Khóa luận tốt nghiệp đại học: Khảo sát thành phần hóa học của vỏ thân cây me rừng Phyllanthus emblica Linn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA HỌC 

  

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA VỎ THÂN CÂY ME RỪNG

Phyllanthus emblica Linn.

PHẠM BẢO QUÝ

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2018.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA HỌC 

  

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA VỎ THÂN CÂY ME RỪNG

Phyllanthus emblica Linn.

Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Thị Ánh Tuyết

Sinh viên thực hiện Mã số sinh viên

: Phạm Bảo Quý : K40.106.088

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2018.

NHẬN XÉT CỦA HỘI ĐỒNG

................................................................................................................................

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày…tháng…năm 2018.

Chủ tịch hội đồng

LỜI CẢM ƠN

Quá trình thực nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Hợp chất

thiên nhiên, khoa Hóa học, trường Đại học Sư phạm thành phố Hồ Chí Minh.

Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Ánh Tuyết – người giảng viên luôn nhiệt tình trong việc truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm, luôn theo sát quá trình làm việc của em để kịp thời hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em được hoàn thành tốt đề tài này. Bên cạnh những bài học thực nghiệm quý báu mà em được học tập từ cô, em còn được cô truyền cho tinh thần nghiên cứu khoa học giúp em có được động lực trong việc nghiên cứu và học tập. Cảm ơn thầy Phạm Đức Dũng đã giúp đỡ và cho em những ý kiến bổ ích để em hoàn thành đề tài của mình.

Em cũng xin dành một lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình đã là điểm tựa vững chắc cho em trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện khóa luận của mình. Thành công của em trong ngày hôm nay không thể có được nếu không có sự yêu thương và chăm sóc của ba mẹ.

Em xin hết lòng cảm ơn quý thầy cô khoa Hóa học – trường Đại học Sư phạm thành phố Hồ Chí Minh, thầy cô đã tận tâm trong công tác giảng dạy, truyền thụ cho em nhiều kiến thức khoa học hữu ích trong suốt thời gian em học tập tại trường.

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Huỳnh Thị Thùy Linh – học viên cao học, cùng các bạn Nguyễn Thị Thanh Trúc, Nguyễn Hữu Toàn, Trần Thị Tú Quyên, Dư Vỉnh An đã luôn giúp đỡ, động viên em trong quá trình thực hiện đề tài này. Xin gửi những lời chúc tốt đẹp nhất đến các bạn và mong các bạn mãi thành công trên con đường tương lai sau này. Mong rằng sẽ có thật nhiều cơ hội hợp tác với các bạn sau này.

Xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người!

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 14 tháng 04 năm 2018

MỤC LỤC

Lời cảm ơn Danh mục các kí hiệu và chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các sơ đồ Danh mục các hình Danh mục các phụ lục LỜI MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 1

1.1. Đặc điểm thực vật cây Me rừng .................................................................. 1

1.2.

Các nghiên cứu về dược tính của cây Me rừng ........................................... 2

1.3.

Các nghiên cứu về thành phần hóa học ....................................................... 4

CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM .............................................................................. 13

2.1. Hóa chất, thiết bị, phương pháp ................................................................ 13

2.2. Nguyên liệu ............................................................................................... 14

2.3. Điều chế các loại cao ................................................................................. 14

2.4.

Cô lập các hợp chất hữu cơ có trong cao ethyl acetate........................ 15

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 20

3.1. Khảo sát cấu trúc hợp chất PEE04 ............................................................ 20

3.2. Khảo sát cấu trúc hợp chất PA1 ................................................................ 23

3.3. Khảo sát cấu trúc hợp chất PA2 ................................................................ 26

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT.............................................................. 30

4.1. Kết luận ..................................................................................................... 30

4.2. Đề xuất ...................................................................................................... 31

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 32

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

1H-NMR

Proton (1) Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của proton (1))

13C-NMR Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của carbon (13))

HSQC

HMBC

brs s d dd m 𝛿 J ppm RP-18 Rf EA C Me H SKC SKLM G Mg Hz Heteronuclear Single Quantum Correlation (Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết) Heteronuclear Multiple Bond Coherence (Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết) Broad singlet (mũi đơn rộng) Singlet (Mũi đơn) Doublet (Mũi đôi) Double of doublet (Mũi đôi - đôi) Multiplet (Mũi đa) Chemical shift (Độ chuyển dịch hoá học) Coupling constant (Hằng số ghép spin) Part per million (Một phần một triệu) Reversed Phase-18 (Pha đảo C-18) Retention factor (Hệ số lưu giữ) Ethyl Acetate Chloroform Methanol n-Hexane Sắc ký cột Sắc ký lớp mỏng Gam Miligam Hertz

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Một số hợp chất đã được cô lập từ cây Phyllanthus emblica Linn. 4

Bảng 2.1. Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate ..................................... 15

Bảng 2.2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4 ........................................ 16

Bảng 2.3. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4.6 ..................................... 17

Bảng 2.4. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4.3 ..................................... 18

Bảng 2.5. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4.7 ..................................... 19

Bảng 3.1. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất PEE04 và periplogenin ............... 22

Bảng 3.2. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất PA1và 16-dehydropregenolone .. 25

Bảng 3.3. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất PA2 và phyllanthol ...................... 28

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1. Quy trình điều chế các loại cao từ vỏ thân cây Me rừng .............. 15

Sơ đồ 2.2. Quy trình cô lập một số hợp chất từ cao ethyl acetate.................. 19

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cây Me rừng ........................................................................................ 1

Hình 1.2. Vỏ thân cây Me rừng .......................................................................... 1

Hình 1.3. Cấu trúc một số hợp chất đã được cô lập từ cây Phyllanthus emblica

Linn. .................................................................................................................... 12

Hình 3.1. Cấu trúc và một số tương quan HMBC của hợp chất PEE04 ............. 23

Hình 3.2. Cấu trúc và một số tương quan HMBC của hợp chất PA1 ................. 25

Hình 3.3. Cấu trúc và một số tương quan HMBC của hợp chất PA2 ................. 29

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Phổ 1H-NMR của hợp chất PEE04

Phụ lục 2. Phổ 13C-NMR của hợp chất PEE04

Phụ lục 2a. Phổ 13C-NMR dãn rộng của hợp chất PEE04

Phụ lục 3. Phổ DEPT của hợp chất PEE04

Phụ lục 4. Phổ HSQC của hợp chất PEE04

Phụ lục 5. Phổ HMBC của hợp chất PEE04

Phụ lục 6. Phổ 1H-NMR của hợp chất PA1

Phụ lục 7. Phổ 13C-NMR của hợp chất PA1

Phụ lục 8. Phổ DEPT (CDCl3) của hợp chất PA1

Phụ lục 9. Phổ COSY (CDCl3) của hợp chất PA1

Phụ lục 10. Phổ HSQC (CDCl3) dãn rộng của hợp chất PA1

Phụ lục 11. Phổ HMBC (CDCl3) dãn rộng của hợp chất PA1

Phụ lục 12. Phổ 1H-NMR (CDCl3) của hợp chất PA2

Phụ lục 12a. Phổ 1H-NMR dãn rộng (CDCl3) của hợp chất PA2

Phụ lục 13. Phổ 13C-NMR (CDCl3) của hợp chất PA2

Phụ lục 14. Phổ HMBC (CDCl3) của hợp chất PA2

Phụ lục 15. Phổ HMBC (CDCl3) dãn rộng của hợp chất PA2

LỜI MỞ ĐẦU

Chi Phyllanthus là một chi lớn, bao gồm khoảng 500 đến 700 loài, được

chia thành 10 đến 11 chi nhỏ, bao gồm các chi Isocladus, Kirganelia, Cicca,

Emblica, Conani, Gomphidium, Phyllanthodendron, Xylophylla, Botryanthus,

Ericocus và Phyllanthus [6]. Bên cạnh các loài như Phyllanthus amarus Schum

et Thonn. (cây Diệp hạ châu đắng), Phyllanthus urinaria L. (cây Diệp hạ châu

ngọt), Phyllanthus reticulatus Poir. (cây Phèn đen) được dùng nhiều trong các

bài thuốc chữa bệnh gan, sỏi thận,…[2], thì trong những năm gần đây, cây Me

rừng (Phyllanthus emblica Linn.) cũng đang rất được quan tâm bởi vì những

ứng dụng của nó trong y học cổ truyền và y học hiện đại.

Cây Me rừng (Phyllanthus emblica Linn.) là cây thuộc chi Phyllanthus.

Cây này được dùng phổ biến trong y học cổ truyền của Việt Nam và nhiều nước

trên thế giới. Ở nước ta, cây mọc phổ biến trên các đồi trọc, trong các rừng thưa.

Quả có thể dùng chữa cảm mạo, phát sốt, ho, đau cổ họng, miệng khô khát, rễ

được dùng để trị viêm ruột, đau bụng đi ngoài, cao huyết áp, lá nấu nước rửa bên

ngoài có thể trị lở loét, mẫn ngứa, còn thân vỏ có tác dụng hạ huyết áp [2]. Bên

cạnh việc được sử dụng trong các bài thuốc y học cổ truyền, các hợp chất cô lập

được từ cây Me rừng đã được chứng minh có tác dụng hạ men gan, chống oxi

hóa, kháng khuẩn [1].

Mặc dù trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học về cây

Me rừng, nhưng ở Việt Nam, các nghiên cứu về thành phần hóa học của cây này

còn hạn chế, đặc biệt là chưa có nghiên cứu về thành phần hóa học trên vỏ thân.

Chính vì vậy mà chúng tôi chọn vỏ thân cây Me rừng để nghiên cứu với mong

muốn làm rõ thêm thành phần hóa học, từ đó hiểu thêm về tác dụng chữa bệnh

của cây và đóng góp những chứng cứ khoa học có giá trị vào kho dược liệu của

Y học Việt Nam.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Đặc điểm thực vật cây Me rừng

Tên thông thường tại Việt Nam là cây Me rừng. Ngoài ra, cây Me rừng có

tên gọi khác tùy thuộc từng vùng miền là mận rừng, me quả tròn, chùm ruột núi,

chùm ruột rừng, mác kham (Tày), diều cam (Dao), xì xà Liên (K’Ho) [2].

Tên khoa học: Phyllanthus emblica Linn.

Thuộc họ: Thầu dầu (Euphorbiaceae).

Hình 1.1. Cây Me rừng Hình 1.2. Vỏ thân cây Me rừng

Cây Me rừng phân bố rộng khắp vùng nhiệt đới châu Á, có thể tìm thấy

loài thực vật này ở Việt Nam, Ấn Độ, Thái Lan,… Riêng tại Việt Nam, cây Me

rừng phân bố nhiều ở các tỉnh trung du và miền núi phía Bắc như Cao Bằng,

Lạng Sơn, Vĩnh Phúc, … [1].

Cây Me rừng thường là loại cây gỗ nhỏ, ưa sáng, ưa nóng, chịu khô hạn rất

tốt, thân cây cao 2 – 7 mét, phân nhiều cành, cành nhỏ mềm, có lông, dài 20cm.

Lá xếp thành hai dãy trên các cành nhỏ trông giống như một lá kép lông chim,

cuống lá rất ngắn. Lá kèm rất nhỏ hình ba cạnh. Hoa nhỏ, đơn tính cùng gốc.

Cụm hoa thành xim co mọc ở nách lá phía dưới của cành, với rất nhiều hoa đực

và vài hoa cái. Quả hình cầu trước mọng, sau khô thành quả nang. Hạt hình ba

cạnh, màu hồng nhạt. Cây ra hoa từ tháng 3 đến tháng 11 hàng năm.

1.2. Các nghiên cứu về dược tính của cây Me rừng

1.2.1. Dược tính theo y học cổ truyền

Dựa vào những nghiên cứu trước đây về dược tính theo y học cổ truyền,

hầu hết tất cả các bộ phận của loài thực vật này đều có những công dụng chữa

bệnh. Ở Ấn Độ, quả Me rừng là một thành phần trong nhiều bài thuốc cổ truyền

dùng để chữa sỏi niệu, các bệnh về gan, có tác dụng bảo vệ chống độc hại gan.

Còn ở Việt Nam, quả Me rừng khô thường được dùng để trị tiêu chảy đau bụng.

Hơn hết, quả Me rừng còn được dùng như một nguồn vitamin C dồi dào với tên

“Myrobalan emblic”, chữa bệnh cảm mạo, phát sốt, ho, đau cổ họng, miệng khô

khát (dùng 10 – 30 quả sắc uống mỗi ngày), còn trị được bệnh đái tháo đường,

trị ho, lợi tiểu, nhuận tràng. Còn rễ có vị đắng, chát, tính mát được dùng để trị

viêm ruột, đau bụng đi ngoài, cao huyết áp (dùng 15 – 20g sắc uống mỗi ngày).

Bên cạnh đó, lá nấu nước rửa bên ngoài để trị lở loét, mẩn ngứa. Vỏ thân cây và

rễ có vị đắng, chát, tính mát, sắc lấy nước uống làm lợi tiểu, chữa phù thũng và

tăng huyết áp [1–2].

1.2.2. Dược tính theo y học hiện đại

Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về dược tính theo y học

hiện đại về cây Me rừng, trong đó phải kể đến một số nghiên cứu tác dụng dược

lý của các hợp chất quan trọng trong cây Me rừng như acid gallic, acid ellagic,

phyllaemblicin B, phyllaemblicin C, putranjivain A, emblicamin A và B…

 Tác dụng kháng khuẩn và chống oxi hóa

Năm 2007, từ dịch chiết của quả Me rừng, Xiaoli Liu cùng các cộng sự của

mình đã nghiên cứu thành công được về khả năng kháng khuẩn và chống oxi

hóa từ dịch chiết đó. Dịch chiết này thu được bằng phương pháp chiết với chất

lỏng siêu tới hạn và cao chiết với methanol [22].

Kết quả của cuộc nghiên cứu cho thấy cao chiết bằng phương pháp chiết

với chất lỏng siêu tới hạn có khả năng kháng khuẩn ở các loại vi khuẩn gram âm

(E. coli, P. aeruginosa, S. typhi), gram dương (S. aureus, B. cereus và B.

subtilis) và kể cả nấm (C. abican, C. tropicalis và A. niger) gây hại trên thực

phẩm. Điều này được xem như góp phần vào việc sử dụng một sản phẩm thay

thế để kiểm soát vi khuẩn và bảo quản thực phẩm từ tự nhiên.

Ngoài ra, vào năm 2016, cũng từ dịch chiết ethanol của quả Me rừng,

Sirinya Pientaweeratch và các cộng sự đã cho thấy nó khả năng chống oxi hóa

với nồng độ ức chế 50% (IC50) được xác định bằng phương pháp khử gốc tự do

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DDPH) là 1.70 0.07 mg/mL và phương pháp

khử gốc tự do 3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid (ABTS) là 4.45 0.10

mg/mL [13].

 Tác dụng bảo vệ gan

Năm 2008, từ dịch chiết trong vỏ thân cây Me rừng, S.K. El-Desouky và

các cộng sự đã công bố trong dịch này có chứa các phenolic, flavonoid và tanin.

Với một số thử nghiệm trên chuột, kết quả thu được cho thấy dịch chiết này có

tác dụng chống rối loạn chức năng gan dưới tác dụng của ethanol [15].

Sau đó, năm 2010, một loạt các nghiên cứu của Sharma Bhawna và cộng sự

đã công bố dịch chiết ethanol của cây Me rừng có tác dụng hạ men gan, phục

hồi chức năng gan với liều lượng 75 mg/kg/ngày khi thử nghiệm trên chuột [12].

 Tác dụng kháng virus

Vào năm 2011, Yang Fei Xiang và các cộng sự đã cô lập được hợp chất

1,2,4,6‐tetra‐O‐galloyl‐β‐D‐glucose (75), sau đó họ tiến hành một loạt các thử

nghiệm với tác dụng chống virus HSV (Herpes Simplex virus) loại 1 và 2 (HSV-

1 và HSV-2). Kết quả cho thấy rằng hoạt chất này ngăn chặn được sự lây nhiễm

virus trong tế bào ở giai đoạn đầu [26].

Năm 2017, He Yan và các cộng sự từ dịch chiết rễ Me rừng đã tìm ra được

hai hợp chất chalconoid là emblirol A (21) và emblirol B (22) có tác dụng kháng

virus khảm thuốc lá (TMV) gây bệnh khảm thuốc lá, với khả năng ức chế lần

lượt ở 79,6% và 82,1% (nồng độ thử nghiệm 1mg/mL) [5].

 Tác dụng gây độc tế bào ung thư

Năm 2012, Xiaoli Liu cùng các cộng sự đã cô lập từ cao etyl acetat của quả

Me rừng và thử nghiệm hoạt tính sinh học một số hợp chất một số hợp chất

tannin (41–52), flavonoid (70–73). Kết quả cho thấy các hoạt chất này có tác

dụng gây độc tế bào ung thư vú. Đặc biệt, hợp chất isocorilagin (41) có tác dụng

gây độc HELF (Human embryonic lung fibroblast cell) với nồng độ ức chế 50%

(IC50) là 51,4 μg/mL [23].

Vào năm 2013, Xinxian Zhu cùng cộng sự đã công bố nghiên cứu cho thấy

trên cao chiết xuất giàu polyphenol từ cây Me rừng có tác dụng ức chế sự phát

triển của tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa) ở nồng độ tối ưu là 150 mg/mL [24].

1.3. Các nghiên cứu về thành phần hóa học

Theo một số nghiên cứu đã được công bố, phần lớn trên các bộ phận như

lá, quả, cành và rễ của cây Me rừng chứa các nhóm hợp chất alkaloid,

benzenoid, coumarin, phenolic, tanin, terpenoid, steroid, flavonoid,… [4], [6],

[16–21], [25–28].

Bảng 1.1. Một số hợp chất đã được cô lập từ cây Phyllanthus emblica Linn.

Hợp chất Nhóm hợp chất Bộ phận cây

Quả Alkaloid

Tài liệu tham khảo [6] [6] [6] [6]

[6]

Quả Benzenoid

[6] [4], [6] [4], [6] [4] [26] [26]

[26]

[26] Zeatin (1) Zeatin nucleotide (2) Zeatin riboside (3) Chebulic acid (4) 3,6-Di-O-galloyl-β-O-D-glucopyranose (5) Gluco-gallin (6) Gallic acid (7) Ethyl gallate (8) Cinnamic acid (9) 2-O-Galloyl L-malic acid (10) 2-O-Galloyl mucic acid (11) 2-O-Galloyl 1,4-lactone mucic acid (12) 5-O-Galloyl 1,4-lactone mucic acid (13)

[26]

[26] 3-O-Galloyl 1,4-lactone mucic acid (14) 3,5-Di-O-galloyl1,4-lactone mucic acid (15) 2-O-Galloylmethyl ester mucic acid (16) 2-O-Galloyl-1,4-lactone mucic acid methyl ester (17) 5-O-Galloyl-1,4-lactone mucic acid methyl ester (18) 3-O-Galloyl-1,4-lactone mucic acid methyl ester (19) 3,5-Di-O-galloyl-1,4-lactone mucic acid methyl ester (20)

Emblirol A (21) [5] Rễ Emblirol B (22) [5]

Quả Coumarin Ellagic acid (23)

Quả Diterpenoid

Rễ

Sesqui- terpenoid

Rễ Norsesqui- terpenoid [4], [6] [6] [6] [6] [6] [6] [27] [28] [28] [28] [28] [29] [29] [29]

[28]

Rễ Phenolic Glycoside [28]

Giberellin A-1 (24) Giberellin A-3 (25) Giberellin A-4 (26) Giberellin A-7 (27) Giberellin A-9 (28) Phyllaemblic acid (29) Phyllaemblic acid methyl ester (30) Phyllaemblic acid B (31) Phyllaemblic acid C (32) Phyllaemblicin D (33) Phyllaemblicin A (34) Phyllaemblicin B (35) Phyllaemblicin C (36) 2-Carboxylmethylphenol-1-O-β-D- glucopyranoside (37) 2,6-Dimethoxy-4-(2- hydroxyethyl)phenol1-O-β-D- glucopyranoside (38) Chebulanic acid (39) Quả [19] Tannin

Lá, cành

Quả [6] [21], [22] [19] [19] [20] [29] [29] [22] [29] [29] [29] [4] [22]

Quả [4] Lipid và acid

[8]

Lá, quả [8]

Steroid

Lá, cành

[18] [18] [18] [18] [18] [18] [18] [18] [18] [18] [18]

[18]

Quả Flavonoid Corilagin (40) Isocorilagin (41) Chebulanin (42) Chebulagic acid (43) Mallotusinin (44) Phyllaembinin A (45) Phyllaembinin B (46) Phyllaembinin C (47) Phyllaembinin D (48) Phyllaembinin E (49) Phyllaembinin F (50) Phyllanthunin (51) Geraniin (52) Stearic acid (53) Lauric acid (54) β-Sitosterol 3-O-β-D-glucoside (55) Stigmasta-5,22-diene-3-O-β-D- glucopyranoside (56) 5α,6β-Dihydroxysitosterol (57) 5α,6β,7α-Trihydroxysitosterol (58) 7α-Acetoxysitosterol (59) β-Sitosterol (60) 7α-Hydroxy-β-sitosterol (61) 7β-Ethoxy-β-sitosterol (62) 7-Ketositosterol (63) Stigmast-4-ene-3-one (64) Stigmast-4-ene-3,6-dione (65) Stigmast-4-ene-6β-ol-3-one (66) Stigmast-4-ene-3β,6α-diol (67) 3-O-β-D-(6'-O- Hexanedecanoylglucopyranosyl)stigma st-5-ene-3β-ol (68) 3-O-β-D-(6'-O- Hexanedecanoylglucopyranosyl)stigma st-5-ene-3β,7β-diol (69) Kaempferol (70) Quercetin (71) [21], [22] [6], [22]

[21]

[21], [22]

Quercetin 3-O-β-D-glucopyranoside (72) Kaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside (73) Leucodelphinidin (74) Rutin (75) [6] [6]

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

(9)

(10)

(7) R = H, (8) R = C2H5

(16) R1=R2=CH3, (18) R1=CH3, R2=H (12) R1=Galloyl, R2=R3=R4=H

(17) R1=H, R2=CH3, (11) R1=R2=H (19) R1=Galloyl, R2=R3=H, R4=CH3

(14) R1=R3=R4=H, R2=Galloyl

(15) R1=R4=H, R2=R3=Gallo

(13) R1=H, (20) R1=Me (21) R=Me, (22) R=H (23)

(24) R1=R2=OH (25) R=OH (29) R=H

(26) R1=H, R2=OH (27) R=H (30) R=Me

(28) R1=R2=H

(34)

(31) R1=OH, R2=H

(32) R1=R2=H

(33) R1=H, R2=Glu

(35)

(36)

(37)

(38)

(39

(40)

(41)

(42)

(43)

(44)

(45)

(46)

(48) R1=Galloyl, R2=neoche, R3=R4=H

(49) R1=Galloyl, R3=neoche, R2=R4=H

(50) R1=Galloyl, R4=neoche, R2=R3=H

(47)

(53) R=n-C17H35

(54) R=n-C11H23

(51)

(55)

(56)

(57) R=H

(59) R1=H, R2=OCOCH3, (60) R1=H, R2=H (58) R=OH (61) R1=H, R2=OH, (62) R1=OC2H5, R2=H

(63)

(64) R1=R2=H

(66) R1=H, R2=OH

(65)

(67)

(70) R=H

(68) R1=H, R2=OOC(CH2)14CH3

(69) R1=OH, R2=OOC(CH2)14CH3

(71) R=OH

(72)

(73)

(74) (75)

Chú thích:

Galloyl

Neoche

Glu =Glucopyranosyl

Hình 1.3. Cấu trúc của một số hợp chất trong cây Phyllanthus emblica Linn.

CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM

2.1. Hóa chất, thiết bị, phương pháp

2.1.1. Hoá chất

- Silica gel: silica gel 40–63μm, Merck và silica gel 230–400μm, Himedia

dùng cho sắc kí cột.

- Silica gel pha đảo, RP–18, Merck dùng cho sắc kí cột.

- Sắc kí lớp mỏng loại DC – Alufolein 20×20, Kiesel gel 60 F254, Merck.

- Sắc kí lớp mỏng loại 25DC, RP–18, Merck.

- Dung môi dùng cho quá trình thí nghiệm gồm: n–hexane, chloroform,

ethyl acetate, acetone, methanol, acetic acid và nước cất.

- Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên lớp mỏng dung dịch

H2SO4 20%, nung nóng bảng.

2.1.2. Thiết bị

- Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu.

- Các cột sắc kí.

- Máy cô quay chân không.

- Bếp cách thuỷ.

- Đèn soi UV: bước sóng 254 nm và 365 nm.

- Cân điện tử.

2.1.3. Phương pháp tiến hành

 Phương pháp phân lập các hợp chất

Cô lập các hợp chất hữu cơ bằng phương pháp sắc kí, bao gồm kỹ thuật sắc

kí cột silica gel pha thường, pha đảo RP–18 và sắc kí lớp mỏng.

Phát hiện vết chất hữu cơ có trên sắc kí lớp mỏng bằng đèn tử ngoại ở hai

bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 20%,

nung nóng bảng mỏng.

 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz),

2D-NMR trên máy Bruker Avance được ghi tại phòng thí nghiệm Phân tích

trung tâm, Đại học Khoa học Tự nhiên, số 227 Nguyễn Văn Cừ, quận 5, thành

phố Hồ Chí Minh và tại Trung tâm các phương pháp phổ ứng dụng, Phòng 133,

nhà A18, Viện Hóa học, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội.

2.2. Nguyên liệu

2.2.1. Thu hái nguyên liệu

Mẫu cây dùng trong nghiên cứu khoá luận là vỏ thân cây Me rừng

(Phyllanthus emblica Linn.) được thu hái tại xã Tân Tiến, thị xã La Gi, tỉnh Bình

Thuận vào tháng 5 năm 2014.

Mẫu cây đã được TS. Phạm Văn Ngọt (khoa Sinh học – trường Đại học Sư

phạm thành phố Hồ Chí Minh) nhận danh tên khoa học là “Phyllanthus emblica

Linn.”, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae).

2.2.2. Xử lý mẫu nguyên liệu

Mẫu nguyên liệu được rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh, phơi khô trong

bóng râm, rồi xay thành bột mịn. Sau đó tiến hành ngâm chiết và phân lập các

hợp chất.

2.3. Điều chế các loại cao

Vỏ thân cây Me rừng (Phyllanthus emblica Linn.) được phơi khô và nghiền

thành bột mịn, sấy khô đến khối lượng không đổi (16.2kg). Nguyên liệu bột mịn

được tận trích với ethanol 960 bằng phương pháp ngâm dầm, lọc và cô quay loại

dung môi dưới áp suất thấp thu được cao ethanol thô (350.5g).

Cao ethanol thô được chiết lỏng–lỏng lần lượt với n–hexane, ethyl acetate

thu được cao hexane (11.5g), cao ethyl acetate (85.4g) và cao còn lại (224.8g).

Quá trình thực hiện được tóm tắt theo sơ đồ 2.1.

Bột vỏ thân cây khô (16.2kg)

- Ngâm dầm với ethanol - Lọc, cô quay, thu hồi dung môi

Cao ethanol thô (350.5g)

- Chiết lỏng – lỏng với dung môi n–hexane - Lọc, cô quay, thu hồi dung môi

Dịch chiết còn lại

Cao n-hexane (11.5g)

- Chiết lỏng – lỏng với dung môi ethyl acetate - Lọc, cô quay, thu hồi dung môi

Cao ethyl acetate (85.4g)

Dịch chiết còn lại

Sơ đồ 2.1. Quy trình điều chế các loại cao từ vỏ thân cây Me rừng

2.4. Cô lập các hợp chất hữu cơ có trong cao ethyl acetate

2.4.1. Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate

Cao ethyl acetate (85.4g) được SKC silica gel, giải ly với hệ dung môi

H:EA có độ phân cực tăng dần từ 70% đến 100% EA, sau đó tiếp tục giải ly với

hệ dung môi EA:Me có độ phân cực tăng dần từ 5% đến 100% Me. Dịch giải ly

qua cột được hứng vào các lọ, theo dõi quá trình giải ly bằng SKLM. Những lọ

cho kết quả SKLM giống nhau được gom chung thành một phân đoạn. Kết quả

thu được 9 phân đoạn (EA1 – 9) được trình bày ở bảng 2.1.

Bảng 2.1. Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate

STT Ghi chú Khối lượng (g) Sắc kí lớp mỏng

Phân đoạn EA1 Dung môi giải ly H:EA (95:5) 4.1 Nhiều vết tách xa Đã khảo sát 1

EA2 H:EA (9:1) 5.4 Đã khảo sát 2

Chưa khảo sát EA3 H:EA (85:15) 12.6 3

Nhiều vết, kéo dài Nhiều vết, kéo vệt Nhiều vết Đã Khảo sát EA4 EA:Me (99:1) 4.6 4

EA5 EA:Me (95:5) 6.2 Nhiều vết tách xa Đã khảo sát 5

EA6 EA:Me (9:1) 11.2 Chưa khảo sát 6

EA7 EA:Me (8:2) 6.7 Chưa khảo sát 7

EA8 EA:Me (7:3) 10.5 Chưa khảo sát 8

EA9 Me (100%) 9.8 Chưa khảo sát 9 Nhiều vết, kéo dài Nhiều vết, kéo dài Nhiều vết, kéo dài Nhiều vết, kéo dài

2.4.2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4 của bảng 2.1

Phân đoạn EA4 (4.6g) SKLM cho nhiều vết, hiện hình màu tím dưới đèn tử

ngoại nên được chọn SKC silica gel, giải ly với hệ dung môi H:Ac có độ phân

cực tăng dần từ 75% đến 100% EA, sau đó tiếp tục giải ly với hệ dung môi

EA:Me có độ phân cực tăng dần từ 5% đến 100% Me. Tiến hành các bước

tương tự như khi sắc kí cột phân đoạn trước. Kết quả thu được 8 phân đoạn

(EA4.1 – EA4.8) được ghi lại ở bảng 2.2.

Bảng 2.2. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4

STT Phân đoạn Dung môi giải ly Ghi chú Khối lượng (mg)

1 EA4.1 H:Ac (95:5) 437.8 Chưa khảo sát

2 EA4.2 H:Ac (9:1) 323.9 Chưa khảo sát

Sắc kí lớp mỏng Có vết trùng với vết glycoside của stigmasterol Có vết trùng với vết của lupeol

EA4.3 H:Ac (85:15) 554.7 Nhiều vết 3

Khảo sát thu được hợp chất PA1

EA4.4 H:Ac (8:2) 449.9 4

EA4.5 H:Ac (7:3) 375.9 Chưa khảo sát 5 Nhiều vết Chưa khảo sát Nhiều vết, kéo vệt

EA4.6 H:Ac (6:4) 536.6 3 vết 6 Khảo sát thu được hợp

EA4.7 EA:Me (95:5) 421.3 Nhiều vết 7

chất PEE04 Khảo sát thu được hợp chất PA2

Chưa khảo sát EA4.8 EA:Me (9:1) 312.9 8 Nhiều vết, kéo vệt

2.4.3. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4.6 của bảng 2.2

Phân đoạn EA4.6 (536.6mg) bằng hệ dung môi C:Me có độ phân cực tăng

dần từ 5% đến 100% Me. Tiến hành các bước tương tự như khi sắc kí cột phân

đoạn trước. Kết quả thu được 6 phân đoạn (EA4.6.1 – EA4.6.6). Kết quả được

trình bày ở bảng 2.3.

Bảng 2.3. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4.6

STT Phân đoạn Sắc kí lớp mỏng Ghi chú Dung môi giải ly Khối lượng (mg)

EA4.6.1 C:Me (95:5) 68.6 Đã khảo sát 1

EA4.6.2 C:Me (95:5) 81.9 Đã khảo sát 2 Nhiều vết, kéo vệt Nhiều vết, kéo vệt

3 EA4.6.3 C:Me (9:1) 161.7 Nhiều vết, tách rõ Tinh chế thu được hợp chất PEE04

EA4.6.4 C:Me (9:1) 121.3 Đã khảo sát 4

EA4.6.5 C:Me (9:1) 52.0 Đã khảo sát 5

EA4.6.6 C:Me (8:2) 49.6 Đã khảo sát 6 Nhiều vết, kéo vệt Nhiều vết, kéo vệt Nhiều vết, kéo vệt

Phân đoạn EA4.6.3 (161.7mg) của bảng 2.3 khi SKLM cho vết màu xanh

và hai vết dơ kéo dài, nên tiếp tục SKC nhiều lần với hệ dung môi C:Ac thu

được hợp chất có dạng bột màu trắng, được kí hiệu là PEE04 (5.8mg).

2.4.4. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4.3 của bảng 2.2

Phân đoạn EA4.3 (554.7mg) bằng hệ dung môi H:Ac có độ phân cực tăng

dần từ 20% đến 100% Ac. Tiến hành các bước tương tự như khi SKC phân đoạn

trước. Kết quả thu được 5 phân đoạn (EA4.3.1 – EA4.3.5). Kết quả được trình

bày ở bảng 2.4.

Bảng 2.4. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4.3

STT Phân đoạn Sắc kí lớp mỏng Ghi chú Dung môi giải ly Khối lượng (mg)

1 EA4.3.1 H:Ac (9:1) 143.7 Đã khảo sát Nhiều vết, kéo vệt

2 EA4.3.2 H:Ac (9:1) 121.3 Nhiều vết, tách rõ Tinh chế thu được hợp chất PA1

3 EA4.3.3 H:Ac (8:2) 85.8 Đã khảo sát

4 EA4.3.4 H:Ac (8:2) 97.4 Đã khảo sát

5 EA4.3.5 H:Ac (7:3) 105.9 Đã khảo sát Nhiều vết, kéo vệt Nhiều vết, kéo vệt Nhiều vết, kéo vệt

Phân đoạn EA4.3.2 (121.3mg) của bảng 2.4 khi SKLM cho vết màu cam và

nhiều vết dơ nhưng các vết tách rõ ràng nên tiếp tục SKC nhiều lần với hệ dung

môi H:Ac:AcOH thu được hợp chất có dạng hình kim màu trắng, được kí hiệu là

PA1 (5.9mg).

2.4.5. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4.7 của bảng 2.2

Phân đoạn EA4.7 (421.3mg) bằng hệ dung môi C:Me có độ phân cực tăng

dần từ 10% đến 100% Me. Tiến hành các bước tương tự như khi sắc kí cột phân

đoạn trước. Kết quả thu được 6 phân đoạn (EA4.7.1 – EA4.7.6). Kết quả được

trình bày ở bảng 2.5.

Bảng 2.5. Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA4.7

STT Phân đoạn Sắc kí lớp mỏng Ghi chú Dung môi giải ly Khối lượng (mg)

EA4.7.1 C:Me (95:5) 68.1 Đã khảo sát 1

EA4.7.2 C:Me (95:5) 71.2 Đã khảo sát 2 Nhiều vết, kéo vệt Nhiều vết, kéo vệt

3 EA4.7.3 C:Me (9:1) 100.7 Nhiều vết, tách rõ Tinh chế thu được hợp chất PA2

4 EA4.7.4 C:Me (9:1) 69.8 Đã khảo sát

5 EA4.7.5 C:Me (9:1) 59.9 Đã khảo sát

6 EA4.7.6 C:Me (8:2) 51.1 Đã khảo sát Nhiều vết, kéo vệt Nhiều vết, kéo vệt Nhiều vết, kéo vệt

Phân đoạn EA4.7.3 (100.7mg) của bảng 2.5 khi SKLM cho vết màu nâu,

hiện hình UV và có bốn vết dơ không hiện hình dưới đèn tử ngoại nhưng tách

rõ, nên tiếp tục SKC nhiều lần với hệ dung môi C:Ac:AcOH thu được hợp chất

có dạng bột màu trắng, được kí hiệu là PA2 (10.9mg).

Dưới đây là sơ đồ trình bày quy trình cô lập một số hợp chất từ cao ethyl

acetate.

Sơ đồ 2.2. Quy trình cô lập một số hợp chất từ cao ethyl acetate

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Khảo sát cấu trúc hợp chất PEE04

Hợp chất PEE04 (5.8mg) thu được từ phân đoạn EA4.6.3 có những

đặc điểm như sau:

- Dạng hình kim, màu trắng.

- Sắc kí lớp mỏng cho một vết duy nhất khi hiện hình dưới đèn tử ngoại và

khi phun bằng H2SO4 20%, hơ nóng, bảng mỏng xuất hiện vết có màu xanh.

(dung môi giải ly chloroform : acetone (9:1), Rf = 0.4)

- Phổ 1H–NMR (CDCl3, phụ lục 1, bảng 3.1) δH (ppm): 5.88 (1H, s, H–22),

4.98 (1H, dd, J = 1.0, 8.0 Hz, H–21a) , 4.81 (1H, dd, J = 1.5, 8.5 Hz, H–21b),

4.18 (1H, brs, H–3), 2.78 (1H, m, H–17), 0.95 (3H, s, H–19), 0.88 (3H, s, H–

18).

- Phổ 13C kết hợp với DEPT–NMR (CDCl3, phụ lục 2, 2a và 3, bảng 3.1)

δC (ppm): 174.5, 174.4 (>C=O, >C=C, C–20/23), 117.8 (=CH–, C–22), 16.7 (–

CH3, C–19), 15.7 (–CH3, C–18) và độ chuyển dịch của các carbon khác được

trình bày trong bảng 3.1.

 BIỆN LUẬN CẤU TRÚC

- Phổ HSQC, HMBC (CDCl3, phụ lục 4, 5).

Phổ 1H-NMR của hợp chất PEE04 thể hiện tín hiệu cộng hưởng của

một proton olefin tại δH 5.88 (1H, s, H–22). Phổ đồ còn thể hiện hai tín hiệu

cộng hưởng của proton nhóm methylene gắn với oxygen tại δH 4.98 (1H, dd, J =

1.5, 8.5 Hz, H–21a) và 4.81 (1H, dd, J = 1.0, 8.0 Hz, H–21b), tín hiệu cộng

hưởng của hai nhóm methyl –CH3 tại δH 0.95 (3H, s, H–19), 0.88 (3H, s, H–18).

Ngoài ra, một số tín hiệu cộng hưởng của các proton methylene –CH2– và

methine >CH– cũng xuất hiện trên phổ ở vùng từ trường cao.

Phổ 13C-NMR kết hợp với DEPT và HSQC của hợp chất PEE04 xuất

hiện tín hiệu cộng hưởng của 23 carbon, gồm hai carbon methyl, mười carbon

methylene, năm carbon methine và sáu carbon bậc bốn. Trong đó, tín hiệu cộng

hưởng của vòng lactone không no 𝛼, 𝛽 ở δC 174.5 (>C=O, C–23), 174.4 (>C=C,

C–20), 117.8 (=CH–, C–22), 73.5 (–CH2–O, C–21). Ngoài ra, phổ đồ còn có tín

hiệu cộng hưởng của hai carbon tứ cấp mang oxygen tại δC 85.5 (C–14), 74.6

(C–5) và carbon oxymethine tại δC 68.1 (>CH–O–, C–3). Tín hiệu cộng hưởng

của hai nhóm methyl bậc 4 tại δC 16.7 (–CH3, C–19) và 15.7 (–CH3, C–18).

Từ các dữ kiện của phổ NMR trên và tài liệu tham khảo, hợp chất

PEE04 được dự đoán là steroid có khung sườn pregnane với một nhóm C=O

được gắn trong vòng lactone không no và ba nhóm hydroxyl.

Tương quan HMBC của proton tại δH 2.78 (1H, m, H–17) với các

carbon ở δC 174.4 (>C=, C–20), 117.8 (>C=CH–, C–22), 85.5 (>C<, C–14),

73.5 (–CH2–, C–21), 49.5 (>C<, C–13), 40.1 (–CH2–, C–12) và 26.8 (–CH2–, C–

16) giúp dự đoán vòng lactone không no gắn ở vị trí carbon C–17. Ngoài ra,

tương quan HMBC từ proton methyl tại δH 0.88 (3H, s, H–18), proton tại δH

2.78 (1H, m, H–17) đến carbon mang oxygen tại δC 85.5 (C–14) xác định nhóm

hydroxyl gắn tại C–14. Tương tự, tương quan HMBC từ proton H–3 (δH 4.18)

và proton methyl H–19 (δH 0.95) đến C–5 (δC 74.6) giúp xác định nhóm

hydroxyl gắn vào vị trí C–5. Một số tương quan HMBC khác được trình bày

trong hình 3.1.

Qua các dữ kiện phổ NMR ở trên và kết hợp dữ liệu phổ của hợp chất

periplogenin [9] cho thấy có sự tương đồng nên cấu trúc của hợp chất PEE04

được đề nghị là periplogenin.

Bảng 3.1. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất PEE04 và periplogenin

PEE04 (CDCl3) Periplogenin (CDCl3) [9] Vị trí carbon

δH (ppm) (J-Hz) 4.18 (brs) 2.78 (m) 0.88 (s) 0.95 (s) δC (ppm) 24.9 27.9 68.0 36.9 74.6 35.2 23.7 40.8 39.0 40.7 21.5 40.0 49.5 85.4 33.0 26.8 50.7 15.7 16.7 174.5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 δC (ppm) 24.8 28.0 68.1 36.9 74.6 35.3 23.8 40.9 39.0 40.9 21.5 40.1 49.5 85.5 33.1 26.8 50.7 15.7 16.7 174.4*

73.5 21 73.5

117.7 174.5 4.98 (dd, 1.5, 8.5) 4.81 (dd, 1.0, 8.0) 5.88 (s) 22 23 117.8 174.5*

Ghi chú: (*): tín hiệu có thể trao đổi lẫn nhau.

Periplogenin (PEE04)

Hình 3.1. Cấu trúc và một số tương quan HMBC của hợp chất PEE04

3.2. Khảo sát cấu trúc hợp chất PA1

Hợp chất PA1 (5.9mg) thu được từ phân đoạn EA4.3.2 có những đặc

điểm như sau:

- Dạng bột, màu trắng.

- Sắc kí lớp mỏng cho một vết duy nhất khi hiện hình dưới đèn tử ngoại và

khi phun bằng H2SO4 20%, hơ nóng, bảng mỏng xuất hiện vết có màu vàng nâu.

(dung môi giải ly n-hexane : chloroform (85:15), Rf = 0.45)

- Phổ 1H-NMR (CDCl3, phụ lục 6, bảng 3.2) δH (ppm): 6.70 (1H, dd, J =

2.0, 3.0 Hz, H–16), 5.36 (1H, dd, J = 2.5, 3.0 Hz, H–6), 3.52 (1H, m, H–3), 2.39

(3H, s, H–21), 1.04 (3H, s, H–19), 0.92 (3H, s, H–18).

- Phổ 13C kết hợp với DEPT–NMR (CDCl3, phụ lục 7 và 8, bảng 3.2) δC

(ppm): 197.0 (>C=O, C–20), 155.6 (=C<, C–17), 144.5 (=CH–, C–16), 141.6

(=C<, C–5), 121.2 (=CH–, C–6), 71.9 (>CH–O–, C–3), 19.5 (–CH3, C–19), 15.9

(–CH3, C–18) và độ chuyển dịch của các carbon khác được trình bày trong bảng

3.2.

 BIỆN LUẬN CẤU TRÚC

- Phổ COSY, HSQC, HMBC (CDCl3, phụ lục 9, 10 và 11).

Phổ 1H-NMR của hợp chất PA1 thể hiện tín hiệu cộng hưởng của hai

proton olefin ở δH 6.70 (1H, dd, J = 2.0, 3.0 Hz, H–16), 5.36 (1H, dd, J = 2.5,

3.0 Hz, H–6), tín hiệu cộng hưởng của proton gắn trên carbon mang oxygen ở δH

3.52 (1H, m, H–3), tín hiệu cộng hưởng của một nhóm methyl ketone tại 2.39

(3H, s, H–21) và tín hiệu cộng hưởng của hai nhóm methyl –CH3 ở δH 1.04 (3H,

s, H–19), 0.92 (3H, s, H–18).

Phổ 13C-NMR kết hợp với DEPT–NMR của hợp chất PA1 xuất hiện

tín hiệu cộng hưởng của 21 carbon. Trong đó, tín hiệu cộng hưởng của carbon

ketone không no tại δC 197.0 (>C=O, C–20), bốn carbon olefin tại δC 155.6

(>C=, C–17), 144.5(=CH–, C–16), 141.6 (>C=, C–5), 121.2 (=CH–, C–6),

carbon gắn oxygen tại δC 71.9 (>CH–O–, C–3), một nhóm methyl ketone tại δC

27.3 (–CH3, C–21) và hai nhóm methyl –CH3 tại δC 19.5 (–CH3, C–19), 15.9 (–

CH3, C–18).

Từ các dữ kiện của phổ NMR trên và tài liệu tham khảo, hợp chất PA1

được dự đoán là steroid có khung sườn pregnane với hai liên kết đôi, một nhóm

hydroxyl và một nhóm ketone.

Về phổ HMBC, nhận thấy proton của nhóm methyl ketone tại δH 2.39

(3H, s, H–21) cho tương quan HMBC đến carbon carbonyl tại δC 197.0 (>C=O,

C–20) và carbon olefin tại δC 155.6 (=C<, C–17) giúp xác định nhóm methyl

ketone gắn tại carbon C–17. Tương quan HMBC từ proton methyl ở δH 0.92

(3H, s, H–18) đến carbon olefin tại δC 155.6 (=C<, C–17) và tương quan từ

proton olefin H–16 (δH 6.70, 1H, dd, J = 2.0, 3.0 Hz) đến carbon δC 197.0

(>C=O, C–20) giúp xác định nối đôi nằm tại vị trí carbon C16–17. Tương tự,

proton methyl ở δH 1.04 (3H, s, H–19) tương quan HMBC đến carbon olefin ở

δC141.6 (=C<, C–5) và proton olefin H–6 (δH 5.36, 1H, dd, J = 2.5, 3.0 Hz)

tương quan đến carbon tại δC 30.4 (>CH–, C–8) giúp xác định nối đôi nằm tại vị

trí carbon C5–6. Một số tương quan HMBC khác được trình bày trong hình 3.2.

Qua các dữ kiện của phổ NMR ở trên và kết hợp dữ liệu phổ của hợp

chất 16-dehydropregnenolone [30] cho thấy có sự tương đồng nên cấu trúc của

hợp chất PA1 được đề nghị là 16-dehydropregnenolone.

Bảng 3.2. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất PA1 và 16-dehydropregnenolone

PA1 (CDCl3) 16-dehydropregnenolone (CDCl3) [30] Vị trí carbon

δC (ppm)

δH (ppm) (J-Hz) 3.58

37.3 31.8 71.9 42.5 141.6 121.2 31.7 30.4 50.7 36.9 20.8 34.9 46.3 56.6 32.4 144.5 155.6 15.9 19.5 197.0 27.3 5.48 6.70 0.92 1.05 2.26 δC (ppm) 37.2 31.7 71.8 42.4 141.5 121.1 31.6 30.3 50.6 36.8 20.8 34.8 46.2 56.6 32.3 144.4 155.6 15.8 19.4 196.7 27.2 δH (ppm) (J-Hz) 3.52 (m) 5.36 (dd, 2.5, 3.0) 6.70 (dd, 2.0, 3.0) 0.92 (s) 1.04 (s) 2.39 (s) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

16-Dehydropregnenolone (PA1)

Hình 3.2. Cấu trúc và một số tương quan HMBC của hợp chất PA1

3.3. Khảo sát cấu trúc hợp chất PA2

Hợp chất PA2 (10.9mg) thu được từ phân đoạn EA4.7.3 có những đặc

điểm như sau:

- Dạng bột, màu trắng.

- Sắc kí lớp mỏng không hiện hình dưới đèn tử ngoại và hiện một vết duy

nhất khi phun bằng H2SO4 20%, hơ nóng, bảng mỏng xuất hiện vết có màu cam

nhạt. (dung môi giải ly n-hexane : acetone (9:1), Rf = 0.3)

- Phổ 1H-NMR (CDCl3, phụ lục 12, 12a và bảng 3.3) δH (ppm): 3.19 (1H, dd,

J = 5.5, 11.0 Hz, H–3), 1.14 (3H, s, H–26), 0.96 (3H, s, H–23), 0.93 (3H, d, J =

6.0 Hz, H–30), 0.89 (3H, s, H–28), 0.87 (3H, d, J =5.0 Hz, H–29), 0.86 (3H, s,

H–25), 0.77 (3H, s, H–24), 0.66 (1H, d, J = 5.5 Hz, H–27a) và 0.00 (1H, d, J =

5.5 Hz, H–27b).

- Phổ 13C-NMR (CDCl3, phụ lục 13, bảng 3.3) δC (ppm): 79.2 (>CH–O–, C–

3) và độ chuyển dịch của các carbon khác được trình bày trong bảng 3.3.

 BIỆN LUẬN CẤU TRÚC

- Phổ HSQC, HMBC (CDCl3, phụ lục 14, 15).

Phổ 1H-NMR của hợp chất PA2 thể hiện tín hiệu cộng hưởng của

proton gắn trên carbon mang oxygen ở δH 3.19 (1H, dd, J = 5.5, 11.0 Hz, H–3).

Ngoài ra, phổ 1H-NMR còn thể hiện tính hiệu cộng hưởng proton năm nhóm

methyl tứ cấp ở δH 1.14 (3H, s, H–26), 0.96 (3H, s, H–23), 0.89 (3H, s, H–28),

0.86 (3H, s, H–25), 0.77 (3H, s, H–24) và hai nhóm methyl bậc ba ở δH 0.93

(3H, d, J = 6.0 Hz, H–30), 0.87 (3H, d, J =5.0 Hz, H–29). Trên phổ cũng xuất

hiện tín hiệu cộng hưởng của hai proton thuộc nhóm methylene –CH2– của vòng

cyclopropane ở tại δH 0.66 (1H, d, J = 5.5 Hz, H–27a) và 0.00 (1H, d, J = 5.5

Hz, H–27b).

Phổ 13C-NMR và HSQC của hợp chất PA2 xuất hiện tín hiệu cộng

hưởng của 30 carbon. Trong đó, có tín hiệu cộng hưởng của carbon gắn nhóm

hydroxyl tại δC 79.2 (>CH–O–, C–3), bảy tín hiệu carbon methyl tại δC 28.0 (–

CH3, C–23), 15.4 (–CH3, C–24), 16.1 (–CH3, C–25), 18.0 (–CH3, C–26), 28.4 (–

CH3, C–28), 18.1 (–CH3, C–29), 20.9 (–CH3, C–30), ba tín hiệu carbon cộng

hưởng của nhóm methine tại δC 55.9 (>CH–, C-5), 50.1 (>CH–, C–9), 54.2

(>CH–, C–18). Ngoài ra trên phổ cũng xuất hiện tín hiệu cộng hưởng carbon

methylene của vòng cyclopropane tại δC 13.5 (–CH2–, C–27).

Từ các dữ kiện của phổ NMR trên và tài liệu tham khảo, hợp chất PA2

được dự đoán là triterpene với khung sườn ursane có một nhóm hydroxyl.

Bên cạnh đó, tương quan HMBC của proton tại δH 3.19 (H–3) với

carbon ở δC 55.9 (C–5), 38.6 (C–1), 28.0 (C–23) và 15.4 (C–24) xác định nhóm

hydroxyl gắn trên carbon C–3. Ngoài ra phổ HMBC còn cho thấy sự tương quan

từ proton ở δH 0.00 (H–27) với các carbon ở δC 54.2 (C–18), 35.3 (C–12), 26.7

(C–13), 21.4 (C–15) giúp xác định vòng cyclopropane gắn tại vị trí carbon C13–

14. Một số tương quan HMBC khác được trình bày trong hình 3.3.

Qua các dữ kiện của phổ NMR ở trên và kết hợp dữ liệu phổ của hợp

chất phyllanthol [17] cho thấy có sự tương đồng nên đề nghị cấu trúc của hợp

chất PA2 là phyllanthol.

Bảng 3.3. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất PA2 và phyllanthol

PA2 (CDCl3) Phyllanthol (CDCl3) [17]

Vị trí carbon

δH (ppm) (J-Hz)

δH (ppm) (J-Hz) 3.19 (dd, 5.5, 11.0)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 δC (ppm) 38.6 27.4 79.2 39.0 55.9 18.3 38.6 37.1 50.1 37.5 17.8 35.3 26.7 32.4 21.4 27.4 32.1 54.2 40.9 38.6 31.2 42.2 28.0 15.4 16.1 18.0 13.5 3.18 (dd, 5.8, 10.9) δC(ppm) 38.7 27.5 79.3 39.1 55.9 18.3 38.7 37.2 54.2 37.5 17.8 35.4 26.6 32.4 21.5 27.5 32.1 50.3 41.0 38.7 31.3 42.3 28.1 15.5 16.2 18.2 13.5

28 29 30 0.96 (s) 0.77 (s) 0.86 (s) 1.14 (s) 0.00 (d, 5.5) 0.66 (d, 5.5) 0.89 (s) 0.87 (d, 5.0) 0.93 (d, 6.0) 0.96 (s) 0.77 (s) 0.86 (s) 1.11 (s) 0.00 (d, 5.5) 0.66 (d, 5.5) 0.89 (s) 0.87 (d, 5.6) 0.93 (d, 6.0) 28.4 18.3 20.9

28.4 18.1 20.9

Phyllanthol (PA2)

Hình 3.3. Cấu trúc và một số tương quan HMBC của hợp chất PA2

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

4.1. Kết luận

Việc khảo sát thành phần hóa học từ vỏ thân của cây Me rừng

(Phyllanthus emblica Linn.) được hái ở tỉnh Bình Thuận đã thu về những kết

quả như sau:

Từ phân đoạn EA4.3, EA4.6 và EA4.7 của phân đoạn EA4 cao ethyl

acetate, thông qua các phương pháp chiết xuất và sắc ký đã cô lập được ba hợp

chất, kí hiệu là PA1, PEE04 và PA2. Sử dụng các phương pháp phổ nghiệm và

so sánh với tài liệu tham khảo, cấu trúc của các hợp chất PA1, PEE04 và PA2

được đề nghị như sau:

 Periplogenin (PEE04)

 16-Dehydropregnenolone (PA1)

Periplogenin (PEE04)

Phyllanthol (PA2)

 Phyllanthol (PA2)

16-Dehydropregnenolone (PA1)

Ba hợp chất periplogenin (PEE04), 16-dehydropregenolone (PA1),

phyllanthol (PA2) được cô lập từ cao ethyl acetate của vỏ thân cây Me rừng

(Phyllanthus emblica Linn.) đều là những chất lần đầu tiên cô lập trong cây,

trong đó hai hợp chất periplogenin (PEE04) và 16-dehydropregenolone (PA1)

là những chất lần đầu tiên được phát hiện trong chi Phyllanthus.

4.2. Đề xuất

Trong phạm vi của khóa luận, em chỉ mới nghiên cứu một số phân đoạn

của cao ethyl acetate. Trong thời gian sắp tới, nếu có đủ điều kiện, em sẽ tiếp tục

khảo sát các cao phân đoạn khác để có thể cô lập thêm những hợp chất khác.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tham khảo Tiếng Việt

1. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học,

695–696.

2. Đỗ Huy Bích (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB

Khoa học và Kỹ Thuật, 260-262.

Tài liệu tham khảo Tiếng Anh

3. A.K. Jamal, W.A. Yaacob, Laily B. Din (2008), "A chemical study on

Phyllanthus reticulatus", Journal of Physical Science, 19, 45–50.

4. Chun-Bin Yang, Fan Zang, Mei-Cai Deng, Guang-Yun He, Jian-Min Yue,

Run-Hua Lu (2007), “A new ellagitannin from the fruit of Phyllanthus

emblica L.”, Journal of the Chineses Chemical Society, 54, 1615–1618.

5. He Yana, Li Rong Han, Xing Zhang, Jun Tao Feng (2017), "Two new anti-

TMV active chalconoid analogues from the root of Phyllanthus emblica",

Natural Product Research, 31, 2143–2148.

6. João B. Calixto, Adair R. S. Santos, Valdir Cechinel Filho, Rosendo A.

Yunes (1998), “A review of the plants of the genus Phyllanthus: their

chemistry, pharmacology, and therapeutic potential”, Medicinal Research

Reviews, 18, 225–258.

7. M. Goretti V. Silva, Ícaro G. P. Vieira, Francisca N. P. Mendes, Irineu. L.

Albuquerque, Rogério N. dos Santos, Fábio O. Silva, Selene M. Morais, M.

Goretti V. Silva, Ícaro G. P. Vieira, Francisca N. P. Mendes, Irineu. L.

Albuquerque, Rogério N. dos Santos, Fábio O. Silva, Selene M. Morais

(2008), "Variation of ursolic acid content in eight Ocimum species from

northeastern Brazil", Molecules, 13, 2482–2487.

8. Mahbuba Khatun, Mirajum Billah, Md. Abdul Quader (2012), “Sterols and

sterol glucoside from Phyllanthus species”, Dhaka University Journal of

Science, 60, 5–10.

9. Peter Junior, Max Wichtl (1979), "3-epi-periplogenin: ein neues cardenolid

aus adonis verivaljs", Phytochemistry, 19, 2193–2197.

10. Prapawadee Puapairoj, Waree Naengchomnong, Anake Kijjoa, Madalena

M. Pinto, Madalena Pedro, Maria São José Nascimento, Artur M. S. Silva,

Werner Herz (2004), "Cytotoxic activity of lupane-type triterpenes from

Glochidion sphaerogynum and Glochidion eriocarpum two of which

induce apoptosis", Planta Medica, 71, 208–213.

11. Saem Han, Hye Min Kim, Jeong Min Lee, So-Youn Mok, Sanghuyn Lee

(2010), "Isolation and identification of polymethoxyflavones from the

hybrid Citrus, Hallabong", Journal of Agricultural and Food Chemistry,

52, 9488–9491.

12. Sharma Bhawna, Sharma Upendra Kumar (2010), “Hepatoprotective

activity of some indigenous plants”, International Journal of PharmTech

Research, 2, 568–572.

13. Sirinya Pientaweeratch, Vipaporn Panapisal, Anyarporn Tansirikongkol

(2016), "Antioxidant, anti-collagenase and anti-elastase activities of

Phyllanthus emblica, Manilkara zapota and silymarin: an in vitro

comparative study for anti-aging applications", Pharmaceutical Biology,

54, 1865–1872.

14. Sitthichai Iamsaard, Supatcharee Arun, Jaturon Burawat, Wannisa

Sukhorum, Porntip Boonruangsri, Malivalaya Namking, Nongnut

Uanindut, Somsak Nualkaew và Bungorn Sripanidkulchai (2015),

“Phyllanthus emblica L. branch extract ameliorates testicular damage in

valproic acid – included rats”, International Journal of Morphology, 33,

1016–1022.

15. S.K. El-Desouky, Shi Young Ryu, Young-Kyoon Kim (2008), “A new

cytotoxic acelated apigenin glucoside form Phyllanthus emblica L”,

Natural Product Research, 22 (1), 91-95.

16. Tania Peshin, H. K. Kar (2017), "Isolation and characterization of β-

sitosterol 3-O-β-D-glucoside from the extract of the flowers of Viola

odorata", British Journal Pharmaceutical Research, 16,1–8.

17. Vuyelwa J. Ndlebe, Neil R. Crouch b,c, Dulcie A. Mulholland (2007),

"Triterpenoids from the African tree Phyllanthus polyanthus",

Phytochemistry Letters, 1, 11-17.

18. Wei-Yan Qi, Ya Li, Lei Hua, Ke Wang, Kun Gao (2013), “Cytotoxicity

and structure activity relationships of phytosterol from Phyllanthus

emblica”, Fitoterapia, 84, 252–256.

19. Wei Luo, Lingrong Wen, Mouming Zhao, Bao Yang, Jiaoyan Ren,

Guanglin Shen, Gouhua Rao (2012), “Structural indentification of

isomallotusisnin and other phenolics in Phyllanthus emblica L. fruit hull”,

Food Chemistry, 132, 1527–1533.

20. Wei Luo, Mouming Zhao, Bao Yang, Jiaoyan Ren, Guanglin Shen,

Guohua Rao (2011), “Antioxidant and antiproliferative capacities of

phenolics purified from Phyllanthus emblica L. fruit”, Food Chemistry,

126, 277–282.

21. Xiaoli Liu, Chun Cui, Mouming Zhao, Jinshui Wang, Wei Luo, Bao Yang,

Yueming Jiang (2008), “Identification of phenolics in the fruit of emblica

(Phyllanthus emblica L.) and their antioxidant activities”, Food Chemistry,

109, 909-915.

22. Xiaoli Liu, Mouming Zhao, Jinshui Wang, Wei Luo (2007), “Antimicrobial

and antioxidant activity of emblica extracts obtained by supercritical

carbon dioxide extraction và methanol extraction”, Journal of Food

Biochemistry, 33, 307–330.

23. Xiaoli Liu, Mouming Zhao, Kegang Wua, Xianghua Chai, Hongpeng Yu,

Zhihua Tao, Jinshui Wang (2012), “Immunomodulatory and anticancer

activities of phenolics from emblica fruit (Phyllanthus emblica L.)”, Food

Chemistry, 131, 685–690.

24. Xinxian Zhu, Jianjun Wang, Yang Ou, Weiwei Han và Huaifang Li (2013),

“Polyphenol extract of Phyllanthus emblica (PEEP) induces inhibition of

cell proliferation and triggers apoptosis in cervical cancer cells”, European

Journal of medical research, 18, 2–5.

25. Yang Fei Xiang, Ying Pei, Chang Qu, Zhicai Lai, Zhe Ren, Ke Yang,

Sheng Xiong, Yingjun Zhang, Chongren Yang, Dong Wang, Qing Liu,

Kaio Kitazato and Yifei Wang (2011), “In vitro anti-Herpes simplex virus

activity of 1,2,4,6-tetra-O-galloyl-β-D-glucose from Phyllanthus emblica

L. (Euphorbiaceae)”, Phytotherapy Research, 25, 975-982.

26. Ying-Jun Zhang, Takashi Tanaka, Chong-Ren Yang, Isao Kouno (2001),

“New phenolic constituents from the fruit juice of Phyllanthus emblica”,

Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 49, 537–540.

27. Ying-Jung Zhang, Takashi Tanaka, Yoko Iwamoto, Chong-Ren Yang, Isao

Kouno (2000), “Phyllaemblic acid, a novel highly oxygenated

norbisabolane form the root of Phyllanthus emblica”, Tetrahedron Letters,

41, 1781–1784.

28. Ying-Jun Zhang, Takashi Tanaka, Yoko Iwamoto, Chong-Ren Yang, Isao

Kouno (2001), “Novel norsesquiterpenoids from the root of Phyllanthus

emblica”, American Chemical Society and American Society of

Pharmacognosy, 63, 1507–1510.

29. Ying-Jung Zhang, Tomomi Abe, Takashi Tanaka, Chong-Ren Yang, Isao

Kouno (2001), “Phyllanemblinins A-F, new ellagitannins from Phyllanthus

emblica”, Journal of Natural Products, 64, 1527–1532.

30. Zsuzsa Szendi, Peter Forgó, Frederick Sweet (2000), "Complete 1H and 13C

NMR spectra of pregnenolone", Steroids, 60, 442 - 446.

PHỤ LỤC

21a

21b

Phụ lục 1. Phổ 1H-NMR của hợp chất PEE04

20, 23

Phụ lục 2. Phổ 13C-NMR của hợp chất PEE04

Phụ lục 2a. Phổ 13C-NMR dãn rộng của hợp chất PEE04

20, 23

Phụ lục 3. Phổ DEPT của hợp chất PEE04

19 18

21a

21b

Phụ lục 4. Phổ HSQC của hợp chất PEE04

21b

21a

3 21

20, 23

Phụ lục 5. Phổ HMBC của hợp chất PEE04

Phụ lục 6. Phổ 1H-NMR của hợp chất PA1

11 19

Phụ lục 7. Phổ 13C-NMR của hợp chất PA1

Phụ lục 8. Phổ DEPT (CDCl3) của hợp chất PA1

Phụ lục 9. Phổ COSY (CDCl3) của hợp chất PA1

Phụ lục 10. Phổ HSQC (CDCl3) của hợp chất PA1

Phụ lục 11. Phổ HMBC (CDCl3) của hợp chất PA1

27a

27b

Phụ lục 12. Phổ 1H-NMR của hợp chất PA2

27a

27b

Phụ lục 12a. Phổ 1H-NMR dãn rộng của hợp chất PA2

2,16

Phụ lục 13. Phổ 13C-NMR của hợp chất PA2

27a

27b

Phụ lục 14. Phổ HSQC (CDCl3) của hợp chất PA2

27a

27b

Phụ lục 15. Phổ HMBC (CDCl3) của hợp chất PA2