̀ ̀ ̉ ̣ ́ sau đo bô sung đam vao rôi rot vao binh tam giac.

̀ ử ­ Kh  trung 12 1ºC ; 1,2atm; 45 phut́.

̀ ̃ ̃ ̉ ̣ ­  Đô môi tr ̀ ̃ ươ ng vao đia petri, môi loai 7 đia.

ư ở ̣ ươ ư ơ ̣ ­  Gi ̃  môi tr ̀ ươ ng nhiêt đô th ̀ ng t ̀  12 – 24 gi ̀ .

́ ̀ ́ ư ̣ ­  Cây giông ́ Cordyceps sp. t ̃ ̀  thach nghiêng vao đia petri sau đo đem nuôi.

́ ́ ́ ́ ́ ̣ ự ̣ ợ ̣ ̉ ̉ ­  Quan sat, đo đac, so sanh, rut ra kêt luân s  phat triên cua hê s i.

́ ̀ ̀ ́ ́ ̉ ̣ ̣ ­   Sau khi khao sat trên cac loai đ ̀ ̣ ươ ng đam khac nhau. Tim ra nguôn đam,

́ ́ ́ ́ ̀ ́ ́ ự ợ ̉ ̉ ̉ ̀ ̣   ̣ ợ ươ ng thich h p cho s  phat triên cua hê s i nâm ta tiên hanh khao sat trên cac loai đ

̀ ́ ̀ ́ ̀ ́ ́ ̣ ợ ự ư ̣ ̉ ̣ ̉ ̉ nông đô khac nhau, đê tim ra nông đô tôi  u cho s  phat triên cua hê s i nâm.

́ ̀ ́ ̀ ưở ơ ử ̉ ̉ ̉ ̉ ̉ 2.4.3.3. Khao sat anh h ng cua nguôn Nit lên kha năng sinh bao t cua nâm

Cordyceps sp.

́ ̀ ̀ ượ ự ưở ơ ử ̉ ̉ ̉ ̉ ̉ Đê biêt đ c s  anh h ng cua nguôn Nit lên kha năng sinh bao t ́    cua nâm

́ ̀ ́ ̀ ́ ̀ ử ươ Cordyceps sp. ta tiên hanh đêm bao t ̀  băng ph ̀ ́ ng phap đêm hông câu.

́ ̀ ́ Cach tiên hanh:

4NO3,

́ ̣ ̣ ̀ Sau 8 ngay nuôi nâm ́ ́ Cordyceps  sp.  trên cac loai  đam khac nhau: NH

2 mâu hoa vao 1ml n ̀

́ ́ ̃ ̃ ̀ ́ ơ ̣ ̣ (NH4)2SO4, pepton, cao thit. Đôi v i môi loai ta lây 1cm ́ ́ ươ c lăc

̀ ́ ̀ ́ ́ ̀ ̀ ̀ ́ ử ượ ̣ đêu cho đên khi cac bao t dinh trên thach đ ́ c hoa hêt vao n ́ ́ ươ c sau đo tiên hanh

̀ ̀ ̀ ́ ́ ́ ́ ư ̀ đêm băng phong đêm hông câu. Cach đêm nh  sau:

́ ̣ ́ ­  Đây la kinh lên l ́ ́ ươ i đêm.

̀ ́ ́ ́ ̀ ̀ ̀ ́ ́ ́ ́ ư ử ̣ ­  Lăc đêu ông nghiêm ch a bao t ̀ . Hut băng ông hut vô trung, sau đo cho đâu

́ ̀ ́ ́ ̀ ̀ ̀ ́ ự ử ́ ơ ̉ ̣ ́ ́ ông hut t a vao mep la kinh đê dich bao t ̃ ư  luông vao gi a hai l p kinh.

̉ ­  Đê yên 3­5 phut.́

́ ̀ ́ ́ ́ ̀ ̉ ̉ ̣ ́ ơ ­ Chinh kinh hiên vi v i vât kinh 40×, tim l ̀ ̀ ́ ươ i đêm trên phong đêm hông câu.

́ ̀ ́ ́ ư ơ ̉ ̣ ̣ ̉ Chinh thi tr ̀ ̣ ươ ng sao cho ch a tron môt ô l n trong đo có 4 × 4 băng 16 ô nho.

26

́ ́ ̀ ́ ̀ ử ̣ ươ ́ ơ ơ ̣ ̣ ̉ ̣ ­ Đêm sô bao t hiên diên trong ô l n. Chinh thi tr ́ ̀ ng tim môt ô l n khac.

́ ̀ ́ ́ ̀ ử ́ ơ ̉ Tiên hanh đêm sô bao t cua 5 ô l n.

́ ́ ̀ ự ưở ̣ ạ ự ̉ ̉ ̉ ̉ ̉ 2.4.3.4. Khao sat s  anh h ̣ ợ   ng cua nông đô đ m lên s  phat triên cua hê s i

nâm ́ Cordyceps sp.

̀ ̉ ̣ ́ ­ Chuân bi: 5 binh tam giac.

̃ 10 đia petri.

́ ̀ ở ̣ Pepton cac nông đô: 5; 10; 15; 20; 30g/lit.

̀ươ ­ Pha môi tr ng:

Agar: 15g/lit.

Pepton: 5; 10; 15; 20; 30g/lit.

ướ ừ ủ        N c v a đ  1lit.

́ ̀ ử ­ Đem hâp kh  trung: 121º C ; 1 atm; 45 phut́.

̀ ̃ ̉ ­ Đô môi tr ̀ ươ ng vao đia petri .

́ ́ ̀ ̃ ̃ ́ ử ̉ ̀ ­ Sau khi hâp kh  trung đem phân phôi môi tr ̀ ̣  ươ ng vao cac đia petri đa chuân bi

́ ̀ ̃ ̃ ̃ ư ́ ơ ̣ ̉ ̉ ̉ ̣ săn,  ng v i môi nông đô đô 3 đia. Đê môi tr ̀ ươ ng ôn đinh.

̀ ́ ̀ ́ ̃ ́ ̀ ̉ ́ ­  Cây giông vao đia: ́ ̃  1 – 2 ngay sau khi đô đia, cây giông vao; sau đo đem nuôi.

́ ̀ ự ưở ̣ ươ ự ̉ ̉ ̉ ̉ 2.4.3.5. Khao sat s  anh h ng cua nông đô đ ́ ̀ ̉ ợ   ng lên s  phat triên cua s i

nâḿ

́ ̀ ̀ ́ ươ ự ự ư ưở ̣ ấ ̉ ̉ ̉ Cach lam t ng t nh  khi khao sat s  anh h ng cua nông đô n m lên s ự

́ ́ ̀ ́ ̀ ́ ̣ ợ ử ươ ợ ở ư ̉ ̉ ̉ ̣ ̣ ́ phat triên cua hê s i nâm, chi khac la s  dung đ ́ ̀ ng thich h p cac m c nông đô 5;

10; 15; 20; 30; 40; 50g/lit.

27

́ ́ ưở ươ ươ ̉ ̣ ̣ ̉ ̣ Đê xac đinh tôc đô sinh tr ̣ ợ ng cua hê s i trên môi tr ̀ ng dinh d ̃ ng đăc, ta

́ ̀ ́ ́ ̀ ̀ ̀ ̀ ́ ́ ̉ ̀ tiên hanh đo đ ̀ ươ ng kinh colonie sau 4 ngay va 8 ngay cua qua trinh nuôi cây va tinh

́ ̀ ̀ ̀ ́ ưở ̣ ợ ơ ̣ ̉ ̣ ̣ tôc đô sinh tr ng trung binh cua hê s i trong môt ngay (đ n vi tinh: µm/ngay).

́ ́ ́ ̣ ợ 2.4.4. Nuôi cây sinh khôi hê s i nâm

̀ ̀ ̉ ̣ ­ Chuân bi: 14 binh câu 500ml cho 1,4 lit môi tr ̀ ươ ng dinh d ̃ ươ ng.

̀ ̀ ̀ Thanh phân môi tr ̀ ươ ng gôm :

Pepton:                   15g/lit

̀ươ Đ ng saccharose: 30g/lit

Khoai tây:               200g/lit

ướ ừ ủ N c v a đ            1, 4 lit

̀ươ ­ Pha môi tr ng:

́ ́ ́ ắ ̉ Khoai tây c t lat mong đem nâu lây n ́ ́ ươ c chiêt.

́ ̀ ̉ Sau đo bô sung đ ̀ ̀ ươ ng va pepton vao.

̀ ̉ ̉ Chinh cho t ́ ơ ư i v a đu 1,4lit.

́ ́ ̀ ́ ̀ ượ Khuây đêu cho đên khi tan hêt đ ̀ ươ ng va pepton là đ c

̀ ́ ́ ở ử ­ Hâp kh  trung 121ºC trong 45 phut, 1 atm.

́ ́ ­ Cây giông:

́ ́ ́ ượ ̣ ở ̉ Cây giông t ̀ư  ngố  thacḥ ̃ ̀  nghiêng qua binh tam giac đa đ c chuân bi ́  trên. Cac

́ ́ ̀ ượ ự ̣ thao tac đ c th c hiên trong phong cây vô trùng.

­ Đem nuôi:

́ ̀ ̉ + 7 binh nuôi trong tu âm 2 5ºC ± 1.

28

̀ ̀ ́ ̀ ́ ́ ́ ́ ượ ̣ ̣ + 7 binh nuôi trong điêu kiên đ ́ c lăc liên tuc trên may lăc co tân sô lăc 80

trong 4 ngaỳ

́ ở ̣ ̀ vòng/phut va biên đô 1cm, 25ºC

́ ́ ̀ ̣ ̉ ̉ ̣ ́ ­ Cac thi nghiêm tiên hanh trong môi tr ̀ ̃ ươ ng long tinh, môi tr ̀ ươ ng long đông,.

̃ ́ ̀ ́ ́ ̀ ̀ ̀ ́ ượ Sau 8 ngay nuôi cây se thu đ c sinh khôi, sây khô va đem phân tich thanh phân sinh

khôi.́

́ ́ ́ 2.4.5. Phân tich câu truc DNA ( Deoxyribonucleic Axit)

́ ̃ ử ̣ ̣ ̣ ̉ ̣ ̣ Hiên nay ng ̀ ́ ươ i ta co xu h ̃ ́ ươ   ng s  dung ky thuât DNA đê đinh loai nâm. Ky

̀ ̀ ̀ ́ ̀ ́ ̃ ́ ́ ́ ơ ̣ ̉ ̉ ̣ thuât nay cung v i mô ta hinh thai giai phâu gop phân tăng tinh thuyêt phuc   trong

́ ́ ̀ ươ ươ ̣ ̣ ̣ ̣ ̉ viêc đinh loai nâm. Ng ̀ i ta th ̀ ng chon phân tich vung gen ITS cua rDNA trong

̃ ́ ́ ́ ̀ ́ ́ ̀ ̀ ̀ ư ́ ư ̣ ̣ ̉ nghiên c u đinh loai nâm. Đây la vung co nhiêu biên đôi gi a cac loai khac nhau

́ ́ ư ̉ ̀ nh ng it biên đôi trong loai.

́ ̃ ̀ ́ ́ ́ ̉ Chung tôi tiên hanh phân tich DNA cua nâm ́ ̣ ơ ̉ Cordyceps sp. Cac ky thuât c  ban

́ ́ ̉ ́ ̀ theo cac quy trinh chuân quôc tê.

́ ̀ ́ ́ ̀ ́ ̣ 2.4.5.1. Hoa chât va thiêt bi dung trong phân tich DNA

a. Nguyên li uệ

́ ̣ ợ ượ ươ ở ̣ ̣ Hê s i nâm đ c nuôi trong môi tr ̀ ̀ ng PDA.Trong 15 ngay nhiêt đô 25ºC

́ ệ ̉ ̀ đê làm nguyên li u dung cho phân tich DNA

́ ́ ̣ ̀ b. Đêm pha tê bao.

́ ́ ̣ ̀ Pha đêm pha tê bao cho Eukaryota:

̀ ̀ ượ ̀ Thanh phân Ham l ng

Triston­X100 2% (v/v)

SDS 1%

NaCL 100mM

Tris 10mM.pH 8

EDTA 1mM.pH 8

29

̣ Glassbead,  PCI  (Phenol­Chlorofom­isoamylalcohol)  25:24:1,   ĐêmTE,   Proteinaza,

ARNaza, Isopropanol, Ethanol, Binding bufer PBI, Bufer PE, EtBr (Ethylen bromide),

̣ Agaroza 1%, bô Kit QIA gen (Đ ćư ), n ́ ́ ươ c cât...

́ ́ ̀ ́ ̣ c. Cac thiêt bi dung trong phân tich DNA

́ ́ ́ ́ ́ ́ ư ̉ ̣ ̣ ̉ Autoclave; ependorf; May lăc ôn nhiêt (Nhât); may lăc Gerhadt (Đ c); tu cây vô

́ ̀ ́ ́ ̀ ự ̣ trung;   may   ly   tâm;   may  nhân   gen   Geneamp   PCR   System ;  may   đoc   trinh   t ABI

́ ́ ư ̣ ́ PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer; may ly tâm lanh (Sigma, Đ c); may soi gel Bio

́ ́ ́ ́ ̉ ̣ ̃ rad; may đo quang phô UV 3000; may điên di Bio rad; may vortex; may cô mâu

̉ ̣ ̣ ̣ (Themosavant); tu lanh sâu, pipet Pasteur; dung cu nghiên...̀

́ ́ ̉ ư 2.4.5.2. Tach  DNA cho phan  ng PCR

́ ́ ̀ ượ ư ̣ ̀ ­ Tê bao nâm đ ́ c n ôi cây trên môi tr ̀ ̀ ở ươ ng PGA trong ngay duy tri ̣   nhiêt đô

25 ºC.

́ ́ ̀ ́ ̀ ̀ ́ ̀ ̣ ­ Cho 400 µl đêm pha tê bao vao ông ependorf vô trung 1,5ml. Lây 2 vong que

̀ ́ ̀ ̀ ̃ ̀ ệ ̣ ̣ ̣ cây mâu, nghiên băng dung cu chuyên nghi p. Thêm 0,3 glassbead trôn đêu băng

̀ ́ ̀ ̣ ́ vortex, thêm 400 µl PCI, trôn băng vortex trong 2­3 phut. Ly tâm 15000 vong/ phut.

́ ̣ ̉ ̀ Lây phân dich nôi.

̣ ̉ ­ Thêm 200 µl TE, trôn nhanh, thêm 300 µl proteinaza (3mg/ml), đao đêu. Ù ̉

́ ̀ ̉ ̉ 56ºC, trong 15 ­ 30 phut. Thêm 50 µl ARNaza (1mg/ml) đao đêu u 37 ºC trong 30

phut.́

́ ́ ̀ ̀ ̃ ̀ ̀ ớ ̉ ̉ ̣ ́ ­ Thêm PCI v i thê tich băng thê tich mâu va trôn đêu, ly tâm 15000 vong/phut,

́ ́ ̀ ́ ̀ ̀ ư ̣ ư ̉ ̣ ̃ sau đo lây phân nôi phia trên. Lam lai nh  vây thêm 2 lân n a.

̃ ̀ ̀ ́ ̀ ́ ́ ̉ ̉ ̣ ̉ ­ Thêm 2 lân thê tich mâu băng 2­ propanol đê lanh. Lây phân kêt tua.

́ ̀ ̀ ử ̣ ̉ ­ R a sach phân kêt tua băng ethanol 70%

30

̀ ̀ ́ ́ ­ Lam khô băng không khi trong 5­10 phut.

ươ ̉ ­ Hòa tan tua trong n c.́

̣ ­ Gi ̃ ư ở ­20 ºC tr ́ ử ươ c khi s  dung.

̀ ́ ̉ ư 2.4.5.3. Phan  ng PCR (theo Sugita va Nakase )

́ ̀ ̀ ́ ̀ ̉ ư ượ ̣ ́ Phan   ng   PCR   đ c   tiên   hanh   nhăm   khuêch   đai   vung   ITS (Internal   Transcribed

́ ̀ ̀ ̀ ́ ơ ̉ ̣ ̉ DNA 26S v i cac thanh phân va ti lê sau: Spacer) cua r

̃ ́ ̉ ư ợ Hôn h p phan  ng:

̀ ̀ ượ ̀ Thanh phân Ham l ng

10X Buffer 10 µl

dNTP mixture 16 µl

Mi ITS1 2 µl

Mi NL4 2 µl

TaqTm 1.2 µl

MuADN10­100 ng 2 µl

́ ́ ́ ươ N c cât Đên 100 µl

31

,­GTGGTAACAAGGTTTCCGTAGGTG­3,

̀ Môi xuôi ITS1: 5

,­GGTCCGTGTTTCAAGACGG­3,

̀ ượ Môi ng cNL4:5

̀ ́ ̉ ư ̣ ­ Chu trinh nhiêt cho phan  ng PCR

́ ̀ ́ ươ ̣ B c tiên hanh Nhiêt đô  º ̣ C ̀ơ Th i gian

1 1 phut́ 94

̀ ̣ ̣ ̀ Lăp lai 35 lân chu ki sau 2

45 giây 94

45 giây 53

45 giây 72

3 7 phut́ 72

4 4

̃ ́ ́ ̀ ̀ ượ ́ ̉ ư ̀ ơ ̣ ợ Hôn h p trên đ ́ c tiên hanh phan  ng nh  may PCR theo chu trinh nhiêt thich

̀ ̀ ̀ ượ ̉ ̉ ̉ ̣ ̣ ̣ ợ h p. San phâm PCR đ c kiêm tra băng điên di va nhuôm băng dung dich Ethidium

̀ ̃ ̀ ́ Bromit loang va soi băng may soi gel.

́ ̀ ̉ ̉ ̉ ̣ ­ Kiêm tra cac san phâm PCR băng điên di

́ ̣ Đun tan 1% agroza (dung dich 50X TAE: 2ml, n ́ ̉  ươ c cât 98ml, agaroza:1g) đê

̀ ̀ ́ ̀ ợ ̉ ̣ ̣ ̣ ̣ ́ âm, đô vao khuôn, đ i cho nguôi va đăt trên tâm gel vao trong máy điên di, ngâp trong

32

́ ̃ ơ ̣ ̣ ̣ ̣ 300ml dung dich 1 X TAE. Trôn 2 µl dung dich 6X loading buffer v i 5 µl mâu trôn

̀ ̀ ́ ̀ ́ ̀ ̀ ́ ơ ệ ̉ ̣ ̣ ̣ ̣ ̀ đêu nho vao giêng. Chay đi n di băng dong điên môt chiêu v i điên thê 100V, dong

́ ̀ ̣ ̉ ̣ ̣ ́   điên 80A trong 30 phut, ngâm ban gen trong dung dich EtBr nông đô 0,5 µl/ml 20 phut

́ ́ ̣ ́ ơ v t ra. Quan sat vach DNA trên may soi gel.

́ ̉ ư ự ̣ ̣ 2.4.5.4. Tinh sach DNA sau khi th c hiên phan  ng PCR

̀ ́ ượ ̣ a. Xac đinh ham l ng axit nucleic

́ ́ ̀ ́ ự ượ ử ơ ượ ̣ ̉ ́ Trong th c tê, axit nucleic đ ́ c s  dung v i l ng rât nho khi tiên hanh cac thi ́

̀ ́ ́ ượ ̉ ượ ự ươ ̣ ́ nghiêm vê DNA. Do đo l ng axit nucleic co thê đ c đo tr c tiêp nên ng ̀ i ta

̀ ̀ ́ ́ ̀ ̣ ươ ̣ th ̀ ươ ng đo nông đô axit nay tai b ́ ̉  c song 260 nm (A260)  băng may đo quang phô

́ ́ ́ ́ ́ ̣ ơ ươ ươ ơ ̣ ̣ ̣ kê. Môt đ n vi (1,0) gia tri hâp thu b ́ ̣ ươ c song 260 nm t ng đ ̀ ng v i nông đô 50

́ ́ ̀ ̣ ươ ợ ươ ơ ̉ ̣ ̉ µg/ml cua DNA s i kep, hoăc t ng đ ̣   ng v i nông đô 40 µg/ml cua DNA hoăc

́ ́ ́ ̃ ̀ ́ ́ ư ơ ̣ ̉ ̉ ̣ ARN mach đ n. Ti sô A260/A280 la chi sô cho thây đô nhiêm cac chât nh  phenol

́ ́ ̃ ̀ ́ ơ ̣ ̉ ̣ hoăc protein. Ti sô A260/A280 la 1,8 đôi v i mâu DNA sach.

̃ ̀ ử ự ̣ ̣ ̣ ̉ ̉ ̉ ́ S  dung bô kit QIA gen th c hiên theo chi dân cua nha san xuât.

̀ ̃ ̣ ̉ ̣ ̣ ̀ + Thêm dung dich PBI vao mâu theo ti lê 5:1. Trôn đêu.

̀ ̃ ̣ + Cho mâu vao côt, ly tâm 10000 x g trong 30 giây.

́ ̉ ̉ ̣ ̣ + Đô bo dich phia d ́ ươ i côt.

̉ ̣ ̣ + Bô sung 500 đêm PE lên côt. Ly tâm 10000 x g trong 30­60 giây.

́ ̉ ̉ ̣ ̣ + Đô bo dich phia d ́ ươ i côt.

́ ́ . + Ly tâm tiêp 10000 x g trong 1 phut

́ ̉ ̣ ́ ơ . + Chuyên côt sang ông eppendoff m i

̀ ̉ ở ̣ ̣ + Thêm 30 µl n ́ ươ c. Đê ́ .  nhiêt đô phong 5 phut

33

+ Ly tâm 10000 xg trong 1 phut́.

́ ́ ̣ + Lây dich phia d ́ ươ i.

̉ ̣ ̣ ̉ b. Kiêm tra đô tinh sach cua mâũ

́ ́ ượ ở ̉ ̉ ̉ ̃ Mâu đ ́ c kiêm tra trên may quang phô kha kiên ́  cac b ́ ươ c song 260nm va ̀

̉ ̣ ̣ 280nm. Ti lê sach: OD 260/OD 280 > 1,7.

́ ́ ̉ ư ̣ 2.4.5.5. Phan  ng khuyêch đai DNA cho sequencing

́ ́ ́ ượ ̣ ơ ̉ ̉ ̣ ̣ Cac san phâm PCR tinh sach đ c khuyêch đai v i bô kit ABI PRISM Cycle

̀ ̃ ợ ́ ơ ̣ ̉ sequencing va đêm sequence ( Perkin­ Elmer Applied Biosystem ) v i hôn h p phan

́ư ư ng nh  sau:

Terminator ready reaction mix 8µl

̃ Mâu DNA sau PCR 200ng/ml

1 µl Môì

̉ ́ Đu đên 20 µ l ́ ́ ươ N c cât

ITS1: 5,­ GTGGTAACAAGGTTTCCGTAGGTG­3,

NL1: 5,­ GCATATCAATAAGCGGAGGAAAG­3,

ITS4: 5,­ TCCTCCGCTTATTGAATTGC­3,

NL4: 5,­ GGTCCGTGTTTCAAGACGG­3,

34

̀ ́ ̣ ­Chu trinh khuyêch đai DNA cho sequencing

́ ̀ ́ ươ ̣ ̣ B c tiên hanh Nhiêt đô ̀ơ Th i gian

1 1 phut́ 96

̣ ̣ ̀ Lăp lai 25 lân chu kì sau 2

10 giây 96

5 giây 50

4 phut́ 60

3 ­ 4

́ ̀ ́ ơ ượ ̉ ̉ ̣ ̀ San phâm luc nay la cac đoan DNA đ n đ ̃ c duôi ra.

̣ ̉ ̉ 2.4.5.6. Tinh sach san phâm cho sequencing

́ ượ ̉ ̃ Mâu đ c chuyên sang ông eppendoft 1,5 ml. Thêm 5 µ l EDTA 1,25M, thêm 60

̀ ̀ ́ ̣ ̣ ̣ ̣ ̣ ̉ ̉ ̣ µl ethanol 100 %. Trôn thât nhe nhang gi ̃ ư ở nhiêt đô phong trong 15 phut. Đô bo dich

̀ ́ ́ ́ ̀ ử ̀ phia trên. R a băng 100 µl ethanol 70 %. Ly tâm 15000 vong/phut trong 10 phut. Lam

́ ̀ ̃ ́ khô mâu băng may cô quay chân không trong 3­5 phut.

̀ ự ̣ ­  Đoc trinh t DNA

́ ́ ự ượ ự ̉ ̉ ̉ ̣ ̀ Trinh t cua ITS rDNA 26S cua chung nâm đ ́ c đoc tr c tiêp trên may đoc t ̣ ự

́ ́ ̀ ́ ́ ̀ ̣ ự ̣ ̉ ̉ đông 3100 Avant. Sau đo kêt qua trinh t ự ượ  đ ́ ơ c so sanh v i cac trât t ̃ ́    cua cac loai đa

̀ ́ ̣ ượ đ c xac đinh trong ngân hang gen.

35

́

́

ươ

2.5. Ph

̣

ử ng pháp x  ly sô liêu

́ ́ ́ ́ ́ ̀ ̃ ử ươ ̉ ở ̣ ̣ ̉ ̣ S  dung ph ng phap thông kê sinh hoc đê tinh sai sô co thê ̣   môi loai nông đô

̉ ư ̀ cua t ng môi tr ̀ ươ ng.

n

́ ượ ư ́ Sai sô m đ ́ c tinh theo công th c:

x

i

X

1 n

(cid:0) (cid:0) ứ ẫ * Công th c tính trung bình m u : (cid:0)

ẫ ớ V i  X  : trung bình m u.

ố ẫ ổ n : t ng s  m u,

n

2

ẫ ượ xi : m u đo đ c.

X

X

(

)

i

i

1

SD

S

n

1

(cid:0) (cid:0) ộ ệ ứ ẩ * Công th c tính đ  l ch chu n : (cid:0) (cid:0) (cid:0) (cid:0)

̀ ́ ́ ử ư ̣ ̣ Cach tinh mât đô bao t nh  sau:

a x 4000 x 103  x 10n

ử X (bào t / ml) =

b

̀ ử ́ a: Sô bao t ́ ơ  trong 5 ô l n

́ ̀ ́ ơ b: Sô ô con trong 5 ô l n la 80

3 thanh cm̀

3 hay ml

́ ̉ 103: Sô chuyên mm

ộ 10n: Đ  pha loãng.

36

̀

́

̉

́ Ư PHÂN III: KÊT QUA NGHIÊN C U

́

̀ 3.1. Xac đinh loai

̣

ả ặ ủ ể 3.1.1. Mô t đ c đi m hình thái c a loài Cordyceps sp.

ả ể ể ộ ự ờ ố Qu  th  túi phát tri n trên m t cách t do trên thân sâu róm, r i g c. Màu nâu

ấ ề ế ồ ủ ắ ấ ơ ả ể qu , đ ng nh t. Ch t n n c a qu  th  túi màu tr ng, h i giòn. Qu  th  tr ả ể ưở   ng

ệ ầ ầ ố ườ thành chia làm hai ph n rõ r t, ph n cu ng có đ ng kính 0,5 – 1mm, dài 6 – 8 mm.

ề ặ ả ẵ ầ ố ơ ở ữ ầ ạ ề B  m t cu ng nh n. Ph n sinh s n h i phình to lên gi a và thót d n l i v  phía

ọ ướ ứ ể ạ ng n, kích th c 1 – 1,8 mm × 5 – 11 mm, ch a các th  chén, d ng cánh sen, nhô

ắ ặ ố ướ ườ ấ ừ cao, g n ch t vào xung quanh cu ng. Kích th c: đ ơ ớ ng kính n i l n nh t t 0.12 –

ừ ứ ể ạ ợ 0.18 mm, dài t 0.18 – 0.27 mm. Th  túi ch a bên trong chén có d ng s i, kích

ướ ử ạ ướ th c: 4,0 – 4,5 × 400 ­ 450 µm. Bào t ứ  túi d ng tr ng kích th c 2 – 2,5 × 3 – 5

ự ồ ạ ủ ả ể ạ ấ ố ạ µm. Bên c nh s  t n t i c a các qu  th  túi còn có các c u trúc d ng dùi tr ng dài

̀ ứ ề ặ ấ ử 3­6 mm, không mang c u trúc túi mà trên bê m t ch a nhi u bào t vô tính có màu

ắ tr ng.

37

̉

Thê  du i ̀ trô nǵ Phâ n ̀ sinh san̉

́ Cuô ng  nâ ḿ

ượ Hình 1: N m ấ Cordyceps sp. đ c thu th p t 5 mm ậ ừ ự  t

nhiên

1 mm

Hình 2:  ạ ủ   t o c a chén  ặ ủ   m t c a C uấ   thể  trên bề  th  túiể

0,1 mm

38

ủ ể ắ ở ậ Hình 3: Lát c t ngang c a th  chén v t kính 10 ×

0,5 mm

ể ứ ử Hình 4: Các th  ch a bào t túi

10 µm

ụ ở ậ 39 ử Hình 5: Các bào t túi ch p v t kính 40 ×

ề ả ệ ợ ể ả ầ ớ Bào t ử ườ  th ng n y m m v  c  2 phía. H  s i phát tri n khá nhanh và s m hình

ữ ể ả ơ ử thành c  quan sinh s n h u tính là các th  bình. Các bào t vô tính sau khi hình

ấ ễ ị ớ ạ ẫ ầ ộ ớ ỗ thành dính v i nhau thành m t chu i dài, r t d  b  nh m l n v i d ng bào t ử ố    đ t.

ệ ợ ể ể ạ ầ ắ H  s i ban đ u có màu tr ng sau đó chuy n sang vàng nh t, phát tri n theo chu k ỳ

ề ặ ệ ợ ộ ớ ồ ử ạ t o nên các vòng đ ng tâm. Trên b  m t h  s i là m t l p bào t vô tính, màu

ắ ườ ả ể ạ ượ ặ tr ng, dày đ c. Trên môi tr ầ ng nhân t o, m m qu  th  túi đ c hình thành t ươ   ng

ễ ề ườ ể ớ ạ ố đ i nhi u và d  dàng, tuy nhiên chúng th ng không phát tri n t i giai đo n tr ưở   ng

thành.

̉ Thê bi nh̀

̀ ̀ ̀ ự ̉ ̉ Hi nh 6. S  nay mâ m cua ba o t ử

tu i.́

ể Th  bình

ử Bào t vô tính

40

ử Hình 7: Các bào t vô tính

̀ ́ ̀ ự ̉ ̉ ̣

̣ ợ ̀ ̀ ̃ ư Hi nh 8. S  pha t triên cua hê s i theo chu ky  tao nên  nh ng vo ng đô ng tâm.

ả ể ủ ầ ườ ng

Hình 9:  Các m m c a qu  th  khi nuôi trong môi tr dinh d ngưỡ

41

̃ ́ ̀ ́ ̀ ́ ự ư ẫ ̣ ̉ ̉ ̣ ̣ ̉ ̀   D a trên nh ng đăc điêm vê hinh thai giai ph u chung tôi nhân đinh đây co thê  la

loai ̀ Cordyceps romosostipitata Kob. et. Shim.

̀ ự ̉ 3.1.2. Giai trinh t ITS rDNA

ả ả ế ự ồ Hình 10. K t qu  gi i trình t ITS rDNA (m i xuôi)

42

ả ả ế ự Hình 11. K t qu  gi i trình t ITS rDNA (m i ồ ng cượ )

̀ ́ ́ ́ ̀ ́ ự ở ́ ơ ̉ Sau khi co kêt qua trinh t nucleotid e ́ ̀  vung ITS, tiên hanh so sanh v i cac

̃ ́ ́ ̀ ượ ̃ chuôi   trên ITS  cuả   rDNA  đa   đ ́   c   công   bô   trên   ngân   hang   gen   quôc   tê

̀ ươ (http://ww w   .ncbi.nlm.nih.gov ̀   ) băng ch ng trinh BLAST .

43

ế ả ự ớ ữ ệ ả B ng 1.  K t qu  so sánh trình t ITS rDNA c a ủ Cordyceps sp. v i d  li u đã công

ố b  trên Genbank

ự ớ ữ ệ Sau khi so sanh trình t ủ Cordyceps sp. v i d  li u đã công b

ấ ẫ ITS rDNA c a  ậ ể ộ

ư ế ể ế

ậ ữ ệ ẫ ự ỉ ủ ng đ ng c a các trình t

ủ ả ớ ̣

ố  ạ   i Langbiang ­ Đà L t có th  là m t loài ự  ồ ứ    mà chúng tôi so sánh trên ngân hàng d  li u ch  có m c ậ   ng đ ng đ n 89 % so v i m u c a Đà Lat. Theo b ng so sánh trên ta nh n ̀ ồ ́ ́ ̀ ́ ́ ̀ ̀ ̀ Cordyceps. ́ ượ ạ c t trên Genbank cho th y m u v t thu đ ủ ớ m i tuy nhiên chúng tôi v n ch a có đ  thông tin đ  đi đ n k t lu n này. Vì s ươ t ế ộ ươ đ  t ấ th y hâu hêt cac loai ma no co đô t ẫ ̀ ̣ ươ ng đông cao đêu năm trong chi

44

ớ Paecilomyces sp.  thì m u thu đ ạ có đ  t i Đà L t

̀

́

́

ẫ ể ậ ượ ạ c t ộ Paecilomyces là m t th  vô tính c a ộ ươ   ng ủ Cordyceps. Vì v y, co thế ̉ ụ   Ví d : So v i   ớ i 89% mà  ̀ ̃ ̣ ̣ ồ đ ng cao t ́ xac đinh mâu nay thuôc chi Cordyceps.

ưở

ươ

3.2. Anh h

ng cua cac nguôn dinh d

̉ ̉

́ ̃ ̣  ng Cacbon khac nhau lên tôc đô

ưở

̣ ợ

sinh tr

ng cua hê s i nâm ́

Cordyceps sp.

̉

̀ ́ ́ ượ ự ợ ưở ̉ ̣ ̉ ́ Đê xac đinh đ c nguôn Cacbon thich h p giup cho s  sinh tr ̣  ng nhanh cua hê

́ ́ ́ ̀ ́ ́ ư s i loai ̀ ợ Cordyceps sp. ta tiên hanh nuôi cây chung trên cac môi tr ́ ̀ ̣   ươ ng ch a cac loai

́ ̀ ươ đ ng khac nhau: Glucose, arabinose, mantose, saccharose .

̀ ươ ́ Đ ng kinh colonie

4 ngaỳ 8 ngaỳ ́ ̣ ̣ Tôc đô moc (mm) (mm)

Nguôǹ (µm/ngaỳ )

Cacbon

̣ ử s  dung

Arabinose 1,33 ± 0,06 2,03 ± 0,08 175 ± 5,60

Glucose 1,64 ± 0,02 2,36 ± 0,07 180 ± 8,10

Mantose 1,51 ± 0,03 2,2 ± 0,06 172 ± 7,30

Saccharose 1,56 ± 0,03 2,36 ± 0,06 200 ± 6,70

45

́ ̀ ́ ́ ưở ươ ̉ ̉ ̉ ̣ Bang 2: Anh h ng cua cac nguôn dinh d ̃ ng Cacbon khac nhau lên tôc đô sinh

205

200

195

190

185

180

175

170

165

160

155

Arabinose

Glucose

Mantose

Saccharose

ưở ̉ tr ng cua loai ̀ Cordyceps sp.

46

̀ ́ ̀ ưở ̣ ̣ ̉ ́ Đô thi 1: Tôc đô sinh tr ng cua nâm ́   ́ Cordyceps sp. trên cac nguôn Cacbon khac

nhau

́ ́ ̀ ̀ ̀ ̀ ́ ́ ̀ ư ̉ ̣ ̣ T  bang 2 va đô thi 1 ta nhân thây răng trên cac loai đ ̀ ̣  ̣ ươ ng khac nhau thi tôc đô

ưở sinh tr ́ ng khac nhau.

̀ ́ ́ ợ ̀ Sau 8 ngay nuôi cây s i loai Cordyceps sp. ta thây trong môi tr ̀ ́ ươ ng co đ ̀ ươ   ng

́ ́ ́ ̣ ợ ơ ̉ ̉ saccharose   hê   s i   phat   triên   tôt   h n   ca.   Trên   môi   tr ̀ ươ ng   co   đ ̀ ươ ng   mantose   va ̀

́ ́ ́ ̀ ơ ươ ̣ ợ ơ ̉ arabinose hê s i phat triên kem h n so v i đ ́ ̀   ng glucose va saccharose, tuy nhiên co

̀ ̀ ̀ ̀ ́ ử ươ ươ ̣ ợ ̣ ̣ ̣ ́ môt điêu nhân thây la khi s  dung đ ̀ ng la nguôn dinh d ̀ ̃ ư   ng chinh thi hê s i th a

̀ ́ ̀ ̀ ́ ơ ử ơ ̣ ̣ ̉ ́ ơ h n so v i khi s  dung đam. Vi đây la nâm ki sinh trên côn trung, trong c  thê côn

̀ ̀ ̀ ̀ ́ ́ ̀ ́ ử ư ̣ ̣ ̣ ̣ ̀ trung giau đam vi vây nguôn dinh d ̃ ̉   ươ ng chinh ma no s  dung la đam ch  không phai

̀ươ ̀ la đ ng.

́ ̀ ́ ợ ư Hinh 12: S i nâm Cordyceps sp. khi nuôi trên môi tr ́ ̀ ươ ng co ch a arabinose

47

́ ̀ ́ ợ Hinh 13: S i nâm Cordyceps sp. khi nuôi trên môi tr ̀ ́ ư ươ ng co ch a glucose

̀ ́ ́ ợ ư Hinh 14: S i nâm Cordyceps sp. khi nuôi trên môi tr ́ ̀ ươ ng co ch a saccharose

48

̀

́

́

́

́ ̀ ́ ợ Hinh 15: S i nâm Cordyceps sp. khi nuôi trên môi tr ̀ ́ ư ươ ng co ch a mantose

ưở

ươ

ơ

3.3. Anh h

ng cua cac nguôn dinh d

̃ ng Nit

khac nhau lên tôc đô sinh

̉ ̉ ̣

ưở

̣ ợ

tr

ng cua hê s i nâm ́

Cordyceps sp.

̉

́ ̀ ươ Đ ng kinh colonie 8 ngaỳ ́ ̣ ̣ Nguôǹ 4 ngay ̀ (mm) Tôc đô moc (mm) Cacbon (µm/ngaỳ )

̣ ử s  dung

Pepton 1,03 ± 0,02 2,06 ± 0,05 343 ± 3,80

Cao thiṭ 1,10 ± 0,01 2,11 ±0,01 336 ± 3,00

(NH4)2SO4 0,90 ± 0,02 1,67 ± 0,03 257 ± 7,60

NH4NO3 0,93 ± 0,03 1,73 ± 0,01 267 ± 1,90

49

́ ̀ ́ ́ ưở ươ ơ ̉ ̉ ̉ ̣ Bang 3 : Anh h ng cua cac nguôn dinh d ̃ ng Nit khac nhau lên tôc đô sinh

400

350

300

250

200

150

100

50

0

Pepton

Cao thị t

(NH4)2SO4

NH4NO3

ưở ̉ tr ng cua loai ̀ Cordyceps sp.

̀ ̀ ́ ưở ̣ ợ ̣ ̣ ̉ ́ Đô thi 2: Tôc đô sinh tr ́ ng cua hê s i nâm Cordyceps sp. trên cac nguôn dinh

ơ d ̃ ươ ng Nit ́  khac nhau.

́ ̀ ̀ ̀ ́ ́ ́ ̀ ̀ ư ̉ ̣ ̣ ̣ ̣ ̣  T  bang 3 va đô thi 2 ta nhân thây răng trên cac loai đam khac nhau thi tôc đô

ưở sinh tr ́ ng khac nhau.

́ ̃ ̃ ́ ̃ ̀ ́ ơ ự ư ư ̣ ̣ ̣ ̣ Đăc biêt ta thây co s  khac nhau ro rêt gi a nguôn đam h u c  (pepton, cao

4NO3 va (NH̀

4)2SO4).

̀ ơ ̣ ̣ thit ) va đam vô c  (NH

́ ̀ ́ ́ ́ ́ ợ ̉ ̀ Sau 8 ngay nuôi cây s i nâm loai Cordyceps  sp. phat triên tôt nhât trong môi

̀ ́ ̀ ́ ư ơ ́ ơ ̣ tr ̀ ươ ng ch a nguôn nit ̀  la pepton, tiêp theo la cao thit. So v i môi tr ̀ ́ ư   ươ ng ch a

̀ ́ ̀ ́ ́ ̃ ơ ơ ư ơ ư ̣ ợ ơ ̉ ̀ nguôn nit vô c  thi môi tr ̀ ươ ng ch a nguôn Nit ơ    h u c  hê s i phat triên tôt h n,

̀ ́ ̀ ́ ̀ ơ ơ ưở ̣ ợ ̣ ̣ ̉ phân nhanh nhiêu h n, đô day colonie day h n. Tôc đô sinh tr ng cua hê s i trên

4)2SO4  chi có

̀ ̀ ̀ ư ơ ̉ môi tr ̀ ́ ươ ng ch a nguôn Nit la pepton la 343 µm ̀ /ngày  con trên (NH

257µm/ngày.

50

́ ̀ ̃ ̀ ̀ ́ ́ ̣ ợ ư ̣ ̣ ̉ ̣ ̀ T  dân liêu va đô thi co thê thây hê s i loai Cordyceps  sp. moc tôt trên môi

̃ ̀ ̀ ̃ ̀ ư ̃ ơ ư ơ ̃ ơ ư ơ ̉ ̉ tr ̀ ́ ̀ ươ ng ch a nguôn Nit h u c . Điêu nay cung dê hiêu vi Nit ̃  h u c  dê phân huy

̀ ̀ ̀ ̃ ơ ơ ư ơ ̉ ̣ h n so v i ́ ơ ơ Nit ̀  vô c . H n n a trong ban thân con côn trung giau đam, đây la nguôn

́ ̀ ́ ử ử ̣ ̣ ̣ ̣ dinh d ̃ ươ ng chinh ma nâm thuôc chi ̀ Cordyceps  s  dung. Vi vây, nên s  dung môi

́ ́ ́ ́ ̀ ̀ ̉ ử ư ̣ tr ́ ̀ ư ươ ng ch a pepton cho qua trinh nghiên c u tiêp theo. Ngoai ra co thê s  dung cao

̀ ́ ́ ́ ́ ́ ́ ̃ ̣ ợ ư ̣ ̉ ̉ ̣ thit vi trong môi tr ̀ ươ ng ch a cao thit s i nâm cung phat triên tôt, chi kem môt it so

ử ̣ ́ơ v i khi s  dung pepton.

4)2SO4

́ ̀ ́ ́ ợ Hinh 16: S i nâm Cordyceps sp. khi nuôi trên môi tr ̀ ư ươ ng co ch a (NH

51

́ ̀ ́ ợ Hinh 17: S i nâm Cordyceps sp. khi nuôi trên môi tr ́ ̀ ư ươ ng co ch a pepton

́ ̀ ́ ợ ̣ Hinh 18: S i nâm Cordyceps sp. khi nuôi trên môi tr ̀ ́ ư ươ ng co ch a cao thit

4NO3

̀ ́ ́ ́ ợ Hinh 19: S i nâm Cordyceps sp. khi nuôi trên môi tr ̀ ư ươ ng co ch a  NH

52

̀

̀

ưở

ơ

ử

3.4.   Anh   h

ng   cua   nguôn   Nit

lên   kha   năng   sinh   bao   t

́   cua   nâm

Cordyceps sp.

̉ ̉ ̉ ̉

́ ̀ ̀ ượ ự ưở ơ ử ̉ ̉ ̉ ̉ ̉ Đê biêt đ c s  anh h ng cua nguôn Nit lên kha năng sinh bao t ́    cua nâm

́ ̀ ́ ̀ ́ ̉ ư Cordyceps sp. ta tiên hanh đêm bao t ử ượ  đ c kêt qua nh  sau:

́ ́ ̀ ơ ử ̣ ử ̣ ̣ Nguôn ̀ Nit s  dung ́ơ Sô tê bao trong 5 ô l n Mât đô bao t̀

̀ ử (80 ô nhỏ) ́ (Sô bao t / ml )

Pepton 420 210.105

Cao thiṭ 274 137.105

NH4NO3 99 49.105

(NH4)2SO4 52 26.105

̀ ́ ̀ ́ ử ̉ ̉ ̉ Bang 4 cua nâm Cordyceps sp. trên cac nguôn dinh d ̃ươ   ng : Kha năng sinh bao t

ơ Nit ́  khac nhau

53

250

200

150

100

50

0

Pepton

Cao th tị

NH4NO3

(NH4)2SO4

̀ ́ ̀ ̀ ̃ ử ̣ ̣ ̉ ̉ ̉ Đô thi 3: Đô thi biêu diên kha năng sinh bao t cua nâm Cordyceps sp. trên cać

ơ ̀ nguôn dinh d ̃ ươ ng Nit ́  khac nhau

̀ ̀ ̀ ́ ́ ̀ ư ̉ ̣ ̣ ̣ ̣ ̉ ̀ T  bang 4 va đô thi 3 ta nhân thây răng trên cac loai đam kha năng sinh bao t ử

́ ́ ̃ ̉ ̣ cua nâm ́ ự Cordyceps sp. co s  khac nhau ro rêt.

̀ ̀ ́ ử ̉ ̉ ́   Sau 8 ngay nuôi cây kha năng sinh bao t cua nâm Cordyceps  sp. trong môi

́ ̀ ̀ ́ ̀ ́ ̀ ư ơ ́ ơ ̣ tr ̀ ươ ng ch a nguôn nit la pepton la cao nhât, tiêp theo la cao thit. So v i môi tr ̀ ươ   ng

̀ ́ ̀ ́ ́ ư ơ ơ ư ̃ ơ ư ơ Cordyceps ch a nguôn nit ̀  vô c  thi trong môi tr ̀ ươ ng ch a nguôn nit h u c  nâm

̀ ́ ̀ ử ử ư ̉ ̣ sp. co kha năng sinh bao t manh h n ́ ơ . Sô bao t trên môi tr ̀ ̀ ́ ươ ng ch a nguôn Nit làơ

5 /ml con trên (NH ̀

4)2SO4 chi co 26.10

5/ml

̀ ́ ̉ pepton la 210.10

̀ ̀ ̀ ́ ̀ ợ ử ̣ ̉ Vi vây, pepton la nguôn dinh d ̃ ươ ng thich h p cho kha năng sinh bao t ̉    cua

nâm ́ Cordyceps sp.

54

̀

́

̀

ưở

ưở

3.5. Anh h

ng nông đô cua nguôn Cacbon lên tôc đô sinh tr

̉ ̣ ̉ ̣ ̉

̣  ng cua hê

s i nâm ́ ợ

Cordyceps sp.

̀ ̀ ́ ́ ́ ́ ̀ ượ ợ ̉ Sau khi tim đ ́ ư   c nguôn Cacbon thich h p ta tiên hanh khao sat trên cac m c

̀ ̀ ́ ̀ ́ ́ ự ợ ợ ̣ ̉ ̣ ̉ ̉ ́   nông   đô   khac   nhau   đê   tim   ra   nông   đô   thich   h p   cho   s   phat   triên   cua   s i   nâm

Cordyceps sp.

̀ ươ ́   Đ ng kinh colonie

́ ̣ ̣ 4 ngay ̀ (mm) 8 ngay  ̀ (mm) Tôc đô moc

Nông̀ (µm/ngaỳ )

̣ đô saccharose

(g/lit)

5 1,07 ± 0,02 2,03 ± 0,01 240 ± 3,00

10 0,93 ± 0,01 1,93 ± 0,03 250 ± 1,90

20 1,05 ± 0,04 2,1 ± 0,06 262 ± 1,30

30 1,13 ± 0,05 2,2 ± 0,04 267 ± 1,70

40 1,1 ± 0,07 2,1 ± 0,01 250 ± 2,80

50 1,2 ± 0,06 2,17 ± 0,05 242 ± 6,50

́ ̀ ́ ưở ̣ ợ ̉ ̣ ̉ ́ Bang 5: Tôc đô sinh tr ng cua hê s i nâm Cordyceps sp. trên cac nông đô ̣

́ saccharose khac nhau.

55

300

250

200

ộ

150

100

N ng đồ saccharose (g/l) ố ộ T c đ  sinh ngưở tr (µm/ngày)

50

0

1

2

3

4

5

6

5

10

20

30

40

50

N ng đồ ộ saccharose (g/l)

240

250

262

267

250

242

ố ộ T c đ  sinh ưở (µm/ngày) ng  tr

̀ ́ ́ ̀ ưở ̣ ợ ̣ ̣ ̉ ́ Đô thi 4: Tôc đô sinh tr ng cua hê s i nâm Cordyceps sp. trên cac nông đô ̣

́ saccharose khac nhau.

̀ ̀ ̀ ́ ́ ̀ ư ̉ ưở ̣ ợ ̣ ̉ ̣ ̉ Cordyceps T  bang 5 va đô thi 4 chi ra răng tôc đô sinh tr ng cua hê s i nâm

̃ ̀ ̀ ̀ ̀ ̀ ̀ ư ̣ ̣ ̣ ̣ ̣ ̉   sp. không nh ng phu thuôc vao nguôn Cacbon ma con phu thuôc vao nông đô cua

́ ̀ ươ ̣ chung trong môi tr ̀ ươ ng. Khi nông đô saccharose trong môi tr ̀ ươ ng dinh d ̃ ng tăng

̀ ́ ưở ư ̣ ư t ̀  5­30g/l thi tôc đô sinh tr ng hê s i ̣ ợ Cordyceps  sp. tăng t ̀ ̀  240­267 µm/ngay,

̀ ́ ́ ́ ư ư ưở ̣ ̉ ̣ ̣ ̣ ̉ nh ng khi nông đô cua no tiêp tuc tăng t ̀ ̀  30­50g/l thi tôc đô sinh tr ̀ ng lai giam dân

̀ ̀ ̣ ư t ̀  267­250 µm/ngay. Khi nông đô saccharose trong môi tr ̀ ươ ng dinh d ̃ ̀ ươ ng la 30g/l

̀ ́ ́ ̀ ̀ ưở ̣ ợ ̣ ự ̣ ̉ ̣ thi tôc đô sinh tr ng cua hê s i nâm Cordyceps sp. đat c c đai la 267 µm/ngay. Vi ̀

̀ ̀ ̀ ở ̣ ̉ ̣ vây, khi ta bô sung saccharose vao môi tr ̀ ́ ươ ng nuôi cây ̣ ợ    nông đô 30g/l thi hê s i

́ ưở nâm sinh tr ́ ́ ng tôt nhât.

56

́

̀

̀

ưở

ơ

ưở

3.6. Anh h

ng nông đô cua nguôn Nit

lên tôc đô sinh tr

̉ ̣ ̉ ̣ ̉

̣ ợ   ng cua hê s i

nâm ́ Cordyceps sp.

̀ ̀ ́ ̀ ́ ́ ́ ́ ̀ ượ ơ ợ ư ̉ Sau khi tim đ c nguôn Nit thich h p ta tiên hanh khao sat trên cac m c nông

̀ ̀ ́ ́ ́ ̉ ợ ự ợ ̣ ̉ ̣ ̉ ́ đô khac nhau đê tim ra nông đô thich h p cho s  phat triên cua s i nâm Cordyceps sp.

́ ̀ ươ Đ ng kinh colonie

̣ ̣ 4 ngay  ̀ (mm) 8 ngay  ̀ ́ (mm) Tôc đô moc Nông̀ (µm/ngay)̀ ̣ đô Pepton

(g/lit)

5 1 ± 0,020 1.9 ± 0,150 225 ± 0,900

10 0.77 ± 0,001 1.83 ± 0,020 265 ± 2,600

15 0.87 ± 0,030 2 ± 0,011 282 ± 2,200

20 0.43 ± 0,014 1.23 ± 0,030 217 ± 2,800

30 0.2 ± 0,022 0.67 ± 0,004 117 ± 0,090

̀ ́ ưở ̣ ợ ̉ ̣ ̉ ̣ ̣ ́ Bang 6: Tôc đô sinh tr ́ ng cua hê s i nâm Cordyceps sp. trên cac nông đô đam

́ khac nhau.

57

300

250

ộ

N ng đồ pepton (g/l)

200

150

ố ộ T c đ  sinh ngưở tr (µm/ngày)

100

50

0

1

2

3

4

5

5

10

15

20

30

ộ

N ng đồ pepton (g/l)

225

265

282

217

117

ố ộ T c đ  sinh ngưở tr (µm/ngày)

̀ ́ ́ ̀ ưở ̣ ợ ̣ ̣ ̉ ́ Đô thi 5: Tôc đô sinh tr ng cua hê s i nâm Cordyceps sp. trên cac nông đô ̣

́ pepton khac nhau.

̀ ̀ ̀ ̀ ́ ư ưở ̣ ợ ̉ ̣ ̉ ̣ ̉ T   bang  6  va   đô  thi  5  chi  ra   răng  tôc   đô  sinh  tr ́   ng  cua   hê   s i  nâm

̀ ̀ ̀ ̀ ̀ ̀ ư ơ ̣ ̣ ̣ ̣ ̃ Cordyceps sp. không nh ng phu thuôc vao nguôn Nit ̣   ma con phu thuôc vao nông đô

́ ̀ ươ ươ ̉ ̣ cua chung trong môi tr ̀ ươ ng. Khi nông đô pepton trong môi tr ̀ ng dinh d ̃ ng tăng

́ ̀ ̀ ưở ư ư ̣ ư t ̀ ̀  5­15g/l thi tôc đô sinh tr ̣ ợ ng hê s i tăng t ̀ ̣   225­282 µm/ngay, nh ng khi nông đô

́ ́ ̀ ư ưở ư ̉ ̣ ̣ ̣ ̉ ́ cua   no  tiêp  tuc   tăng  t ̀ ̀   15­30g/l  thi   tôc   đô  sinh  tr ng   lai  giam  dân  t ̀   282­167

̀ ̀ ̀ ̀ ́ ̣ ̣ µm/ngay. Khi nông đô pepton trong môi tr ̀ ươ ng dinh d ̃ ươ ng la 15g/l thi tôc đô sinh

̀ ̀ ̀ ưở ̣ ợ ̣ ự ̉ ̣ ̣ tr ng cua hê s i nâm ́ ̉  Cordyceps sp. đat c c đai la 282 µm/ngay. Vi vây, khi ta bô

̀ ̀ ́ ở ̣ ợ ưở ̣ sung pepton vao môi tr ̀ ́ ươ ng nuôi cây ̀  nông đô 15g/l thi hê s i nâm sinh tr ́   ng tôt

́ ́ ̀ ̀ ́ ̀ ́ ư ượ ̣ ̣ nhât, nh ng khi tiêp tuc tăng nông đô pepton thi luc nay v t qua ng ̃ ́ ̀ ươ   ng cân thiêt

́ ́ ̀ ̀ ̀ ́ ư ở ở ̉ ̣ ̉ cua nâm ́ ̀ Cordyceps sp. no tr  nên  c chê. Cu thê la ợ    20g/l thi sau 4 ngay đâu s i

́ ̀ ́ ̀ ́ ̀ ́ ̉ ơ ̉ ̉ ̣ ̣ ̣ ̀ nâm chi m i xu ra rât nho, sau 8 ngay chi đat 1,23mm, tôc đô moc la 217 µm/ngay.

58

́

́

̃

́

̣ ợ

3.7. Kha năng tich luy sinh khôi cua hê s i nâm

Cordyceps  sp

caćở

́

́

̉ ̉

ươ

trang thai khac nhau cua môi tr

̣ ̉

̀ ươ ng dinh d

̃ ng.

Sinh khôí ́ ̣ Trang thai môi tr ̀ ươ ng (g/l)

12.25 ± 0,17 ̉ Long­tinh̃ 6.20 ± 0,24 ̉ ̣ Long­ đông

́ ́ ́ ̣ ợ ở ̉ ̉ ̣ ́ Bang 7: Sinh khôi cua hê s i nâm Cordyceps sp. ́ ̉    cac trang thai khac nhau cua

ươ môi tr ̀ ươ ng dinh d ̃ ng.

̀ ́ ́ ́ ̃ ư ̉ ̉ ̉ Cordyceps ́ ư ở T  kêt qua nghiên c u ́  bang 7 ta thây kha năng tich luy sinh khôi

́ ̃ ươ ̣ ̣ ̣ ̣ ̉ ̉ ̣ ̀ sp. phu thuôc vao trang thai môi tr ̀ ươ ng dinh d ̀ ̃ ng (long tinh, long đông),  ma s ự

́ ̃ ́ ́ ̀ ́ ư ̣ ̉ ̣ ́ khac nhau gi a cac trang thai môi tr ̀ ươ ng chu yêu la đô thông thoang. Cordyceps sp.

̀ ́ ́ ́ ̀ ̀ ́ ́ ̀ ở ̣ la loai nâm ki sinh trên côn trung năm ́  trên la hoăc trong cac hôc cây, thich môi

́ tr ́ ̀ ươ ng thiêu không khi.

́ ̃ ́ Ở ươ ấ ơ ớ ̉ ̣ ̉ môi tr ̀ ng long ­ đông, thì kha năng tich luy sinh khôi th p h n so v i khi ở

̀ ́ ườ ̣ ử ỏ ộ ơ ̉ ̉ trong môi tr ng l ng đ ng, chi băng khoang môt n a so v i khi nuôi trong môi

̀ ̃ ́ ̀ ́ ở ươ ̣ ơ ̣ ợ ̉ ̉ ̉ tr ̀ ươ ng long tĩnh. Vì môi tr ̀ ̀ ng long tinh hê s i phat triên bê măt c  chât va chim

̀ ̀ ́ ̣ ợ ̣ ̣ ̣ ́   trong dung dich, 75% hê s i chim trong dung dich trong điêu kiên thiêu không khi,

̀ ́ ̀ ́ ̃ ́ ̀ ́ ơ ợ ̣ ̉ ̉ ̉ ́ phu h p v i đăc điêm sinh ly cua loai nên kha năng tich luy sinh khôi la cao nhât.

59

̀ ́ ̃ ợ ̉ Hinh 20 : S i nâm Cordyceps sp. nuôi trên môi tr ̀ ươ ng long tinh.

̀ ́ ợ ̀ươ ̉ ̣ ̣ Hinh 21: S i nâm Cordyceps sp. nuôi trên môi tr ng long đông.

60

̀ ́ ́ ̀ ̣ ợ ̉ ́ Hinh 22 : Sinh khôi khô cua hê s i nâm Cordyceps sp. sau 10  ngay nuôi cây trong

̀ ̃ ̣ ̉ điêu kiên long tinh.

̀ ́ ̀ ̣ ợ ̉ ́ Hinh 23: Sinh khôi khô cua hê s i nâm ́   Cordyceps sp. sau 10  ngay nuôi cây

̀ ̣ ̉ ̣ trong điêu kiên long đông.

61

́

́

̀

̣ ̣

KÊT LUÂN VA KIÊN NGHI

́

I. KÊT LUÂN:

̣

̀ ́ ́ ́ ́ ư ư ư ̉ ̣ ̣ ́ T  kêt qua nghiên c u trên chung tôi đ a ra môt sô kêt luân sau:

ư ủ ọ ủ ể ị 1. Ch a đ  thông tin đ  xác đ nh chính xác tên khoa h c c a loài Cordyceps sp.

ệ ạ ạ phát hi n t i Langbiang Đà L t.

́ ́ ́ ̣ ợ ự ợ ̉ ̉ 2. Nguôn ̀ Cacbon thich h p cho s  phat triên cua hê s i nâm Cordyceps sp. là

̀ ́ ́ ơ ư ̣ ̀ ̀ ươ đ ng saccharose v i nông đô tôi  u la 30g/l.

́ ́ ơ ̣ ợ ự ợ ̉ ̉ 3. Nguôn  ̀ Nit ́  thich h p cho s  phat triên cua hê s i nâm Cordyceps  sp. là

̀ ̀ ́ ư ́ ơ ̣ pepton v i nông đô tôi  u la 15g/l.

̃ ́ ́ ́ ̀ ạ ở ̉ ̣ ̣ ợ 4. Kha năng tich luy sinh khôi hê s i nâm trong cung môt lo i môi tr ̀ ươ ng ́  cac

́ ́ ̀ ́ ̃ ́ ấ ở ấ ̣ ̣ ̉ trang thai nuôi c y khac nhau thi khac nhau. Khi nuôi c y trang thai long tinh kha ̉

́ ́ ̃ ấ ở ơ ́ ơ ̣ ̉ ̣ năng tich luy sinh khôi cao h n so v i khi nuôi c y ́  trang thai long đông.

́      II. KIÊN NGHI:

̣

ụ ứ ủ ế ằ ọ ị 1.   Ti p   t c   nghiên   c u   nh m   xác   đ nh   chính   xác   tên   khoa   h c   c a   loài

ả ớ ộ ị ̉ Cordyceps sp. khăng đ nh đây có ph i là m t loài m i hay không.

́ ̀ ̀ ̀ ế ụ ơ ự ̉ 2. Ti p t c khao sat các nguôn Cacbon va nguôn Nit khác nhau lên s  sinh

́ ́ ́ ưở ̣ ợ ưở ̉ ̉ ̉ ̉ tr ng cua hê s i nâm ́ Cordyceps sp. Khao sat anh h ́   ng cua vitamin, chât kich tô

̣ ả ưở ệ ợ ể ằ sinh hoc,  nh h ủ ng c a nhi ệ ộ … lên quá trình phát tri n h  s i nh m xác t đ , pH

ồ ơ ấ ố ư ể ấ ố ồ ị đ nh ngu n c  ch t t i  u đ  nuôi tr ng thu sinh kh i loài n m này.

ả ể ứ ế ề ể ệ ồ 3. Ti n hành nghiên c u nuôi tr ng thu qu  th , tìm hi u các đi u ki n môi

ườ ơ ấ ự ợ tr ả ể ng, c  ch t thích h p cho s  hình thành qu  th .

ộ ố ợ ủ ấ ạ ầ ọ ề   4. Phân tích thành ph n c a m t s  h p ch t có ho t tính sinh h c có ti m

ứ ượ ụ năng  ng d ng trong y d c.

ả ả ệ ừ ộ ố ủ 5. Kh o sát kh  năng di t tr  m t s  loài sâu c a loài Cordyceps sp. Đà L tạ .

62

̀

̣ ̉

TAI LIÊU THAM KHAO

̀

́

̣ ̉ ̣

Tai liêu tham khao tiêng Viêt Nam

́ ̃ Ả ưở ộ ố ủ ồ ưỡ ̣ 1. Lê Ba Dung (1991).  nh h ng c a m t s  ngu n dinh d ng (Cacbon, ̣

ơ ự ưở ủ ấ Nit và vitamin) lên s  sinh tr ủ ng c a micelium c a hai loài n m kinh t ế   :

ọ ạ ọ   Pleurotus cornucorpae và  Pleurotus eryngii. Thông báo khoa h c. Đ i h c

Đà L t.ạ

̀ ́ ̃ ̃ ̀ ́ ̣ ̉ 2. Nguyên Lân Dung (2005). Công nghê nuôi trông nâm. Nha xuât ban nông

̀ ̣ ̣ nghiêp Ha Nôi.

̀ ́ ́ ươ ự ư ̣ ̣ ̣ ̉ 3. Tr ́ ng Thi Hông (2008). Nghiên c u s  phân hoa sinh đia hoc cua nâm

̃ ̣ ̣ ̣ ươ h ng Shitakee Lentinula spp.. Luân văn thac si sinh hoc.

́ ́ ́ ́ ̣ ̣ ̣ ̉ ̣ ̣ 4. Trinh Tam Kiêt (1981). Vi tri cua nâm trong sinh gi ́ ơ i. Tap chi sinh hoc sô hai.

̀ ̃ ̃ ́ ̃ ợ ̣ ̣ ̃ 5. Nguyên Văn Lan; Đô Tât L i; Nguyên Văn Thach (1965). Ki thuât nuôi trông

̀ ́ ̀ ́ ́ ượ ̣ ̉ ̣ ́ va chê biên d c liêu. Nha xuât ban y hoc Băc Kinh.

̀ ̃ ̃ ̀ ̀ ́ ươ 6. Lê Đinh L ̀   ng, Nguyên Lân Dung, Bui Xuân Đông (1982). Vi nâm. Nha

̀ ̃ ́ ̀ ̉ ̣ ̣ ̣ xuât ban khoa hoc va ky thuât Ha Nôi.

̃ ́ ́ ượ ự ư ưở ủ ̉ 7. Nguyên Thuc Duy Ph ng (1997). Nghiên c u s  anh h ng c a m t s ộ ố

̀ ̀ ồ ưỡ ̣ ự ưở ủ ̣ ̉ ngu n dinh d ng va môt vai Phytohormon lên s  sinh tr ̣  ng c a cua hê ̣

́ ̃ ̣ ̣ ̣ s i nâm ́ ợ Poria coccus Wolf. Luân an thac si sinh hoc.

̀ ̀ ́ ́ ự ̣ ̉ ̣ ̣ ̣ ̉ ̣ 8. Hoang Thi San (2007). Phân loai hoc th c vât . Nha xuât ban giao duc.

́ ́ ̀ ươ ̣ ̣ 9. Lê Xuân Tham (2000). Nâm H ng Cao Băng – Taxon đăc biêt trong chi

ượ ̣ ̣ ́ Lentinula Earle. Tap chi d ́ c hoc sô 3: 6­9.

63

́

̀

̣ ̉

Tai liêu tham khao tiêng n

̀ ́ ươ c ngoai

10. Chang   Shu­Ting;   Jonh   A.   Buswell   and   Siu­Wai   Chiu   (1993).   Mushroom

Biology and Mushroom Products. The Chinese university Press, Hong Kong.

11. Gu   Yu­Xiang;   Wang   Zun­Sheng;   Wang   Su­Xia;   Yuan   Qin­Sheng   (2007).

Effect   of   multiple   factors   on   accumulation   of   nucleosides   and   bases   in

Cordyceps militaris. Food Chemistry 102: 1304­1309.

12. Holliday, John; Cleaver Phillip; Lomis­Powers Megan; Patel Dinesh (2004).

Analysis of Quality and Techniques for Hybridization of Medicinal Fungus

Cordyceps   sinensis Ascomycetes (Berk.) Sacc.   ( )  .   International   Journal   of

Medicinal Mushrooms (New York: Begell House) 6 (2): 152.

13. Kobayasi,   Y.   (1982).   The   genus   genera  Cordyceps  and  Torrubiella.

Transactions of the Mycological Society Japan 23: 329­364.

14. Petch, T. (1926). Note on   entomogenous fungi. Transactions of the British

Mycological Society 15: 209­245.

15. Sung, Gi­Ho; Nigel L. Hywel­Jones; Jae­Mo Sung; J. Jennifer Luangsa­ard;

Bhushan Shrestha; Joseph W. Spatafora (2007). Phylogenetic classification of

Cordyceps and the clavicipitaceous fungi. Studies in  Mycology 57 (1): 5–59.

16. Wang, Z. S.; Gu, Y. X.; Yuan, Q. S. (2006). Effect of nutrition factors on the

synthesis   of   superoxide   dismutase,   catalase,   and   membrane   lipid   peroxide

levels in Cordyceps militaris mycelium. Current Microbiology 52: 74­79.

17.   Winkler,   D.   (2008).   Yartsa   Gunbu   (Cordyceps   sinensis)   and   the   Fungal

Commodification of the Rural Economy in Tibet AR. Economic Botany 63

(2): 291­306.

64