Khóa luận tốt nghiệp: Xây dựng quy trình định lượng đồng thời chuẩn imidacloprid và azoxystrobin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ

KHOA DƯỢC - ĐIỀU DƯỠNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI IMIDACLOPRID VÀ AZOXYSTROBIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Giáo viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

Th.s. NGUYỄN PHƯỚC ĐỊNH

LÊ HỮU BẢO TRÂN

MSSV: 12D720401175

Lớp: ĐH DƯỢC 7B

Cần Thơ, năm 2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ

KHOA DƯỢC - ĐIỀU DƯỠNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI IMIDACLOPRID VÀ AZOXYSTROBIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Giáo viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

Th.s. NGUYỄN PHƯỚC ĐỊNH

LÊ HỮU BẢO TRÂN

MSSV: 12D720401175

Lớp: ĐH DƯỢC 7B

Cần Thơ, năm 2017

LỜI CÁM ƠN

Qua 5 năm học tập và rèn luyện tại trường ĐH Tây Đô, dưới sự chỉ bảo và giảng

dạy nhiệt tình của quý thầy cô, đặc biệt là quý thầy cô khoa Dược-Điều dưỡng đã

truyền đạt cho em những kiến thức về lý thuyết và thực hành để em có thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Chính vì thế, một trong những yếu tố không nhỏ tạo nên “sản

phẩm trí tuệ” này là sự hướng dẫn, giúp đỡ tận tình của giáo viên hướng dẫn và các

thầy cô. Bên cạnh đó còn có sự ủng hộ của gia đình và bạn bè mà em mới có thể hoàn

thành khóa luận một cách thuận lợi nhất.

Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ths. Nguyễn Phước Định,

người trực tiếp hướng dẫn em trong quá trình làm luận văn. Không chỉ gợi ý và hướng

dẫn em trong quá trình tìm hiểu, đọc tài liệu và lựa chọn đề tài, thầy còn tận tình chỉ

bảo em những kĩ năng phân tích, khai thác tài liệu để có được những lập luận phù hợp

với nội dung của khóa luận. Hơn nữa, thầy còn rất nhiệt tình trong việc đốc thúc quá trình viết khóa luận, đọc và đưa ra những nhận xét, góp ý để em có thể hoàn thành luận

văn một cách tốt nhất.

Bên cạnh đó, em cũng xin gửi đến các thầy cô giáo đang hoạt động, giảng dạy tại

phòng Kiểm Nghiệm lòng biết ơn sâu sắc về những kiến thức và kĩ năng mà các thầy

cô đã truyền đạt, chỉ em thêm những kiến thức em còn thiếu sót, cũng như đóng góp

thêm ý kiến cho việc hoàn thành khóa luận.

Cần Thơ, tháng 6 năm 2017

Sinh viên

Lê Hữu Bảo Trân

TÓM TẮT

Hai hóa chất bảo vệ thực vật phổ biến nhất là imidacloprid và azoxystrobin được

nhiều nông dân tin dùng vì hai loại này có hiệu quả cao trong việc ngăn ngừa sâu bệnh và nấm mốc gây hại, nên imidacloprid và azoxystrobin được chọn trong nghiên cứu

này. Điều này đặt ra yêu cầu cần có phuơng pháp phân tích chính xác và đơn giản xác

định hai hoạt chất trên. Nghiên cứu đã xây dựng và thẩm định được quy trình định

lượng đồng thời imidacloprid và azoxystrobin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Kết quả nghiên đã lựa chọn được với điều kiện sắc ký trong đó cột

sắc ký RP- C18 (250 x 4,6mm, 5µm), pha động gồm acetonitril –nước với tỷ lệ (55%: 45%), tốc độ dòng 1ml/phút và phát hiện ở bước sóng 250 nm. Cả hai chất đã tách

được hoàn toàn trong thời gian 15 phút. Giới hạn định lượng của imidacloprid và

azoxystrobin lần lượt là 0,0048 ppm và 0,048 ppm. Diện tích pic và nồng độ có mối

tương quan tuyến tính với hệ số tương quan của imidacloprid là 0,9978 và của

azoxystrobin là 0,997. Phương pháp có độ đúng nằm trong khoảng 98-102% và độ lặp

lại tốt với RSD < 2%. Vì vậy quy trình có thể sử dụng để định lượng nhanh

imidacloprid và azoxystrobin từ đó xác định dư lượng của hai chất này trong dược liệu.

Từ khóa: imidacloprid, azoxystrobin, định lượng, HPLC.

MỤC LỤC

LỜI CÁM ƠN

TÓM TẮT

MỤC LỤC .......................................................................................................................i

CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1

1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................................... 1

1.2. MỤC TIÊU ........................................................................................................... 1

CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 2

2.1. TỔNG QUAN VỀ CÁC CHẤT NGHIÊN CỨU ................................................. 2

2.1.1. Khái niệm hóa chất bảo vệ thực vật ............................................................... 2

2.1.2. Phân loại hóa chất bảo vệ thực vật ................................................................. 2

2.1.3. Imidacloprid ................................................................................................... 3

2.1.3.1. Khái niệm ................................................................................................ 3

2.1.3.2. Cấu tạo ..................................................................................................... 3

2.1.3.3. Tính chất vật lý và hóa học ..................................................................... 3

2.1.3.4. Độc tính của Imidacloprid ....................................................................... 4

2.1.3.5. Cơ chế tác động của imidacloprid ........................................................... 4

2.1.4. Azoxystrobin .................................................................................................. 5

2.1.4.1. Khái niệm ................................................................................................ 5

2.1.4.2. Cấu tạo ..................................................................................................... 5

2.1.4.3. Tính chất vật lý và hóa học ..................................................................... 5

2.1.4.4. Độc tính của azoxystrobin ....................................................................... 5

2.1.4.5. Cơ chế tác động ....................................................................................... 6

2.1.5. Các loại hóa chất bảo vệ thực vật chứa imidacloprid và azoxystrobin .......... 6

2.1.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .................................................... 6

2.1.6.1. Một số phương pháp định lượng imidacloprid bằng phương pháp HPLC .... 6

2.1.6.2. Các phương pháp định lượng azoxysrobin bằng phương pháp HPLC ... 8

2.1.6.3. Phương pháp định lượng đồng thời hai chất imidacloprid và

azoxystrobin. ........................................................................................................ 8

i

2.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ....... 9

2.2.1. Khái niệm ....................................................................................................... 9

2.2.2. Phân loại ......................................................................................................... 9

2.2.3. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC ........................................................ 9

2.2.3.1. Bình đựng dung môi .............................................................................. 10

2.2.3.2. Bộ phận khử khí .................................................................................... 10

2.2.3.3. Bơm cao áp ............................................................................................ 11

2.2.3.4. Bộ phận tiêm mẫu .................................................................................. 11

2.2.3.5. Cột sắc ký .............................................................................................. 11

2.2.3.6. Đầu dò ................................................................................................... 11

2.2.3.7. Bộ phận ghi tín hiệu .............................................................................. 11

2.2.3.8. Thiết bị in dữ liệu .................................................................................. 12

2.2.4. Nguyên tắc của quá trình sắc kí trong cột .................................................... 12

2.2.5. Sắc ký phân bố hiệu năng cao ...................................................................... 12

2.2.6. Các thông số đặc trưng trong HPLC ............................................................ 13

2.2.6.1. Thời gian lưu tR .................................................................................... 13

2.2.6.2. Hệ số phân bố K .................................................................................... 14

2.2.6.3. Hệ số dung lượng K’ ............................................................................. 14

2.2.6.4. Hệ số tách α ........................................................................................... 15

2.2.6.5. Số đĩa lý thuyết ...................................................................................... 15

2.2.6.6. Độ phân giải RS .................................................................................... 15

2.2.6.7. Các hệ số liên quan tới đối xứng của pic sắc ký ................................... 16

2.2.7. Phương pháp chọn điều kiện sắc ký ............................................................. 16

2.2.7.1. Lựa chọn pha tĩnh .................................................................................. 17

2.2.7.2. Lựa chọn pha động ................................................................................ 17

2.2.8. Các bước tiến hành sắc ký............................................................................ 19

2.2.8.1. Chuẩn bị dụng cụ và máy móc .............................................................. 19

2.2.8.2. Chuẩn bị dung môi pha động ................................................................ 19

ii

2.2.8.3. Chuẩn bị mẫu đo HPLC ........................................................................ 19

2.2.8.4. Cách vận hành thiết bị ........................................................................... 20

CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................... 21

3.1. HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ .............................................................................. 21

3.1.1. Hóa chất ....................................................................................................... 21

3.1.1.1. Chất chuẩn ............................................................................................. 21

3.1.1.2. Dung môi ............................................................................................... 21

3.1.2. Dụng cụ - Thiết bị ........................................................................................ 21

3.1.2.1 Thiết bị.................................................................................................... 21

3.1.2.2. Dụng cụ ................................................................................................. 22

3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ............................................................................... 22

3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................... 23

3.3.1. Chuẩn bị dung dịch ...................................................................................... 23

3.3.2. Khảo sát điều kiện tối ưu cho hệ thống sắc ký............................................. 23

3.3.2.1. Chọn cột................................................................................................. 23

3.3.2.2. Chọn bước sóng cho detector ................................................................ 23

3.3.2.3. Khảo sát bước sóng trên thiết bị HPLC................................................. 23

3.3.2.4. Khảo sát thành phần pha động .............................................................. 24

3.3.2.5. Khảo sát tốc độ dòng ............................................................................. 25

3.3.3. Thẩm định phương pháp .............................................................................. 25

3.3.3.1 Tính phù hợp hệ thống ........................................................................... 25

3.3.3.2. Tính đặc hiệu ......................................................................................... 26

3.3.3.3. Xác định giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ........... 27

3.3.3.4. Tính tuyến tính ...................................................................................... 27

3.3.3.5. Độ chính xác .......................................................................................... 28

3.3.3.6. Độ đúng (tỷ lệ hồi phục %) ................................................................... 28

3.3.4. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả ....................................................... 29

Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 30

iii

4.1. CHUẨN BỊ MẪU NGHIÊN CỨU VÀ LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ ... 30

4.1.1. Chuẩn bị dung dịch ...................................................................................... 30

4.1.2 Khảo sát điều kiện phân tích sắc ký .............................................................. 30

4.1.2.1. Đặt bước sóng cho detector ................................................................... 30

4.1.2.2. Khảo sát thành phần pha động .............................................................. 31

4.1.2.3 Khảo sát tốc độ dòng .............................................................................. 35

4.2. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI HAI CHẤT IMIDACLOPRID VÀ AZOXYSTROBIN ............................................................... 35

4.2.1. Thẩm định quy trình ..................................................................................... 35

4.2.1.1. Tính phù hơp hệ thống .......................................................................... 35

4.2.1.2 Tính đặc hiệu .......................................................................................... 38

4.2.1.3. Xác định LOD và LOQ của thiết bị ...................................................... 39

4.2.1.4. Tính tuyến tính ...................................................................................... 40

4.2.1.5. Độ chính xác .......................................................................................... 43

4.2.1.6. Độ đúng ................................................................................................. 45

4.3. THẢO LUẬN ..................................................................................................... 47

CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ................................................................. 48

5.1. KẾT LUẬN ......................................................................................................... 48

5.2. ĐỀ XUẤT ........................................................................................................... 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 50

PHỤ LỤC

iv

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu, chữ viết tắt Từ nguyên (nghĩa tiếng Việt)

: Acetonitrile ACN

: Hệ số đối xứng As

: Dược điển Việt Nam DĐVN

: High Performance Liquid Chromatography HPLC

(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

: Lethal concentration (Nồng độ gây chết 50% ) LC50

: Lethal dose (Liều gây chết 50%) LD50

: Limit of quantitation (Giới hạn định lượng) LOD

: Limit of detection (Giới hạn phát hiện) LOQ

: Photo Diode Array (Dãy diod quang) PDA

: Part per million (phần triệu) ppm

: Resolution (Độ phân giải) Rs

: Relative Standard Deviation RSD

(Độ lệch chuẩn tương đối)

:

: Standard Deviation (Độ lệch chuẩn) SD

Diện tích pic sắc kí Speak

: Tử ngoại UV

: Khả kiến Vis

v

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1. Cấu trúc của imidacloprid ............................................................................... 3

Hình 2.2. Cấu trúc của azoxystrobin ............................................................................... 5

Hình 2.3. Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC ......................................................................... 9

Hình 2.4. Sắc ký đồ thời gian lưu của chất A và chất B................................................ 14

Hình 4.1. Phổ hấp thụ của azoxystrobin và imidacloprid trong acetonitrile. ................ 31

Hình 4.2. Sắc ký đồ ACN/ Nước (90%:10%). .............................................................. 32

Hình 4.3. Sắc ký đồ ACN/ Nước (95%:5%). ................................................................ 32

Hình 4.4. Sắc ký đồ ACN/ Nước (85%:15%) ............................................................... 33

Hình 4.5. Sắc ký đồ ACN/ Nước (60%:40%). .............................................................. 33

Hình 4.6. Sắc ký đồ ACN/ Nước (55%:45%). .............................................................. 34

Hình 4.7. Sắc ký đồ ACN/ Nước (50%:50%). .............................................................. 34

Hình 4.8. Kết quả sắc kí đồ khảo sát tính phù hợp hệ thống ......................................... 36

Hình 4.9. Sắc kí đồ đánh giá độ đặc hiệu với imidacloprid và azoxystrobin ................ 38

Hình 4.10. Hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin ở nồng độ 0,048 ppm .................... 39

Hình 4.11. Hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin ở nồng độ 0,0048 ppm .................. 39

Hình 4.12. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ của imidacloprid ... 42

Hình 4.13. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ của azoxystrobin .. 42

vi

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Thông tin về độc tính cấp của imidacloprid .................................................... 4

Bảng 2.2. Thông tin về độc tính cấp của azoxystrobin ................................................... 6

Bảng 2.3. Lực rửa giải của một số dung môi ................................................................ 18

Bảng 3.1. Danh mục dung môi tinh khiết chuyên dùng cho HPLC .............................. 21

Bảng 3.2. Danh mục máy móc - thiết bị phục vụ cho đề tài nghiên cứu ...................... 21

Bảng 3.3. Tỷ lệ thành phần pha động của acetonitril và nước ...................................... 24

Bảng 4.1. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của imidacloprid............................ 36

Bảng 4.2. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống azoxystrobin .................................. 37

Bảng 4.3. Cách pha loãng dung dịch mẫu chuẩn hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin

trước khi tiêm vào hệ thống HPLC ............................................................................... 40

Bảng 4.4: Diện tích peak ứng với từng nồng độ imidacloprid trong dãy chuẩn ........... 41

Bảng 4.5: Diện tích peak ứng với từng nồng độ azoxystrobin trong dãy chuẩn ........... 41

Bảng 4.6. Phương trình hồi quy của azoxystrobin và imidacloprid .............................. 43

Bảng 4.7. Độ lặp lại của hệ thống HPLC với mẫu azoxystrobin .................................. 43

Bảng 4.8. Độ lặp lại của hệ thống HPLC đối với mẫu imidaclopid .............................. 44

Bảng 4.9. Độ chính xác trung gian đối với mẫu imidacloprid ...................................... 44

Bảng 4.10. Độ chính xác trung gian đối với mẫu azoxystrobin .................................... 45

Bảng 4.11. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp với mẫu Imidacloprid ........... 45

Bảng 4.12. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp với azoxystrobin ................... 46

Bảng 5.1: Giá trị LOD, LQD và khoảng tuyến tính cho 2 chất imidacloprid và azoxystrobin................................................................................................................... 48

vii

CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU

1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong nông nghiệp, có nhiều mối nguy làm ảnh hưởng xấu đến năng suất và chất lượng nông sản như sâu bệnh, cỏ dại, chuột, mối mọt, nấm... Vì vậy hóa chất bảo

vệ thực vật đóng vai trò quan trọng để phòng và loại trừ các loại dịch bệnh cho các sản

phẩm nông nghiệp. Hiện nay, khi trồng hầu hết các loại dược liệu cần phải sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật nhằm tăng năng suất và chất lượng dược liệu.

Gần đây một trong những phương pháp phổ biến nhất là việc sử dụng

imidacloprid và azoxystrobin là hai loại phổ biến nhất trong nông nghiệp để ngăn ngừa

sâu bệnh, côn trùng, nấm mốc ảnh hưởng đến cây trồng. Các công trình nghiên cứu

nước ngoài đã thành công trong việc định lượng imidacloprid hoặc azoxystrobin với nhiều loại hóa chất bảo vệ thực vật khác bằng các phương pháp như: quang phổ UV-

VIS, sắc ký khí ghép đầu dò khối phổ, sắc ký lỏng hiệu nâng cao (HPLC)…Trong đó

HPLC là phương pháp thường được sử dụng nhất do phương pháp này rất phổ biến,

thuận lợi, đỡ tốn kém và cho độ chính xác cao hơn so với các phương pháp khác.

Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nhiều kỹ thuật phân tích

mới và hiện đại đã được áp dụng vào việc phân tích, xác định hàm lượng của chúng

nhằm kiểm soát chất lượng của các sản phẩm, đảm bảo an toàn và sức khỏe của người

sử dụng. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một trong những phương

pháp phân tích hiện đại, chính xác và nhanh chóng để phân tích hàm lượng của các

loại hóa chất bảo vệ thực vật đang được nghiên cứu và ứng dụng trong thực tế.

Trong nghiên cứu này định lượng đồng thời hai chất imidacloprid và

azoxystrobin từ đó có thể xác định dư lượng của hai chất này trong lá, rễ từ dược liệu

bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu nâng cao (HPLC). Vì vậy đề tài “Xây dựng quy

trình định lượng đồng thời chuẩn imidacloprid và azoxystrobin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” được thực hiện với mong muốn tìm ra một phương pháp nhanh, hiệu quả và phù hợp với điều kiện nghiên cứu của phòng thí nghiệm.

1.2. MỤC TIÊU

Nghiên cứu này được thực hiện chủ yếu với hai mục tiêu sau:

 Xây dựng điều kiện phân tích đông thời imidacloprid và azoxystrobin bằng

phương pháp HPLC sử dụng detector UV-VIS.

 Thẩm định quy trình định lượng đồng thời imidacloprid và azoxystrobin.

1

CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. TỔNG QUAN VỀ CÁC CHẤT NGHIÊN CỨU

2.1.1. Khái niệm hóa chất bảo vệ thực vật

Hóa chất bảo vệ thực vật là bất kì hợp chất hay hỗn hợp được dùng với mục

đích ngăn ngừa, tiêu diệt hoặc kiểm soát các tác nhân gây hại, bao gồm vật chủ trung

gian truyền bệnh của con người hoặc động vật, các bộ phận không mong muốn của thực vật hoặc động vật gây hại hoặc ảnh hưởng đến các quá trình sản xuất, chế biến,

bảo quản, vận chuyển, mua bán thực phẩm, nông sản, gỗ và sản phẩm từ gỗ, thức ăn

chăn nuôi, hoặc hợp chất được phân tán lên động vật để kiểm soát côn trùng, nhện hay

các đối tượng khác trong hoặc trên cơ thể chúng. Hóa chất bảo vệ thực vật còn được

dùng làm tác nhân điều hòa sinh trưởng thực vật, chất làm rụng lá, chất làm khô cây, tác nhân làm thưa quả hoặc ngăn chặn rụng quả sớm. Cũng có thể dùng hóa chất bảo

vệ thực vật cho cây trồng trước cũng như sau khi thu hoạch để bảo vệ sản phẩm không

bị hỏng trong quá trình bảo quản và vận chuyển (Trần Cao Sơn, 2015).

2.1.2. Phân loại hóa chất bảo vệ thực vật

Các hóa chất bảo vệ thực vật được phân loại theo ba nhóm chính sau: - Thuốc trừ sâu: là một loại chất được sử dụng để chống côn trùng. Chúng bao gồm các thuốc diệt trứng và thuốc diệt ấu trùng để diệt trứng và ấu trùng của côn trùng

như: imidacloprid, dichlopropene, methyl isocyanate, chloropicrin, methyl bromide…. Một số chất khác như: aldicarb, dazomet và metham natri, hoạt động chủ yếu qua tiếp xúc. Gần như tất cả các loại thuốc trừ sâu đều có nguy cơ làm thay đổi lớn các hệ sinh thái; nhiều loại thuốc trừ sâu độc hại với con người; và các loại khác tích tụ trong chuỗi thức ăn (Saed Mousa Diab Ali, 2012).

- Thuốc diệt cỏ: Thuốc diệt cỏ kiểu Hormon như 2,4,5-T; 2,4-D;…là những chất không hiện diện trong đất nhưng có độc tính cao đối với thực vật và thấp đối với động vật có vú. Các chất thuộc nhóm này ít ảnh hưởng trực tiếp đến môi trường nhưng

lại hòa tan hoàn toàn trong nước và trong các mạch nước ngầm. Các loại thuốc diệt cỏ ảnh hưởng trực tiếp trên thân, lá bao gồm: dintrophenols, xianophenols, pentachlorophenol

và Paraquat (Saed Mousa Diab Ali, 2012).

- Thuốc trừ nấm: là những chất độc có nguồn gốc từ tự nhiên hay hóa chất tổng hợp được dùng để bảo vệ cây trồng và nông sản, chống lại sự phá hoại của nấm mốc, vi khuẩn ảnh hưởng đến năng suất của cây trồng Nhiều loại thuốc trừ nấm khác nhau được sử dụng, với các hóa chất có cấu trúc khác nhau. Hầu hết đều có độc tính tương

đối thấp, ngoại trừ các chất thuộc nhóm carbamat như benomyl. Độc tính của thuốc trừ nấm ảnh hưởng lớn đến môi trường nhất là đối với hệ vi sinh vật trong đất nhưng ảnh hưởng này chỉ trong thời gian ngắn (Saed Mousa Diab Ali, 2012).

2

Trong nghiên cứu này hai chất hóa chất bảo vệ thực vật khảo sát đó là

imidacloprid và azoxystrobin. Theo các tài liệu trong và ngoài nước đã phân loại

imidacloprid thuộc nhóm thuốc trừ sâu và azoxystrobin thuộc nhóm thuốc trừ nấm. Dựa vào tính chất và đặc điểm của từng nhóm từ đó chọn ra phương pháp nghiên cứu

phù hợp.

2.1.3. Imidacloprid

2.1.3.1. Khái niệm Imidacloprid là một trong những loại hoạt chất có phổ được sử dụng rộng rãi

nhất. Nó được dùng để trừ hầu hết các loại sâu hại trong nông nghiệp, lâm nghiệp, trừ

mối,….Do có độ độc bởi vòng Pyridin có gắn với nguyên tử Clo và dị vòng Azo 5

cạnh, có độ độc cao với côn trùng, diệt trừ sâu, bướm, rầy, rệp…(Sacramento, 2002).

2.1.3.2. Cấu tạo[31]

Hình 2.1. Cấu trúc của imidacloprid

- Tên chung quốc tế: imidacloprid - Công thức phân tử: C9H10ClN5O2 - Khối lượng phân tử: 255,662 g/mol - Danh pháp IUPAC: N-[1-[(6-chloropyridin-3-yl)methyl]-4,5-

dihydroimidazol-2-yl]nitramide

- Loại HCBVTV: thuốc trừ sâu - Nhóm: Neonicotinoid

2.1.3.3. Tính chất vật lý và hóa học (Sprivastava, 2004)

- Dạng bột tinh thể màu hoặc bột màu be, có mùi đặc trưng nhẹ - Tỷ trọng: 1.54 g/cm3 - Nhiệt độ nóng chảy ở 144oC - Áp suất hơi: 1.00 x 10-7 mm Hg (20oC) - Độ ổn định: ổn định trong điều kiện bảo quản được khuyến cáo - Độ tan trong nước: 0,61 g/l (20oC) - Thời gian bán hủy: Trên 30 ngày (25oC ở pH 7) - Độ hòa tan: Tan trong các dung môi như: nước, dchloromethane,

isopropanol, toluene ở nhiệt độ 20oC

3

- 0.Phân hủy ở pH khoảng 5-11, khi đun nóng ở nhiệt độ cao, sinh ra khí độc

2.1.3.4. Độc tính của Imidacloprid (Raihanah, 2016)

Theo một số tài liệu nghiên cứu của các tác giả nước ngoài, imidacloprid gây

độc với động vật ở một liều nhất định, cụ thể trong bảng sau:

Bảng 2.1: Thông tin về độc tính cấp của imidacloprid

Động vật thí nghiệm Đường dùng Kết quả

miệng LD50 tương đương 130 mg/kg

da LD50 > 5000 mg/kg và gây kích ứng da nhẹ

hít LC50 > 5,33 mg/l

Chuột Nuốt một lượng lớn có thể gây

nôn mửa, tiêu chảy, đau bụng, lơ tiêu hóa mơ, trầm cảm, chuột rút, run rẩy

và rối loạn hô hấp.

mắt Gây kích ứng mắt

Trong các trường hợp đã được khảo sát về độc tính của Imidacloprid ở người

ngộ độc cấp thường có các dấu hiệu bao gồm buồn ngủ, chóng mặt, nôn mửa, không

tỉnh táo và sốt. Các trường hợp ngộ độc này phụ thuộc vào hàm lượng imidacloprid có

trong chế độ ăn uống (Spivastava, 2004).

 Liều dùng cho phép mỗi ngày (ADI) trong khẩu phần ăn hằng ngày ở người

có chứa imidacloprid là 0,06 mg/kg một ngày (Spivastava, 2004).

2.1.3.5. Cơ chế tác động của imidacloprid (Spivastava, 2004)

Imidacloprid thuộc nhóm Neonicotinoid là nhóm hóa chất bảo vệ thực vật gây kích thích thần kinh có cấu trúc tương tự nicotin. Cơ chế gây độc là do các sản phẩm này này gắn với các receptor của acetylcholin, gây độc thần kinh trung ương. Imidacloprid có độc tính cao với côn trùng vì nó gắn kết tốt hơn với các thụ thể của tế bào thần kinh của côn trùng. Đường tiếp xúc qua da có độc tính thấp, có thể gây đỏ và ngứa mắt nhẹ. Chưa có các bằng chứng về gây ngộ độc cấp tính trên người. Các nghiên cứu cũng cho thấy các chất này phân hủy nhanh trong đường tiêu hóa và loại trừ qua phân, nước tiểu trong vòng 48 giờ.

4

2.1.4. Azoxystrobin (Bursic Vojislava and Lazic Sanja, 2012)

2.1.4.1. Khái niệm

Azoxystrobin là một loại thuốc diệt nấm phổ rộng có hoạt tính chống lại một số bệnh trên nhiều cây ăn quả và cây cảnh nhằm mục đích ngăn ngừa các bệnh ở lúa, nấm

mốc, rụng lá …gây hại ảnh hưởng đến năng suất trồng trọt.

2.1.4.2. Cấu tạo

- Tên chung quốc tế: Azoxystrobin - Công thức phân tử: C22H17N3O5 - Khối lượng phân tử: 403,4 g/mol - Danh pháp IUPAC: Methyl (E)-2-[2-[6-(2-cyanophenoxy)pyrimidin-4-

Hình 2.2. Cấu trúc của azoxystrobin

yl]oxyphenyl]-3-methoxyprop-2-enoate. - Loại HCBVTV: thuốc trừ nấm - Nhóm: methoxyacrylates

2.1.4.3. Tính chất vật lý và hóa học (Rao Nageswara, 2012)

- Dạng bột tinh thể màu trắng - Nhiệt độ nóng chảy ở 116 oC - Tỷ trọng: 1.25 g/cm3 (ở 25 ºC) - Độ ổn định: ổn định trong điều kiện bảo quản được khuyến cáo - Độ hòa tan: Tan trong các dung môi như: hexane, methanol, toluen, acetone,

ethyl acetat, acetonitril, dichloromethane, nước ở nhiệt độ 20oC.

- Phân hủy khi đun nóng ở nhiệt độ cao, sinh ra khí độc nitrogen oxide (N2O)

2.1.4.4. Độc tính của azoxystrobin (Sh.A.Ashorkr, 2006)

Theo tác giả T.Nageswara Rao và cộng sự năm 2012 đã khảo sát độc tính của

azoxystrobin qua các thí nghiệm trên các động vật thí nghiệm như bảng sau:

5

Bảng 2.2. Thông tin về độc tính cấp của azoxystrobin

Động vật thí nghiệm Đường dùng Kết quả

LD50 > 2000 mg / kg. Chuột đực uống Không có tác dụng phụ

LD50 > 2000 mg / kg Chuột đực và cái da Không có tác dụng phụ

LC50 tương đương 0,38 mg /l trong Chuột đực và cái hít không khí

da Thỏ đực Không gây kích ứng trên da

Thỏ đực và cái mắt Không gây kích ứng trên da

 Liều dùng cho phép mỗi ngày (ADI) trong khẩu phần ăn hằng ngày ở người có

chứa azoxystrobin khoảng 0-0,2 mg/ kg một ngày (T.Nageswara Rao và cộng sự, 2012).

2.1.4.5. Cơ chế tác động (T.Nageswara Rao và cộng sự, 2012).

Azoxystrobin là một chất diệt nấm phổ rộng thuộc nhóm methocyacrylate.

Được bắt nguồn từ các strobilurin tự nhiên xảy ra. Nó hoạt động với chất diệt nấm

bằng cách ức chế ty thể trong nấm. Chúng tạo thành một lớp bảo vệ trên bề mặt thực

vật và ức chế sự phát triển của bào tử nấm.

2.1.5. Các loại hóa chất bảo vệ thực vật chứa imidacloprid và azoxystrobin

- Danh mục thuốc có chứa imidacloprid: Confidor 100 SL, Actador 100WP,

Javidan 100 WP, Anvado 100WP, Conphai 10WP, Kola 700WO, Abamix 1,45SP,

Aba- plus 100EC…[32]

- Danh mục thuốc có chứa azoxystrobin: Amistar Top 250 SC, Amistar Top

325 SC, Mi stop 350 SC, Ohho 3255SC, Neoamistagold 360SC, 400SC, 450SC, 500SC, Ammisdotop 400SC, Dovatop 400SC , Paramax 400SC[34].

Các loại thuốc trên được bán rộng rãi trên cả nước, trong các đại lý thuốc trừ

sâu, hóa chất bảo vệ thực vật.

2.1.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.1.6.1. Một số phương pháp định lượng imidacloprid bằng phương pháp HPLC

Phương pháp 1(J.Serb, 2009)

6

- Cột C18 (250 cm x 4,6 mm, 5 µm) - Đầu dò UV-Vis - Pha động: acetonitril / 0,01 M dung dịch đệm phosphate (pH 3.0) với tỉ lệ

25%: 75%

- Tốc độ dòng: 1 ml/phút - Nhiệt độ 25oC - Bước sóng: 270 nm - Thể tích tiêm mẫu: 20 µl

Phương pháp 2 (Sacramento, 2002):

- Cột C18 (25 cm x 4,6 mm, 5 µm) - Đầu dò UV-Vis - Pha động: acetonitril 30% : Nước 70% - Tốc độ dòng: 1 ml/phút - Bước sóng 270 nm - Thể tích tiêm mẫu: 20 µl - Thời gian lưu của imidacloprid: 5,5 phút

Phương pháp 3 (Sprivastava, 2004):

- Cột C18 (75 cm x 4,6 mm, 3,5 µm) - Đầu dò khối phổ QuEChERS - Pha động: acetonitril 20%: Nước 80% - Tốc độ dòng: 1 ml/phút - Bước sóng: 270 nm - Thể tích tiêm mẫu: 20 µl

Phương pháp 4 (Raihanah, 2004):

- Cột C18 (25 cm x 4,6 mm, 5 µm) - Đầu dò UV-Vis - Pha động: acetonitril 20% : nước 80% - Tốc độ dòng: 1 ml/phút - Bước sóng 270 nm - Thể tích tiêm mẫu: 10 µl Các phương pháp này đã được thẩm định về độ tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ chính xác (độ lặp lại và độ chính xác trung

gian), và độ đúng (phục hồi). Phương pháp này cho kết quả phân tích tốt với độ tuyến tính có hệ số tương quan cao, độ phục hồi nằm trong giới hạn cho phép. Nên phương

pháp này có thể thực hiện trong phòng thí nghiệm.

7

2.1.6.2. Các phương pháp định lượng azoxysrobin bằng phương pháp HPLC

Phương pháp 1 (Bursic Vojilava and Lazic Sanja, 2012):

- Cột C18 (250 cm x 4,6 mm, 5 µm) - Đầu dò UV-Vis - Pha động: acetonitril 80% : nước 20% - Tốc độ dòng: 1 ml/phút - Bước sóng 255 nm - Thể tích tiêm mẫu: 20 µl - Thời gian lưu của azoxystrobin: 11,07 phút.

Phương pháp 2 (Burket and Sapiests, 2005):

- Cột RP C18 (25 cm x 4,6 mm, 5 µm) - Đầu dò UV-Vis - Pha động: acetonitril 55% : nước 45% - Tốc độ dòng: 1 ml/phút - Bước sóng 207 nm - Thể tích tiêm mẫu: 20 µl - Thời gian lưu của azoxystrobin: 8,3 phút

Phương pháp 3 (Rao Nageswara, 2012):

- Cột C18 (250 cm x 4,6 mm, 5 µm) - Đầu dò UV-Vis - Pha động: acetonitril 70% : acid formic 30% - Tốc độ dòng: 1 ml/phút - Bước sóng 240 nm - Thể tích tiêm mẫu: 20 µl

2.1.6.3. Phương pháp định lượng đồng thời hai chất imidacloprid và

azoxystrobin.

Hiện chưa có nghiên cứu nào trong và ngoài nước định lượng đồng thời hai chất imidacloprid và azoxystrobin bằng phương pháp HPLC. Nhưng đã có nghiên cứu định lượng đồng thời hai hóa chất bảo vệ thực vật khác bằng phương pháp HPLC. Ví dụ như định lượng đồng thời imidacloprid hoặc azoxystrobin với một hóa chất bảo vệ thực vật khác thuộc nhóm thuốc trừ sâu, thuốc trừ nấm hay thuốc diệt cỏ bằng phương pháp sắc ký lỏng nâng cao hay sắc ký khối phổ.

Năm 2015 tác giả Trần Cao Sơn đã nghiên cứu xác định dư lượng hóa chất vảo vệ thực vật trong dược liệu và sản phẩm từ dược liệu bằng sắc ký khối phổ. Trong

8

nghiên cứu này tác giả nêu ra một số phương pháp phân tích hóa chất bảo vệ thực vật

trong đó có cả imidacloprid và azoxystrobin bao gồm phương pháp xử lý mẫu và các

kỹ thuật dùng để phân tích. Các kỹ thuật dùng để phân tích hóa chất bảo vệ thực vật như sắc ký khí và sắc ký lỏng. Nhưng trong nghiên cứu này tác giả chọn sắc ký lỏng vì

có khả năng ứng dụng rộng, phù hợp với các dung môi phân cực như methanol,

acetonitril, nước và được sử dụng phổ biến ở Việt Nam (Trần Cao Sơn, 2015).

2.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

2.2.1. Khái niệm

HPLC là kỹ thuật phân tích dựa trên cở sở của sự phân tách các chất trên một

pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao. Sắc

ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ tùy vào loại pha tĩnh

sử dụng (Võ Thị Bạch Huệ, 2016)

2.2.2. Phân loại

Kỹ thuật phân tích HPLC bao gồm hai nhóm: sắc ký lớp mỏng áp suất cao

(HPTLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

Trong nhóm HPLC, tùy theo bản chất của quá trình sắc kí của pha tĩnh trong

cột tách mà người ta chia thành:

- Sắc kí phân bố của chất tan giữa hai pha không tan (trộn) vào nhau. - Sắc kí hấp phụ pha thường. - Sắc kí hấp phụ pha ngược hay pha đảo. - Sắc kí trao đổi ion và cặp ion. - Sắc kí rây phân tử.

2.2.3. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC (Thái Duy Thìn, 2013)

Hình 2.3: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC

9

Trong đó:

1 - Bình chứa dung môi pha động.

2 - Bộ phận khử khí.

3 - Bơm cao áp.

4 - Bộ phận tiêm mẫu (tiêm bằng syringe hay auto sampler).

5 - Cột sắc ký (pha tĩnh) để ngoài môi trường hay có thiết bị điều nhiệt.

6 - Đầu dò detector (nhận tín hiệu).

7 - Hệ thống máy tính điện tử cài đặt phần mềm nhận tín hiệu, xử lý số liệu và

điều khiển toàn bộ hệ thống.

8 - Thiết bị in dữ liệu

2.2.3.1. Bình đựng dung môi

Hiện tại máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp, cho phép chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng 1 lần để rửa giải theo tỷ lệ mong

muốn và tổng tỷ lệ dung môi của 4 đường là 100%. Tuy nhiên theo kinh nghiệm thì

chúng ta ít khi sử dụng 4 đường dung môi cùng một lúc mà chúng ta chỉ sử dụng tối đa

là 3 hoặc 2 đường để cho hệ pha động luôn được pha trộn đồng nhất hơn, hệ pha động

đơn giản hơn để quá trình rửa giải ổn định.

 Lưu ý: Tất cả các dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết và có ghi rõ trên nhãn là dùng cho HPLC hay dung môi tinh khiết phân tích. Tất cả các

hóa chất dùng để pha mẫu và pha hệ đệm phải được sử dụng là hóa chất tinh khiết

phân tích và phải lọc qua hệ thống lọc 0,2 – 0,45 µm nhằm mục đích tránh làm hỏng

cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo ra các peak tạp trong quá trình phân tích.

2.2.3.2. Bộ phận khử khí

Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi

pha động. Nếu như trong quá trình phân tích mà dung môi pha động còn sót các bọt

khí thì một số hiện tượng sau đây sẽ sảy ra:

- Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lấy không đúng sẽ làm cho thời gian

lưu của peak thay đổi.

- Trong trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì có thể Pump sẽ không hút được dung môi (bị e) khi đó áp suất không lên và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động. Trong bất cứ trường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai.

10

2.2.3.3. Bơm cao áp

Để bơm pha động vào cột tách, thực hiện quá trình sắc kí, rửa giải chất tan ra

khỏi cột sắc kí. Bơm phải điều chỉnh được áp suất (0 – 200 bar) để tạo ra được những tốc độ nhất định của pha động qua cột tách phù hợp cho quá trình sắc kí, phải có tốc độ

nằm trong vùng 0,5 – 2 ml/phút.

2.2.3.4. Bộ phận tiêm mẫu

Để đưa mẫu vào cột phân tích theo phương pháp không ngừng dòng chảy. Với dung tích của loop là 5 – 100 µl. Có 2 cách lấy mẫu vào trong cột: bằng tiêm mẫu thủ

công (tiêm bằng syringe) và tiêm mẫu tự động (auto sampler).

2.2.3.5. Cột sắc ký

Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao.

Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột khoảng 10 – 30 cm, đường kính trong 1- 10 mm, hạt chất nhồi cỡ 5 - 10 µm. Ngoài ra còn có một số

trường hợp đặc biệt về kích thước và kích cỡ hạt …

Chất nhồi cột tùy theo lọai cột và kiểu sắc ký (trong các dược điển USP 23, 24

có tiêu chuẩn hóa các lọai cột). Thông thường chất nhồi cột là silicagel (pha thường)

hoặc là silicagel đã được silan hóa hoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ (pha đảo),

ngoài ra người ta còn dùng các loại hạt khác như: nhôm oxid, polyme xốp, chất trao

đổi ion.

Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt độ cao hoặc thấp

hơn nhiệt độ phòng thì cột được đặt trong thiết bị điều nhiệt.

 Lưu ý: Tuyệt đối không đánh siêu âm vì sẽ làm hư cột.

2.2.3.6. Đầu dò

Đầu dò (hay còn gọi là detector) là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi

cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng. Tùy theo tính chất của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại detector thích hợp và

phải thoả mãn điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định của chất phân tích.

Tất nhiên phải tuỳ theo chất phân tích mà chọn loại detector nào cho phù hợp để đạt được độ nhạy cao khi phát hiện các chất, cũng như khi định lượng chúng. Hiện nay, detector hấp thụ quang phân tử vùng phổ hay UV-Vis đang được dùng phổ biến nhất vì nó thích hợp cho nhiều loại chất và lại ko quá đắt.

2.2.3.7. Bộ phận ghi tín hiệu

Để ghi tín hiệu phát hiện do detector truyền sang.

11

+ Trong các máy thế hệ cũ thì sử dụng máy ghi đơn giản có thể vẽ sắc ký đồ,

thời gian lưu, diện tích của peak, chiều cao….

+ Các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm chạy trên máy tính nó có thể lưu tất cả các thông số, phổ đồ và các thông số của peak như tính đối xứng, hệ số phân giải...

trong quá trình phân tích đồng thời xử lý, tính toán các thông số theo yêu cầu của

người sử dụng như: nồng độ, RSD…

2.2.3.8. Thiết bị in dữ liệu

Sau khi đã phân tích xong các mẫu ta sẽ in kết quả do phần mềm tính toán ra

giấy để hoàn thiện hồ sơ.

2.2.4. Nguyên tắc của quá trình sắc kí trong cột (Võ Thị Bạch Huệ, 2016)

Mẫu phân tích được hòa tan trong một pha động. Pha này có thể là một chất

khí, chất lỏng hoặc chất lỏng siêu tới hạn được cho qua pha tĩnh một cách liên tục và không hòa lẫn với nó. Pha tĩnh được cố định trong cột hay trên bề mặt chất rắn. Các

chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển qua cột theo pha động với tốc độ khác

nhau tùy thuộc vào tương tác giữa pha tĩnh, pha động và chất tan. Nhờ tốc độ di

chuyển khác nhau, các thành phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành dải, làm cơ sở cho

phân tích định tính và định lượng.

Pha tĩnh được nhồi vào cột tách theo một kĩ thuật nhất định và là yếu tố quyết

định bản chất của quá trình sắc ký.

Có 4 kỹ thuật sắc ký căn bản: Sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, trao đổi ion và

sắc ký rây phân tử. Trong đó sắc ký phân bố được sử dụng nhiều nhất trong kiểm

nghiệm.

2.2.5. Sắc ký phân bố hiệu năng cao (Trần Tử An và Thái Nguyễn Hùng Thu, 2007)

Sắc ký phân bố là phương pháp phân tách dựa trên độ khác biệt về phân bố của

các cấu tử giữa pha tĩnh và pha động. Sắc ký phân bố được chia làm 2 loại tùy thuộc vào pha tĩnh: sắc ký lỏng - lỏng và sắc ký pha liên kết.

 Pha tĩnh:

Sắc ký lỏng - lỏng: Pha tĩnh gồm một lớp mỏng pha lỏng hữu cơ bao trên bề mặt các tiểu phân chất mang silica hoặc các chất liệu khác. Các tiểu phân này thường có đường kính từ 3 đến 10 µm (kích thước hạt có thể đến 50 µm hoặc lớn hơn trong sắc ký điều chế). Pha tĩnh kiểu này có nhược điểm là: bị rửa trôi dần theo dòng pha

động, hiệu lực cột sẽ giảm dần trong quá trình sử dụng.

Sắc ký pha liên kết: Pha tĩnh được liên kết hóa học với chất mang nên khắc

12

phục được nhược điểm của sắc ký lỏng - lỏng. Trong pha tĩnh loại này, các nhóm chức

hữu cơ liên kết với bề mặt của các tiểu phân silica qua nhóm silanol. Tính phân cực

của loại pha tĩnh này phụ thuộc vào tính phân cực của các nhóm chức liên kết.

 Pha động

Pha động trong sắc ký phân bố có thể là dung môi đơn hay hỗn hợp nhiều dung

môi. Người ta có thể thay đổi độ phân cực của pha động bằng cách thay đổi tỷ lệ các

thành phần dung môi.

Tùy thuộc vào việc sử dụng pha động và pha tĩnh, người ta chia sắc ký phân bố

thành 2 loại: sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo.

- Sắc ký pha thuận: Hệ bao gồm pha tĩnh phân cực và pha động không phân cực được gọi là sắc ký pha thuận. Dung môi pha động thường là các hydrocacbon mạch

thẳng như: pentan, hexan, heptan…Trong sắc ký pha thuận các chất không phân cực sẽ

được rửa giải sớm, thứ tự rửa giải sẽ chậm dần theo chiều tăng của độ phân cực của

các thành phần trong mẫu thử.

- Sắc ký pha đảo: Hệ pha động phân cực và pha tĩnh không phân cực gọi là sắc

ký pha đảo. Đây là phương pháp được sử dụng nhiều nhất trong kiểm nghiệm. Chất

càng tan tốt trong dung môi phân cực thì càng được rửa giải sớm. Dung môi pha động

thường là: nước, methanol, acetonitril…Việc đuổi khí hòa tan trong pha động rất quan

trọng trong sắc ký pha đảo.

2.2.6. Các thông số đặc trưng trong HPLC (Trần Tử An, 2007)

2.2.6.1. Thời gian lưu tR

Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi bơm mẫu vào cột cho đến khi

chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại. Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các

chất khác nhau thì thời gian lưu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện sắc ký đã chọn.

Vì vậy thời gian lưu là đại lượng để phát hiện định tính các chất. Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố:

 Bản chất sắc ký của pha tĩnh.  Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động.  Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan.  Trong một số trường hợp thời gian lưu còn phụ thuộc vào pH của pha động.

Trong một phép phân tích nếu tR’ nhỏ quá thì sự tách kém, còn nếu tR’ quá lớn thì peak bị doãng và độ lặp lại của peak rất kém, thời gian phân tích rất dài đồng thời kéo theo nhiều vấn đề khác như hao tốn dung môi, hoá chất, độ chính xác của phép phân tích kém. Để thay đổi thời gian lưu chúng ta dựa vào các yếu tố mà tR phụ thuộc.

13

Hình 2.4. Sắc ký đồ thời gian lưu của chất A và chất B

2.2.6.2. Hệ số phân bố K

Tốc độ di chuyển của chất tan qua pha tĩnh được xác định bởi hệ số phân bố K:

Trong đó: Cs là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh (mol/l)

CM là nồng độ mol của chất tan trong pha động (mol/l)

Hệ số K phụ thuộc bản chất của pha động, pha tĩnh và chất hòa tan. Trị số K

càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm. Nếu các chất trong hỗn

hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều, thì khả năng tách diễn ra càng dễ dàng hơn.

2.2.6.3. Hệ số dung lượng K’

Hệ số dung lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong hai

pha động với sức chứa cột tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở trong thời điểm cân bằng.

Nếu K’ nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém. Nếu K’ lớn thì peak bị doãng.

Trong thực tế K’ từ 1 - 5 là tối ưu.

14

2.2.6.4. Hệ số tách α

Hệ số tách α (hay còn gọi là thời gian lưu tương đối của hai chất A và B) là đại

lượng đánh giá khả năng tách hai chất bằng phương pháp sắc ký. Nó phụ thuộc vào hệ số phân bố và là tỉ số của hệ số phân bố của hai chất.

Điều kiện cần thiết để hai chất A, B tách khỏi nhau là α ≠ 1

2.2.6.5. Số đĩa lý thuyết

Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc

ký nhất định. Mỗi đĩa lý thuyết trong cột săc ký giống như là một lớp pha tĩnh có chiều

cao là H. Tất nhiên lớp này có tính chất động tức là một khu vực của hệ phân tách mà

trong đó một cân bằng nhiệt động học được thiết lập giữa nồng độ trung bình của chất

tan trong pha tĩnh và pha động. Bề dày H phụ thuộc vào nhiều yếu tố:

 Đường kính và độ hấp phụ của hạt pha tĩnh  Tốc độ và độ nhớt (độ phân cực) của pha động  Hệ số khuếch tán của các chất trong cột.

Vì vậy với một điều kiện sắc ký xác định thì chiều cao H cũng hằng định đối

với một chất phân tích và số đĩa lý thuyết của cột cũng được xác định. Số đĩa lý thuyết

được tính theo công thức sau:

Trong đó: tR là thời gian lưu của chất phân tích.

W0,5 là độ rộng tại ½ của peak.

Trong thực tế N nằm trong khoảng 2500 đến 5500 là vừa đủ.

2.2.6.6. Độ phân giải RS

Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc ký đã cho. Độ phân giải của hai peak cạnh nhau phải được tính theo công

thức sau:

15

Trong đó: tRA, tRB: thời gian lưu của hai peak liền kề nhau

WB, WA: độ rộng pic đo ở các đáy peak

Trong thực tế nếu các peak cân đối thì độ phân giải tối thiểu để hai peak tách

nhau là RS = 1,0. Trong phép định lượng RS = 1,5 là phù hợp.

Nếu R càng lớn thì hai chất A và B càng tách ra xa nhau, nếu hai chất này tách

nhau quá xa làm cho đường nền càng kéo dài thì cũng không cần thiết. Vì như thế tốn nhiều dung môi (pha động) để rửa giải các chất hơn. Do đó giá trị RS chỉ vừa đủ để

tách hoàn toàn hai chất ra khỏi nhau là tốt. Nghĩa là chỉ cần hai peak vừa tách ra khỏi hẳn nhau dứt khoát là được.

2.2.6.7. Các hệ số liên quan tới đối xứng của pic sắc ký

Để đánh giá tính đối xứng của pic sắc ký người ta dùng các đại lượng:

 Hệ số bất đối AF:

Trong đó: a: nửa chiều rộng phía trước peak

b: nửa chiều rộng phía sau peak

(cả a và b được đo ở 1/10 chiều cao peak)

Giá trị AF càng gần 1, peak càng đối xứng.

 Hệ số kéo đuôi AS

- Với a và b đo ở 1/20 chiều cao peak - Nếu AS càng lớn hơn 1, peak kéo đuôi càng nhiều, peak càng mất cân đối. - Hệ số kéo đuôi của peak chính phải trong khoảng 0,8 - 1,5 (0,8 ≤ AS ≤ 1,5).

2.2.7. Phương pháp chọn điều kiện sắc ký

Muốn có một kết quả tốt nhất ta phải tìm được các điều kiện sắc ký tốt nhất cho

một hỗn hợp mẫu, các điều kiện đó bao gồm:

Pha tĩnh:

16

- Loại pha tĩnh. - Kích thước cột.

Pha động:

- Thành phần và tỷ lệ, pH, tốc độ dòng, nhiệt độ… nếu là chương trình rửa giải

isocratic.

- Thành phần và tỷ lệ, pH, tốc độ dòng, nhiệt độ và chương trình dung môi…

nếu là chương trình rửa giải gradient.

2.2.7.1. Lựa chọn pha tĩnh

Dựa vào các tài liệu, dược điển, thành phần và tính chất của các chất có trong

mẫu phân tích; ta lựa chọn cột sắc ký phù hợp có thể là cột pha thường, cột pha đảo

hay các loại cột khác nhau….

Thông thường ta dùng 2 loại cột pha thường (NP) và cột pha đảo (RP).

 Cột pha thường (NP): Silicagel trung tính. Pha tĩnh loại cột này dùng để tách các chất có độ phân cực thấp hay trung bình. Trên bề mặt hoạt động của nó có chứa

các nhóm – OH phân cực ưa nước.

 Cột pha đảo (RP): Silicagel đã alkyl hóa. Pha tĩnh loại cột này dùng để tách các chất không phân cực, ít phân cực, các chất phân cực có thể tạo cặp ion. Trên bề

mặt hoạt động các nhóm – OH đã bị alkyl hóa tức là thay thế nguyên tử H bằng các

mạch carbon thẳng (C8 hay C18 tương đương RP-8 hay RP-18) hay các mạch carbon

vòng (phenyl- tương đương cột phenyl). Vì thế nó ít phân cực hay phân cực rất ít.

2.2.7.2. Lựa chọn pha động

Dựa vào các tài liệu, dược điển, thành phần và tính chất của các chất có trong mẫu phân tích; ta lựa chọn pha động phù hợp để cho quá trình rửa giải tách hoàn toàn

các chất có trong mẫu đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn của peak đã trình bày đồng thời

phải có thời gian phân tích phù hợp nhằm tiết kiệm được dung môi, hóa chất, thời gian phân tích mẫu, giảm thiểu sự hoạt động của thiết bị. Pha động có thể làm thay đổi:

+ Độ chọn lọc α.

+ Thời gian lưu.

+ Hiệu năng tách của cột.

+ Độ phân giải.

+ Tính đối xứng của peak.

Do đó, trong một pha tĩnh đã chọn nếu ta chọn được pha động có thành phần

phù hợp thì ta sẽ có hiệu suất tách sắc ký tốt nhất đối với hỗn hợp các chất cần phân 17

tích. Chính vì vậy pha động cần có cầu yêu cầu sau:

- Pha động phải trơ với pha tĩnh. Không được làm cho pha tĩnh bị biến đổi hóa

học ( ví dụ giá trị pH: 2,5 < pH < 8,5).

- Pha động phải hòa tan được các chất phân tích thì mới rửa giải được chúng đặc biệt phải chú ý khi thay đổi pha động phải rửa cột bằng dung môi phù hợp để

không làm tủa các chất có trong cột, hay pha động có sẵn trong cột. Ví dụ: đệm

phosphat rửa ngay bằng ACN hay MeOH sẽ bị kết tủa trên cột.

- Pha động phải bền vững theo thời gian: càng bền lâu càng tốt nhưng ít nhất là

pha động không bị phân hủy trong suốt thời gia phân tích mẫu.

- Phải có độ tinh khiết cao: dung môi cho HPLC, hoá chất tinh khiết phân tích. - Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký. - Phải phù hợp với loại detector: detector UV-Vis thì dung môi không được hấp thụ quang (ví dụ: acid acetic hấp thụ ở bước sóng thấp < 220 nm). Detector huỳnh

quang thì dung môi không được phát quang.

- Phải kinh tế, không quá hiếm và đắt. Trong hệ sắc ký hấp phụ pha đảo (RP - HPLC), pha động là dung môi phân cực: nước, ACN, MeOH, acid hay base hữu cơ và

một vài amin hay acid amin …

- Ngoài các dung môi chính thì trong thành phần pha động trong rất nhiều trường hợp tách RP- HPLC còn có thêm hỗn hợp đệm để ổn định pH. Chất tạo phức,

tạo cặp ion để tạo ra sự rửa giải tốt nhất.

 Khi chọn dung môi ta thường dựa vào lực rửa giải E của dung môi theo

bảng sau:

Bảng 2.3. Lực rửa giải của một số dung môi

Dung môi Lực rửa giải E

n-Hexan 0,1

Tetrachlorua carbon 1,6

Toluen 2,4

Methanol 5,11

Acetonitril 10,20

Việc lựa chọn điều kiện sắc ký là công việc hết sức cần thiết trong quá trình xây dựng chương trình sắc ký. Chỉ khi lựa chọn điều kiên sắc ký tốt, phù hợp thì chúng ta mới có thể định tính, định lượng được các lọai hóa chất một cách nhanh chóng và hiệu

18

quả cao. Tất nhiên phần lý thuyết nói rất nhiều về các phương pháp chọn điều kiện sắc

ký, tuy nhiên để chọn được chương trình sắc ký tốt đòi hỏi phải có thời gian, tài liệu và

một phần kinh nghiệm của những người làm sắc ký.

2.2.8. Các bước tiến hành sắc ký (Võ Thị Bạch Huệ, 2012)

2.2.8.1. Chuẩn bị dụng cụ và máy móc

Máy HPLC phải được kiểm chứng theo định kỳ để bảo đảm máy họat động tốt,

cho kết quả phân tích có độ đúng, độ lặp lại, tuyến tính, tỷ lệ dung môi, tốc đô dòng, năng lượng đèn UV… đúng theo yêu cầu thông số của máy do nhà sản xuất đặt ra.

Cột sắc ký phải được kiểm tra về số đĩa lý thuyết theo định kỳ hay khi có nghi

ngờ về khả năng tách và rửa đúng quy định sau mỗi lần chạy sắc ký:

Ví dụ: Sắc ký pha thường NP-HPLC: Rửa bằng methanol; không rửa bằng

nước. Còn sắc ký pha đảo RP-HPLC: khi chạy pha động có các loại muối thì phải rửa nước trước cho sạch.Tỷ lệ ACN hay methanol: Nước là 50%: 50% cho sạch hết các

chất còn đọng lại trong cột đồng thời để bảo vệ cột không bị mốc khi để lâu. Tuyệt đối

tránh tình trạng chỉ rửa bằng nước 100% sau đó để cột một thời gian không sử dụng

chắc chắn cột sẽ bị mốc, hỏng không thể dùng được.

 Lưu ý: Nếu rửa cột không tốt thì kết quả chạy sắc ký sẽ không thể đáp ứng

được các yêu cầu phân tích.

2.2.8.2. Chuẩn bị dung môi pha động

Các dung môi dùng cho sắc ký là loại tinh khiết dành cho HPLC. Các hóa chất

dùng phải là loại tinh khiết phân tích. Pha dung môi đúng, chính xác theo đúng tỷ lệ đã

nêu, để ổn định dung môi đúng thời gian theo chuyên luận đã yêu cầu

2.2.8.3. Chuẩn bị mẫu đo HPLC

 Mẫu thử: Xử lý mẫu thử theo đúng chuyên luận, quy trình theo nguyên tắc sau: - Dung môi hòa tan hoạt chất phải hòa tan trong pha động, trong nhiều trường

hợp dùng dung môi pha động để hòa tan mẫu.

- Phải loại bỏ các chất không tan trong pha động hoặc không rửa giải được

bằng cách lọc hay chiết ….

- Phải lọc và ly tâm, lọc mẫu qua màng lọc 0,2 – 0,45 μm. - Nồng độ mẫu ở mức vừa phải, không vượt quá khả năng tách của cột. Có thể

gây ra nghẽn cột.

 Mẫu chuẩn:

Pha dung dịch chuẩn có thành phần giống như mẫu thử trong cùng dung môi,

riêng về nồng độ các thành phần giống như mẫu thử là tốt nhất, ngoài ra có thể dùng 19

nồng độ khác nhưng phải nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát của từng thành phần.

2.2.8.4. Cách vận hành thiết bị

Mỗi máy có cách vận hành khác nhau tùy thuộc vào hãng sản xuất, phần mềm điều

khiển hệ thống sắc ký HPLC. Tuy nhiên cách vận hành luôn phải theo nguyên tắc sau:

- Chạy máy với dung môi pha động để đuổi hết bọt khí có trong hệ thống ống

dẫn trước khi cho vào cột.

- Đặt đầy đủ các điều kiện sắc ký như:

 Cấu hình máy

 Tỷ lệ các dung môi pha động

 Bước sóng, thành phần mẫu, các thông số của quá trình phân tích yêu cầu.

20

CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ

3.1.1. Hóa chất

3.1.1.1. Chất chuẩn

- Chất chuẩn: imidacloprid và azoxystrobin. - Nhà sản xuất: Sigma Aldrish - Hàm lượng: imidacloprid: 99,82%

azoxystrobin: 99,60%

3.1.1.2. Dung môi

Bảng 3.1. Danh mục dung môi tinh khiết chuyên dùng cho HPLC

STT Tên dung môi Nhà sản xuất Tiêu chuẩn

1 Acetonitril Đức Dùng cho HPLC

2 Methanol Đức Dùng cho HPLC

3 Nước cất hai lần ĐH Cần Thơ Dùng cho HPLC

3.1.2. Dụng cụ - Thiết bị

3.1.2.1 Thiết bị

Bảng 3.2. Danh mục máy móc - thiết bị phục vụ cho đề tài nghiên cứu

STT Loại thiết bị Tên thiết bị Hãng sản xuất

1 Bơm cao áp Pump Germany

2 Bộ loại khí cho dung môi Vacuum Degasser Germany

3 Thiết bị tiêm mẫu Syringe 100µl Hamilton

4 Thiết bị nạp mẫu Injector 20µl USA

5 Cột sắc ký Columns Germany

RP-18, 250x4,6 mm,

kích thước hạt 5µm

6 Thiết bị ghi tín hiệu UV/Vis Detector Germany

21

STT Loại thiết bị Tên thiết bị Hãng sản xuất

7 Glassico India

Bộ lọc dung môi dùng giấy lọc 0,45µm

8 Máy rút chân không Neuburger Germany

9 Máy đánh siêu âm S100H Elmasonic Germany

10 Cân phân tích Balances and Precious USA

Metal scales

11 Bộ lọc nước Dùng cho HPLC

3.1.2.2. Dụng cụ

- Bình định mức 100 ml, 50 ml, 25 ml, 10 ml. - Pipet chính xác: 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 20 ml, 25 ml. - Cốc thủy tinh 50 ml, 100 ml. - Ống nhỏ giọt, bình tia. - Bơm tiêm, vial

3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời imidacloprid và azoxystrobin

bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao như sau:

 Lựa chọn điều kiện sắc ký

- Lựa chọn cột sắc ký - Lựa chọn pha động và các điều kiện pha động - Tốc độ dòng, thể tích tiêm - Lựa chọn bước sóng phát hiện

 Đánh giá chương trình sắc ký đã xây dựng bằng cách thẩm định quy trình

- Độ thích hợp của hệ thống sắc ký - Độ đặc hiệu - Khoảng tuyến tính giữa nồng độ và diện tích peak - Độ lặp lại - Độ đúng

22

3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.3.1. Chuẩn bị dung dịch

 Chuẩn bị dung môi pha mẫu - Qua nghiên cứu tính chất hóa lý của các chất nghiên cứu, kết hợp với các tài

liệu tham khảo, khảo sát lựa chọn ra dung môi pha mẫu thích hợp.

- Tiến hành pha dung môi pha mẫu để phục vụ cho quá trình phân tích

 Chuẩn bị dung dịch gốc và dung dịch mẫu chuẩn Để có thể định lượng được imidacloprid và azoxystrobin, việc chuẩn bị dung dịch gốc và các mẫu chuẩn là rất cần thiết. Qua nghiên cứu tính chất hóa lý của các

chất nghiên cứu, kết hợp các tài liệu tham khảo lựa chọn ra dung môi pha và bảo quản

dung dịch chuẩn gốc.

3.3.2. Khảo sát điều kiện tối ưu cho hệ thống sắc ký (Vũ Thị Quỳnh, 2013)

3.3.2.1. Chọn cột

Trên thị trường có rất nhiều hãng sản xuất cột sắc ký pha đảo C8 và C18 …. Tuy

nhiên cột RP –18 được sử dụng rộng rãi trong ngành kiểm nghiệm dược phẩm nhờ danh

tiếng thương hiệu, chất lượng cột cũng như tính kinh tế so với các loại cột khác.

Hiện nay, phòng thí nghiệm có trang bị loại cột này và được kỹ thuật viên

thường xuyên kiểm tra, đánh giá tình trạng. Vì vậy, ta chọn cột RP – 18, kích thước

hạt 5 μm, 250 x 4,6 mm cho phép định lượng này.

3.3.2.2. Chọn bước sóng cho detector

Trong phép phân tích đồng thời, việc lựa chọn bước sóng rất quan trọng vì nó

quyết định tới độ nhạy của phép phân tích. Do phương pháp phân tích là HPLC sử dụng đầu dò là detector UV-Vis cố định bước sóng, ta cần khảo sát điều kiện nhằm

chọn bước sóng tối ưu để phân tích đồng thời các chất.

Dựa vào tài liệu tham khảo và cực đại hấp thụ của imidacloprid và azoxystrobin ta chọn các bước sóng tiêu biểu. Sau đó tiến hành khảo sát bước sóng trên thiết bị

HPLC lần lượt tại các bước sóng λ bằng 220 nm, 250 nm, 255 nm, 260nm. Bên cạnh

đó sử dụng máy UV-VIS SHIMADZU quét phổ khoảng từ 200-400nm để phát hiện ra bước sóng tối ưu nhất cho cả hai chất imidacloprid và azoxystrobin.

Căn cứ phổ đồ thu được, kết hợp các tài liệu tham khảo và tiến hành khảo sát để

lựa chọn bước sóng phát hiện phù hợp

3.3.2.3. Khảo sát bước sóng trên thiết bị HPLC

Dựa vào kết quả thực nghiệm ở mục 3.3.2.3 ta tiến hành tiêm mẫu là hỗn hợp

23

azoxystrobin và imidacloprid nồng độ 50 ppm vào hệ thống HPLC với điều kiện như sau:

- Cột tách: RP – 18, 5 μm, 250 x4,6 mm. - Pha động: C: acetonitril (CH3CN); D: Nước - Thời gian: 0 – 20 phút, 55%C: 45%D. - Nồng độ mẫu: 50 ppm. - Tốc độ dòng: 1 ml/phút. - Detector: UV- Vis đặt tại các bước sóng 220 nm, 250 nm, 255 nm, 260nm. - Thể tích vòng mẫu: 20 µl.

3.3.2.4. Khảo sát thành phần pha động

Tỷ lệ thành phần dung môi tạo ra pha động có ảnh hưởng lớn đến quá trình rửa

giải các chất mẫu ra khỏi cột. Trong phân tích HPLC, khái niệm lực rửa giải là đặc

trưng cho quá trình sắc kí. Khi tỷ lệ thành phần pha động thay đổi thì lực rửa giải của dung môi pha động thay đổi, nghĩa là làm thay đổi thời gian lưu của các chất phân tích

qua đó làm thay đổi hệ số lưu của chất phân tích đó. Vì vậy để có được tỷ lệ thành

phần pha động phù hợp cần tiến hành khảo sát hệ sắc kí với tỷ lệ thành phần pha động

khác nhau với các điều kiện sắc kí như nhau:

- Cột tách: RP – 18, 5 μm, 250 x 4,6 mm. - Thể tích vòng mẫu: 20 μl - Nồng độ chất phân tích: 50 ppm. - Tốc độ dòng: 1 ml/phút. - Pha động: C: acetonitril (CH3CN); D: nước - Thời gian: 0 -20 phút - Detector: UV- Vis đặt ở bước sóng λ = 250 nm

Khảo sát pha động bằng cách thay đổi thành phần pha động (gradient) lần lượt

với tỷ lệ như sau:

Bảng 3.3. Tỷ lệ thành phần pha động của acetonitril và nước

Acetonitril (%) Nước (%)

95 10

90 5

85 15

80 20

24

Acetonitril (%) Nước (%)

60 40

55 45

50 50

40 60

3.3.2.5. Khảo sát tốc độ dòng

Tốc độ pha động cũng là yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sắc ký vì nó ảnh hưởng

đến quá trình thiết lặp cân bằng của chất tan giữa pha tĩnh và pha động. Tốc độ dòng

quá nhỏ sẽ làm dãn rộng chân peak, thời gian rửa giải lâu hơn. Tuy nhiên nếu tốc độ

dòng quá lớn có thể làm cho các chất trong hỗn hợp không tách khỏi nhau hoàn toàn,

nghĩa là gây ra hiện tượng chồng chéo peak lên nhau. Vì vậy cần phải khảo sát để tìm

ra tốc độ dòng phù hợp với hệ phân tích.

- Cột tách: RP – 18, 250 x 4,6 mm, kích thước hạt 5 μm - Pha động: C: acetonitril (CH3CN); D: nước - Thời gian: 0 – 20 phút, 55%C: 45%D. - Nồng độ chất phân tích: 50 µg/ml. - Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút; 0,8 ml/phút; 1 ml/phút; 1,2 ml/phút; 1,5ml/phút - Detector: UV- Vis đặt ở bước sóng λ = 250 nm. - Thể tích vòng mẫu: 20 μl

3.3.3. Thẩm định phương pháp (ICH, 1996)

 Định nghĩa: Thẩm định quy trình phân tích là quá trình thiết lập bằng thực nghiệm các thông số đặc trưng của phương pháp để chứng minh quy trình phân tích đó có phù hợp và có đáp ứng yêu cầu phân tích dự kiến. Khi tiến hành thử nghiệm các sai số mắc phải là rất nhỏ và chấp nhận được (Bộ y tế, 2009)

 Mục đích: - Giúp thực hiện các chỉ tiêu kiểm nghiệm trong tiêu chuẩn kiểm nghiệm. - Là công việc bắt buộc có tính chất định kỳ nhằm đảm bảo phương pháp phân

tích là phù hợp và kết quả phân tích đạt độ tin cậy trong suốt quá trình phân tích.

- Để đưa vào chuyên luận Dược điển hoặc tiêu chuẩn cơ sở (Bộ y tế, 2009)

3.3.3.1 Tính phù hợp hệ thống

Tiến hành sắc ký với hỗn hợp chứa mẫu chuẩn imidacloprid và azoxystrobin

với nồng độ khoảng 50 ppm, tiến hành sắc ký 6 lần.

25

Tính phù hợp hệ thống được xác định dựa trên các thông số đặc trưng của sắc

ký như: diện tích peak (S), thời gian lưu (tR), độ phân giải (RS), hệ số đối xứng (AS), số đĩa lý thuyết (N) là những thông số thường được dùng để đánh giá độ ổn định của hệ thống khi tiêm lặp lại 6 lần. Yêu cầu:

- Số đĩa lý thuyết ≥ 2000.

- Giá trị RSD của thời gian lưu ≤ 1,0% và của diện tích peak phải ≤ 2,0% (với

phép thử định lượng). Trường hợp giá trị RSD > 2%, phải có sự giải thích phù hợp. - Hệ số đối xứng của peak chính phải trong khoảng 0,8 - 1,5 (0,8 ≤ AS ≤ 1,5). - Độ phân giải giữa peak chính và peak phụ phải lớn hơn 1,5 (RS ≥ 1,5).

 Các thông số khác của píc phải đáp ứng yêu cầu chung của phương pháp

HPLC quy định trong Dược điển và quy định cụ thể trong quy trình phân tích thẩm định.

 Khảo sát tính đặc hiệu trên mẫu chuẩn

3.3.3.2. Tính đặc hiệu

Tiến hành sắc ký các loại mẫu sau đây theo quy trình phân tích:

 Mẫu trắng: dung môi pha động/dung môi hòa tan mẫu hay pha loãng mẫu.  Mẫu chuẩn: dung dịch chứa chất chuẩn imidacloprid

dung dịch chứa chất chuẩn azoxystrobin

dung dịch chứa hỗn hợp hai chất chuẩn.

Yêu cầu:

- Sắc ký đồ hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin phải cho peak có thời gian

lưu tương ứng với thời gian lưu trên sắc ký đồ của riêng tưng chất chuẩn.

- Sắc ký đồ của mẫu trắng, dung dịch mẫu nền không xuất hiện píc ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn. Nếu có đáp ứng pic

phải ≤ 1,0%, so với đáp ứng của pic mẫu chuẩn.

Để quy trình định lượng có ý nghĩa trong ứng dụng thực tế ta nên thực hiện

khảo sát độ đặc hiệu trên mẫu giả định.

 Khảo sát tính đặc hiệu trên mẫu giả định Tiến hành sắc ký các loại mẫu sau đây theo quy trình phân tích  Mẫu trắng: dung môi pha động/dung môi hòa tan mẫu hay pha loãng mẫu.  Mẫu chuẩn: dung dịch chứa chất chuẩn imidacloprid

dung dịch chứa chất chuẩn azoxystrobin

dung dịch chứa hỗn hợp hai chất chuẩn.  Mẫu giả định: dịch chiết dược liệu (không có chất cần phân tích) đã được

cho thêm chất chuẩn hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin

26

 Ghi lại sắc ký đồ. Xác định thời gian lưu của hoạt chất cần phân tích; độ tinh

khiết của peak hoạt chất cần phân tích trong sắc ký đồ mẫu giả định.

Yêu cầu: - Sắc ký đồ trong dung dịch mẫu giả định cho peak có thời gian lưu khác nhau không có ý nghĩa thống kê với peak của chất chuẩn trong sắc ký đồ các mẫu chuẩn. Trên

sắc ký đồ mẫu giả định: peak của các chất cần phân tích phải tách nhau hoàn toàn.

- Sắc ký đồ của mẫu trắng, dung dịch mẫu nền không xuất hiện peak ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn. Nếu có đáp ứng peak

phải ≤ 1,0%, so với đáp ứng của peak mẫu chuẩn.

- Peak của chất cần phân tích trong sắc ký đồ mẫu giả định phải tinh khiết.

3.3.3.3. Xác định giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ

Trong một quy trình phân tích bất kỳ, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn

định lượng (LOQ) là hai thông số quan trọng.

 Giới hạn phát hiện (LOD) là giá trị nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích có nghĩa so với tín hiệu mẫu trắng hay

tín hiệu của đường nền.

 Giới hạn định lượng (LOQ) được xem là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích có nghĩa định lượng so

với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền.

Để xác định LOD và LOQ của thiết bị, ta tiến hành như sau:

- Pha loãng từ 5 - 7 lần mẫu chuẩn chứa hỗn hợp imdacloprid và azoxystrobin

nồng độ 10 ppm và chuẩn bị một mẫu trắng (chứa dung môi pha động).

- Tiêm vào thiết bị HPLC và ghi kết quả.  Sắc ký đồ nào thể hiện chiều cao peak khoảng gấp 3 lần đường nền thì nồng

độ của mẫu chuẩn đó chính là giới hạn phát hiện LOD của thiết bị.

 Giới hạn định lượng được suy ra từ công thức:

3.3.3.4. Tính tuyến tính

Khoảng nồng độ tuyến tính là một thông số quan trọng của quy trình phân tích. Một chất chỉ có thể định lượng tốt theo phương pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn khi nồng độ của chất phân tích nằm trong khoảng tuyến tính.

- Khảo sát khoảng tuyến tính từ 20-160% của nồng độ đo. Tiến hành pha 5 dung dịch (ứng với 5 nồng độ 40%, 80%, 100%, 120%, 160%), thực hiện tiêm 3 lần cho mỗi mẫu.

- Tiêm vào hệ thống HPLC với điều kiện tối ưu đã được khảo sát ở mục 3.3.2

27

- Ghi lại sắc ký đồ và xác định diện tích peak trung bình của mỗi mẫu. Dùng phần mềm Microsoft Excel 2003 vẽ đồ thị biểu diễn và thiết lập phương trình hồi quy

của diện tích pic theo nồng độ.

Yêu cầu:

Hệ số tương quan (r) phải ≥ 0,997 (hay R2 ≥ 0,995). Trường hợp r < 0,997 phải

có sự giải thích phù hợp.

3.3.3.5. Độ chính xác

Độ chính xác của phương pháp thể hiện ở độ lặp lại và độ chính xác trung gian.

 Độ lặp lại của phép đo

Đô ̣ lă ̣p la ̣i của hệ thống sắc ký được khảo sát bằng cách tiêm lặp lại 6 lần cùng một mẫu chuẩn hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin (có nồng độ nằm trong khoảng

tuyến tính) vào hệ thống sắc ký với điều kiện tối ưu đã được khảo sát ở mục 3.3.2.

Kết quả được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn (SD), độ lệch chuẩn tương đối

(RSD) của diện tích peak sắc ký S peak và thời gian lưu tR.

 Yêu cầu: Với phép thử định lượng: Giá trị RSD ≤ 2,0%. Các trường hợp giá

trị RSD trên 2%, cần phải có sự giải thích phù hợp.

 Độ chính xác trung gian Tiến hành như độ lặp lại và làm trong 3 ngày khác nhau cùng với điều kiện và

người thực hiện.

Yêu cầu: Gía trị RSD từ 6 mẫu chuẩn trong một ngày và 6 mẫu chuẩn trong

ngày khác đều có RSD ≤ 2,0%.

3.3.3.6. Độ đúng (tỷ lệ hồi phục %)

Thực hiện ở ba mức nồng độ 80%, 100% và 120% của nồng độ đo. Mỗi mức

pha ba dung dịch, mỗi dung dịch tiến hành sắc ký một lần. Tính diện tích peak và dựa

vào phương trình hồi quy suy ra nồng độ tìm thấy. So với nồng độ khi pha sẽ tính ra tỷ lệ phục hồi. Xác định độ đúng của phương pháp theo công thức tính tỷ lệ phục hồi:

Trong đó:

- Ms: Nồng độ khi pha (g/ml)

- Mt: Nồng độ tìm thấy (g/ml) từ phương trình hồi quy của đường tuyến tính

Yêu cầu:

- Tỷ lệ thu hồi ở mỗi mức nồng độ: 98,0% – 102% cho quy trình phân tích định lượng.

28

- RSD tỷ lệ phục hồi ở mỗi mức nồng độ phải ≤ 2,0 % ở mỗi mức nồng độ

Trường hợp nằm ngoài khoảng này, phải có sự giải thích phù hợp.

3.3.4. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả

Theo lý thuyết sắc ký lỏng, trong một điều kiện sắc ký xác định đã chọn, thì thời

gian lưu của chất là đại lượng đặc trưng để định tính (phát hiện) các chất. Còn chiều cao

và diện tích peak sắc ký có liên quan chặt chẽ đến nồng độ của chất. Trong một vùng

nồng độ nhất định và không lớn, thì chúng ta có mối quan hệ tuyến tính như sau:

Hi = k1 . Ci = f(C) (1)

Si = k2 . Ci = f(C) (2)

Trong đó:

Hi và Si là chiều cao và diện tích của peak sắc ký của cấu tử i.

Ci là nồng độ của cấu tử i với thời gian lưu tRi.

k1, k2 là các hằng số thực nghiệm phụ thuộc vào các điều kiện sắc ký cũng như bản chất pha tĩnh.

Dựa trên (1) và (2) ta có thể xác định nồng độ các chất phân tích theo phương

pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn.

Giá trị trung bình:

Độ lệch chuẩn:

Độ lệch chuẩn tương đối:

29

Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. CHUẨN BỊ MẪU NGHIÊN CỨU VÀ LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ

4.1.1. Chuẩn bị dung dịch

 Chuẩn bị dung môi pha mẫu

Các chất được khảo sát đều tan tốt trong acetonitril nên tôi lựa chọn dung môi

pha mẫu là acetonitril và đây cũng là thành phần chính trong pha động.

 Chuẩn bị dung dịch gốc và dung dịch mẫu chuẩn

Dung dịch mẫu chuẩn gốc:

- Cân chính xác lượng chất chuẩn tương ứng với 10 mg, cho vào bình định mức 25 ml. - Thêm khoảng 10 ml acetonitril, đánh siêu âm 10 phút, để nguội, thêm acetonitril đến vạch, lắc kĩ. Làm đồng thời với cả hai chất chuẩn imidacloprid và

azoxystrobin. Dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 400 ppm.

- Dung dịch này được pha loãng tới nồng độ thích hợp để khảo sát và xây dựng

dãy dung dịch chuẩn.

Dung dịch mẫu chuẩn đơn:

- Hút chính xác 6 ml dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức dung tích 50

ml, thêm acetonitrile tới vạch và lắc kĩ.

- Dung dịch thu được đem lọc qua màng 0,45 µm trước khi đem chạy sắc ký.

Dung dịch chuẩn đơn này có nồng độ chất chuẩn 50 ppm. - Làm đồng thời với imidacloprid và azoxystrobin.

Dung dịch mẫu chuẩn hỗn hợp:

- Hút 1 ml dung dịch chuân gốc imidacloprid và hút 5 ml dung dịch chuẩn gốc

azoxystrobin vào bình định mức dung tích 50 ml. - Thêm acetonitril tới vạch và lắc kĩ. - Lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi đem chạy sắc ký. Dung dịch thu được là

hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin có nồng độ 50 ppm.

4.1.2 Khảo sát điều kiện phân tích sắc ký

Sau khi tiến hành các thí nghiệm khảo sát theo mục 3.3.2, ta thu được kết quả

như sau:

4.1.2.1. Đặt bước sóng cho detector

Bước sóng λ của detector là một yếu tố quan trọng, ảnh hưởng đến độ nhạy của phương pháp. Vì thế ta phải nghiên cứu, khảo sát sao cho tín hiệu của chất phân tích tại bước sóng λ là tốt nhất. Tiến hành quét phổ ở nồng độ từ 200-400 nm có kết quả

như hình sau:

30

azoxystrobin

imidacloprid

Hình 4.1: Phổ hấp thụ của azoxystrobin và imidacloprid trong acetonitrile.

Từ hình 4.1 cho thấy azoxystrobin có độ hấp thu cực đại tại bước sóng 207 nm,

imidacloprid có hấp thụ cực đại tại bước sóng 270 nm. Hai phổ này có độ hấp thu giao

nhau tại bước sóng 250 nm. Vì vậy tôi chọn bước sóng 250 nm để định lượng đồng

thời hai chất này.

4.1.2.2. Khảo sát thành phần pha động

Để khảo sát thành phần pha động, tiến hành chạy chương trình sắc kí như mục

3.3.2 đã trình bày với sự thay đổi thành phần pha động. Dung dịch chất chuẩn hỗn hợp

của imidacloprid và azoxystrobin được pha loãng từ dung dịch gốc 400 ppm. Thành

phần dung môi pha động được chọn để khảo sát là acetonitril và nước với các tỉ lệ thể

tích khác nhau.

Tiến hành khảo sát thành phần pha động như mục 3.3.2.4. Kết quả được thể

hiện trong các hình như sau:

31

Hình 4.2. Sắc ký đồ ACN/ Nước (90%:10%).

Hình 4.3. Sắc ký đồ ACN/ Nước (95%:5%).

32

Hình 4.4. Sắc ký đồ ACN/ Nước (85%:15%)

Hình 4.5. Sắc ký đồ ACN/ Nước (60%:40%).

33

Hình 4.6. Sắc ký đồ ACN/ Nước (55%:45%).

Hình 4.7. Sắc ký đồ ACN/ Nước (50%:50%).

Dựa vào hình 4.2; 3.3; 4.4; 4.5; 4.6; 4.7, ta thấy rằng thành phần pha động ảnh hưởng lớn đến thời gian lưu, hệ số lưu, hệ số tách và hệ số đối xứng của peak. Tỷ lệ ACN càng lớn (80%-95%) thì hai chất không tách nhau, cả hai peak càng dính nhau, pic không sắc nét, thời gian rửa giải lâu hơn. Ngược lại, tỷ lệ ACN càng thấp, hai peak tách nhau rõ ràng, peak đẹp, cân đối, hiện tượng kéo đuôi giảm dần. Ngoài ra khi tỷ lệ nước càng cao thì peak imidacloprid càng không đẹp, hệ số kéo đuôi tăng. Vì vậy ta chọn thành phần pha động là hỗn hợp dung môi ACN và nước cất có tỷ lệ gần bằng nhau (55%:45%) cho những nghiên cứu tiếp theo.

34

4.1.2.3 Khảo sát tốc độ dòng

Sự ảnh hưởng của tốc độ dòng đến quá trình sắc ký được khảo sát bằng cách

tiến hành chạy sắc kí hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin với các tốc độ khác nhau:

o 0,5 ml/phút. o 0,8 ml/phút. o 1 ml /phút o 1,2 ml/phút o 1,5 ml/phút

Các điều kiện còn lại của quá trình sắc kí không đổi, cụ thể như sau:

- Cột tách: RP – 18, 5µm, 250 x 4,6 mm. - Thể tích vòng mẫu: 20 µl. - Nồng độ chất phân tích: 50 ppm - Detector UV-Vis: 250 nm. - Pha động: pha động đã khảo sát ở 3.3.2.4.

Tiến hành khảo sát theo mục 3.3.2.5. Theo kết quả được khảo sát qua các lần

tiêm ta thấy rằng, tốc độ dòng ảnh hưởng lớn đến thời gian lưu, hệ số tách.

- Tốc độ dòng từ 0,6 – 0,8 ml/phút cho thấy thời gian lưu tăng dần, peak chưa

đẹp và không có sự cân đối, tách nhau hoàn toàn, hệ số tách giảm dần.

- Tốc độ dòng 1 ml/phút cho thấy thời gian lưu giảm dần, peak rõ đẹp, hai peak

tách nhau hoàn toàn, hệ số tách giảm dần, áp suất ổn định.

- Tốc độ dòng lớn (> 1 ml/phút) sẽ làm hao tốn dung môi và tăng áp suất cột tách, nhưng tốc độ quá nhỏ sẽ kéo dài thời gian phân tích và làm doãng peak gây ra

hiện tượng kéo đuôi.

 Do đó, ta chọn tốc độ dòng là 1 ml/phút để tiến hành định lượng

azoxystrobin và imidacloprid.

4.2. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI HAI CHẤT

IMIDACLOPRID VÀ AZOXYSTROBIN

4.2.1. Thẩm định quy trình

4.2.1.1. Tính phù hơp hệ thống

Pha dung dịch mẫu chuẩn hỗn hợp azoxystrobin và imidacloprid nồng độ 50 ppm.

Tiến hành sắc ký lặp lại 6 lần.

35

Hình 4.8: Kết quả sắc kí đồ khảo sát tính phù hợp hệ thống

Bảng 4.1. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của imidacloprid

Số lần tiêm As Rs imi K’ N mẫu tR (phút) Speak (µAU x giây)

1 3,954 626144 1,140 0,941 0,00 39194,789

2 3,949 634100 1,126 0,955 0,00 39100,101

3 3,969 638942 1,138 0,967 0,00 39103,700

4 3,947 642210 1,156 0,942 0,00 38679,280

5 3,974 643648 1,162 0,951 0,00 39004,980

6 3,960 660550 1,128 0,960 0,00 38243,829

Trung bình 3,957 640932 1,142 0,953 0,00 38887,780

%RSD 0,309 1,797 1,282 0,011 0,00 0,933

SD 0,012 11517 0,015 0,0101 0,00 362,722

36

Bảng 4.2. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống azoxystrobin

Số lần tiêm As Rs azo K’ N tR (phút) mẫu Speak (µAU x giây)

1 12,058 1805578 1,013 2,012 2,056 76407,704

2 12,081 1814130 1,009 2,212 2,059 75540,833

3 12,165 1824734 1,007 2,411 2,065 75960,530

4 12,072 1832351 1,021 2,254 2,059 76049,748

5 12,215 1835474 1,014 2,211 2,074 76593,872

6 12,144 1828874 0,999 2,231 2,067 73276,171

Trung bình 12,122 1823524 1,010 1,889 2,063 75638,143

%RSD 0,513 0,631 0,731 21,12 0,315 1,605

SD 0,012 11498 0,0073 0,399 0.0065 1213,992

Kết quả ở hai bảng 4.1 và 4.2 cho thấy giá trị độ lệch chuẩn tương đối của thời

gian lưu (tR), diện tích peak (S), số đĩa lý thuyết đều không quá 2%, hệ số đối xứng (AS) nằm trong khoảng 0,8-1,5, độ phân giải (RS) lớn hơn 1,5, nên khẳng định rằng hệ thống có tính phù hợp, có thể tiếp tục tiến hành những bước đánh giá tiếp theo với điều

kiện sắc kí tương tự.

37

4.2.1.2 Tính đặc hiệu

Hình 4.9: Sắc kí đồ đánh giá độ đặc hiệu với imidacloprid và azoxystrobin

Kết quả khảo sát khảo sát độ đặc hiệu trên mẫu chuẩn cho thấy:

- Sắc ký đồ pha động và dung môi pha mẫu không xuất hiện pic nào tại thời

gian lưu của imidacloprid và azoxystrobin trong trong sắc ký đồ của imidacloprid và

sắc ký đồ của azoxystrobin.

- Trong sắc ký đồ dung dịch chuẩn của hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin:

Xuất hiện hai peak có thời gian lưu tương ứng với thời thời gian lưu của pic sắc ký đồ

riêng của imidacloprid và pic azoxystrobin. Ngoài peak imidacloprid và azoxystrobin chỉ có 1 peak lạ có thời gian lưu ở 2,606 phút trong sắc kí đồ hỗn hợp chuẩn và sắc ký

đồ riêng từng chất imidacloprid và azoxystrobin giống như peak xuất hiện trong sắc ký đồ mẫu trắng, chứng tỏ peak lạ này là của mẫu trắng. Peak imidacloprid và azoxystrobin tách nhau hoàn toàn.

Kết quả khảo sát độ đặc hiệu trên mẫu tự tạo cho thấy:

Đối với dung dịch chuẩn, trên sắc ký đồ xuất hiện hai peak imidacloprid và

azoxystrobin rõ rang ở tại thời gian lưu 3,959 phút và 12,210 phút.

- Đối với sắc ký đồ trên mẫu trắng, trên sắc ký đồ không có peak nào xuất hiện

38

tương ứng tại thời gian lưu của imidacloprid và azoxystrobin

- Đối với mẫu giả định, sắc ký đồ cho hai peak tương ứng với peak của

imidacloprid và azoxystrobin trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn về thời gian lưu.

Từ kết quả trên, có thể khẳng định quy trình phân tích có tính đặc hiệu.

4.2.1.3. Xác định LOD và LOQ của thiết bị

Trong một quy trình phân tích bất kỳ, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn

định lượng (LOQ) là hai thông số quan trọng.

Để xác định LOD và LOQ của thiết bị, ta tiến hành như sau: pha loãng từ 5 – 7

lần mẫu chuẩn chứa hỗn hợp imdacloprid và azoxystrobin nồng độ 10 ppm và chuẩn bị

một mẫu trắng (chứa dung môi pha động) Sau đó tiêm vào thiết bị HPLC. Đến khi nào

chiều cao peak = 3 lần chiều cao đường nền thì lấy đó là LOD

Hình 4.10: Hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin ở nồng độ 0,048 ppm

Hình 4.11. Hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin ở nồng độ 0,0048 ppm

Kết quả từ hình 4.10 và 4.11 cho thấy khi nồng độ azoxystrobin là 0,048 ppm

và imidacloprid là 0,0048 ppm thì chiều cao = 3 lần đường nền. Do đó:

- LOD của azoxystrobin là 0,048 ppm

39

- LOD của imidacloprid là 0,0048 ppm. Từ đó suy ra:

- LOQ của azoxystrobin = LOD = x 0,048 = 0,16 ppm. 10 3 10 3

- LOQ của imidacloprid = LOD = x 0,0048 = 0,016 ppm. 10 3 10 3

4.2.1.4. Tính tuyến tính

Khoảng tuyến tính của imidacloprid và azoxystrobin được khảo sát bằng cách pha một dãy dung dịch chuẩn khoảng từ 0,4-1,6 ppm có nồng độ tăng dần như sau: 0,4

ppm; 0,8 ppm; 1 ppm; 1,2 ppm; 1,6 ppm ứng với 40%, 80%, 100%, 120%, 160%. Tiến

hành pha dãy chuẩn như sau:

- Pha loãng dung dịch chuẩn hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin gốc có nồng

độ 2 ppm thành 50 ml có nồng độ 1,6 ppm: hút chính xác 40 ml dung dịch gốc cho vào

bình định mức 50 ml, định mức bằng acetonitril cho đến vạch.

- Pha dãy chuẩn từ dung dịch 1,6 ppm vừa thu được ở trên: hút chính xác Vx ml

cho vào bình định mức 10 ml và định mức bằng acetonitril. Cụ thể như sau:

Bảng 4.3: Cách pha loãng dung dịch mẫu chuẩn hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin

trước khi tiêm vào hệ thống HPLC

C(ppm) 0,4 0,8 1 1,2 1,6

2,5 5 6,25 7,5 10 Vx ml

Vacetonitrile Định mức đến vạch

Sau đó, tiêm vào hệ thống HPLC với điều kiện tối ưu đã khảo sát với chương

trình sắc kí sau:

- Cột tách: RP – 18, 250 x 4,6 mm, kích thước hạt 5µm - Pha động: kênh C: ACN 55%; kênh D: Nước: 45%

- Tốc độ pha động: 1 ml/phút. - Detector UV-Vis: λ = 250 nm. - Thể tích vòng mẫu: 20 µl.

Từ các giá trị diện tích pic S thu được, xây dựng phương trình hồi quy giữa diện

tích pic S và nồng độ C của mỗi dãy chuẩn.

Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính được chỉ ra trong bàng, bảng, hình và hình,

ghi giá trị và dùng phần mềm Microsoft Excel 2003 xây dựng đường hồi quy.

40

Bảng 4.4. Diện tích peak ứng với từng nồng độ imidacloprid trong dãy chuẩn

Imidacloprid

C (ppm) Speak

0,4 81789

0,8 152152

1 226200

1,2 291980

1,6 368627

Bảng 4.5. Diện tích peak ứng với từng nồng độ azoxystrobin trong dãy chuẩn

azoxystrobin

C (ppm) Speak

0,4 185609

0,8 357070

1 506195

1,2 670685

1,6 870305

41

Hình 4.12. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ của imidacloprid

Hình 4.13. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ của azoxystrobin

Dựa vào kết quả khảo sát, ta có các phương trình hồi quy sau được biểu diễn

trong hình 4.12, 4.13 và Bảng 4.4 và 4.5.

42

Bảng 4.6. Phương trình hồi quy của azoxystrobin và imidacloprid

Khoảng nồng độ Chất phân tích Phương trình hồi quy Hệ số tương quan R2 tuyến tính (ppm)

imidacloprid Y=74105x R2=0,9978 0,4-1,6

azoxystrobin Y=171865x R2=0,997 0,4-1,6

Nhận xét: Qua các kết quả phân tích và thống kê ta thấy, tỷ lệ diện tích peak sắc ký và nồng độ phụ thuộc tuyến tính với nhau một cách chặt chẽ với hệ số tương quan

cao đạt yêu cầu ở mục 3.3.3.4. Khoảng nồng độ tuyến tính rộng đối với cả hai chất

azoxystrobin và imidacloprid từ 0,4 – 1,6 ppm. Do đó, ta có thể sử dụng các phương

pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn để định lượng azoxystrobin và imidacloprid trong

mẫu thử ở khoảng tuyến tính đã khảo sát.

 Độ lặp lại của phép đo

4.2.1.5. Độ chính xác

Độ lặp lại của hệ thống sắc ký được khảo sát bằng cách tiêm lặp 6 lần cùng một

mẫu chuẩn hỗn hợp azoxystrobin và imidacloprid vào hệ thống HPLC với điều kiện tối

ưu ở mục 3.3.2. Kết quả được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn (SD), độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích peak sắc ký Speak và thời gian lưu tR.

Bảng 4.7. Độ lặp lại của hệ thống HPLC với mẫu azoxystrobin

Thời gian lưu của azoxystrobin Diện tích peak của azoxystrobin

6472807 Giá trị trung bình

TT Thời Các thông số thống kê Diện tích Các thông số thống kê gian lưu

12,081 Gía trị trung bình

12,077

1

6535964 Xtb=6495348.67

12,132

2 Xtb=12,162

6475974 Độ lệch chuẩn

Độ lệch chuẩn 3

12,167

6419486 SD=60348.26

SD=0,088 4

12,205

6475006 Độ lệch chuẩn tương đối

Độ lệch chuẩn tương đối 5

12,311

6592855 RSD(%)=0,92%

RSD(%)=0,72% 6

43

Bảng 4.8. Độ lặp lại của hệ thống HPLC đối với mẫu imidaclopid

Thời gian lưu của imidacloprid Diện tích peak của imidacloprid

TT

3,959

2375675 Gía trị trung bình

Thời gian lưu Các thông số thống kê Diện tích Các thông số thống kê

3,964

2360311 Xtb=2383429,5

1 Gía trị trung bình

3,971

2 Xtb=3,959

2339617 Độ lệch chuẩn

3,966

Độ lệch chuẩn 3

2375992 SD=34611,11

SD=0,0188 4

3,973

2419586 Độ lệch chuẩn tương đối

Độ lệch chuẩn tương đối 5

3,922

2429396 RSD(%)=1,45%

RSD(%)=0,47% 6

Theo kết quả khảo sát ta thấy hệ thống sắc ký lỏng có độ lặp lại tốt. Đối với

phép định lượng, độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic là 0,92 % và 1,45 % ứng

với azoxystrobin và imidacloprid đạt yêu cầu mục 3.3.3.5. Quy trình phân tích ổn định

và có thể áp dụng để phân tích mẫu thử.

 Độ chính xác trung gian

Bảng 4.9. Độ chính xác trung gian đối với mẫu imidacloprid

Diện tích peak (μAU*giây) Số lần đo Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Kết quả

1 2367836 2341037 2352453

2 2301897 2401004 2390451

3 2401211 2390312 2385421

4 2315012 2352789 2410207

5 2342202 2321107 2331652

6 2296789 2321775 2314473

Trung bình 2337491 2354671 2364109 2352090

RSD 1,75% 1,44% 1,57% 1,59%

44

Bảng 4.10. Độ chính xác trung gian đối với mẫu azoxystrobin

Diện tích peak (μAU*giây)

Số lần đo

Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Kết quả

1 6399178 6417754 6475441

2 6400153 6438765 6390435

3 6403347 6443221 6485421

4 6421182 6432119 6410379

5 6501122 6421277 6478553

6 6467781 6456423 6455763

Trung bình 6432127 6432927 6449332 6438128

RSD 0,66% 0,23% 0,61% 0,5%

Kết quả thu được theo bảng 4.9 và bảng 4.10 cho thấy quy trình phân tích có độ

chính xác cao (RSD của diện tích peak ≤ 2%).

Nhận xét: quy trình định lượng đồng thời hai chất imidacloprid và azoxystrobin

bằng phương pháp HPLC có tính đặc hiệu, miền giá trị rộng và độ chính xác cao, do

đó quy trình phân tích ổn định và có thể áp dụng để phân tích mẫu thử.

4.2.1.6. Độ đúng

Bảng 4.11. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp với mẫu Imidacloprid

Imidacloprid

Mức nồng Diện tích pic độ đo (%)

Tỷ lệ hồi phục % (µAU x giây) Nồng độ đo ở các mức (µg/ml) Nồng độ (µg/ml) tính từ phương trình hồi quy

2050270 199,50 101,00 200

80% 2082793 203,46 98,29 200

2054821 200,06 99,97 200

45

2455806 250 248,79 101,00

100% 2505612 250 254,83 98,12

2502276 250 254,13 98,25

2927766 300 306.12 98,00

120% 2865312 300 298,53 100,30

2887210 300 301,20 99,60

Bảng 4.12. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp với azoxystrobin

Azoxystrobin

4860132

200

202,03

98,98

80%

4788941

200

201,51

99,25

4888295

200

203,50

98,28

5804669

250

250,52

99,79

100%

5898400

250

259,31

98,41

5870421

250

253,89

98,46

6779319

300

300,51

99,82

120%

6698359

300

296,36

101,22

6700758

300

296,48

101,48

Mức nồng Diện tích pic độ đo (%) Nồng độ đo ở các mức Nồng độ (µg/ml) tính từ phương Tỷ lệ hồi phục % (µAU x giây) (µg/ml) trình hồi quy

Nhận xét: tỷ lệ phục hồi ở 3 mức nồng độ trong bảng 4.9 và bảng 4.10 của

imidacloprid và azoxystrobin nằm trong khoảng 98-102% nên phương pháp đạt yêu

cầu về độ đúng.

 Như vậy quy trình định lượng imidacloprid và azoxystrobin bằng phương pháp

HPLC có tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính rộng, độ chính xác và độ đúng đạt yêu cầu.

46

4.3. THẢO LUẬN

 Về phương pháp HPLC:

Tuy có một số nhược điểm như trang thiết bị giá thành cao, dung môi hóa chất

đắt tiền nhưng phương pháp HPLC có nhiều ưu điểm vượt trội hơn hẳn so với các

phương pháp phân tích khác đặc biệt là khi có nhiều thành phần phân tích trong cùng

một mẫu. Một số ưu điểm như:

- Tính chọn lọc cao: tách riêng biệt chất cần phân tích khỏi các chất khác có

trong cùng một mẫu cho kết quả có độ chính xác cao.

- Có thể định tính, định lượng đồng thời nhiều thành phần trong hỗn hợp mà

không cần tách riêng biệt các chất.

- Tiết kiệm thời gian, dung môi, hóa chất và ít bị sai số. Vì vậy HPLC đã và đang được sử dụng phổ biến trên thế giới và cả ở Việt Nam.

Trong dược điển các nước và cả ở Việt Nam phương pháp HPLC ngày càng

được sử dụng nhiều. Do đó phương pháp đuợc trình bày ở đây có khả năng áp dụng

rộng rãi trong thực tế.

 Về quy trình định lượng đồng thời imidacloprid và azoxystrobin bằng

phương pháp HPLC

Quy trình đã xây dựng cho phép định lượng được đồng thời được cả hai hoạt

chất imidacloprid và azoxystrobin. Bằng việc sử dụng chung một quy trình phân tích

có thể định lượng được cả hai hóa chất bảo vệ thực vật trong rất nhiều các chế phẩm

tương ứng đang lưu hành trên trị trường. Điều này giúp tiết kiệm được thời gian, công

sức, dung môi hóa chất và chi phí.

Imidacloprid và azoxystrobin là hai trong số các hóa chất bảo vệ thực vật được

sử dụng nhiều trong nông, lâm nghiệp với xu hướng ngày càng tăng. Trong một số tài

liệu tham khảo đã có định lượng đơn chất nhưng chưa có phương pháp định lượng

đồng thời hỗn hợp hai chất này. Đặc biệt, trong DĐVN IV đã có chuyên luận nhưng còn ít về phương pháp định lượng các hoạt chất cũng như chế phẩm chứa hai hoạt chất

này. Do đó quy trình định lượng mà tôi đã xây dựng có tính thực tế và ứng dụng cao, có thể áp dụng rộng rãi.

47

CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

5.1. KẾT LUẬN

Kết quả đề tài “Định lượng đồng thời imidacloprid và azoxystrobin bằng

phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)” cho những kết luận sau:

Chọn được điều kiện phù hợp để tách và xác định đồng thời imidacloprid và

azoxystrobin trong một số chế phẩm thuốc hóa chất bảo vệ thực vật bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV-Vis. Với điều kiện sắc ký:

- Cột tách: RP – 18; 250 x4,6 mm; kích thước hạt 5 µm

- Pha động: acetonitril: nước (55%:45%)

- Tốc độ dòng: 1 ml/phút

- Thể tích vòng mẫu: 20 µl

- Bước sóng: 250 nm

Với chương trình chạy như trên cho kết quả như sau: Các peak tách tốt, thời

gian lưu ổn định và không có hiện tượng kéo đuôi.

Qua các bước khảo sát thẩm định phương pháp cho thấy phương pháp đã xây

dựng phuơng pháp có độ lặp lại với RSD diện tích peak của imidacloprid là 1,45% và

RSD của diện tích peak của azoxystrobin là 0,92% và có độ chính xác trung gian cao

với RSD ≤ 2%. Phương pháp có sự phụ thuộc tuyến tính của đáp ứng với nồng độ chất phân tích với hệ số tương quan hồi quy ≥ 0,997 (hay R2 ≥ 0,995) đạt yêu cầu định lượng. Độ đúng (độ phục hồi) nằm trong khoảng 98-102% nên quy trình đạt yêu cầu

phân tích định lượng.

Bảng 5.1: Giá trị LOD, LQD và khoảng tuyến tính cho 2 chất imidacloprid và azoxystrobin

Tên chất imidacloprid azoxystrobin

LOD (ppm) 0,0048 0,048

LOQ (ppm) 0,0016 0,016

Phương trình hồi quy Y=74105x Y=171865x

Hệ số tương quan R2=0,9978 R2=0,997

Khoảng tuyến tính 0,4-1,6 0,4-1,6

 Phương pháp có thể áp dụng dễ dàng với các phòng thí nghiệm, các cơ sở có trang bị máy sắc ký lỏng hiệu năng cao và nhân lực đủ trình độ vì các hóa chất, dung 48

môi dễ kiếm, quy trình làm đơn giản, dễ thực hiện.

5.2. ĐỀ XUẤT

Như vậy, với kết quả thu được, ta thấy phương pháp HPLC có độ nhạy cao, độ lặp lại tốt, thích hợp cho việc định lượng đồng thời imidacloprid và azoxystrobin bằng

phương pháp HPLC từ đó có thể xác định dư lượng của imdacloprid và azoxystrobin

trong dược liệu. Ngoài ra cần phải thay đổi hai vấn đề sau:

 Thay đổi tỷ lệ dung môi để rút ngắn thời gian và tránh làm hao tốn dung môi

 Thay đổi một số dung môi khác hoặc kết hợp với hệ đệm để có hệ dung môi

tối ưu hơn.

Hi vọng những nghiên cứu trên có thể đóng góp phần nào vào việc ứng dụng

phương pháp RP - HPLC nói riêng và phương pháp HPLC nói chung để xác định các

hóa chất bảo vệ thực vật trong dược liệu nhằm hạn chế sự tồn dư những chất này trong

lương thực, thực phẩm và trong dược liệu để đảm bảo sức khỏe cho người dân tránh các bệnh do các hóa chất bảo vệ thực vật gây ra.

49

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

1. Bộ Y tế (2009), Hướng dẫn của ASEAN về thẩm định quy trình phân tích, Phụ

lục 7 –Thông tư 22/2009/TT-BYT Quy định về đăng ký thuốc

2. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ (2014). Thẩm định quy trình phân tích. Trường Đại

học Y Dược Cần Thơ.

3. Đoàn Hạnh Dung (2014). Xác định dư lượng một số hóa chất bảo vệ thực vật trong

dược liệu khô. Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ. Trường Đại học Dược Hà Nội.

4. Lê Thị Hường Hoa (2013). Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện và xác định hàm lượng một số chất bị cấm sử dụng trong mỹ phẩm. Luận án tiến sĩ

dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội.

5. Nguyễn Phước Định (2015). Tổng hợp và thiết lập tạp chất của fluconazol làm chuẩn tạp chất. Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ dược học. Đại học Y dược TP. Hồ

Chí Minh.

6. Thái Duy Thìn và cộng sự (2003). Nghiên cứu ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và đo quang phổ UV –VIS để định tính và định lượng. 7. Trần Cao Sơn (2015). Nghiên cứu xác định dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong dược liệu và sản phẩm từ dược liệu bằng sắc ký khối phổ. Luận án tiến sĩ

dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội.

8. Trần Tử An và cộng sự (2007). Kiểm nghiệm dược phẩm. NXB Y Học, Hà Nội. 9. Trần Tử An và Thái Nguyễn Hùng Thu (2007). Hóa phân tích II, NXB Y Học, 10. Từ Văn Mạc (1995). Phân tích hóa lý. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 11. Võ Thị Bạch Huệ (2016).HPLC-ứng dụng trong phân tích dược liệu. Trường

Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh.

12. Vũ Thị Quỳnh (2013). Định lượng đồng thời Calci Atorvastatin và Simvastatin trong chế phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu nâng cao. Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ.

Trường Đại học Dược Hà Nội.

TÀI LIỆU TIẾNG ANH

13. BP 2010. Validation of Analytical Procedures, Supplementary Chapter III E. Printed in the United Kingdom by The Stationery Office, N5977690 C34 8/2009.

14. ICH Topic Q2B (1996). Validation of Analytical Procedures: Text and

Methodology.

15. Ferrer Imma. et al (2005). Multi-residue pestiside analysis in fruits and vegetables by liquid Chromatography- time of-flight mass spectrometry.

Pesticide Residue Research Group, University of almera, Spain.

50

16. J.Serb (2009). A rapid spectrophotometric determination of Imidacloprid in selected commercial formulation in the presence of 6- chloronicotinic acid.

Journal of the Serbian Chemical Society. 74(12). pp.1455-1465.

17. Mastovka Katerina (2006). Azoxystrobin. Agricultural Research Service.

United State Department of Agriculture, USA.

18. M.K. Sprivastava (2004). Analysis of imidacloprid residues in fruits,

vegetables, cereals, fruit juices, and baby foods and daily intake estimation in and around lucknow, India. Environmental Toxicology and Chemistry, India. 19. Raihanah. Et al (2016). Ultra hight performance liquid Chromatography technique to determine Imidacloprid residue in rice using QuEChERS method.

International Food Research Journal. 23(4), pp.1396-1402.

20. Schonind Ralf and Schmuck Richard (2003). Analytical determination of Imidacloprid and relevant metabolite residues by LC, MS/MS. Bulletin of

Insectology. 56(1), pp.41-50.

21. S.R Burket and A Sapiests (1995). Residue analytical method for the analysis of ICIA 5504 and R2 30310 in cereals (grain) and wine (grapes). Center for

Analytical Chemistry, USA.

22. Sacramento (2002). HPLC Determination of Total Imidaclopridin Vegetation,

Center for Analytical Chemistry, California.

23. Saed Mousa Diab Ali (2012). Evaluation of Imidacloprid and Abamectin Residue in Tomato, Cucumber and Pepper by High Performance Liquid

Chromatography (HPLC). MSc. Thesis, Faculty of graduate Studies, An-Najah

National University.

24. Ahmad Baig Sajad. Et al (2012). Imidacloprid residues in vegetables, soil and water in the southern Punjab, Pakistan. Journal of Agricultural Technology.

8(3), pp.903-916.

25. Sh.A.Ashorkr. et al (2006). Persistence and fate of Carbosulfan and in potato plants. Central Agricultural Pesticides Imidacloprid residue

Laboratory. Agricultural Research Centre, Egypt.

26. T. Nageswara Rao. Et al (2012). Development and Validation of HPLC- UV method for Simultanous determination of Strobilurin fungicide residues in tomato fruits followed by matrix solid phase Disperision (MSPD). Department of Analytical Chemistry International Insitiuate of Biotechnology and

Toxicology. 3(11). pp, 113-118.

27. USP 34/ NF 29 (2011). Validation of Compendial<1225>. Printed in the United

States by United Book, Inc., Baltimore, MD.

51

28. Vojislava Bursic and Sanja Lazic (2012). Dissipation of Fungicide

Azoxystrobin from Cucumber. Faculty of Agriculture. Universit of Novi Sad,

Serbia.

TÀI LIỆU TRÊN WEBSITE

29. National pesticide information center. Imidacloprid (10.11.2016).

http://npic.orst.edu/factsheets/imidagen.html. Truy cập ngày 10 tháng 03 năm 2017.

30. Nông học (2005). Danh mục thuốc bảo vệ thực vật (04.12.2005)

https://nonghoc.com/thuoc-bao-ve-thuc-vat/1/thuocbvtv1.aspx. Truy cập ngày

19 tháng 04 năm 2017.

31. Pubchem open chemistry database. Azoxystrobin (5.2010)

https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Azoxystrobin. Truy cập ngày 12

tháng 6 năm 2017

32. Pubchem open chemistry database. Imidacloprid (5.2010)

https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Imidacloprid. Truy cập ngày 12

tháng 6 năm 2017

52

PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1: Một số sắc ký đồ của chất chuẩn Imidacloprid

Hình 1.1. Sắc ký đồ của chất chuẩn imidacloprid với tỷ lệ ACN/Nước (60%:40%),

C= 80ppm, λ= 255nm

Các thông số sắc ký tương ứng với hình 1.1 như sau:

tR (phút)

Speak (µAU x giây)

As

Rs

K’

N

5,425

226144

1,100

0

0

19094

Hình 1.2. Sắc ký đồ của chất chuẩn imidacloprid với tỷ lệ ACN/Nước (55%:45%), λ=260 nm

Các thông số sắc ký tương ứng với hình 1.2 như sau:

tR (phút) Speak (µAU x giây)

As

Rs

K’

N

3,959

386504

1,208

0

0

26076

Hình 1.3. Sắc ký đồ của chất chuẩn imidacloprid với tỷ lệ ACN/Nước (50%:50%), λ=250 nm

Các thông số sắc ký tương ứng với hình 1.3 như sau:

As Rs K’ N tR (phút) Speak (µAU x giây)

4,683 3702019 0,652 0 0 29705

PHỤ LỤC 2. Một số sắc ký đồ của chất chuẩn Azoxystrobin

Hình 2.1. Sắc ký đồ của chất chuẩn Azoxystrobin với tỷ lệ ACN/Nước (55%:45%), λ=260 nm

Các thông số sắc ký tương ứng với hình 2.1 như sau:

As Rs K’ N tR (phút) Speak ( µAU x giây)

12,164 1805578 1,013 0 0 66407,502

Hình 2.2. Sắc ký đồ của chất chuẩn Azoxystrobin với tỷ lệ ACN/Nước (80%:20%), λ=255 nm

Các thông số sắc ký tương ứng với hình 2.2 như sau:

As Rs K’ N tR (phút) Speak (µAU x giây)

5,179 1705578 0,813 2,011 2,043 46709

Hình 2.3. Sắc ký đồ của chất chuẩn Azoxystrobin với tỷ lệ ACN/Nước (60%:40%), λ=255 nm

Các thông số sắc ký tương ứng với hình 2.3 như sau:

As Rs K’ N tR (phút) Speak (µAU x giây)

5,179 1705578 0,813 0 0 46709

PHỤ LỤC 3. Một số sắc ký đồ của hỗn hợp chất chuẩn azoxystrobin và imidacloprid

Hình 3.1. Sắc ký đồ của hỗn hợp azoxystrobin và imidacloprid với tỷ lệ ACN/Nước

(55%:45%), λ=250 nm

Các thông số tương ứng với hình 3.1 như sau:

Mẫu chuẩn

tR (phút)

Speak(µAU x giây)

As

Rs

K’

N

imidacloprid

3,949

616204

1,140

0,941

0,00

39194,789

azoxystrobin

12,081

1814130

1,005

2,231

2,05

75530,733

Hình 3.2. Sắc ký đồ của hỗn hợp azoxystrobin và imidacloprid với tỷ lệ ACN/Nước

(55%:45%), λ=255 nm

Các thông số tương ứng với hình 3.2 như sau:

Mẫu chuẩn

tR (phút)

As

Rs

K’

N

Speak(µAU x giây)

imidacloprid

3,963

529831

1,140

0,941

0,00

37634,532

azoxystrobin

12,143

1795231

1,315

2,511

2,12

75820,611

Hình 3.3. Sắc ký đồ của hỗn hợp azoxystrobin và imidacloprid với tỷ lệ ACN/Nước

(60%:40%), λ=255 nm

Các thông số tương ứng với hình 3.3 như sau:

mẫu chuẩn

tR (phút)

As

Rs

K’

N

Speak(µAU x giây)

imidacloprid

3,953

629732

1,140

0,941

0,00

39600,411

azoxystrobin

12,103

1895321

1,315

2,471

2,33

69947,623

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

KHOA DƯỢC-ĐIỀU DƯỠNG

Độc Lập - Tự do - Hạnh phúc

BẢN GIẢI TRÌNH CHỈNH SỬA KHÓA LUẬN THEO GÓP Ý

CỦA HỘI ĐỒNG ĐÁNH GIÁ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH DƯỢC HỌC

Họ tên sinh viên: Lê Hữu Bảo Trân

Lớp: Đại học Dược 7B

MSSV: 12D720401175

Tên khóa luận: “Xây dựng quy trình định lượng đồng thời chuẩn imidacloprid và

azoxystrobin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”.

Cán bộ hướng dẫn: ThS. Nguyễn Phước Định

Căn cứ theo góp ý của hội đồng đánh giá khóa luận tốt nghiệp đại học, khóa

luận đã được chỉnh sửa như sau:

1. Về hình thức:

Đề tài đã chỉnh sửa nhũng lỗi cơ bản như: lỗi chính tả, viết thường một cách

đồng nhất sau dấu hai chấm, khoảng cách “ml”, tài liệu tham khảo bổ sung thêm năm,

viết lại tài liệu tham khảo trên website theo đúng quy định nhà trường đưa ra, trích dẫn

tài liệu tham khảo trong phần thẩm định phương pháp, chỉnh sửa lại hãng sản xuất tên

các thiết bị…

2. Về nội dung

Tên khóa luận: “Xây dựng quy trình định lượng đồng thời imidacloprid và

azoxystrobin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” được đổi thành “Xây dựng

quy trình định lượng đồng thời chuẩn imidacloprid và azoxystrobin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”.

Chỉnh sửa phần kết luận và phần kiến nghị bổ sung thêm và chuyên sâu để phù

hợp hơn với nội dung đề tài.

Bổ sung thêm thẩm định độ đặc hiệu trên mẫu giả định, độ chính xác trung gian. Làm lại độ tuyến tính với nồng độ thấp hơn để phù hợp với nồng độ

imidacloprid và azoxystrobin trong cây đinh lăng.

Làm rõ hơn cách pha mẫu và nồng độ các dung dịch mẫu. Bổ sung thông số sắc ký ở phần sắc ký đồ trong phần phụ lục.

Thêm trích dẫn tài liệu tham khảo trong phần thẩm định phương pháp

XÁC NHẬN CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

XÉT DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ KHÓA LUẬN

…………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

PGS.TS Trần Công Luận