T¹P CHÝ Y - D¦îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îc-2016<br />
<br />
KHẢO SÁT MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP GIẢM KÍCH THƯỚC<br />
TIỂU PHÂN LIPOSOME AMPHOTERICIN B<br />
Nguyễn Tuấn Quang*; Nguyễn Văn Lâm**<br />
Nguyễn Thái Sơn***; Phạm Thị Minh Huệ**<br />
TÓM TẮT<br />
Mục tiêu: khảo sát một số phương pháp làm giảm kích thước tiểu phân (KTTP) liposome<br />
amphotericin B (AmB). Phương pháp: liposome AmB được bào chế theo phương pháp hydrat<br />
hóa film và giảm KTTP bằng các phương pháp đùn tay qua màng, siêu âm và đồng nhất hóa áp<br />
suất cao kết hợp đùn qua màng. Kết quả: liposome AmB giảm KTTP bằng phương pháp đùn<br />
tay với thiết bị mini extruder có độ đồng nhất cao (PDI < 0,2) nhưng KTTP vẫn > 200 nm;<br />
phương pháp dùng que siêu âm sau 4 phút có KTTP < 200 nm và phân bố KTTP đồng nhất<br />
(PDI < 0,2); phương pháp dùng bể siêu âm đều cho liposome AmB có KTTP lớn (> 500 nm) và<br />
phân bố KTTP không đồng nhất (PDI > 0,5); phương pháp đồng nhất hóa áp suất cao kết hợp<br />
đùn qua màng với điều kiện áp suất đồng nhất hóa là 5000 psi, số chu kỳ đồng nhất hóa là 2,<br />
màng polycarbonat 400 nm, số lần đùn là 2 cho liposome AmB có hình cầu, đa số có 1 lớp,<br />
KTTP < 200 nm và phân bố KTTP tương đối đồng nhất (PDI < 0,3). Kết luận: đã khảo sát được<br />
một số phương pháp làm giảm KTTP liposome AmB. Trong đó, phương pháp đồng nhất hóa áp<br />
suất cao kết hợp đùn qua màng cho kết quả tốt nhất. Đây là cơ sở để nghiên cứu giai đoạn tiếp<br />
theo bào chế thuốc tiêm liposome AmB.<br />
* Từ khoá: Liposome; Amphotericin B; Kích thước tiểu phân; Giảm kích thước.<br />
<br />
Evaluating Methods of Particle Size Reduction of Liposome<br />
Amphotericin B<br />
Summary<br />
Objectives: To evaluate several methods for particle size reduction of liposome AmB.<br />
Materials and methods: Liposome AmB was prepared by using film hydration and its particle<br />
size was reduced by manual trans-membrane extrusion method, ultrasonification and combination of<br />
high pressure homogenization method with manual trans-membrane extrusion method. Results:<br />
Liposome AmB particle size reduction using manual trans-membrane extrusion method with<br />
miniextruder device resulted in high uniformity (PDI < 0.2) but the particle size was still greater<br />
than 200 nm; using ultrasonification probe method in 4 minutes enabled particle size to be<br />
smaller with less than 200 nm and particle size distributed evenly (PDI < 0.2); using ultrasonic<br />
method made particle size larger (above 500 nm) and particle size distributed unevenly (PDI > 0.5);<br />
* Học viện Quân y<br />
** Đại học Dược Hà Nội<br />
*** Bệnh viện Quân y 103<br />
Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Tuấn Quang (dsquang2000@yahoo.com)<br />
Ngày nhận bài: 20/07/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 18/08/2016<br />
Ngày bài báo được đăng: 14/09/2016<br />
<br />
39<br />
<br />
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îc-2016<br />
combination of high-pressure homogenization method with manual trans-membrane extrusion<br />
method, repeated twice at 5,000 psi, 400 nm sized polycarbonate membranes, resulted in<br />
spherical liposome Am B particle size of less than 200 nm, mostly 1 layer and particle size<br />
distributed relatively evenly (PDI < 0.3). Conclusion: Several methods of particle size reduction<br />
of liposome amphotericin have been evaluated and combination of high-pressure homogenization<br />
method with manual transmembrane extrusion method gave the best result. This is the basement<br />
for further studies in preparing liposome AmB injection.<br />
* Key words: Liposome; Amphotericin B; Particle size; Reduction.<br />
<br />
ĐẶT VẤN ĐỀ<br />
Liposome là hệ mang thuốc có nhiều<br />
ưu điểm nổi bật về kiểm soát giải phóng<br />
và khả năng đưa thuốc tới cơ quan đích...<br />
[2]. Để bào chế liposome, có nhiều phương<br />
pháp khác nhau, trong đó phương pháp<br />
hydrat hóa film thường được sử dụng do<br />
có các ưu điểm như: kỹ thuật bào chế<br />
tương đối đơn giản, dễ thực hiện, áp dụng<br />
cho tất cả các loại phospholipid, hiệu suất<br />
liposome hóa với dược chất tan trong lipid<br />
khá cao... Tuy nhiên, một trong những<br />
hạn chế của phương pháp là liposome<br />
thu được thường có kích thước lớn,<br />
nhiều lớp và không đồng nhất (khoảng<br />
50 - 1.000 nm) [2, 4]. Vì thế, nếu muốn<br />
đưa liposome vào dạng bào chế thuốc<br />
tiêm, cần tiếp tục xử lý để thu được<br />
liposome có kích thước nhỏ và đồng nhất<br />
hơn, nhằm giúp quá trình lọc vô khuẩn<br />
thuận lợi, tăng cường đưa thuốc tới đích,<br />
Liposome AmB đã được nghiên cứu<br />
bào chế theo phương pháp hydrat hóa<br />
film [1]. Nghiên cứu này nhằm: Trình bày<br />
kết quả khảo sát một số phương pháp làm<br />
giảm KTTP và đồng nhất hóa liposome<br />
AmB. Đây là giai đoạn có vai trò quan trọng<br />
và có ý nghĩa quyết định đến quá trình<br />
nghiên cứu tiếp theo nhằm bào chế thuốc<br />
tiêm có chứa liposome AmB.<br />
40<br />
<br />
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP<br />
NGHIÊN CỨU<br />
1. Nguyên liệu và thiết bị.<br />
- Nguyên liệu: AmB, phosphatidylcholin<br />
đậu nành hydrogen hóa (HSPC), distearoyl<br />
phosphatidylglycerol (DSPG), cholesterol<br />
(Chol) và các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn<br />
USP, tiêu chuẩn nhà sản xuất hoặc tinh<br />
khiết hóa học.<br />
- Thiết bị: hệ thống cất quay Rovapor<br />
R-210 (Buchi, Đức), bình cầu NS 29/32,<br />
dung tích 2.000 ml (Buchi, Đức); thiết bị<br />
đùn mini extruder (Eastern Scientific, Mỹ);<br />
thiết bị đùn cao áp EmulsiFlex-C5 (Avestin,<br />
Canada); bể siêu âm Wiseclean 40 kHz<br />
(Hàn Quốc); máy siêu âm que UP200Ht<br />
(Hielscher, Đức); hệ thống thiết bị phân<br />
tích kích thước Zetasizer nano ZS90 (Anh);<br />
kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)<br />
JEOL 1010 (Nhật Bản) và các thiết bị,<br />
dụng cụ khác đạt tiêu chuẩn nghiên cứu.<br />
2. Phương pháp nghiên cứu.<br />
* Phương pháp bào chế liposome AmB:<br />
Liposome AmB được bào chế theo<br />
phương pháp hydrat hóa film với các thành<br />
phần chính gồm AmB, HSPC, DSPG, Chol<br />
[1].<br />
<br />
T¹P CHÝ Y - D¦îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îc-2016<br />
* Phương pháp giảm KTTP và đồng nhất<br />
hóa liposome AmB:<br />
- Phương pháp đùn ép qua màng<br />
polycarbonat bằng thiết bị mini extruder<br />
[2, 3].<br />
- Phương pháp siêu âm: bằng bể siêu<br />
âm hoặc que siêu âm [2].<br />
- Phương pháp đồng nhất hóa áp suất<br />
cao kết hợp đùn qua màng [2].<br />
* Phương pháp đánh giá đặc tính của<br />
liposome AmB:<br />
- KTTP và độ đồng nhất: sử dụng<br />
phương pháp tán xạ ánh sáng động với<br />
thiết bị Zetasizer ZS90.<br />
- Hình thái cấu trúc tiểu phân: bằng<br />
phương pháp chụp hiển vi điện tử truyền<br />
qua (TEM) với kỹ thuật nhuộm soi âm bản.<br />
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ<br />
BÀN LUẬN<br />
Tiến hành bào chế các mẫu liposome<br />
AmB theo phương pháp hydrat hóa film<br />
thu được kết quả có KTTP khoảng 738 1.026 nm, phân bố KTTP khoảng 0,451 0,868. Các mẫu liposome AmB này được<br />
dùng để khảo sát các biện pháp làm giảm<br />
KTTP và đồng nhất hóa.<br />
1. Kết quả khảo sát phương pháp đùn<br />
qua màng bằng thiết bị mini extruder.<br />
Liposome AmB sau khi bào chế được<br />
đùn ép lần lượt qua màng polycarbonat<br />
kích thước 1.000 - 400 - 200 nm bằng thiết<br />
bị đùn tay mini extruder. Mỗi mẫu đùn<br />
29 lần và giữ ở nhiệt độ 60oC trong suốt<br />
quá trình đùn bằng bể điều nhiệt.<br />
<br />
Bảng 1: KTTP và phân bố KTTP của các<br />
mẫu liposome AmB trước và sau khi đùn tay.<br />
Trước đùn<br />
<br />
Sau đùn<br />
<br />
KTTP (d.nm)<br />
<br />
PDI<br />
<br />
KTTP (d.nm)<br />
<br />
PDI<br />
<br />
738,8<br />
<br />
0,495<br />
<br />
207,5<br />
<br />
0,122<br />
<br />
750,0<br />
<br />
0,566<br />
<br />
211,6<br />
<br />
0,111<br />
<br />
761,6<br />
<br />
0,686<br />
<br />
233,5<br />
<br />
0,227<br />
<br />
Các mẫu liposome AmB sau đùn có<br />
chỉ số PDI thấp (từ 0,111 - 0,227) cho<br />
thấy phân bố KTTP đồng nhất. Tuy nhiên,<br />
KTTP vẫn còn lớn (> 200 nm), thể tích<br />
mỗi lần đùn tay chỉ được 1 ml nên khó áp<br />
dụng ở quy mô lớn.<br />
2. Kết quả khảo sát phương pháp<br />
siêu âm.<br />
* Phương pháp sử dụng que siêu âm:<br />
Liposome AmB sau khi bào chế cho<br />
vào cốc có mỏ. Sau đó, siêu âm bằng<br />
máy siêu âm que UP200Ht. Sau thời gian<br />
1, 2, 3… đến 10 phút, lấy mẫu đo KTTP<br />
và phân bố KTTP.<br />
Bảng 2: KTTP và phân bố KTTP của<br />
các mẫu liposome AmB sử dụng que siêu<br />
âm (n = 3).<br />
Thời gian<br />
siêu âm (phút)<br />
<br />
KTTP<br />
(d.nm)<br />
<br />
PDI<br />
<br />
Ban đầu<br />
<br />
566,0 ± 11,5<br />
<br />
0,607 ± 0,019<br />
<br />
256,7 ± 5,3<br />
<br />
0,453 ± 0,031<br />
<br />
2<br />
<br />
202,9 ± 4,3<br />
<br />
0,411 ± 0,031<br />
<br />
3<br />
<br />
175,4 ± 4,5<br />
<br />
0,303 ± 0,008<br />
<br />
4<br />
<br />
148,1 ± 0,1<br />
<br />
0,255 ± 0,008<br />
<br />
5<br />
<br />
146,6 ± 1,3<br />
<br />
0,212 ± 0,025<br />
<br />
6<br />
<br />
139,1 ± 0,1<br />
<br />
0,220 ± 0,028<br />
<br />
7<br />
<br />
139,4 ± 0,1<br />
<br />
0,227 ± 0,001<br />
<br />
8<br />
<br />
140,6 ± 0,4<br />
<br />
0,248 ± 0,004<br />
<br />
9<br />
<br />
141,3 ± 4,7<br />
<br />
0,253 ± 0,001<br />
<br />
10<br />
<br />
145,9 ± 1,0<br />
<br />
0,272 ± 0,007<br />
<br />
41<br />
<br />
T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îc-2016<br />
Với phương pháp sử dụng que siêu<br />
âm, sau 4 phút, các mẫu đã cho kết quả<br />
có KTTP < 200 nm, phân bố KTTP tương<br />
đối đồng nhất (PDI < 0,3). Hạn chế của<br />
phương pháp là thường đưa các tạp chất<br />
vào chế phẩm [2] và chỉ áp dụng ở quy<br />
mô nhỏ.<br />
* Phương pháp sử dụng bể siêu âm:<br />
Liposome AmB sau khi bào chế cho<br />
vào cốc có mỏ và tiến hành siêu âm<br />
trong bể Wiseclean (40 kHz) với quy trình<br />
siêu âm ngắt quãng: siêu âm 30 giây,<br />
nghỉ 30 giây (mẫu A1); siêu âm 1 phút,<br />
nghỉ 1 phút (mẫu A2); siêu âm 2 phút,<br />
nghỉ 2 phút (mẫu A3) (trong quá trình siêu<br />
âm sử dụng nước đá để tránh tăng nhiệt<br />
cục bộ hỗn dịch liposome). Sau 20 phút,<br />
lấy mẫu đo KTTP và phân bố KTTP.<br />
Bảng 3: KTTP và phân bố KTTP của các<br />
mẫu liposome AmB sử dụng bể siêu âm<br />
(n = 3).<br />
<br />
Liposome AmB sau khi bào chế được<br />
tiến hành đồng nhất hóa và đùn qua màng<br />
bằng máy Emulsiflex-C5 dưới áp lực của<br />
bình khí N2 lỏng, áp suất 5.000 psi (350 bar).<br />
Khảo sát số lần đùn khác nhau để tìm<br />
ra điều kiện phù hợp. Sau đó, kết hợp<br />
đùn qua màng 400 nm ở áp suất 500 psi<br />
(35 bar).<br />
* Ảnh hưởng của số chu kỳ đồng nhất<br />
hóa:<br />
Bảng 4: KTTP và phân bố KTTP của các<br />
mẫu liposome AmB theo số chu kỳ đống<br />
nhất hóa.<br />
Số chu kỳ<br />
<br />
KTTP (d.nm)<br />
<br />
PDI<br />
<br />
0<br />
<br />
882,6<br />
<br />
0,508<br />
<br />
1<br />
<br />
174,0<br />
<br />
0,408<br />
<br />
2<br />
<br />
149,2<br />
<br />
0,364<br />
<br />
3<br />
<br />
141,9<br />
<br />
0,376<br />
<br />
Mẫu<br />
<br />
KTTP (d.nm)<br />
<br />
PDI<br />
<br />
4<br />
<br />
135,1<br />
<br />
0,382<br />
<br />
A1<br />
<br />
522,13 ± 26,05<br />
<br />
0,727 ± 0,075<br />
<br />
5<br />
<br />
130,5<br />
<br />
0,371<br />
<br />
A2<br />
<br />
507,97 ± 33,62<br />
<br />
0,713 ± 0,104<br />
<br />
6<br />
<br />
121,1<br />
<br />
0,376<br />
<br />
A3<br />
<br />
662,30 ± 59,01<br />
<br />
0,542 ± 0,051<br />
<br />
7<br />
<br />
112,5<br />
<br />
0,306<br />
<br />
8<br />
<br />
110,0<br />
<br />
0,294<br />
<br />
Sau 20 phút, các quy trình siêu âm<br />
đều cho liposome AmB có KTTP lớn<br />
(> 500 nm) và phân bố KTTP không đồng<br />
nhất (PDI > 0,5). Điều này cho thấy, hiệu<br />
quả của việc giảm KTTP liposome AmB<br />
bằng bể siêu âm cho kết quả thấp. Chỉ có<br />
thể ứng dụng để sơ bộ giảm KTTP<br />
liposome trước khi áp dụng các phương<br />
pháp khác.<br />
42<br />
<br />
3. Kết quả khảo sát phương pháp<br />
đồng nhất hóa áp suất cao kết hợp đùn<br />
qua màng.<br />
<br />
Sau chu kỳ thứ nhất, KTTP liposome<br />
AmB đã giảm xuống dưới 200 nm. Tuy nhiên,<br />
phân bố KTTP chưa đồng nhất (PDI > 0,4).<br />
Từ chu kỳ thứ 2 trở đi, KTTP liposome<br />
AmB có xu hướng giảm dần và PDI duy<br />
trì khoảng 0,3. Vì vậy, cần kết hợp mẫu<br />
đã giảm KTTP với đùn qua màng để tăng<br />
độ đồng nhất.<br />
<br />
T¹P CHÝ Y - D¦îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îc-2016<br />
* Kết quả khảo sát ảnh hưởng của số lần đùn qua màng:<br />
Các mẫu liposome AmB sau khi đồng nhất hóa, tiến hành đùn qua màng polycarbonat<br />
400 nm ở áp suất 500 psi.<br />
Bảng 5: KTTP và phân bố KTTP các mẫu liposome AmB theo số lần đùn qua màng.<br />
Số lần<br />
<br />
KTTP (d.nm)<br />
<br />
PDI<br />
<br />
0<br />
<br />
149,2<br />
<br />
0,364<br />
<br />
1<br />
<br />
134,3<br />
<br />
0,337<br />
<br />
2<br />
<br />
134,9<br />
<br />
0,281<br />
<br />
3<br />
<br />
131,8<br />
<br />
0,274<br />
<br />
4<br />
<br />
131,6<br />
<br />
0,275<br />
<br />
Sau khi đùn qua màng 400 nm, ở chu kỳ thứ 2, PDI giảm xuống < 0,3, mẫu đã đồng<br />
nhất hơn. Sự khác biệt về KTTP và phân bố KTTP của mẫu giữa chu kỳ thứ 2 và các<br />
chu kỳ tiếp theo không rõ rệt.<br />
Hình ảnh chụp TEM các mẫu sau khi đồng nhất áp suất cao và đùn qua màng cho<br />
thấy các tiểu phân vẫn có cấu trúc hình cầu, đa số có một lớp, KTTP nhỏ và đồng nhất<br />
(hình 1).<br />
<br />
(a) Ban đầu<br />
<br />
(b) Sau giảm KTTP<br />
<br />
Hình 1: Hình ảnh chụp TEM mẫu ban đầu (a) và sau khi làm giảm KTTP bằng<br />
phương pháp đồng nhất hóa áp suất cao kết hợp với đùn qua màng (b).<br />
43<br />
<br />
Thêm vào BST
Báo xấu
Download
Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ
