Khảo sát một số phương pháp giảm kích thước tiểu phân liposome amphotericin B

T¹P CHÝ Y - D¦îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îc-2016<br /> <br /> KHẢO SÁT MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP GIẢM KÍCH THƯỚC<br /> TIỂU PHÂN LIPOSOME AMPHOTERICIN B<br /> Nguyễn Tuấn Quang*; Nguyễn Văn Lâm**<br /> Nguyễn Thái Sơn***; Phạm Thị Minh Huệ**<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: khảo sát một số phương pháp làm giảm kích thước tiểu phân (KTTP) liposome<br /> amphotericin B (AmB). Phương pháp: liposome AmB được bào chế theo phương pháp hydrat<br /> hóa film và giảm KTTP bằng các phương pháp đùn tay qua màng, siêu âm và đồng nhất hóa áp<br /> suất cao kết hợp đùn qua màng. Kết quả: liposome AmB giảm KTTP bằng phương pháp đùn<br /> tay với thiết bị mini extruder có độ đồng nhất cao (PDI < 0,2) nhưng KTTP vẫn > 200 nm;<br /> phương pháp dùng que siêu âm sau 4 phút có KTTP < 200 nm và phân bố KTTP đồng nhất<br /> (PDI < 0,2); phương pháp dùng bể siêu âm đều cho liposome AmB có KTTP lớn (> 500 nm) và<br /> phân bố KTTP không đồng nhất (PDI > 0,5); phương pháp đồng nhất hóa áp suất cao kết hợp<br /> đùn qua màng với điều kiện áp suất đồng nhất hóa là 5000 psi, số chu kỳ đồng nhất hóa là 2,<br /> màng polycarbonat 400 nm, số lần đùn là 2 cho liposome AmB có hình cầu, đa số có 1 lớp,<br /> KTTP < 200 nm và phân bố KTTP tương đối đồng nhất (PDI < 0,3). Kết luận: đã khảo sát được<br /> một số phương pháp làm giảm KTTP liposome AmB. Trong đó, phương pháp đồng nhất hóa áp<br /> suất cao kết hợp đùn qua màng cho kết quả tốt nhất. Đây là cơ sở để nghiên cứu giai đoạn tiếp<br /> theo bào chế thuốc tiêm liposome AmB.<br /> * Từ khoá: Liposome; Amphotericin B; Kích thước tiểu phân; Giảm kích thước.<br /> <br /> Evaluating Methods of Particle Size Reduction of Liposome<br /> Amphotericin B<br /> Summary<br /> Objectives: To evaluate several methods for particle size reduction of liposome AmB.<br /> Materials and methods: Liposome AmB was prepared by using film hydration and its particle<br /> size was reduced by manual trans-membrane extrusion method, ultrasonification and combination of<br /> high pressure homogenization method with manual trans-membrane extrusion method. Results:<br /> Liposome AmB particle size reduction using manual trans-membrane extrusion method with<br /> miniextruder device resulted in high uniformity (PDI < 0.2) but the particle size was still greater<br /> than 200 nm; using ultrasonification probe method in 4 minutes enabled particle size to be<br /> smaller with less than 200 nm and particle size distributed evenly (PDI < 0.2); using ultrasonic<br /> method made particle size larger (above 500 nm) and particle size distributed unevenly (PDI > 0.5);<br /> * Học viện Quân y<br /> ** Đại học Dược Hà Nội<br /> *** Bệnh viện Quân y 103<br /> Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Tuấn Quang (dsquang2000@yahoo.com)<br /> Ngày nhận bài: 20/07/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 18/08/2016<br /> Ngày bài báo được đăng: 14/09/2016<br /> <br /> 39<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îc-2016<br /> combination of high-pressure homogenization method with manual trans-membrane extrusion<br /> method, repeated twice at 5,000 psi, 400 nm sized polycarbonate membranes, resulted in<br /> spherical liposome Am B particle size of less than 200 nm, mostly 1 layer and particle size<br /> distributed relatively evenly (PDI < 0.3). Conclusion: Several methods of particle size reduction<br /> of liposome amphotericin have been evaluated and combination of high-pressure homogenization<br /> method with manual transmembrane extrusion method gave the best result. This is the basement<br /> for further studies in preparing liposome AmB injection.<br /> * Key words: Liposome; Amphotericin B; Particle size; Reduction.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Liposome là hệ mang thuốc có nhiều<br /> ưu điểm nổi bật về kiểm soát giải phóng<br /> và khả năng đưa thuốc tới cơ quan đích...<br /> [2]. Để bào chế liposome, có nhiều phương<br /> pháp khác nhau, trong đó phương pháp<br /> hydrat hóa film thường được sử dụng do<br /> có các ưu điểm như: kỹ thuật bào chế<br /> tương đối đơn giản, dễ thực hiện, áp dụng<br /> cho tất cả các loại phospholipid, hiệu suất<br /> liposome hóa với dược chất tan trong lipid<br /> khá cao... Tuy nhiên, một trong những<br /> hạn chế của phương pháp là liposome<br /> thu được thường có kích thước lớn,<br /> nhiều lớp và không đồng nhất (khoảng<br /> 50 - 1.000 nm) [2, 4]. Vì thế, nếu muốn<br /> đưa liposome vào dạng bào chế thuốc<br /> tiêm, cần tiếp tục xử lý để thu được<br /> liposome có kích thước nhỏ và đồng nhất<br /> hơn, nhằm giúp quá trình lọc vô khuẩn<br /> thuận lợi, tăng cường đưa thuốc tới đích,<br /> Liposome AmB đã được nghiên cứu<br /> bào chế theo phương pháp hydrat hóa<br /> film [1]. Nghiên cứu này nhằm: Trình bày<br /> kết quả khảo sát một số phương pháp làm<br /> giảm KTTP và đồng nhất hóa liposome<br /> AmB. Đây là giai đoạn có vai trò quan trọng<br /> và có ý nghĩa quyết định đến quá trình<br /> nghiên cứu tiếp theo nhằm bào chế thuốc<br /> tiêm có chứa liposome AmB.<br /> 40<br /> <br /> NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Nguyên liệu và thiết bị.<br /> - Nguyên liệu: AmB, phosphatidylcholin<br /> đậu nành hydrogen hóa (HSPC), distearoyl<br /> phosphatidylglycerol (DSPG), cholesterol<br /> (Chol) và các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn<br /> USP, tiêu chuẩn nhà sản xuất hoặc tinh<br /> khiết hóa học.<br /> - Thiết bị: hệ thống cất quay Rovapor<br /> R-210 (Buchi, Đức), bình cầu NS 29/32,<br /> dung tích 2.000 ml (Buchi, Đức); thiết bị<br /> đùn mini extruder (Eastern Scientific, Mỹ);<br /> thiết bị đùn cao áp EmulsiFlex-C5 (Avestin,<br /> Canada); bể siêu âm Wiseclean 40 kHz<br /> (Hàn Quốc); máy siêu âm que UP200Ht<br /> (Hielscher, Đức); hệ thống thiết bị phân<br /> tích kích thước Zetasizer nano ZS90 (Anh);<br /> kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)<br /> JEOL 1010 (Nhật Bản) và các thiết bị,<br /> dụng cụ khác đạt tiêu chuẩn nghiên cứu.<br /> 2. Phương pháp nghiên cứu.<br /> * Phương pháp bào chế liposome AmB:<br /> Liposome AmB được bào chế theo<br /> phương pháp hydrat hóa film với các thành<br /> phần chính gồm AmB, HSPC, DSPG, Chol<br /> [1].<br /> <br /> T¹P CHÝ Y - D¦îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îc-2016<br /> * Phương pháp giảm KTTP và đồng nhất<br /> hóa liposome AmB:<br /> - Phương pháp đùn ép qua màng<br /> polycarbonat bằng thiết bị mini extruder<br /> [2, 3].<br /> - Phương pháp siêu âm: bằng bể siêu<br /> âm hoặc que siêu âm [2].<br /> - Phương pháp đồng nhất hóa áp suất<br /> cao kết hợp đùn qua màng [2].<br /> * Phương pháp đánh giá đặc tính của<br /> liposome AmB:<br /> - KTTP và độ đồng nhất: sử dụng<br /> phương pháp tán xạ ánh sáng động với<br /> thiết bị Zetasizer ZS90.<br /> - Hình thái cấu trúc tiểu phân: bằng<br /> phương pháp chụp hiển vi điện tử truyền<br /> qua (TEM) với kỹ thuật nhuộm soi âm bản.<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ<br /> BÀN LUẬN<br /> Tiến hành bào chế các mẫu liposome<br /> AmB theo phương pháp hydrat hóa film<br /> thu được kết quả có KTTP khoảng 738 1.026 nm, phân bố KTTP khoảng 0,451 0,868. Các mẫu liposome AmB này được<br /> dùng để khảo sát các biện pháp làm giảm<br /> KTTP và đồng nhất hóa.<br /> 1. Kết quả khảo sát phương pháp đùn<br /> qua màng bằng thiết bị mini extruder.<br /> Liposome AmB sau khi bào chế được<br /> đùn ép lần lượt qua màng polycarbonat<br /> kích thước 1.000 - 400 - 200 nm bằng thiết<br /> bị đùn tay mini extruder. Mỗi mẫu đùn<br /> 29 lần và giữ ở nhiệt độ 60oC trong suốt<br /> quá trình đùn bằng bể điều nhiệt.<br /> <br /> Bảng 1: KTTP và phân bố KTTP của các<br /> mẫu liposome AmB trước và sau khi đùn tay.<br /> Trước đùn<br /> <br /> Sau đùn<br /> <br /> KTTP (d.nm)<br /> <br /> PDI<br /> <br /> KTTP (d.nm)<br /> <br /> PDI<br /> <br /> 738,8<br /> <br /> 0,495<br /> <br /> 207,5<br /> <br /> 0,122<br /> <br /> 750,0<br /> <br /> 0,566<br /> <br /> 211,6<br /> <br /> 0,111<br /> <br /> 761,6<br /> <br /> 0,686<br /> <br /> 233,5<br /> <br /> 0,227<br /> <br /> Các mẫu liposome AmB sau đùn có<br /> chỉ số PDI thấp (từ 0,111 - 0,227) cho<br /> thấy phân bố KTTP đồng nhất. Tuy nhiên,<br /> KTTP vẫn còn lớn (> 200 nm), thể tích<br /> mỗi lần đùn tay chỉ được 1 ml nên khó áp<br /> dụng ở quy mô lớn.<br /> 2. Kết quả khảo sát phương pháp<br /> siêu âm.<br /> * Phương pháp sử dụng que siêu âm:<br /> Liposome AmB sau khi bào chế cho<br /> vào cốc có mỏ. Sau đó, siêu âm bằng<br /> máy siêu âm que UP200Ht. Sau thời gian<br /> 1, 2, 3… đến 10 phút, lấy mẫu đo KTTP<br /> và phân bố KTTP.<br /> Bảng 2: KTTP và phân bố KTTP của<br /> các mẫu liposome AmB sử dụng que siêu<br /> âm (n = 3).<br /> Thời gian<br /> siêu âm (phút)<br /> <br /> KTTP<br /> (d.nm)<br /> <br /> PDI<br /> <br /> Ban đầu<br /> <br /> 566,0 ± 11,5<br /> <br /> 0,607 ± 0,019<br /> <br /> 256,7 ± 5,3<br /> <br /> 0,453 ± 0,031<br /> <br /> 2<br /> <br /> 202,9 ± 4,3<br /> <br /> 0,411 ± 0,031<br /> <br /> 3<br /> <br /> 175,4 ± 4,5<br /> <br /> 0,303 ± 0,008<br /> <br /> 4<br /> <br /> 148,1 ± 0,1<br /> <br /> 0,255 ± 0,008<br /> <br /> 5<br /> <br /> 146,6 ± 1,3<br /> <br /> 0,212 ± 0,025<br /> <br /> 6<br /> <br /> 139,1 ± 0,1<br /> <br /> 0,220 ± 0,028<br /> <br /> 7<br /> <br /> 139,4 ± 0,1<br /> <br /> 0,227 ± 0,001<br /> <br /> 8<br /> <br /> 140,6 ± 0,4<br /> <br /> 0,248 ± 0,004<br /> <br /> 9<br /> <br /> 141,3 ± 4,7<br /> <br /> 0,253 ± 0,001<br /> <br /> 10<br /> <br /> 145,9 ± 1,0<br /> <br /> 0,272 ± 0,007<br /> <br /> 41<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îc-2016<br /> Với phương pháp sử dụng que siêu<br /> âm, sau 4 phút, các mẫu đã cho kết quả<br /> có KTTP < 200 nm, phân bố KTTP tương<br /> đối đồng nhất (PDI < 0,3). Hạn chế của<br /> phương pháp là thường đưa các tạp chất<br /> vào chế phẩm [2] và chỉ áp dụng ở quy<br /> mô nhỏ.<br /> * Phương pháp sử dụng bể siêu âm:<br /> Liposome AmB sau khi bào chế cho<br /> vào cốc có mỏ và tiến hành siêu âm<br /> trong bể Wiseclean (40 kHz) với quy trình<br /> siêu âm ngắt quãng: siêu âm 30 giây,<br /> nghỉ 30 giây (mẫu A1); siêu âm 1 phút,<br /> nghỉ 1 phút (mẫu A2); siêu âm 2 phút,<br /> nghỉ 2 phút (mẫu A3) (trong quá trình siêu<br /> âm sử dụng nước đá để tránh tăng nhiệt<br /> cục bộ hỗn dịch liposome). Sau 20 phút,<br /> lấy mẫu đo KTTP và phân bố KTTP.<br /> Bảng 3: KTTP và phân bố KTTP của các<br /> mẫu liposome AmB sử dụng bể siêu âm<br /> (n = 3).<br /> <br /> Liposome AmB sau khi bào chế được<br /> tiến hành đồng nhất hóa và đùn qua màng<br /> bằng máy Emulsiflex-C5 dưới áp lực của<br /> bình khí N2 lỏng, áp suất 5.000 psi (350 bar).<br /> Khảo sát số lần đùn khác nhau để tìm<br /> ra điều kiện phù hợp. Sau đó, kết hợp<br /> đùn qua màng 400 nm ở áp suất 500 psi<br /> (35 bar).<br /> * Ảnh hưởng của số chu kỳ đồng nhất<br /> hóa:<br /> Bảng 4: KTTP và phân bố KTTP của các<br /> mẫu liposome AmB theo số chu kỳ đống<br /> nhất hóa.<br /> Số chu kỳ<br /> <br /> KTTP (d.nm)<br /> <br /> PDI<br /> <br /> 0<br /> <br /> 882,6<br /> <br /> 0,508<br /> <br /> 1<br /> <br /> 174,0<br /> <br /> 0,408<br /> <br /> 2<br /> <br /> 149,2<br /> <br /> 0,364<br /> <br /> 3<br /> <br /> 141,9<br /> <br /> 0,376<br /> <br /> Mẫu<br /> <br /> KTTP (d.nm)<br /> <br /> PDI<br /> <br /> 4<br /> <br /> 135,1<br /> <br /> 0,382<br /> <br /> A1<br /> <br /> 522,13 ± 26,05<br /> <br /> 0,727 ± 0,075<br /> <br /> 5<br /> <br /> 130,5<br /> <br /> 0,371<br /> <br /> A2<br /> <br /> 507,97 ± 33,62<br /> <br /> 0,713 ± 0,104<br /> <br /> 6<br /> <br /> 121,1<br /> <br /> 0,376<br /> <br /> A3<br /> <br /> 662,30 ± 59,01<br /> <br /> 0,542 ± 0,051<br /> <br /> 7<br /> <br /> 112,5<br /> <br /> 0,306<br /> <br /> 8<br /> <br /> 110,0<br /> <br /> 0,294<br /> <br /> Sau 20 phút, các quy trình siêu âm<br /> đều cho liposome AmB có KTTP lớn<br /> (> 500 nm) và phân bố KTTP không đồng<br /> nhất (PDI > 0,5). Điều này cho thấy, hiệu<br /> quả của việc giảm KTTP liposome AmB<br /> bằng bể siêu âm cho kết quả thấp. Chỉ có<br /> thể ứng dụng để sơ bộ giảm KTTP<br /> liposome trước khi áp dụng các phương<br /> pháp khác.<br /> 42<br /> <br /> 3. Kết quả khảo sát phương pháp<br /> đồng nhất hóa áp suất cao kết hợp đùn<br /> qua màng.<br /> <br /> Sau chu kỳ thứ nhất, KTTP liposome<br /> AmB đã giảm xuống dưới 200 nm. Tuy nhiên,<br /> phân bố KTTP chưa đồng nhất (PDI > 0,4).<br /> Từ chu kỳ thứ 2 trở đi, KTTP liposome<br /> AmB có xu hướng giảm dần và PDI duy<br /> trì khoảng 0,3. Vì vậy, cần kết hợp mẫu<br /> đã giảm KTTP với đùn qua màng để tăng<br /> độ đồng nhất.<br /> <br /> T¹P CHÝ Y - D¦îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îc-2016<br /> * Kết quả khảo sát ảnh hưởng của số lần đùn qua màng:<br /> Các mẫu liposome AmB sau khi đồng nhất hóa, tiến hành đùn qua màng polycarbonat<br /> 400 nm ở áp suất 500 psi.<br /> Bảng 5: KTTP và phân bố KTTP các mẫu liposome AmB theo số lần đùn qua màng.<br /> Số lần<br /> <br /> KTTP (d.nm)<br /> <br /> PDI<br /> <br /> 0<br /> <br /> 149,2<br /> <br /> 0,364<br /> <br /> 1<br /> <br /> 134,3<br /> <br /> 0,337<br /> <br /> 2<br /> <br /> 134,9<br /> <br /> 0,281<br /> <br /> 3<br /> <br /> 131,8<br /> <br /> 0,274<br /> <br /> 4<br /> <br /> 131,6<br /> <br /> 0,275<br /> <br /> Sau khi đùn qua màng 400 nm, ở chu kỳ thứ 2, PDI giảm xuống < 0,3, mẫu đã đồng<br /> nhất hơn. Sự khác biệt về KTTP và phân bố KTTP của mẫu giữa chu kỳ thứ 2 và các<br /> chu kỳ tiếp theo không rõ rệt.<br /> Hình ảnh chụp TEM các mẫu sau khi đồng nhất áp suất cao và đùn qua màng cho<br /> thấy các tiểu phân vẫn có cấu trúc hình cầu, đa số có một lớp, KTTP nhỏ và đồng nhất<br /> (hình 1).<br /> <br /> (a) Ban đầu<br /> <br /> (b) Sau giảm KTTP<br /> <br /> Hình 1: Hình ảnh chụp TEM mẫu ban đầu (a) và sau khi làm giảm KTTP bằng<br /> phương pháp đồng nhất hóa áp suất cao kết hợp với đùn qua màng (b).<br /> 43<br /> <br />