intTypePromotion=3

Khảo sát một số phương pháp giảm kích thước tiểu phân liposome amphotericin B

Chia sẻ: Nguyễn Thị Thanh Triều | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

0
19
lượt xem
0
download

Khảo sát một số phương pháp giảm kích thước tiểu phân liposome amphotericin B

Mô tả tài liệu
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết trình bày kết quả khảo sát một số phương pháp làm giảm kích thước tiểu phân và đồng nhất hóa liposome AmB. Đây là giai đoạn có vai trò quan trọng và có ý nghĩa quyết định đến quá trình nghiên cứu tiếp theo nhằm bào chế thuốc tiêm có chứa liposome AmB.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Khảo sát một số phương pháp giảm kích thước tiểu phân liposome amphotericin B

T¹P CHÝ Y - D¦îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îc-2016<br /> <br /> KHẢO SÁT MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP GIẢM KÍCH THƯỚC<br /> TIỂU PHÂN LIPOSOME AMPHOTERICIN B<br /> Nguyễn Tuấn Quang*; Nguyễn Văn Lâm**<br /> Nguyễn Thái Sơn***; Phạm Thị Minh Huệ**<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: khảo sát một số phương pháp làm giảm kích thước tiểu phân (KTTP) liposome<br /> amphotericin B (AmB). Phương pháp: liposome AmB được bào chế theo phương pháp hydrat<br /> hóa film và giảm KTTP bằng các phương pháp đùn tay qua màng, siêu âm và đồng nhất hóa áp<br /> suất cao kết hợp đùn qua màng. Kết quả: liposome AmB giảm KTTP bằng phương pháp đùn<br /> tay với thiết bị mini extruder có độ đồng nhất cao (PDI < 0,2) nhưng KTTP vẫn > 200 nm;<br /> phương pháp dùng que siêu âm sau 4 phút có KTTP < 200 nm và phân bố KTTP đồng nhất<br /> (PDI < 0,2); phương pháp dùng bể siêu âm đều cho liposome AmB có KTTP lớn (> 500 nm) và<br /> phân bố KTTP không đồng nhất (PDI > 0,5); phương pháp đồng nhất hóa áp suất cao kết hợp<br /> đùn qua màng với điều kiện áp suất đồng nhất hóa là 5000 psi, số chu kỳ đồng nhất hóa là 2,<br /> màng polycarbonat 400 nm, số lần đùn là 2 cho liposome AmB có hình cầu, đa số có 1 lớp,<br /> KTTP < 200 nm và phân bố KTTP tương đối đồng nhất (PDI < 0,3). Kết luận: đã khảo sát được<br /> một số phương pháp làm giảm KTTP liposome AmB. Trong đó, phương pháp đồng nhất hóa áp<br /> suất cao kết hợp đùn qua màng cho kết quả tốt nhất. Đây là cơ sở để nghiên cứu giai đoạn tiếp<br /> theo bào chế thuốc tiêm liposome AmB.<br /> * Từ khoá: Liposome; Amphotericin B; Kích thước tiểu phân; Giảm kích thước.<br /> <br /> Evaluating Methods of Particle Size Reduction of Liposome<br /> Amphotericin B<br /> Summary<br /> Objectives: To evaluate several methods for particle size reduction of liposome AmB.<br /> Materials and methods: Liposome AmB was prepared by using film hydration and its particle<br /> size was reduced by manual trans-membrane extrusion method, ultrasonification and combination of<br /> high pressure homogenization method with manual trans-membrane extrusion method. Results:<br /> Liposome AmB particle size reduction using manual trans-membrane extrusion method with<br /> miniextruder device resulted in high uniformity (PDI < 0.2) but the particle size was still greater<br /> than 200 nm; using ultrasonification probe method in 4 minutes enabled particle size to be<br /> smaller with less than 200 nm and particle size distributed evenly (PDI < 0.2); using ultrasonic<br /> method made particle size larger (above 500 nm) and particle size distributed unevenly (PDI > 0.5);<br /> * Học viện Quân y<br /> ** Đại học Dược Hà Nội<br /> *** Bệnh viện Quân y 103<br /> Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Tuấn Quang (dsquang2000@yahoo.com)<br /> Ngày nhận bài: 20/07/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 18/08/2016<br /> Ngày bài báo được đăng: 14/09/2016<br /> <br /> 39<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îc-2016<br /> combination of high-pressure homogenization method with manual trans-membrane extrusion<br /> method, repeated twice at 5,000 psi, 400 nm sized polycarbonate membranes, resulted in<br /> spherical liposome Am B particle size of less than 200 nm, mostly 1 layer and particle size<br /> distributed relatively evenly (PDI < 0.3). Conclusion: Several methods of particle size reduction<br /> of liposome amphotericin have been evaluated and combination of high-pressure homogenization<br /> method with manual transmembrane extrusion method gave the best result. This is the basement<br /> for further studies in preparing liposome AmB injection.<br /> * Key words: Liposome; Amphotericin B; Particle size; Reduction.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Liposome là hệ mang thuốc có nhiều<br /> ưu điểm nổi bật về kiểm soát giải phóng<br /> và khả năng đưa thuốc tới cơ quan đích...<br /> [2]. Để bào chế liposome, có nhiều phương<br /> pháp khác nhau, trong đó phương pháp<br /> hydrat hóa film thường được sử dụng do<br /> có các ưu điểm như: kỹ thuật bào chế<br /> tương đối đơn giản, dễ thực hiện, áp dụng<br /> cho tất cả các loại phospholipid, hiệu suất<br /> liposome hóa với dược chất tan trong lipid<br /> khá cao... Tuy nhiên, một trong những<br /> hạn chế của phương pháp là liposome<br /> thu được thường có kích thước lớn,<br /> nhiều lớp và không đồng nhất (khoảng<br /> 50 - 1.000 nm) [2, 4]. Vì thế, nếu muốn<br /> đưa liposome vào dạng bào chế thuốc<br /> tiêm, cần tiếp tục xử lý để thu được<br /> liposome có kích thước nhỏ và đồng nhất<br /> hơn, nhằm giúp quá trình lọc vô khuẩn<br /> thuận lợi, tăng cường đưa thuốc tới đích,<br /> Liposome AmB đã được nghiên cứu<br /> bào chế theo phương pháp hydrat hóa<br /> film [1]. Nghiên cứu này nhằm: Trình bày<br /> kết quả khảo sát một số phương pháp làm<br /> giảm KTTP và đồng nhất hóa liposome<br /> AmB. Đây là giai đoạn có vai trò quan trọng<br /> và có ý nghĩa quyết định đến quá trình<br /> nghiên cứu tiếp theo nhằm bào chế thuốc<br /> tiêm có chứa liposome AmB.<br /> 40<br /> <br /> NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Nguyên liệu và thiết bị.<br /> - Nguyên liệu: AmB, phosphatidylcholin<br /> đậu nành hydrogen hóa (HSPC), distearoyl<br /> phosphatidylglycerol (DSPG), cholesterol<br /> (Chol) và các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn<br /> USP, tiêu chuẩn nhà sản xuất hoặc tinh<br /> khiết hóa học.<br /> - Thiết bị: hệ thống cất quay Rovapor<br /> R-210 (Buchi, Đức), bình cầu NS 29/32,<br /> dung tích 2.000 ml (Buchi, Đức); thiết bị<br /> đùn mini extruder (Eastern Scientific, Mỹ);<br /> thiết bị đùn cao áp EmulsiFlex-C5 (Avestin,<br /> Canada); bể siêu âm Wiseclean 40 kHz<br /> (Hàn Quốc); máy siêu âm que UP200Ht<br /> (Hielscher, Đức); hệ thống thiết bị phân<br /> tích kích thước Zetasizer nano ZS90 (Anh);<br /> kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)<br /> JEOL 1010 (Nhật Bản) và các thiết bị,<br /> dụng cụ khác đạt tiêu chuẩn nghiên cứu.<br /> 2. Phương pháp nghiên cứu.<br /> * Phương pháp bào chế liposome AmB:<br /> Liposome AmB được bào chế theo<br /> phương pháp hydrat hóa film với các thành<br /> phần chính gồm AmB, HSPC, DSPG, Chol<br /> [1].<br /> <br /> T¹P CHÝ Y - D¦îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îc-2016<br /> * Phương pháp giảm KTTP và đồng nhất<br /> hóa liposome AmB:<br /> - Phương pháp đùn ép qua màng<br /> polycarbonat bằng thiết bị mini extruder<br /> [2, 3].<br /> - Phương pháp siêu âm: bằng bể siêu<br /> âm hoặc que siêu âm [2].<br /> - Phương pháp đồng nhất hóa áp suất<br /> cao kết hợp đùn qua màng [2].<br /> * Phương pháp đánh giá đặc tính của<br /> liposome AmB:<br /> - KTTP và độ đồng nhất: sử dụng<br /> phương pháp tán xạ ánh sáng động với<br /> thiết bị Zetasizer ZS90.<br /> - Hình thái cấu trúc tiểu phân: bằng<br /> phương pháp chụp hiển vi điện tử truyền<br /> qua (TEM) với kỹ thuật nhuộm soi âm bản.<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ<br /> BÀN LUẬN<br /> Tiến hành bào chế các mẫu liposome<br /> AmB theo phương pháp hydrat hóa film<br /> thu được kết quả có KTTP khoảng 738 1.026 nm, phân bố KTTP khoảng 0,451 0,868. Các mẫu liposome AmB này được<br /> dùng để khảo sát các biện pháp làm giảm<br /> KTTP và đồng nhất hóa.<br /> 1. Kết quả khảo sát phương pháp đùn<br /> qua màng bằng thiết bị mini extruder.<br /> Liposome AmB sau khi bào chế được<br /> đùn ép lần lượt qua màng polycarbonat<br /> kích thước 1.000 - 400 - 200 nm bằng thiết<br /> bị đùn tay mini extruder. Mỗi mẫu đùn<br /> 29 lần và giữ ở nhiệt độ 60oC trong suốt<br /> quá trình đùn bằng bể điều nhiệt.<br /> <br /> Bảng 1: KTTP và phân bố KTTP của các<br /> mẫu liposome AmB trước và sau khi đùn tay.<br /> Trước đùn<br /> <br /> Sau đùn<br /> <br /> KTTP (d.nm)<br /> <br /> PDI<br /> <br /> KTTP (d.nm)<br /> <br /> PDI<br /> <br /> 738,8<br /> <br /> 0,495<br /> <br /> 207,5<br /> <br /> 0,122<br /> <br /> 750,0<br /> <br /> 0,566<br /> <br /> 211,6<br /> <br /> 0,111<br /> <br /> 761,6<br /> <br /> 0,686<br /> <br /> 233,5<br /> <br /> 0,227<br /> <br /> Các mẫu liposome AmB sau đùn có<br /> chỉ số PDI thấp (từ 0,111 - 0,227) cho<br /> thấy phân bố KTTP đồng nhất. Tuy nhiên,<br /> KTTP vẫn còn lớn (> 200 nm), thể tích<br /> mỗi lần đùn tay chỉ được 1 ml nên khó áp<br /> dụng ở quy mô lớn.<br /> 2. Kết quả khảo sát phương pháp<br /> siêu âm.<br /> * Phương pháp sử dụng que siêu âm:<br /> Liposome AmB sau khi bào chế cho<br /> vào cốc có mỏ. Sau đó, siêu âm bằng<br /> máy siêu âm que UP200Ht. Sau thời gian<br /> 1, 2, 3… đến 10 phút, lấy mẫu đo KTTP<br /> và phân bố KTTP.<br /> Bảng 2: KTTP và phân bố KTTP của<br /> các mẫu liposome AmB sử dụng que siêu<br /> âm (n = 3).<br /> Thời gian<br /> siêu âm (phút)<br /> <br /> KTTP<br /> (d.nm)<br /> <br /> PDI<br /> <br /> Ban đầu<br /> <br /> 566,0 ± 11,5<br /> <br /> 0,607 ± 0,019<br /> <br /> 256,7 ± 5,3<br /> <br /> 0,453 ± 0,031<br /> <br /> 2<br /> <br /> 202,9 ± 4,3<br /> <br /> 0,411 ± 0,031<br /> <br /> 3<br /> <br /> 175,4 ± 4,5<br /> <br /> 0,303 ± 0,008<br /> <br /> 4<br /> <br /> 148,1 ± 0,1<br /> <br /> 0,255 ± 0,008<br /> <br /> 5<br /> <br /> 146,6 ± 1,3<br /> <br /> 0,212 ± 0,025<br /> <br /> 6<br /> <br /> 139,1 ± 0,1<br /> <br /> 0,220 ± 0,028<br /> <br /> 7<br /> <br /> 139,4 ± 0,1<br /> <br /> 0,227 ± 0,001<br /> <br /> 8<br /> <br /> 140,6 ± 0,4<br /> <br /> 0,248 ± 0,004<br /> <br /> 9<br /> <br /> 141,3 ± 4,7<br /> <br /> 0,253 ± 0,001<br /> <br /> 10<br /> <br /> 145,9 ± 1,0<br /> <br /> 0,272 ± 0,007<br /> <br /> 41<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îc-2016<br /> Với phương pháp sử dụng que siêu<br /> âm, sau 4 phút, các mẫu đã cho kết quả<br /> có KTTP < 200 nm, phân bố KTTP tương<br /> đối đồng nhất (PDI < 0,3). Hạn chế của<br /> phương pháp là thường đưa các tạp chất<br /> vào chế phẩm [2] và chỉ áp dụng ở quy<br /> mô nhỏ.<br /> * Phương pháp sử dụng bể siêu âm:<br /> Liposome AmB sau khi bào chế cho<br /> vào cốc có mỏ và tiến hành siêu âm<br /> trong bể Wiseclean (40 kHz) với quy trình<br /> siêu âm ngắt quãng: siêu âm 30 giây,<br /> nghỉ 30 giây (mẫu A1); siêu âm 1 phút,<br /> nghỉ 1 phút (mẫu A2); siêu âm 2 phút,<br /> nghỉ 2 phút (mẫu A3) (trong quá trình siêu<br /> âm sử dụng nước đá để tránh tăng nhiệt<br /> cục bộ hỗn dịch liposome). Sau 20 phút,<br /> lấy mẫu đo KTTP và phân bố KTTP.<br /> Bảng 3: KTTP và phân bố KTTP của các<br /> mẫu liposome AmB sử dụng bể siêu âm<br /> (n = 3).<br /> <br /> Liposome AmB sau khi bào chế được<br /> tiến hành đồng nhất hóa và đùn qua màng<br /> bằng máy Emulsiflex-C5 dưới áp lực của<br /> bình khí N2 lỏng, áp suất 5.000 psi (350 bar).<br /> Khảo sát số lần đùn khác nhau để tìm<br /> ra điều kiện phù hợp. Sau đó, kết hợp<br /> đùn qua màng 400 nm ở áp suất 500 psi<br /> (35 bar).<br /> * Ảnh hưởng của số chu kỳ đồng nhất<br /> hóa:<br /> Bảng 4: KTTP và phân bố KTTP của các<br /> mẫu liposome AmB theo số chu kỳ đống<br /> nhất hóa.<br /> Số chu kỳ<br /> <br /> KTTP (d.nm)<br /> <br /> PDI<br /> <br /> 0<br /> <br /> 882,6<br /> <br /> 0,508<br /> <br /> 1<br /> <br /> 174,0<br /> <br /> 0,408<br /> <br /> 2<br /> <br /> 149,2<br /> <br /> 0,364<br /> <br /> 3<br /> <br /> 141,9<br /> <br /> 0,376<br /> <br /> Mẫu<br /> <br /> KTTP (d.nm)<br /> <br /> PDI<br /> <br /> 4<br /> <br /> 135,1<br /> <br /> 0,382<br /> <br /> A1<br /> <br /> 522,13 ± 26,05<br /> <br /> 0,727 ± 0,075<br /> <br /> 5<br /> <br /> 130,5<br /> <br /> 0,371<br /> <br /> A2<br /> <br /> 507,97 ± 33,62<br /> <br /> 0,713 ± 0,104<br /> <br /> 6<br /> <br /> 121,1<br /> <br /> 0,376<br /> <br /> A3<br /> <br /> 662,30 ± 59,01<br /> <br /> 0,542 ± 0,051<br /> <br /> 7<br /> <br /> 112,5<br /> <br /> 0,306<br /> <br /> 8<br /> <br /> 110,0<br /> <br /> 0,294<br /> <br /> Sau 20 phút, các quy trình siêu âm<br /> đều cho liposome AmB có KTTP lớn<br /> (> 500 nm) và phân bố KTTP không đồng<br /> nhất (PDI > 0,5). Điều này cho thấy, hiệu<br /> quả của việc giảm KTTP liposome AmB<br /> bằng bể siêu âm cho kết quả thấp. Chỉ có<br /> thể ứng dụng để sơ bộ giảm KTTP<br /> liposome trước khi áp dụng các phương<br /> pháp khác.<br /> 42<br /> <br /> 3. Kết quả khảo sát phương pháp<br /> đồng nhất hóa áp suất cao kết hợp đùn<br /> qua màng.<br /> <br /> Sau chu kỳ thứ nhất, KTTP liposome<br /> AmB đã giảm xuống dưới 200 nm. Tuy nhiên,<br /> phân bố KTTP chưa đồng nhất (PDI > 0,4).<br /> Từ chu kỳ thứ 2 trở đi, KTTP liposome<br /> AmB có xu hướng giảm dần và PDI duy<br /> trì khoảng 0,3. Vì vậy, cần kết hợp mẫu<br /> đã giảm KTTP với đùn qua màng để tăng<br /> độ đồng nhất.<br /> <br /> T¹P CHÝ Y - D¦îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îc-2016<br /> * Kết quả khảo sát ảnh hưởng của số lần đùn qua màng:<br /> Các mẫu liposome AmB sau khi đồng nhất hóa, tiến hành đùn qua màng polycarbonat<br /> 400 nm ở áp suất 500 psi.<br /> Bảng 5: KTTP và phân bố KTTP các mẫu liposome AmB theo số lần đùn qua màng.<br /> Số lần<br /> <br /> KTTP (d.nm)<br /> <br /> PDI<br /> <br /> 0<br /> <br /> 149,2<br /> <br /> 0,364<br /> <br /> 1<br /> <br /> 134,3<br /> <br /> 0,337<br /> <br /> 2<br /> <br /> 134,9<br /> <br /> 0,281<br /> <br /> 3<br /> <br /> 131,8<br /> <br /> 0,274<br /> <br /> 4<br /> <br /> 131,6<br /> <br /> 0,275<br /> <br /> Sau khi đùn qua màng 400 nm, ở chu kỳ thứ 2, PDI giảm xuống < 0,3, mẫu đã đồng<br /> nhất hơn. Sự khác biệt về KTTP và phân bố KTTP của mẫu giữa chu kỳ thứ 2 và các<br /> chu kỳ tiếp theo không rõ rệt.<br /> Hình ảnh chụp TEM các mẫu sau khi đồng nhất áp suất cao và đùn qua màng cho<br /> thấy các tiểu phân vẫn có cấu trúc hình cầu, đa số có một lớp, KTTP nhỏ và đồng nhất<br /> (hình 1).<br /> <br /> (a) Ban đầu<br /> <br /> (b) Sau giảm KTTP<br /> <br /> Hình 1: Hình ảnh chụp TEM mẫu ban đầu (a) và sau khi làm giảm KTTP bằng<br /> phương pháp đồng nhất hóa áp suất cao kết hợp với đùn qua màng (b).<br /> 43<br /> <br />

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

Đồng bộ tài khoản