Luận án Tiến sĩ Nông nghiệp: Phân tích trình tự ORF2 của PCV2 từ heo nuôi ở một số tỉnh phía Nam và nghiên cứu vắc-xin phòng bệnh liên quan PCV2 trên heo sau cai sữa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH

LÊ THỊ THU PHƯƠNG

PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ ORF2 CỦA PCV2 TỪ HEO NUÔI Ở MỘT SỐ TỈNH PHÍA NAM VÀ NGHIÊN CỨU VẮC-XIN PHÒNG BỆNH LIÊN QUAN PCV2 TRÊN HEO SAU CAI SỮA

Chuyên ngành: Bệnh lý học và Chữa bệnh vật nuôi

Mã số: 9.64.01.02

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học:

PGS. TS. Nguyễn Ngọc Hải

TS. Nguyễn Thị Thu Hồng

TP. Hồ Chí Minh – tháng 11 năm 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan những công bố trong luận án này là trung thực, một phần dữ liệu

là công trình nghiên cứu của tôi chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình

nào khác, một phần dữ liệu trong luận án thuộc đề tài độc lập trong chương trình

nhiệm vụ nghiên cứu đặc thù, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đặt hàng theo

công văn số 2151/BNN-KHCN ngày 21/4/2011 và theo hợp đồng số 23 HĐ/TC-

KHCN giữa Văn phòng Bộ NN-PTNN và Trung Tâm Nghiên Cứu Thú Y – Công ty

TNHHMTV Thuốc Thú Y Trung Ương – NAVETCO ngày 07/6/2011 do TS. Nguyễn

Thị Thu Hồng làm chủ nhiệm. Những số liệu trong luận án được phép công bố với

sự đồng ý của chủ nhiệm đề tài và cơ quan chủ trì.

Tác giả

Lê Thị Thu Phương

iii

LỜI CẢM ƠN

Xin thành kính biết ơn công lao sinh thành dưỡng dục đến Ba Má.

Xin thành kính ghi ơn PGS. TS. Nguyễn Ngọc Hải và TS. Nguyễn Thị Thu

Hồng đã hết lòng hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình công tác,

học tập, thực hiện và hoàn thành luận án này.

Xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Nguyễn Tất Toàn, PGS.TS. Lâm Thị Thu

Hương, PGS. TS. Nguyễn Văn Khanh, TS. Hồ Thị Kim Hoa, PGS.TS. Lê Thanh

Hiền, PGS.TS. Trần Thị Dân, PGS.TS. Nguyễn Ngọc Tuân đã động viên và tận tình

giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập.

Xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Lãnh Đạo Công ty Cổ phần Thuốc Thú Y

Trung Ương NAVETCO, BLĐ Trung Tâm Nghiên Cứu Thú Y đã đồng ý và tạo điều

kiện về thời gian, cơ sở vật chất để tôi được học tập, nghiên cứu thực hiện và hoàn

thành luận án này.

Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường đại học Nông Lâm thành phố

Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm và quý Thầy Cô giáo Khoa Chăn nuôi Thú y, Phòng

đạo tạo sau đại học đã giảng dạy, truyền đạt kinh nghiệm, kiến thức và tạo điều kiện

thuận lợi cũng như những hỗ trợ khác để tôi hoàn thành khóa học.

Xin chân thành cảm ơn Ông Chris. J. Morrissy và Ông Darren Schafer thuộc

phòng thí nghiệm Australian Animal Health Laboratory – CSIRO, đã cung cấp một

số sinh phẩm trong nghiên cứu này.

Xin chân thành cảm ơn Anh Đặng Hùng, Chị Lam Hương và các bạn đồng

nghiệp Ngọc Ánh, Nhị Hà, Vô Ngôn, Hồng Phúc, Tấn Liêm, Hào Quang, Thu Lâm,

Minh Hải ở Trung Tâm Nghiên Cứu, bạn Kim Phúc và anh Hải, Chị Thu Hà, Chị

Diệu Thúy, Em Thanh Phong đã đồng hành và động viên tôi trong suốt quá trình học

tập, nghiên cứu và thực hiện đề tài.

Xin gởi lời cảm ơn và lời yêu thương chân thành đến đại gia đình đã ủng hộ,

động viên tôi trong công tác, học tập và hoàn thành luận án.

TÓM TẮT

Đề tài “Phân tích trình tự ORF2 của PCV2 từ heo nuôi ở một số tỉnh phía

Nam và nghiên cứu vắc-xin phòng bệnh liên quan PCV2 trên heo sau cai sữa”

được thực hiện nhằm xác định genotype và đánh giá sự tương đồng di truyền của

PCV2 lưu hành tại một số tỉnh phía Nam Việt Nam và nghiên cứu thử nghiệm vắc-

xin phòng hội chứng còi, giảm lượng vi-rút huyết trong mô và bệnh tích liên quan

PCV2 trên heo dựa trên chủng phân lập trong nghiên cứu. Kết quả đạt được như sau:

Phân tích cây phát sinh chủng loại dựa trên toàn bộ ORF2 của 48 mẫu PCV2

thu thập từ năm 2007 đến 2016 từ 44 trại heo ở 13 tỉnh thành Việt Nam (gồm 12 tỉnh

phía Nam và 1 tỉnh Bắc Trung Bộ) cho thấy, có sự lưu hành đồng thời PCV2b, PCV2d

và PCV2-Re (2h) (trước đây được xếp vào nhóm PCV2 tái tổ hợp, theo cách phân

loại mới được xếp vào genotype PCV2h), trong đó phổ biến nhất là PCV2b (24/48).

Sự xuất hiện và ngày càng trở nên phổ biến của genotype PCV2d, đặc biệt là PCV2d-

2 (15/16 mẫu thuộc PCV2d) từ năm 2012 trở đi. Mức độ tương đồng về nucleotide ở

mỗi genotype tương ứng 98,7% - 100% đối với PCV2b, 98,5 - 100% đối với PCV2d-

2 và PCV2-Re (2h) là 98,7 - 100%. Khoảng cách di truyền (p - distance) giữa các

genotype khá cao, từ 0,0595  0,0096 đến 0,0663  0,0102, cao hơn rất nhiều so với

ngưỡng p = 0,035.

Đã phân lập được 18 chủng PCV2 thuộc các genotype PCV2b (9 chủng),

PCV2d (6 chủng) và PCV2-Re (2h) (3 chủng) từ 21 mẫu bệnh phẩm dương tính PCV2

- thu nhận từ heo có biểu hiện triệu chứng và bệnh tích bệnh do circovirus. Hiệu giá

vi-rút đạt được trên môi trường tế bào PK15A dao động từ 1,67 đến 5,50log10

TCID50/ml ở lần tiếp đời thứ 3. Ba chủng thuộc 3 genotype khác nhau có hiệu giá cao

ổn định qua các lần tiếp đời (≥ 5,0log10 TCID50/ml): NAVET-DongNai2/2009

(PCV2b), NAVET-LongAn2/2012 (PCV2d) và NAVET-vietnam3/2004 (PCV2-Re

(2h)) được sử dụng để lựa chọn làm giống gốc nghiên cứu sản xuất vắc-xin phòng

bệnh do circovirus trên heo.

Đánh giá sự tương đồng kháng nguyên giữa các chủng PCV2 thuộc các genotype

khác nhau bằng phản ứng trung hòa chéo. Kết quả cho thấy giữa chủng NAVET-

DongNai2/2009 và NAVET-vietnam3/2004 tương đồng hoàn toàn về kháng nguyên với

hệ số R là 104,20%. Hệ số R giữa chủng NAVET-DongNai2/2009 và chủng NAVET-

LongAn2/2012; giữa NAVET-LongAn2/2012 và NAVET-vietnam3/2004 tương ứng là

91,60% và 91,30%, tất cả đều > 70%. Qua đây cho thấy, cả 3 chủng này tuy khác nhau

về genotype nhưng tương đồng với nhau về kháng nguyên.

Từ các kết quả nghiên cứu về đặc tính di truyền, nuôi cấy trên tế bào, tương

đồng kháng nguyên cho thấy, chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b) đáp ứng đầy

đủ các tiêu chí để được chọn làm giống gốc trong nghiên cứu sản xuất vắc-xin.

Sử dụng binary ethylenimine (BEI) để bất hoạt vi-rút chế tạo kháng nguyên

PCV2, với nồng độ BEI 3 mM, ở nhiệt độ 370C, sau 24 giờ có thể vô hoạt hoàn toàn

các vi-rút thuộc các chủng NAVET-vietnam3/2004, NAVET-DongNai2/2009 và

NAVET-LongAn2/2012, với tốc độ bất hoạt tương ứng với các chủng lần lượt là

0,71; 0,86 và 1,33log10 TCID50/giờ.

Đánh giá hiệu lực của vắc-xin PCV2 vô hoạt nhũ dầu thử nghiệm từ chủng

NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b). Thí nghiệm 3: lúc 4 tuần tuổi, heo ở lô thí nghiệm

(n = 6) được tiêm vắc-xin thử nghiệm (2 ml/ liều, chứa lượng kháng nguyên

106,0TCID50) và sử dụng dịch chiết tế bào PK15A trên lô đối chứng (n = 4). Sau tiêm

vắc-xin 28 ngày, tất cả heo được công cường độc bằng cách nhỏ mũi 2 ml và tiêm

bắp 2 ml với vi-rút chủng NAVET-DongNai2/2009 ở tiếp đời thứ 6 với hiệu giá

5,33log10TCID50/ml. Ở lô thí nghiệm, heo có sự chuyển đổi kháng thể ở 14 - 21 ngày

sau tiêm vắc-xin. Heo sau tiêm vắc-xin và công cường độc đều khỏe mạnh, tăng trọng

bình thường, có thời gian vi-rút huyết ngắn, bài thải vi-rút qua phân và dịch tiết mũi

với tỉ lệ thấp hơn so với heo đối chứng. Tỉ lệ heo mắc PMWS trên lô vắc-xin là 0/6

và ở lô đối chứng là 1/4. Kết quả cho thấy vắc-xin vô hoạt nhũ dầu này có khả năng

kích thích đáp ứng miễn dịch cũng như bảo hộ heo về mặt lâm sàng chống lại PCV2b,

giảm tỉ lệ heo có vi-rút huyết và giảm hiệu giá vi-rút trong mô lúc 28 ngày sau công

cường độc.

SUMMARY

The study “Genetic analysis of PCV2-ORF2 from pigs in Southern Vietnam

and study on vaccine against porcine circovirus diseases in post-weaning pigs” was

carried out from June 2012 to June 2018, in Veterinary Research Center –

NAVETCO National Veterinary Joint Stock Company, Nong Lam University Ho Chi

Minh City. The aims were to determine the prevalence of PCV2 genotypes, genetic

homology of PCV2 isolates circulating in Southern of Vietnam and research on

vaccine against porcine circovirus in post-weaning pigs based on PCV2 isolates in

this study.

Full-length ORF2 of 48 PCV2 isolates from 44 pig farms in 13 provinces in

Vietnam (including 12 Southern and 1 North Central Coast provinces) between 2007

and 2016 was analysed nucleotide sequence. The results showed that genotype

PCV2b, PCV2d and PCV2-Re (2h) (formerly classified as recombinant cluster) co-

existed, of which the most prevalent genotype was PCV2b (24/48). PCV2d genotype

was emergent and predominant, especially PCV2d-2 (15/16) from 2012 onwards.

Nucleotide homology for each genotype was 98.7% - 100% for PCV2b, 98.5 - 100%

for PCV2d-2 and 98.7 - 100% for PCV2-Re (2h). p - distance among genotypes were

quite high and range from 0.0595  0.0096 to 0.0663  0.0102.

Eighteen PCV2 strains were isolated from the PCV2 PCR positive samples,

belonged to genotype PCV2b (9 strains), PCV2d (6 strains) and PCV2-Re (2h) (3

strains). The viral titer of PCV2 isolates at the third passages in PK15A cells was in

the ranges from 1.67 to 5.50log10 TCID50/ml. Three PCV2 field strains, which the

viral titers were stably high (≥ 5.0log10 TCID50/ml) through passages, belonged to

different genotypes, namely NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b), NAVET-

LongAn2/2012 (PCV2d) and NAVET-vietnam3/2004 (PCV2-Re (2h)), were

selected as master seed for studying of PCV2 vaccines.

Applying cross neutralization test and R value (cross-reactivity value) to

determine antigenic diversity of PCV2 strains. The R value obtained by cross

neutralization test between NAVET-DongNai2/2009 and NAVET-vietnam3/2004

was 104.20%; NAVET-DongNai2/2009 and NAVET-LongAn2/2012; NAVET-

vii

LongAn2/2012 and NAVET-vietnam3/2004 were 91.60% and 91.30%, respectively.

These results indicated that no antigenic differences were found among these strains

(R > 70%).

Using binary ethylenimine (BEI) to inactivate virus for producing PCV2

antigen, BEI at 3 mM, 370C after 24 hours was able to inactivate completely NAVET-

vietnam3/2004, NAVET-DongNai2/2009 and NAVET-LongAn2/2012 strains with

inactivation rates 0.71; 0.86 and 1.33log10 TCID50 per hour, respectively.

Efficacy of experimental inactivated oil emulsion PCV2 vaccine based on

NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b) strain: Experiment 3: at 4 weeks of age, vaccine

group (n = 6) were vaccinated with the experimental PCV2 vaccine (2 ml/dose,

contains 106.0TCID50) by intramuscular route, and control group (n = 4) were injected

with 2 ml of PK15A cell extract. After 4 weeks post-vaccination, the vaccinated

together with unvaccinated controls were challenged intranasally and intramuscularly

with 4x105,33TCID50 of NAVET-DongNai2/2009 strain, and observed for 28 days

post challenge. The seroconversion started at 14 - 21 dpv in vaccinated pigs. The

vaccinated pigs had no increase in body temperature, without any clinical signs

during the experiment. The obtained results indicated that this vaccine induced

immunological responses in vaccinated pigs that appeared to provide clinically

protective against PCV2b infection. Viremia, shedding and viral load in tissues were

reduced in vaccinated pigs compared to controls.

viii

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa ............................................................................................................... i

Lời cam đoan ...............................................................................................................ii

Lời cảm ơn ................................................................................................................ iii

Tóm tắt/Summary ....................................................................................................... iv

Mục lục .................................................................................................................... viii

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt .................................................................... xii

Danh mục các bảng ................................................................................................... xv

Danh mục các hình, biểu đồ và sơ đồ .................................................................... xvii

Mở đầu ........................................................................................................................ 4

Chương 1. Tổng quan .................................................................................................. 4

1.1. Giới thiệu về PCV2 ............................................................................................................ 4

1.1.1. Phân loại PCV2 ............................................................................................................... 4

1.1.2. Đặc điểm hình thái và sức đề kháng của PCV2 ........................................................... 5

1.1.3. Đặc điểm nuôi cấy của PCV2 ........................................................................................ 6

1.2. Các bệnh do circovirus trên heo ....................................................................................... 8

1.2.1. Tên gọi ............................................................................................................................. 8

1.2.2. Đặc điểm dịch tễ ............................................................................................................. 9

1.2.3. Cơ chế sinh bệnh ........................................................................................................... 11

1.2.4. Đáp ứng miễn dịch chống PCV2 ................................................................................ 13

1.2.5. Triệu chứng và bệnh tích .............................................................................................. 17

1.2.6. Các biện pháp phòng và kiểm soát PMWS ................................................................ 18

1.3. Các nghiên cứu về di truyền của PCV2 ......................................................................... 18

1.3.1. Các nghiên cứu về biến đổi di truyền của PCV2 trên thế giới ................................. 18

1.3.2. Các nghiên cứu về biến đổi di truyền của PCV2 ở Việt Nam .................................. 21

1.4. Các nghiên cứu về vắc-xin PCV2 .................................................................................. 22

1.4.1. Các loại vắc-xin PCV2 ................................................................................................. 22

1.4.1.1. Vắc-xin cổ điển .......................................................................................................... 22

1.4.1.2. Vắc-xin thế hệ mới .................................................................................................... 23

1.4.2. Các nghiên cứu vắc-xin PCV2 ở Việt Nam ............................................................... 26

1.4.3. Hiệu quả của việc tiêm phòng vắc-xin PCV2 ............................................................ 27

1.4.3.1. Lâm sàng .................................................................................................................... 27

1.4.4.2. Cận lâm sàng .............................................................................................................. 28

1.4.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tiêm phòng vắc-xin PCV2 .............................. 30

1.4.5.1. Kháng thể thụ động ................................................................................................... 30

1.4.5.2. Quy trình tiêm phòng ................................................................................................ 31

1.4.5.3. Các tác nhân đồng nhiễm .......................................................................................... 33

1.4.5.4. Sự biến đổi di truyền của PCV2 ............................................................................... 34

1.4.6. Thất bại sau tiêm phòng vắc-xin PCV2 ...................................................................... 34

1.5. Cơ sở khoa học nghiên cứu sản xuất vắc-xin PCV2 .................................................... 35

1.5.1. Cơ sở chọn thể loại vắc-xin để nghiên cứu ................................................................ 35

1.5.2. Cơ sở chọn chủng vi-rút vắc-xin ................................................................................. 36

1.5.3. Cơ sở lựa chọn chất vô hoạt PCV2 ............................................................................. 36

1.5.4. Cơ sở lựa chọn chất bổ trợ ........................................................................................... 38

1.5.5. Tiêu chuẩn đánh giá vắc-xin ........................................................................................ 39

1.5.5.1. An toàn ........................................................................................................................ 39

1.5.5.2. Hiệu lực....................................................................................................................... 39

Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu .................................................... 43

2.1. Phạm vi và đối tượng nghiên cứu ...................................................................... 43

2.1.1. Địa điểm ......................................................................................................................... 43

2.1.2. Thời gian ........................................................................................................................ 43

2.1.3. Đối tượng ....................................................................................................................... 43

2.2. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................... 43

2.3. Vật liệu, hóa chất................................................................................................ 43

2.3.1. Vật liệu thí nghiệm ....................................................................................................... 43

2.3.2. Hóa chất và các sinh phẩm ........................................................................................... 44

2.3.3. Dụng cụ và trang thiết bị .............................................................................................. 45

2.4. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 45

2.4.1. Phân tích di truyền của PCV2 tại một số tỉnh thành Việt Nam ................................ 45

2.4.2. Khảo sát đặc tính sinh học của các chủng PCV2 phân lập ....................................... 47

2.4.2.1. Phân lập PCV2 trên môi trường tế bào PK15A ...................................................... 47

2.4.2.2. Xác định liều lượng vi-rút gây nhiễm ...................................................................... 48

2.4.2.3. Xác định thời gian thu hoạch tối ưu đối với các chủng phân lập .......................... 49

2.4.2.4. So sánh sự tương đồng kháng nguyên giữa các chủng PCV2 phân lập thuộc các genotype khác nhau ................................................................................................................. 50

2.4.2.5. Thí nghiệm 1. Đánh giá khả năng gây bệnh và tính sinh miễn dịch của chủng NAVET-DongNai2/2009 ...................................................................................................... 52

2.4.3. Nghiên cứu chế tạo vắc-xin PCV2 vô hoạt nhũ dầu ................................................. 55

2.4.3.1. Quy trình vô hoạt PCV2 ........................................................................................... 55

2.4.3.2. Chế tạo vắc-xin PCV2 vô hoạt nhũ dầu .................................................................. 56

2.4.3.3. Tính an toàn và hiệu lực của vắc-xin vô hoạt nhũ dầu thử nghiệm ...................... 56

2.5. Các kỹ thuật dùng trong nghiên cứu .................................................................. 59

2.5.1. Phương pháp ly trích ADN .......................................................................................... 59

2.5.2. Kỹ thuật PCR phát hiện PCV2 .................................................................................... 59

2.5.3. Các phương pháp huyết thanh học .............................................................................. 60

2.5.3.1. Phương pháp miễn dịch peroxidase trên tế bào một lớp định lượng kháng thể .. 60

2.5.3.2. Phương pháp ELISA phát hiện IgG ......................................................................... 60

2.5.3.3. Phương pháp trung hòa ............................................................................................. 60

2.5.4. Phương pháp phân lập PCV2 trên tế bào PK15A ..................................................... 61

2.5.5. Phương pháp chuẩn độ PCV2 ..................................................................................... 62

2.6. Xử lý thống kê .................................................................................................................. 62

Chương 3. Kết quả và thảo luận ................................................................................ 63

3.1. Phân tích di truyền của các mẫu PCV2 tại một số tỉnh thànhViệt Nam .............. 63

3.1.1. Phân tích cây phát sinh chủng loại dựa trên ORF2 của PCV2 ................................. 63

3.1.2. Phân tích đa dạng di truyền của PCV2 dựa vào ORF2 ............................................. 67

3.1.3. Đặc điểm ORF2 của các chủng PCV2 ở Việt Nam .................................................. 68

3.1.4. Phân tích sự tái tổ hợp .................................................................................................. 72

3.2. Kết quả phân lập PCV2 và đặc tính nuôi cấy của một số phân lập PCV2 ............. 78

3.2.1. Kết quả phân lập PCV2 từ các mẫu thực địa ............................................................. 78

3.2.2. Xác định liều lượng gây nhiễm của chủng NAVET-DongNai2/2009 trên tế bào PK15A ...................................................................................................................................... 82

3.2.3. Khả năng gây bệnh tích tế bào ..................................................................................... 83

3.2.4. Khả năng nhân lên của PCV2 trên môi trường tế bào PK15A ................................ 85

3.2.5. Tính ổn định .................................................................................................................. 86

3.3. Sự tương đồng kháng nguyên giữa các phân lập PCV2 thuộc các genotype khác nhau ........................................................................................................................... 87

3.4. Thí nghiệm 1: Khả năng gây bệnh và tính sinh miễn dịch của chủng NAVET- DongNai2/2009 .......................................................................................................... 89

3.5. Kết quả vô hoạt PCV2 ......................................................................................... 97

3.5.1. Vô hoạt PCV2 với các nồng độ chất vô hoạt khác nhau .......................................... 97

3.5.2. Kết quả vô hoạt ba chủng PCV2 phân lập với nồng độ BEI 3 mM ...................... 100

3.6. Đánh giá an toàn và hiệu lực của vắc-xin PCV2 vô hoạt nhũ dầu thử nghiệm chủng NAVET-DongNai2/2009 ............................................................................. 103

3.6.1. Thí nghiệm 2 ............................................................................................................... 103

3.6.2. Thí nghiệm 3 ............................................................................................................... 107

Chương 4. Kết luận và đề nghị ............................................................................... 124

Danh mục các công trình đã công bố của tác giả .................................................... 126

Tài liệu tham khảo ................................................................................................... 127

Phụ lục ..................................................................................................................... 155

xii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

A-xít a-min

Amino acid aa

AAHL Australian Animal Health Laboratory Phòng thí nghiệm sức khỏe động vật quốc gia Úc

Deoxyribonucleic acid ADN

ARN Ribonucleic acid

Base pair bp

Capsid Cap

CD/CD Cesarean-derived colostrum- deprived Mổ lấy thai và không bú sữa đầu

Dendritic cell Tế bào tua DC

Day post-challenge Ngày sau gây nhiễm dpc

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Phản ứng miễn dịch hấp phụ nối kết enzyme

FAID Fluorescent antibody infectious dose Liều gây nhiễm được xác định bằng kháng thể huỳnh quang

Fetal cardinomonocyte Tế bào đơn nhân tim thai FCM

Cản nhiễm tố Interferon IFN

Interleukin IL

IPMA Immunoperoxidase monolayer assay Phương pháp miễn dịch peroxidase trên tế bào một lớp

Immunoperoxidase IPX Phương pháp nhuộm miễn dịch peroxidase

Kilobase kb

kilodalton kDa

xiii

Multiplicity of infection Tỷ số gây nhiễm MOI

Natural interferon producing cell Tế bào tiết interferon tự nhiên NIPC

Natural killer cell Tế bào giết tự nhiên NK

Nucleotide nt

Open reading frame Khung đọc mở ORF

Origin of replication Gốc sao chép Ori

Porcine alveolar macrophages Đại thực bào phế nang của heo PAM

Peripheral blood mononuclear cell Tế bào đơn nhân máu ngoại vi PBMC

Polymerase chain reaction tạo chuỗi do PCR

Phản ứng polymerase

Porcine circovirus type 2 PCV2

Porcine circovirus diseases PCVD Các bệnh do circovirus trên heo

PDNS Porcine dermatitis and nephropathy syndrome Hội chứng viêm da và bệnh lý thận ở heo

Pig kidney 15A Tế bào thận heo dòng 15A PK15A

PMWS Postweaning multisystemic wasting syndrome Hội chứng còi trên heo sau cai sữa

Viêm phổi hoại tử và tăng sinh PNP Proliferative and necrotising pneumonia

Porcine parvovirus PPV

PRRS Porcine reproductive and respiratory syndrome Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo

Replicase Rep

Standard error Sai số chuẩn SE

Standard deviation Độ lệch chuẩn SD

S phase Synthesis phase Pha tổng hợp

xiv

TCID Tissue culture infectious dose Liều gây nhiễm tế bào

TLR Toll-like receptor Thụ thể giống Toll

TNF Tumor necrosis factor Yếu tố hoại tử khối u

VNT Virus neutralization test Xét nghiệm trung hòa vi-rút

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Tóm tắt triệu chứng và bệnh tích bệnh PCVD ......................................... 17

Bảng 1.2. Tổng kết các nghiên cứu về vắc-xin PCV2 ............................................. 25

Bảng 1.3. Các loại vắc-xin PCV2 thương mại ở Việt Nam ..................................... 27

Bảng 2.1. Các mẫu dương tính ADN-PCV2 thu nhận từ năm 2007 đến 2016 ........ 46

Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm phản ứng trung hòa chéo giữa 3 chủng PCV2 phân lập ... 50

Bảng 3.1. Khoảng cách di truyền trong cùng genotype và giữa các genotype lưu hành

ở các tỉnh thành Việt Nam từ năm 2007 đến 2016 ................................... 68

Bảng 3.2. Các a-xít a-min của protein Cap khác nhau giữa các genotype PCV2 ..... 69

Bảng 3.3. Mức độ tương đồng về trình tự nucleotide và a-xít a-min giữa các chủng

PCV2 ........................................................................................................ 71

Bảng 3.4. Phần trăm tương đồng giữa các mẫu PCV2-Re (2h) với chủng bố mẹ giả định

dựa trên ORF2 .................................................................................................. 72

Bảng 3.5. Kết quả phân lập PCV2 trên môi trường tế bào PK15A .......................... 79

Bảng 3.6. Hiệu giá của các chủng NAVET-DongNai2/2009, NAVET-LongAn2/2012

và NAVET-vietnam3/2004 qua các lần tiếp đời trên tế bào PK15A ....... 86

Bảng 3.7. Hiệu giá kháng thể trung hòa của phản ứng trung hòa chéo giữa huyết thanh

heo với các genotype PCV2 phân lập ...................................................... 88

Bảng 3.8. Hệ số tương đồng kháng nguyên R giữa ba chủng PCV2 khảo sát .......... 88

Bảng 3.9. Khối lượng và điểm thể trạng heo thí nghiệm 1 ....................................... 89

Bảng 3.10. Tăng trọng bình quân hàng ngày trên heo ở thí nghiệm 1 ...................... 90

Bảng 3.11. Phát hiện ADN-PCV2 trong huyết thanh và mô của heo ở thí nghiệm 1 ... 91

Bảng 3.12. Số lượng bạch cầu của heo ở thí nghiệm 1 ............................................. 92

Bảng 3.13. Diễn biến kháng thể chống PCV2 trên heo ở thí nghiệm 1 ................. 93

Bảng 3.14. Hiệu giá vi-rút chủng NAVET-DongNai2/2009 theo thời gian vô hoạt ở

các nồng độ BEI ...................................................................................... 97

Bảng 3.15. Hiệu giá vi-rút của ba chủng PCV2 phân lập giảm theo thời gian vô hoạt

ở nồng độ BEI 3 mM .............................................................................. 101

xvi

Bảng 3.16. Khối lượng ban đầu và tăng trọng bình quân hàng ngày trên heo ở thí

nghiệm 2 ................................................................................................. 103

Bảng 3.17. Diễn biến kháng thể chống PCV2 trên heo ở thí nghiệm 2 .................. 105

Bảng 3.18. Khối lượng và điểm thể trạng heo thí nghiệm 3 ................................... 108

Bảng 3.19. Tăng trọng bình quân hàng ngày của heo ở thí nghiệm 3 .................... 108

Bảng 3.20. Diễn biến kháng thể chống PCV2 trên heo ở thí nghiệm 3 .................. 110

Bảng 3.21. Số lượng bạch cầu ở heo sau công cường độc ở thí nghiệm 3 ............. 115

Bảng 3.22. Phát hiện ADN-PCV2 trong huyết thanh, mẫu ngoáy mũi và mẫu ngoáy

trực tràng trên heo sau công cường độc ở thí nghiệm 3 ......................... 116

Bảng 3.23. Hiệu giá vi-rút ở mô heo thí nghiệm 3, mổ khảo sát lúc 28 dpc .......... 119

xvii

DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ VÀ SƠ ĐỒ

Hình 1.1. Hình ảnh PCV2 dưới kính hiển vi điện tử ................................................. 6

Hình 1.2. Cấu trúc bộ gen PCV2 ............................................................................... 7

Hình 2.1. Tóm tắt nội dung nghiên cứu ................................................................... 44

Hình 2.2. Mô tả thiết kế thí nghiệm 1 ....................................................................... 52

Hình 2.3. Mô tả thiết kế thí nghiệm 2 ...................................................................... 57

Hình 2.4. Mô tả thiết kế thí nghiệm 3 ...................................................................... 58

Hình 3.1. Cây phát sinh chủng loại của các chủng PCV2 dựa trên trình tự nucleotide

ORF2 ..................................................................................................................... 65

Hình 3.2. Phân tích các mẫu PCV2-Re (2h) bằng phần mềm RDP4 v.4.39 dựa trên

ORF2 ........................................................................................................ 74

Hình 3.3. So sánh nucleotide giữa các mẫu PCV2-Re (2h) và chủng bố mẹ .......... 77

Hình 3.4. Điện di sản phẩm PCR 760 bp để phát hiện ADN-PCV2......................... 80

Hình 3.5. Phản ứng IPMA phát hiện PCV2 phân lập trên môi trường tế bào PK15A ....... 80

Hình 3.6. Heo 16 tuần tuổi có biểu hiện viêm da...................................................... 81

Hình 3.7. Thai khô ở các giai đoạn khác nhau ......................................................... 81

Hình 3.8. Hình dạng tế bào tế bào PK15A nhiễm PCV2 ......................................... 84

Hình 3.9a. Nang bạch huyết bình thường ở heo đối chứng ..................................... 96

Hình 3.9b. Suy giảm tế bào lym-phô và xuất hiện tế bào đa nhân khổng lồ ở nang

bạch huyết ................................................................................................ 96

Hình 3.10a. Phổi heo đối chứng ............................................................................... 96

Hình 3.10b. Viêm phổi kẽ ........................................................................................ 96

Hình 3.11. Điện di sản phẩm PCR phát hiện ADN-PCV2 trong dịch tế bào ........ 100

Hình 3.12. Nhuộm IPX xác định sự hiện diện của PCV2 trong tế bào PK15A ..... 100

Hình 3.13. Điện di sản phẩm PCR phát hiện ADN-PCV2 trong dịch tế bào ......... 102

Hình 3.14. Các bệnh tích đại thể trên heo sau công cường độc 28 ngày ............... 120

Hình 3.15. Các bệnh tích vi thể trên heo sau công cường độc 28 ngày ................. 121

xviii

Biểu đồ 3.1. Phân bố theo thời gian của các mẫu PCV2 thu thập ở miền Nam Việt

Nam từ năm 2007 đến 2016 .................................................................... 67

Biểu đồ 3.2. Phân bố theo địa lý của các mẫu PCV2 thu thập ở miền Nam Việt Nam

từ năm 2007 đến 2016 ............................................................................. 67

Biểu đồ 3.3. Phân tích tương đồng của các mẫu PCV2-Re (2h) và 2 chủng bố mẹ giả

định ......................................................................................................................... 73

Biểu đồ 3.4. Hiệu giá vi-rút theo hệ số MOI và thời gian thu hoạch của chủng

NAVET-DongNai2/2009 ........................................................................ 83

Biểu đồ 3.5. Đường cong sinh trưởng của các chủng NAVET-DongNai2/2009, NAVET-

LongAn2/2012 và NAVET-vietnam3/2004 trên tế bào PK15A .................. 86

Biểu đồ 3.6. Diễn biến đáp ứng kháng thể trên heo ở thí nghiệm 1 ......................... 94

Biểu đồ 3.7. Khuynh hướng giảm hiệu giá vi-rút theo thời gian vô hoạt ở các nồng

độ BEI ............................................................................................. 98

Biểu đồ 3.8. Khuynh hướng giảm hiệu giá vi-rút của các chủng PCV2 theo thời gian

vô hoạt ở nồng độ BEI 3 mM ................................................................ 102

Biểu đồ 3.9. Diễn biến đáp ứng kháng thể trên heo ở thí nghiệm 2 ....................... 106

Biểu đồ 3.10. Diễn biến đáp ứng kháng thể chống PCV2 trên heo thí nghiệm 3 ... 112

Biểu đồ 3.11. Tỉ lệ phát hiện ADN-PCV2 trong huyết thanh, mẫu ngoáy mũi và mẫu

ngoáy trực tràng, hiệu giá kháng thể trung hòa chống PCV2 ở heo sau công

cường độc .............................................................................................. 117

MỞ ĐẦU

Porcine circovirus type 2 (PCV2) liên quan đến một số bệnh trên heo, gọi chung

là các bệnh do circovirus trên heo (procine circovirus diseases – PCVD) (Segalés,

2012). Trong đó, đáng lưu ý nhất là hội chứng còi trên heo sau cai sữa (postweaning

multisystemic wasting syndrome - PMWS) làm gia tăng tỉ lệ heo chết và loại thải, tăng

tiêu tốn thức ăn và giảm tăng trọng, vì thế gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến hiệu quả

kinh tế trong chăn nuôi heo. Ngoài ra, PCV2 còn gây ảnh hưởng bất lợi lên đáp ứng

miễn dịch sau tiêm vắc-xin phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo

(porcine reproductive respiratory syndrome) (Opriessnig và ctv, 2006a).

Trước khi có vắc-xin PCV2 thì việc phòng PCVD chủ yếu dựa vào các biện

pháp quản lý, an toàn sinh học và kiểm soát yếu tố đồng nhiễm. Đến nay, có khá

nhiều nghiên cứu về vắc-xin PCV2, bao gồm cả loại vắc-xin dạng cổ điển và loại dựa

trên các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại; nhiều loại đã được thương mại hóa. Các

nghiên cứu thí nghiệm và thực địa đã chứng minh hiệu quả của việc phòng PMWS

bằng vắc-xin như cải thiện tăng trọng bình quân hàng ngày, giảm tỷ lệ chết, tỷ lệ loại

thải, giảm lượng vi-rút bài thải cũng như giảm bệnh tích vi thể ở các mô bạch huyết

(Kristensen và ctv, 2011; Fraile và ctv, 2012a; Seo và ctv, 2014b).

Hiện nay, vắc-xin PCV2 được sử dụng rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới

trong đó có Việt Nam. Tuy nhiên, các loại vắc-xin PCV2 thương mại lưu hành tại

Việt Nam hiện hành đều là ngoại nhập, và đa số dựa trên genotype PCV2a. Trong khi

đó, PCV2 lưu hành ở Việt Nam thuộc genotype PCV2b, PCV2d và nhóm tái tổ hợp

(Nguyễn Ngọc Hải và ctv, 2013; Huỳnh Thị Mỹ Lệ và ctv, 2012, 2013; Phạm Hồng

Quân và ctv, 2017). Ngoài ra, một số kết quả nghiên cứu cho thấy, genotype của

PCV2 có thể ảnh hưởng đến hiệu quả phòng PMWS bằng vắc-xin (Takahagi và ctv,

2010; Opriessnig và ctv, 2013a). Do đó, việc nghiên cứu chế tạo vắc-xin từ chủng

PCV2 thuộc genotype lưu hành phổ biến ở Việt Nam là cần thiết, nhằm giúp chủ

động nguồn cung vắc-xin, góp phần kiểm soát hiệu quả bệnh PMWS, cũng như giảm

giá thành chăn nuôi. Để góp phần giải quyết các vấn đề thực tiễn trên, đề tài: “PHÂN

TÍCH TRÌNH TỰ ORF2 CỦA PCV2 TỪ HEO NUÔI Ở MỘT SỐ TỈNH PHÍA NAM

VÀ NGHIÊN CỨU VẮC-XIN PHÒNG BỆNH LIÊN QUAN PCV2 TRÊN HEO

SAU CAI SỮA” được tiến hành.

Mục tiêu nghiên cứu

 Xác định genotype và đánh giá sự tương đồng di truyền của PCV2 lưu hành

tại một số tỉnh thành ở Việt Nam.

 Nghiên cứu chế tạo vắc-xin phòng bệnh liên quan PCV2 trên heo sau cai sữa dựa

trên chủng phân lập của đề tài.

Những đóng góp mới về khoa học và thực tiễn từ các kết quả nghiên cứu này

Nghiên cứu được sự lưu hành, đa dạng di truyền và tương đồng gen của các

chủng PCV2 phân lập ở heo tại Việt Nam.

Phân lập được một số chủng PCV2 làm nguồn gen trong việc nghiên cứu chế

tạo vắc-xin và các ứng dụng công nghệ sinh học khác.

Chế tạo thành công vắc-xin vô hoạt nhũ dầu bằng chủng PCV2b phân lập ngoài

thực địa phòng bệnh liên quan PCV2 trên heo sau cai sữa.

Chương 1

TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu về PCV2

1.1.1. Phân loại PCV2

Porcine circovirus (PCV) thuộc giống Circovirus, họ Circoviridae. Dựa vào

kích thước virion và cấu trúc bộ gen của vi-rút, Ủy ban quốc tế về phân loại vi-rút

(International Committee on Taxonomy of Viruses - ICTV) năm 2017 chia họ

Circoviridae thành 2 giống là Circovirus và Cyclovirus (Breitbart và ctv, 2017).

Porcine circovirus gồm 3 type là PCV1, PCV2 và PCV3 (Rosario và ctv, 2017;

Lefkowitz và ctv, 2018).

Dựa vào kết quả phân tích bộ gen, các nhà nghiên cứu còn phân chia PCV2

thành các genotype. Grau-Roma và ctv (2008) đã đề ra một định nghĩa cho các

genotype PCV2, dựa trên các so sánh trình tự theo cặp (PAirwise Sequence

Comparisions - PASC) để xác định mức độ biến đổi di truyền (p), giá trị này được

tính toán bằng cách chia số nucleotide khác nhau cho tổng số nucleotide so sánh giữa

các bộ gen (Kumar và ctv, 2001). Kết quả là xây dựng một khoảng cách p và biểu đồ

tần số cho phép xác định các giá trị ngưỡng để phân biệt các genotype với nhau

(Rogers và Harpending, 1992; Biagini và ctv, 1999). Có 2 cách để phân chia các

genotype của PCV2: (1) dựa trên sự phân tích toàn bộ bộ gen PCV2 với giá trị ngưỡng

p = 0,02 (Grau-Roma và ctv 2008); (2) dựa trên mức độ biến đổi di truyền của ORF2

thì giá trị ngưỡng p = 0,035 (Segalés và ctv, 2008). Gần đây, Franzo và Segalés (2018)

đề xuất cách phân loại genotype PCV2 dựa trên 3 tiêu chí, đó là khoảng cách di truyền

(p-diastance) tối đa giữa các genotype (intra-genotype) là 13% (dựa trên trình tự

ORF2), giá trị bootstrap ở các nút (node) > 70% và có ít nhất 15 trình tự chuỗi có sẵn.

Các phân lập PCV2 được chia thành 8 genotype chính là PCV2a, PCV2b,

PCV2c, PCV2d (trước đây còn gọi là mutant PCV2b, viết tắt là mPCV2b), PCV2e

(Xiao và ctv, 2015; Davies và ctv, 2016), PCV2f (Bao và ctv, 2017), PCV2g và

PCV2h (Franzo và Segalés, 2018). Dựa vào kết quả phân tích cây phát sinh chủng

loại, Xiao và ctv (2015) phân PCV2d thành 2 subgenotype đó là PCV2d-1 và PCV2d-

2. Ngoài ra, còn có sự hiện diện của nhóm PCV2 tái tổ hợp (recombinant cluster) còn

được gọi là các chủng trung gian (intermediate strains) trong thực địa (Cai và ctv,

2012; Xiao và ctv, 2015; Franzo và ctv, 2016). Nhóm tác giả Franzo và ctv (2016) đã

phân tích 898 trình tự chuỗi nucleotide ở 32 quốc gia từ năm 1980 đến 2014 (dữ liệu

thu thập từ GenBank). Kết quả cho thấy có đến 33% (304/898) trình tự chuỗi

nucleotide được nhận dạng là tái tổ hợp. Hầu hết các quốc gia ở khắp các châu lục

đều có sự lưu hành của nhóm tái tổ hợp, trong đó có Việt Nam. Đáng lưu ý, theo cách

phân loại mới của Franzo và Segalés (2018) một số chủng PCV2 trước đây được xếp

vào nhóm tái tổ hợp (recombinant cluster) nay được xếp vào genotype PCV2g và

PCV2 của Việt Nam đăng ký trên GenBank (đến thời điểm ngày 5 tháng 7 năm 2018) được

xếp vào PCV2h mà trước đây các chủng này được xếp vào nhóm tái tổ hợp. Vì thế, trong

PCV2f. Kết quả phân tích của Franzo và Segalés (2018) cho thấy có đến 45/75 chủng

phần trình bày này các chủng trước đây được xếp vào nhóm tái tổ hợp nhưng nay

theo cách phân loại mới được xếp vào PCV2h sẽ được viết tắt là PCV2-Re (2h).

1.1.2. Đặc điểm hình thái và sức đề kháng của PCV2

PCV có kích thước rất nhỏ, đường kính khoảng 17 ± 1,3 nm, không có vỏ bọc

(Tischer và ctv, 1982). Virion hình cầu, đối xứng 20 mặt, với 60 phân tử protein

capsid (Crowther và ctv, 2003), chứa ADN sợi đơn dạng vòng kích thước khoảng

1,76 - 1,77 kb (Meehan và ctv, 1997; 1998).

PCV rất ổn định ở điều kiện khác nhau của môi trường, đề kháng rất cao với

nhiệt độ và pH: ổn định ở pH = 3, nhiệt độ 560C và 700C trong 15 phút. Các thí

nghiệm in vitro cho thấy, PCV2 đề kháng với nhiệt độ khô, khả năng gây nhiễm của

PCV2 giảm tương ứng 0,75log và 1,25log sau khi xử lý nhiệt độ khô ở 800C trong

vòng 72 giờ và 1200C trong vòng 30 phút (Welch và ctv, 2006). PCV2 bị bất hoạt ở

nhiệt độ ướt 800C trong 15 phút (O'Dea và ctv, 2008). Ở pH = 2, trong vòng 30 phút,

hiệu giá PCV2 giảm từ 5,5 log xuống còn 2,7 log (Kim và ctv, 2009c). Tính gây

nhiễm của PCV2 giảm đáng kể ở pH = 11 và hầu như biến mất ở pH = 12 (Lyoo,

2009). Hiệu giá vi-rút cũng giảm bởi một số chất sát trùng gốc kiềm (ví dụ như

NaOH), các tác nhân oxy hóa (ví dụ như sodium hypochlorite) hoặc amonium bậc 4

(Royer và ctv, 2001; Martin và ctv, 2008). PCV2 đề kháng với chloroform, các chế

phẩm chứa cồn, iodine, formaldehyde và phức hợp chlohexidine.

(A) (B)

Hình 1.1. Hình ảnh PCV2 dưới kính hiển vi điện tử. (A) Hình ảnh PCV2 dưới

kính hiển vi điện tử (Allan và ctv, 2012). (B) Hình ảnh PCV2 dưới kính hiển vi điện

tử lạnh (Cryo-electron microscopy) (Nguồn: King và ctv, 2012)

1.1.3. Đặc điểm nuôi cấy của PCV2

PCV2 là vi-rút phát triển chậm, một chu kỳ nhân lên của PCV2 trên tế bào

PK15 mất khoảng 30 - 36 giờ (Cheung và Bolin, 2002; Meerts và ctv, 2005a). PCV2

nhân lên trong tế bào dòng thận heo PK15 và cũng nhân lên trong một số loại tế bào

tế bào sơ cấp như tế bào đơn nhân tim thai (fetal cardinomonocyte - FCM), đại thực

bào phế nang heo (porcine alveolar marcophage - PAM), tế bào đơn nhân máu ngoại

vi (peripheral blood mononuclear cell - PBMC), tế bào tua (dendritic cell - DC) nhưng

hiệu giá vi-rút đạt được rất thấp (Gilpin và ctv, 2003; Vincent và ctv, 2003; Meerts

và ctv, 2005a; Chang và ctv, 2006; Yu và ctv, 2007b). Kết quả nghiên cứu của Allan

và ctv (1994) về một số đặc tính sinh học của PCV cho thấy, PCV cũng có thể nhân

lên trên các tế bào có nguồn gốc từ heo và tế bào Vero, các tế bào sơ cấp từ bò và cừu

cũng nhạy cảm với PCV nhưng không thể tiếp đời PCV trên các tế bào này.

1.1.4. Cấu trúc bộ gen PCV2

PCV2 chứa ADN sợi đơn dạng vòng kích thước từ 1.766 đến 1.768 nucleotide

(Hamel và ctv, 1998; Meehan và ctv, 1998; Guo và ctv, 2010). Bộ gen PCV2 được sắp

xếp thành 11 khung đọc mở giả định (open reading frames - ORF). Trong đó, ORF1,

ORF5, ORF7 và ORF10 nằm trên chuỗi dương cùng chiều kim đồng hồ, ngược lại các

ORF2, 3, 4, 6, 8, 9 và 11 nằm trên chuỗi bổ sung và ngược chiều kim đồng hồ (Hamel

và ctv, 1998). Ở vùng trung gian lớn giữa ORF1 và ORF2 chứa gốc sao chép (Origin

of DNA replication - Ori), có một cấu trúc cuống - vòng (stem - loop), giúp PCV2 nhân

lên theo cơ chế vòng tròn lăn. Đến nay, chỉ xác định được 4 khung đọc mở mã hóa

protein đó là ORF1, 2, 3 và 4 (Hình 1.2), riêng protein được mã hóa từ ORF5 cũng đã

được nghiên cứu, tuy nhiên, cần phải tiếp tục nghiên cứu thêm để xác định vai trò cụ

thể của protein này (Lv và ctv, 2015).

Hình 1.2. Cấu trúc bộ gen PCV2. ORF1 (màu đỏ) mã hóa protein Rep và Rep’. ORF2 (màu xanh dương) mã hóa protein Cap. ORF3 (màu xanh lá cây) mã hóa protein ORF3. ORF4 (màu vàng) mã hóa protein ORF4. Gốc sao chép (Ori) nằm ở vùng trung gian giữa các điểm bắt đầu của 2 khung đọc ORF1 và ORF2. H1, H2, H3 và H4 là các hexanucleotide (Faurez và ctv, 2009)

ORF1 còn được gọi là gen Rep, dài 945 nucleotide, nằm trên chuỗi dương và

theo chiều kim đồng hồ, là vùng rất bảo tồn của giống Circovirus, mã hóa protein không

cấu trúc là enzyme Rep (helicase) chứa 314 aa và Rep’ (nickase) chứa 178 aa. Đây là

hai protein rất cần thiết cho sự nhân lên của ADN-PCV trong tế bào ký chủ (Mankerts

và Hillenbrand, 2001; Cheung, 2003). Protein Rep đóng vai trò quan trọng trong đáp

ứng miễn dịch qua trung gian tế bào đối với PCV2. Do bởi Rep là protein cần thiết cho

sự nhân lên của PCV2, các đáp ứng miễn dịch chống lại protein này có lẽ cũng đóng

vai trò quan trọng trong việc chế ngự sự nhân lên của PCV2 và ngăn chặn tiến trình

chuyển từ trạng thái nhiễm PCV2 sang PMWS trên heo (Fort và ctv, 2010).

ORF2 còn gọi là gen Cap, nằm trên chuỗi bổ sung và theo chiều ngược chiều

kim đồng hồ, dài từ 702 đến 708 nucleotide, mã hóa protein cấu trúc duy nhất Cap

(capsid) chứa 233-235 aa (Mankertz và ctv, 2000; Nawagitgul và ctv, 2000; Guo và

ctv, 2010), là protein sinh miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào đối

với PCV2 (Mahé và ctv, 2000; Blanchard và ctv, 2003; Fort và ctv, 2010), có chức

năng rất quan trọng trong việc giúp vi-rút bám và xâm nhập vào tế bào ký chủ (Khayat

và ctv, 2011). Sự biến đổi di truyền xảy ra ở protein Cap có thể có ảnh hưởng rất lớn

đến độc lực của PCV2 in vivo cũng như khả năng nhân lên của vi-rút in vitro (Fenaux

và ctv, 2004b). Vì thế, hầu hết các nghiên cứu về PCV2 như chẩn đoán, phân tích di

truyền, miễn dịch và vắc-xin đều tập trung vào ORF2 và protein Cap.

ORF3 ở vị trí hoàn toàn trùng lắp với ORF1, nó nằm trên chuỗi bổ sung và

ngược chiều kim đồng hồ, dài 315 nucleotide mã hóa protein chứa 104 aa (Hamel và

ctv, 1998; Meehan và ctv, 1998; Morozov và ctv, 1998). Protein ORF3 của PCV2 có

liên quan đến sự chết theo chương trình (apoptosis) của tế bào nuôi cấy in vitro và tác

động lên sự sinh bệnh của vi-rút in vivo (Liu và ctv, 2006).

ORF4 ở vị trí hoàn toàn trùng lắp và cùng chiều với ORF3, dài 180 nucleotide,

mã hóa chuỗi protein chứa 59 aa, protein này không cần thiết cho sự nhân lên của

PCV2, nhưng đóng vai trò trong việc ngăn chặn hoạt động caspase và điều hòa lym-

phô T CD4+ and CD8+ trong suốt quá trình nhiễm PCV2 (He và ctv, 2013).

1.2. Các bệnh do circovirus trên heo

1.2.1. Tên gọi

Hội chứng còi trên heo sau cai sữa (post weaning multisystemic wasting

syndrome - PMWS) được mô tả đầu tiên vào năm 1991 ở Canada như là một bệnh lẻ tẻ.

Biểu hiện đặc trưng của hội chứng này là giảm tăng trọng một cách nhanh chóng, suy hô

hấp và da tái nhợt ở heo sau cai sữa (Clark, 1996; Harding, 1996). Sau đó, có nhiều bằng

chứng chứng minh, ngoài PMWS, PCV2 còn liên quan đến một số bệnh khác trên heo

như bệnh rối loạn sinh sản (West và ctv, 1999), hội chứng viêm da và bệnh lý thận

(porcine dermatitis and nephropathy syndrome - PDNS) (Rosell và ctv, 2000), bệnh hô

hấp phức hợp trên heo (porcine respiratory disease complex – PRDC) (Thacker và

Thacker, 2000), bệnh viêm phổi hoại tử và tăng sinh (proliferative and necrotising

pneumonia – PNP) (Allan và Ellis, 2000), bệnh viêm ruột (Jensen và ctv, 2006).

Năm 2002, Allan và ctv (2000) đã đề xuất thuật ngữ “các bệnh do circovirus trên

heo” (porcine circovirus diseases - PCVD), tên gọi này được sử dụng phổ biến ở châu

Âu. Tương tự, năm 2006, Hiệp hội các nhà Thú y Mỹ (American Association of Swine

Veterinarians - AASV) đã đưa ra thuật ngữ “các bệnh liên quan circovirus trên heo”

(porcine circovirus associated diseases - PCVAD) (http://www.aasv.org) để chỉ tất cả

các bệnh liên quan đến PCV2 xảy ra trên heo. Harding (2007) cho rằng, cần có một tên

gọi thống nhất cho hội chứng này vì đây là một bệnh toàn cầu có cùng tác nhân gây bệnh,

cùng sinh bệnh học và cùng biểu hiện bệnh. Để thống nhất trong cách gọi tên, Segalés

(2012) sử dụng thuật ngữ “các bệnh do circovirus trên heo” (PCVD) để chỉ tất cả các

bệnh đã đề cặp ở trên, bao gồm cả trường hợp nhiễm PCV2 tiềm ẩn.

Cho đến nay, các nghiên cứu chứng minh mối liên quan giữa nhiễm PCV2 và

sự phát triển thành bệnh chỉ thành công đối với PMWS (Allan và ctv, 1999; Bolin và

ctv, 2001) và đối với rối loạn sinh sản (Sanchez và ctv, 2001; Mateusen và ctv, 2007).

Các mối liên hệ giữa PCV2 và các tình trạng bệnh khác chỉ dựa trên nghiên cứu hồi

cứu và hoặc dựa vào các ca lâm sàng (Segalés và ctv, 2005a; Segalés, 2012).

1.2.2. Đặc điểm dịch tễ

1.2.2.1. Phân bố địa lý

PCV2 phổ biến khắp nơi trên thế giới, cả nơi phát hiện PCVD hoặc những nơi

không có PCVD (Allan và Ellis, 2000; Segalés và ctv, 2004). Điều thú vị là ở châu

Úc cũng có sự hiện diện của PCV2, nhưng quốc gia này được xem là không có PMWS

(Raye và ctv, 2005; Finlaison và ctv, 2007).

1.2.2.2. Loài cảm thụ, lứa tuổi, tỷ lệ mắc bệnh

- Loài cảm thụ: heo là ký chủ tự nhiên của cả PCV1 và PCV2 (Segalés và

Domingo, 2002). Heo rừng có thể mắc PMWS (Ellis và ctv, 2003; Schulze và ctv,

2004; Lipej và ctv, 2007) nhưng tầm quan trọng về mặt dịch tễ của việc nhiễm PCV2

trên các loài này thì không rõ (Vicente và ctv, 2004).

Mặc dù các nghiên cứu đầu tiên cho thấy PCV có thể nhiễm trên người, bò và

chuột (Tischer và ctv, 1995; Nayar và ctv, 1999), các khảo sát huyết thanh học trên bò,

dê, ngựa, chó, mèo, chuột và người cho thấy không có bằng chứng về việc nhiễm PCV

trên các loài này (Allan và ctv, 2000; Ellis và ctv, 2001). Gây nhiễm thí nghiệm PCV2

trên cừu và thỏ cho thấy không có sự chuyển đổi huyết thanh cũng như phát triển bệnh

tích (Allan và ctv, 2000; Quintana và ctv, 2002).

- Lứa tuổi mắc bệnh: tất cả các lứa tuổi heo đều nhiễm PCV2. PMWS thường

ảnh hưởng trên heo từ 5 đến 18 tuần tuổi, phần lớn các ca PMWS xảy ra trên heo từ

6 đến 10 tuần tuổi, viêm ruột do PCV2 thường thấy trên heo từ 8 đến 16 tuần tuổi,

PDNS ảnh hưởng trên heo các lứa tuổi gồm heo sau cai sữa, heo choai và heo lớn

(Drolet và ctv, 1999).

- Tỉ lệ nhiễm: Trước khi vắc-xin PCV2 được thương mại hóa, các khảo sát

huyết thanh học cho thấy sự nhiễm PCV2 lan rộng khắp toàn cầu, với tỉ lệ dương tính

huyết thanh lên đến 100% tùy thuộc vào lứa tuổi, quy mô đàn. Tỉ lệ bệnh trên đàn

mắc PMWS thường dao động từ 4-30% (đôi khi lên đến 50 - 60%) và tỉ lệ chết từ 4 -

20% (Segalés và Domingo, 2002). Tỉ lệ nhiễm PDNS rất thấp chỉ khoảng dưới 1%

(Segalés và ctv, 1998).

Theo thống kê của Madson (2018), sau khi áp dụng việc tiêm vắc-xin PCV2

rộng rãi, gần như 100% ở Mỹ, tỉ lệ các ca mắc PCVD giảm từ 14% vào năm 2006

xuống còn khoảng 2 - 6% vào các năm từ 2008 - 2017.

1.2.2.3. Chất chứa vi-rút

Trên heo nhiễm PCV2, các chất tiết (mũi, mắt, phế quản), phân, nước bọt,

nước tiểu, sữa, tinh dịch và hạch hạnh nhân đều có chứa vi-rút (Krakowka và ctv,

2000; Shibata và ctv, 2003; 2006; Segalés và ctv, 2005b; Ha và ctv, 2009; Park và

ctv, 2009). Kết quả gây nhiễm PCV2 thí nghiệm trên heo CD/CD (cesarean-derived

colostrum-deprived – heo con được sinh mổ và không bú sữa đầu) của Okuda và ctv

(2003) cho thấy, PCV2 hiện diện trong huyết thanh, dịch ngoáy mũi, và trực tràng,

cũng như ở hầu hết các mô lym-phô như nốt bạch huyết, lách, hạch hạnh nhân và các

tổ chức khác như tim, phổi, gan và ruột non của heo được gây nhiễm. Có sự hiện diện

của PCV2 trong thai sẩy hoặc heo mới sinh trên nái sẩy thai và sinh non do bị nhiễm

PCV2 trong thời gian mang thai (Park và ctv, 2005). Ngoài ra, PCV2 cũng hiện diện

với lượng khá lớn trong bệnh tích cơ tim viêm của thai sẩy hoặc thai gỗ trong trường

hợp nái có vấn đề về sinh sản (Brunborg và ctv, 2007).

1.2.2.4. Đường truyền lây

PCV2 truyền ngang chủ yếu qua đường mũi miệng. Đây chính là cơ sở để gây

nhiễm PCV2 thí nghiệm trên heo bằng đường mũi (intranasal) (Allan và ctv, 1999;

Balasch và ctv, 1999; Krakowka và ctv, 2000; Rovira và ctv, 2002). Khả năng truyền

ngang của PCV2 được chứng minh bằng cách nhốt lẫn giữa heo không nhiễm và heo

nhiễm (Albina và ctv, 2001; Bolin và ctv, 2001). PCV2 truyền lây qua tiếp xúc trực

tiếp giữa các heo được nuôi chung với nhau mạnh hơn là giữa các heo được nuôi ở

các ô chuồng khác nhau (Andraud và ctv, 2008). PCV2 còn có thể lây nhiễm cho heo

qua đường miệng khi cho heo ăn các mô chưa được nấu chín từ các heo bị vi-rút huyết

(Opriessnig và ctv, 2009b). Ngoài ra, PCV2 còn lây gián tiếp giữa các heo được nuôi

ở các ô chuồng gần kề nhau (Kristensen và ctv, 2009).

PCV2 có thể truyền dọc qua nhau thai, gây nhiễm cho bào thai (Ha và ctv,

2009; Park và ctv, 2009). Khi sử dụng tinh dịch có nhiễm PCV2 gieo tinh cho heo

nái tơ, có gây ra biểu hiện rối loạn sinh sản và thai bị nhiễm PCV2 (Madson và ctv,

2009). Tuy nhiên, vẫn chưa xác định được lượng PCV2 nhiễm tự nhiên trong tinh

dịch bao nhiêu là đủ để gây nhiễm cho nái và thai.

1.2.3. Cơ chế sinh bệnh

Các nghiên cứu cho thấy rằng, tế bào lym-phô và đại thực bào cũng như các tế

bào biểu mô và tế bào nội mạc là các tế bào đích để PCV2 nhân lên (Hamberg và ctv,

2007; Pérez-Martín và ctv, 2007; Yu và ctv, 2007a; Rodríguez-Cariño và ctv, 2010).

Nghiên cứu siêu cấu trúc trên môi trường tế bào và các nốt bạch huyết lấy từ heo mắc

PMWS cho thấy, ty thể có lẽ đóng vai trò quan trọng trong việc nhân lên của PCV2

(Rodríguez-Carĩno và ctv, 2010; 2011). Trong các thí nghiệm gây nhiễm PCV2 trên heo,

hiện tượng vi-rút huyết được phát hiện đầu tiên khoảng 7 ngày sau gây nhiễm PCV2,

hiệu giá vi-rút tăng và đạt mức cao nhất vào ngày 14 đến ngày 21 sau gây nhiễm (Rovira

và ctv, 2002; Resendes và ctv, 2004; Opriessnig và ctv, 2008b). PCV2 tập trung cao nhất

ở các mô lym-phô. Bên cạnh đó, PCV2 còn hiện diện ở các tế bào biểu mô thận và đường

hô hấp, các tế bào nội mạc, tế bào lym-phô, tế bào ruột, gan, tế bào cơ trơn, tụy (McNeilly

và ctv, 1999; Rosell và ctv, 1999; Shibahara và ctv, 2000; Sanchez và ctv, 2004).

Các bằng chứng thực địa cho thấy PCVD là bệnh đa yếu tố, không phải tất cả

heo nhiễm PCV2 đều có biểu hiện lâm sàng PMWS. Có 4 yếu tố chính ảnh hưởng đến

tiến trình biểu hiện PMWS gồm: vi-rút, ký chủ, các yếu tố đồng nhiễm và tình trạng

miễn dịch. (1) Vi-rút: các nghiên cứu cho thấy PCV2a, PCV2b và PCVd đều có khả

năng gây PMWS (Guo và ctv, 2012, Opriessnig và ctv, 2014c). Sự khác biệt về độc

lực giữa các genotype PCV2 vẫn là vấn đề đang tranh cãi và cần được nghiên cứu thêm.

(2) Ký chủ: các ghi nhận thực tế và thí nghiệm cho rằng các dòng heo (genetic lines)

có thể nhạy cảm khác nhau đối với PMWS. (3) Các yếu tố đồng nhiễm: các nghiên cứu

đã chứng minh rằng, PCV2 chính là tác nhân chủ yếu và cần thiết trong sinh bệnh học

của PMWS (Ellis và ctv, 1999; Bolin và ctv, 2001; Ladekjær-Mikkelsen và ctv, 2002).

Tuy nhiên, các thí nghiệm tái gây PMWS hiệu quả và chắc chắn hơn khi gây nhiễm kết

hợp giữa PCV2 với các tác nhân gây bệnh khác trên heo. Thực tế cho thấy, trong hầu

hết các ca bệnh PMWS đều có sự đồng nhiễm với các tác nhân vi-rút, vi khuẩn gây

bệnh khác trên heo, chính sự đồng nhiễm này làm cho tình trạng bệnh cũng như dấu

hiệu lâm sàng bệnh trầm trọng hơn. Các tác nhân đồng nhiễm làm gia tăng nguy cơ

phát PMWS phổ biến nhất là PRRSV (Allan và ctv, 2000; Pogranichniy và ctv, 2002),

porcine parvovivus (Allan và ctv, 1999; Kennedy và ctv, 2000; Opriessnig và ctv,

2004b), Mycoplasma hyopneumoniae (Opriessnig và ctv, 2004a). (4) Tình trạng miễn

dịch: nghiên cứu các yếu tố nguy cơ làm gia tăng PMWS ở mức độ cá thể cho thấy,

nguy cơ mắc PMWS cao ở những heo có hàm lượng kháng thể chống PCV2 lúc 7 tuần

tuổi thấp (sau đó không có sự chuyển đổi huyết thanh) và heo con sinh ra từ nái âm

tính với kháng thể chống PCV2 (Rose và ctv, 2005).

Có hiện tượng ức chế miễn dịch (immunosuppression) ở heo mắc PMWS.

Bằng chứng nổi bật về sự ức chế miễn dịch ở heo mắc PMWS đó là sự suy kiệt

(depletion) bạch cầu và thay thế mô bào (Opriessnig và ctv, 2007; Segalés, 2012).

Các nghiên cứu cho thấy có sự suy giảm số lượng các tế bào tua, lym-phô B, các tế

bào NK, lym-phô T (CD4+, CD8+) cùng với sự gia tăng số lượng các tế bào đơn nhân

và tế bào hạt trong máu heo nhiễm PCV2 (Ramamoorthy và Meng, 2009; Darwich

và ctv, 2002; Darwich và Mateu, 2012). Ngoài ra, heo mắc PMWS được cho là do

thiếu hụt miễn dịch mắc phải (acquired immunodeficiency) (Darwich và Matue,

2012). Nguyên nhân có thể là do khả năng điều khiển miễn dịch của PCV2 (Vincent

và ctv, 2005; 2007; Kekarainen và ctv, 2010; Balmelli và ctv, 2011).

1.2.4. Đáp ứng miễn dịch chống PCV2

1.2.4.1. Đáp ứng miễn dịch tự nhiên

Các tế bào: PCV2 nhiễm và tồn tại dai dẳng trong đại thực bào và tế bào tua, và

có lẽ PCV2 sử dụng các tế bào này như công cụ để lan truyền vi-rút khắp các mô lym-

phô, và tại nơi đây chúng sẽ điều khiển chức năng của các loại tế bào miễn dịch. Tế bào

giết tự nhiên (natural killer cell – NK) và tế bào T gây độc là 2 loại tế bào chủ yếu để tiêu

diệt các tế bào bị nhiễm PCV2. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu của Nielsen và ctv (2003)

cho thấy có sự suy giảm tế bào NK ở heo gây nhiễm PCV2 có biểu hiện PMWS.

Các cytokine: PCV2 ngăn trở chức năng của các tế bào tiết interferon tự nhiên

(natural interferon procucing cell - NIPC) hay còn gọi là các tế bào tua dòng bào

tương (plasmacytoid dendritic dells - pDC) tiết interferon (IFN) type I. Đây là loại

cytokine quan trọng nhất trong kiểm soát nhiễm vi-rút. Theo báo cáo của Vincent và

ctv (2007), PCV2 ức chế các tế bào pDC sản sinh IFN-α in vitro trong đáp ứng với

các chất kích thích thụ thể giống Toll TLR7 hoặc TLR9 (Toll-like receptor). Trong

đó, dạng ADN sợi đôi (dạng sao chép - replicative form) của PCV2 có khả năng ức

chế các tế bào pDC tiết IFN-α (Balmelli và ctv, 2011). Theo Baumann và ctv (2013),

PCV2 vừa có khả năng ức chế, vừa có khả năng kích thích các tế bào pDC tiết IFN

type I. ADN sợi đơn của vi-rút kích thích các tế bào pDC khi có sự hiện diện của

IFN-γ. Ngược lại, dạng ADN sợi đôi của vi-rút có khả năng ức chế đáp ứng các tế

bào pDC, ngay cả khi có sự hiện diện của các cytokine có tác dụng kích thích đáp

ứng các tế bào pDC. Bên cạnh đó, PCV2 thúc đẩy tiết IL-10. Các nghiên cứu về

cytokine trong các mô và PBMC của heo mắc PMWS cho thấy có sự gia tăng hàm

lượng IL-10 với sự gia tăng quá mức ARN thông tin mã hóa IL-10 ở tuyến ức của

heo mắc PMWS tự nhiên (Darwich và ctv, 2003b). Ngoài ra, khi kích thích PBMC

lấy từ heo mắc PMWS bằng PCV2 có thể làm gia tăng hàm lượng IL-10 (Dawich và

ctv, 2003a). Doster và ctv (2010) ghi nhận sự gia tăng biểu hiện IL-10 ở hạch dưới

hàm, lách và hạch hạnh nhân ở các heo nhiễm PCV2. Sự biểu hiện IL-10 này xảy ra

chủ yếu ở vùng tập trung nhiều tế bào lym-phô T và hiếm khi ở vùng lym-phô B và

đại thực bào. Các nghiên cứu ex vivo cũng cho thấy có sự gia tăng hàm lượng IL-10

trong huyết thanh của heo có biểu hiện PMWS (Hasslung và ctv, 2005; Stevenson và

ctv, 2006). Ngược lại, kết quả nghiên cứu của Darwich và ctv (2008) cho thấy, đối

với heo nhiễm PCV2 tiềm ẩn thì chỉ có đáp ứng IL-10 thoáng qua (transient) xảy ra

trong pha vi-rút huyết. Từ kết quả của các nghiên cứu trên cho thấy vai trò quan trọng

của IL-10 trong sinh bệnh học PCVD.

1.2.4.2. Đáp ứng miễn dịch thu được

PCV2 kích thích sinh đáp ứng miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào. Protein

capsid của PCV2 kích thích sinh đáp ứng miễn dịch trung hòa và miễn dịch bảo hộ

(Pogranichniy và ctv, 2000; Blanchard và ctv, 2003). Theo Fort và ctv (2010), cả

protein Cap và Rep đều tham gia trong đáp ứng miễn dịch trung gian tế bào.

- Đáp ứng miễn dịch thu được chủ động

Đáp ứng miễn dịch dịch thể: Trong các thí nghiệm gây nhiễm PCV2 trên heo,

dù có biểu hiện lâm sàng bệnh hay không, cũng có sự chuyển đổi huyết thanh xảy ra

vào lúc 10 đến 28 ngày sau khi gây nhiễm (Balasch và ctv, 1999; Pogranichnyy và

ctv, 2000). Tuy nhiên, một vài nghiên cứu cho thấy, những heo bị gây nhiễm với

PCV2 có biểu hiện PMWS thì sự chuyển đổi huyết thanh muộn hơn so với heo không

biểu hiện PMWS (Bolin và ctv, 2001; Rovira và ctv, 2002; Okuda và ctv, 2003). Hiệu

giá kháng thể tổng cộng (total antibody – TA) trên heo có biểu hiện PMWS thấp hơn

so với heo nhiễm PCV2 tiềm ẩn ở thời điểm 21 ngày sau gây nhiễm (Meerts và ctv,

2006). Trên heo thí nghiệm nhiễm vi-rút tiềm ẩn, kháng thể trung hòa chống PCV2

(neutralising antibody - NA) xuất hiện lúc 15 ngày sau gây nhiễm trở đi (Meerts và

ctv, 2006; Fort và ctv, 2007). Kháng thể trung hòa chống PCV2 không có, hoặc có

với lượng rất thấp (chỉ ở thời điểm 7 đến 14 ngày sau gây nhiễm) trên các heo gây

nhiễm thí nghiệm có biểu hiện PMWS (Meerts và ctv, 2006). Fort và ctv (2007) cho

rằng, đáp ứng miễn dịch dịch thể yếu trên heo mắc PMWS, đặc biệt là những heo này

thiếu khả năng đáp ứng kháng thể trung hòa chống PCV2. Trong điều kiện thực địa,

sự chuyển đổi kháng thể tổng cộng chống PCV2 xảy ra ở cả heo mắc PMWS và heo

nhiễm PCV2 tiềm ẩn (Rodriguez-Arrioja và ctv, 2002; Grau-Roma và ctv, 2009). Tuy

nhiên, trên heo mắc PMWS có đáp ứng kháng thể yếu hơn so với các heo nhiễm

PCV2 tiềm ẩn (Meerts và ctv, 2006; Fort và ctv, 2007; Grau-Roma và ctv, 2009).

Đáp ứng miễn dịch trung gian tế bào: Sự phát triển của các tế bào tiết interferon

gama (interferon  secreting cell, viết tắt là IFN--SC) là điểm mấu chốt trong việc

phát triển đáp ứng miễn dịch thu được qua trung gian tế bào chống PCV2 (Fort và

ctv, 2009a; Steiner và ctv, 2009). IFN--SC đặc hiệu PCV2 được tìm thấy trên nhóm

heo nhiễm kết hợp PCV2/PPV vào thời điểm 7 ngày sau gây nhiễm, trong khi đó mãi

đến 21 ngày sau gây nhiễm mới phát hiện được IFN--SC đặc hiệu PCV2 ở nhóm

heo được gây nhiễm với PCV2 (Steiner và ctv, 2009). Kết quả nghiên cứu của Fort

và ctv (2009a) cho thấy, IFN--SC đặc hiệu PCV2 được phát hiện vào giữa ngày 14

và ngày 21 sau gây nhiễm trên cả nhóm heo CD/CD gây nhiễm với PCV2 và nhóm

được gây nhiễm kết hợp PCV2/LPS (lipopolysaccharides). Fort và ctv (2010) cho

rằng, cả protein Cap và Rep của PCV2 đều tham gia trong đáp ứng miễn dịch trung

gian tế bào.

- Miễn dịch thu được thụ động

Kháng thể thụ động: Một số nghiên cứu đã xác định được vai trò quan trọng

của kháng thể mẹ truyền trong việc bảo vệ heo con chống lại PCV2 cũng như PMWS

(Calsamiglia và ctv, 2007; McKeown và ctv, 2005; Ostanello và ctv, 2005). Sự bảo

vệ này có lẽ liên quan đến hoạt tính trung hòa của kháng thể mẹ truyền (Meerts và

ctv, 2006; Fort và ctv, 2007; Fort và ctv, 2008). Thực tế cho thấy, PMWS thường

không xảy ra trên heo nhỏ hơn 4 tuần tuổi, đồng thời cả kháng thể tổng cộng và kháng

thể trung hòa chống PCV2 đều được phát hiện trên heo ở lứa tuổi này (Rodriguez-

Arrioja và ctv, 2002; Larochelle và ctv, 2003; Sibila và ctv, 2004; Ostanello và ctv,

2005; Meerts và ctv, 2006; Calsamiglia và ctv, 2007). Rodriguez-Arrioja và ctv

(2002) đã chứng minh rằng, kháng thể thụ động chống PCV2 giảm trong suốt giai

đoạn bú sữa và giai đoạn đầu sau cai sữa, giảm đến mức âm tính hoặc gần như âm

tính lúc 7 tuần tuổi và sau đó có sự chuyển đổi kháng thể chủ động trong quần thể bắt

đầu vào khoảng 12 tuần tuổi. Một điều đáng lưu ý, hiệu giá kháng thể thụ động chống

PCV2 trên heo con sinh ra từ nái được tiêm vắc-xin PCV2 cao hơn và tốc độ giảm

chậm hơn so với heo con sinh ra từ nái không được tiêm vắc-xin (Kurmann và ctv,

2011; Fraile và ctv, 2015). Ngoài ra, hiệu giá kháng thể thụ động trên heo mắc PMWS

thấp hơn so với heo khỏe mạnh (Grau-Roma và ctv; 2009). Theo Fort và ctv (2009b),

hiệu giá kháng thể thụ động IPMA > 10,6log2 (hoặc NA > 8log2) có thể giúp bảo vệ

heo chống lại tình trạng nhiễm PCV2 huyết khi công cường độc PCV2 bằng đường

mũi miệng với liều gây nhiễm 105TCID50/ heo, ngược lại nếu hiệu giá IPMA thấp

hơn 5,5log2 hoặc NA thấp hơn 3,9log2 thì heo nhạy cảm với PCV2 hơn.

Miễn dịch trung gian tế bào truyền qua sữa đầu: Theo Goubier và ctv (2008),

trong sữa đầu của heo nái SPF (specific pathogen free) tiêm vắc-xin PCV2 có chứa

IFN--SC đặc hiệu PCV2. Oh và ctv (2012) đã nghiên cứu sự truyền các tế bào lym-

phô đặc hiệu PCV2 thụ động qua sữa đầu cũng như khả năng bảo hộ của miễn dịch thụ

động qua trung gian tế bào cho heo con sinh ra từ nái được tiêm phòng vắc-xin PCV2.

Kết quả cho thấy, sau khi bú sữa đầu, heo con sinh ra từ nái được tiêm vắc-xin có số

lượng IFN--SC đặc hiệu PCV2 cao hơn đáng kể, có sự gia tăng đáp ứng quá mẫn

muộn đặc hiệu PCV2 (PCV2-specific delayed type hypersebsitivity) và đáp ứng tăng

sinh PBMC mạnh hơn so với heo con sinh ra từ nái không được tiêm vắc-xin. Miễn

dịch qua trung gian tế bào truyền qua sữa đầu đóng vai trò quan trọng trong việc bảo

vệ heo con sơ sinh trong thí nghiệm công cường độc heo con lúc 3 tuần tuổi. Tuy nhiên,

cần phải nghiên cứu thêm để xác định khoảng thời gian miễn dịch qua trung gian tế

bào thụ động có khả năng bảo vệ heo con chống lại PCV2.

1.2.5. Triệu chứng và bệnh tích

Bảng 1.1. Tóm tắt triệu chứng và bệnh tích bệnh PCVD (Segalés, 2012)

Bệnh tích đại thể Bệnh tích vi thể

Không

Giảm bạch cầu với viêm u hạt ở mô lym-phô nhẹ hoặc không bị Các bệnh PCVD Nhiễm PCV2 tiềm ẩn

PMWS

Triệu chứng chính Giảm tăng trọng nhưng không kèm theo bất kỳ triệu chứng lâm sàng bệnh Còi, giảm tăng trọng, da tái nhợt

- Giảm bạch cầu từ trung bình đến trầm trọng với viêm u hạt ở các mô lym-phô - Viêm phổi kẽ - Viêm thận kẽ - Viêm gan với nhiều mức độ thay thế mô bào - Viêm ruột u hạt

Sẩy thai hoặc thai hóa gỗ

- Viêm cơ tim thai không nung mủ đến hoại tử hoặc sợi hóa - Gan thai sung huyết - Phổi thai viêm nhẹ

Tiêu chảy

- Viêm ruột u hạt - Giảm bạch cầu cùng với viêm u hạt ở mảng Peyer

Suy hô hấp, khó thở - Lông thô dài, gầy trơ xương, - Hạch bạch huyết sung lớn - Phổi xơ cứng, dai và không xẹp, có đốm nâu - Thận có những điểm trắng trên bề mặt - Gan bất dưỡng, mất màu, bề mặt thô ráp - Viêm ruột cata có hoặc không có tích dịch màng treo ruột - Đôi khi lách nhồi huyết - Thai hóa gỗ hoặc bị phù - Gan của bào thai sưng lớn và sung huyết - Tim thai triển dưỡng với nhiều vùng bị mất màu - Viêm ruột cata có hoặc không có tích dịch màng treo ruột - Màng nhày ruột dày - Hạch màng treo ruột sưng lớn Phổi không xẹp và có nhiều đốm nâu - Viêm phổi kẻ u hạt, phế quản bị viêm loét, hoại tử từ trung bình đến nghiêm trọng, xơ hóa

PCV2 liên quan đến rối loạn sinh sản PCV2 liên quan đến viêm ruột PCV2 liên quan đến viêm phổi PDNS

- Những chấm, mẩn đỏ đậm trên da, xuất huyết dưới da - Thận sưng lớn, bề mặt vỏ thận có hạt mịn, bể thận thủy thũng - Đôi khi lách nhồi huyết

Những chấm, mẩn đỏ đậm trên da, chủ yếu chân sau và vùng ngoại vi - Viêm mạch máu hoại tử có hệ thống. - Viêm cầu thận hoại tử sơ hóa với viêm thận kẻ không mủ - Giảm bạch cầu từ không đến trung bình với viêm u hạt ở các mô lym-phô

1.2.6. Các biện pháp phòng và kiểm soát PMWS

Trước khi có vắc-xin PCV2 các biện pháp phòng PMWS chủ yếu dựa vào

phương pháp quản lý, kiểm soát yếu tố đồng nhiễm, cải thiện phẩm chất giống, dinh

dưỡng và liệu pháp huyết thanh. Theo Madec và ctv (2001), muốn kiểm soát PMWS

cần thực hiện “bốn quy tắc vàng” đó là: (1) hạn chế tiếp xúc giữa các đối tượng heo

thông qua giảm một phần mật độ đàn nuôi; (2) heo bị stress là cơ hội để bệnh bộc

phát (nếu hệ thống miễn dịch suy yếu, PCV2 sẽ gây bệnh); (3) nhu cầu dinh dưỡng

phù hợp theo lứa tuổi heo; (4) đảm bảo các điều kiện vệ sinh và an toàn sinh học.

Năm 2004, vắc-xin thương mại phòng PMWS đầu tiên xuất hiện trên thế giới. Đến

nay, vắc-xin PCV2 được chứng minh là có hiệu quả trong việc phòng PMWS trên

heo, giúp giảm tỉ lệ chết và cải thiện tăng trọng bình quân hàng ngày.

1.3. Các nghiên cứu về di truyền của PCV2

1.3.1. Các nghiên cứu về biến đổi di truyền của PCV2 trên thế giới

Kết quả phân tích sự tiến hóa của PCV2 theo Firth và ctv (2009) cho thấy, cả

2 genotype PCV2 (PCV2a và PCV2b) có khả năng đã xuất hiện từ một tổ tiên chung

khoảng 100 năm trước đây và tiến hóa độc lập kể từ thời điểm đó, mặc dù cùng lưu

hành trong cùng các loài ký chủ và các vùng địa lý. Phân tích phát sinh loài giữa các

genotype PCV2 cho thấy, sự phân nhánh khởi đầu là PCV2c sau đó đến sự phân

nhánh của PCV2a, PCV2b và PCV2d, sự phân nhánh của PCV2a xảy ra trước so với

PCV2b (Dupont và ctv, 2008; Guo và ctv, 2010; Cortey và ctv, 2011; Ge và ctv,

2012). Cũng theo kết quả phân tích của Firth và ctv (2009), tốc độ thay thế nucleotide

của PCV2 khoảng 1,2 x 10-3 sự thay thế/vị trí/năm (substitutions/site/year). Theo ghi

nhận của Pérez và ctv (2011), từ phân tích các PCV2 thu thập ở Cuba từ năm 2005 –

2009, tốc độ thay thế nucleotide của PCV2 từ 3,1 x 10-3 đến 6,6 x 10-3 sự thay thế/vị

trí/năm. Tốc độ này được ghi nhận là cao nhất đối với một vi-rút ADN sợi đơn. Tốc

độ tiến hóa cao như vậy có thể cho phép PCV2 duy trì khả năng tiến hóa tương

đương với các vi-rút ARN sợi đơn và cao hơn so với các vi-rút ADN sợi đôi.

Các nghiên cứu cho thấy có sự biến đổi toàn cầu về genotype của PCV2 từ

PCV2a sang PCV2b và sự xuất hiện vượt trội của PCV2b từ sau năm 2003 (Olvera và

ctv, 2007; Dupont và ctv, 2008). Genotype PCV2a và PCV2b tương đồng khoảng 95%

về trình tự nucleotide (Olvera và ctv, 2007). Sự khác nhau cơ bản giữa PCV2a và PCVb

chủ yếu là ở ORF2. Mức độ tương đồng về trình tự nucleotide và peptide giữa 2

genotype này khoảng 90%. Genotype PCV2a và PCV2b đã được tái phân lập từ các ca

PMWS trên toàn thế giới. Kết quả phân tích trình tự gen của các phân lập PCV2 cho

thấy, từ năm 1997 đến năm 2006 sự biến đổi genotype của PCV2 không xảy ra ở Hàn

Quốc, Nhật Bản hoặc Úc (Dupont và ctv, 2008). Sau đó, từ năm 2005 – 2007, PCV2b

trở thành genotype vượt trội ở Hàn Quốc (Kim và ctv, 2009a), ở Nhật Bản cả PCV2a

và PCV2b đều được phát hiện trong các phân lập giữa năm 2006 và 2007 (Takahagi

và ctv, 2008). Olvera và ctv (2007) phân tích 148 chuỗi trình tự nucleotide bộ gen

của PCV2 có trên cơ sở dữ liệu của NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) đến tháng

9 năm 2005, tác giả ghi nhận PCV2b là genotype chủ yếu công bố sau năm 2003

(87/94), trong khi đó genotype công bố trước năm 2003 chủ yếu là PCV2a (33/53).

Câu hỏi đặt ra là tại sao lại có sự biến đổi trên quy mô toàn cầu từ PCV2a sang

PCV2b? Đến nay vẫn là một câu hỏi chưa có câu trả lời rõ ràng chính xác. Tuy nhiên,

dựa trên các dữ liệu có sẳn cho thấy, sự gia tăng thương mại trên toàn thế giới về heo

và các sản phẩm có nguồn gốc từ heo; stress, mật độ nuôi, áp lực của các bệnh khác

như PRRS; khả năng lây truyền qua nhiều đường khác nhau cũng như sức đề kháng

mạnh mẽ và đặc biệt là tốc độ thay thế nucleotide cao của PCV2, có lẽ đóng vai trò

quan trọng trong việc thay thế genotype của PCV2 (PCV2b thay thế cho PCV2a) trên

quy mô toàn cầu.

PCV2c được ghi nhận đầu tiên ở Đan Mạch từ các mẫu huyết thanh heo lưu

trữ vào những năm 1980 – 1990. Vào thời điểm này, PMWS lại không hiện diện hoặc

ít nhất là không phát hiện thấy (Dupont và ctv, 2008). Franzo và ctv (2015) đã phát

hiện được một phân lập PCV2 thuộc genotype 2c trên heo hoang dã (feral pig) thu

thập từ năm 2010 ở Brazil.

Genotype PCV2d, còn được gọi là biến chủng PCV2b – mPCV2b, được mô

tả đầu tiên ở Trung Quốc (Wang và ctv, 2009; Guo và ctv, 2010). Sau đó được mô tả

ở một số nước như Mỹ (Xiao và ctv, 2012), Việt Nam (Nguyễn Ngọc Hải và ctv,

2013) và Hàn Quốc (Seo và ctv, 2014a). Một điều đáng lưu ý là mPCV2b lại được

phát hiện ở các ca tiêm vắc-xin PCV2 thất bại ở Mỹ (Xiao và ctv, 2012; Opriessnig

và ctv, 2013b) và Hàn Quốc (Seo và ctv, 2014a). Có khá nhiều tranh cãi liên quan

đến PCV2d về cách phân chia genotype cũng như về tên gọi. Tuy nhiên, theo kết quả

phân tích của Xiao và ctv (2015) thì PCV2d đáp ứng đủ điều kiện để được công nhận

là một genotype độc lập. Theo nhóm tác giả này, PCV2d có thể đã xuất hiện ở Thụy

Sĩ từ năm 1998 với phân lập S98-30512 (mã số GenBank JX512855). Căn cứ vào kết

quả phân tích cây phát sinh chủng loại theo phương pháp gần giống tối đa (maximum-

likelihood, ML) và nối kết liền kề (neighbour-joining, NJ), genotype PCV2d được

chia thành 2 subgenotype đó là PCV2d-1 và PCV2d-2. Đồng thời, có sự phổ biến

vượt trội của PCV2d-2 so với PCV2d-1, và có thể PCV2d-1 là tổ tiên của PCV2d-2

(Xiao và ctv, 2015). Kết quả nghiên cứu của Xiao và ctv (2016) cho thấy, PCV2d đặc

biệt là PCV2d-2 ngày càng phổ biến và trở thành genotype lưu hành vượt trội ở Mỹ.

Nghiên cứu của Davies và ctv (2016) cho thấy sự xuất hiện genotype PCV2

mới với tên gọi là PCV2e. PCV2e có bộ gen dài 1777 nt, với ORF2 dài 717 nt mã

hóa protein dài 238 aa. ORF2 của PCV2e dài hơn 15 nt so với ORF2 của PCV2a và

PCV2b và dài hơn 12 nt so với ORF2 của PCV2d và PCV2c, và tương đồng khoảng

85% so với các ORF2 của các genotype trên. Kết quả phân tích hồi cứu của Davies

và ctv (2016) chỉ ra rằng PCV2e xuất hiện đầu tiên ở Mỹ vào năm 2006. Đến nay, có

khá ít thông tin về sự phân bố, tỉ lệ lưu hành cũng như tầm quan trọng của PCV2e.

Các genotype khác: từ kết quả hồi cứu của Bao và ctv (2017), PCV2 còn được

phân chia thêm một genotype mới, PCV2f. Ngoài Trung Quốc, PCV2f còn được phát

hiện ở Croatia, Ấn Độ và Indonesia. PCV2f có chiều dài ORF2 là 705 nt. Khoảng

cách di truyền giữa PCV2f và các genotype PCV2 khác dao động từ 0,047 – 0,172

đối với ORF2 và từ 0,031 đến 0,08 khi so sánh toàn bộ gen. Điều này cho thấy PCV2f

đủ điều kiện để phân thành genotype mới theo như định nghĩa của Grau-Roma và ctv

(2008) và Segalés và ctv (2008). Ngoài ra, còn có các genotype PCV2g và PCV2h.

Trong đó, có một số chủng trước đây được xếp vào nhóm tái tổ hợp, theo cách phân

loại mới của Franzo và Segalés (2018) được xếp vào PCV2g và PCV2h.

Sự tái tổ hợp giữa các genotype PCV2

PCV2 tiếp tục tiến hóa thông qua đột biến điểm và tái tổ hợp. ORF2 được xem

có tốc độ đột biến cao nhất trong số các gen của PCV2, dẫn đến một vài biến đổi tính

kháng nguyên của protein Cap tương ứng (Olvera và ctv, 2007; Hesse và ctv, 2008;

Wang và ctv, 2009). Điều kiện tiên quyết để xảy ra sự tái tổ hợp là sự đồng nhiễm nhiều

hơn một chủng vi-rút trong cùng một tế bào hoặc một ký chủ. Thực tế cho thấy có sự

nhiễm đồng thời cả PCV2a và PCV2b từ các mẫu thu thập được ở các heo mắc PCVD

(Horlen và ctv, 2007; Hesse và ctv, 2008). Phân tích của Hesse và ctv (2008) đã mô tả

một chủng PCV2 (chủng phân lập 0737A) sở hữu gen ORF1 từ PCV2a và ORF2 từ

PCV2b. Tiếp theo đó, nhiều tác giả cũng báo cáo về sự phổ biến của vi-rút thể ghép

PCV2a/b xảy ra trên heo ở Mỹ (Cheung, 2009 [36]), Hàn Quốc (Kim và ctv, 2009a) và

Trung quốc (Cai và ctv, 2012).

Điều khá thú vị là việc tái tổ hợp giữa các chủng PCV2 không chỉ xảy ra trong

tự nhiên, mà có thể tạo ra chủng vi-rút tái tổ hợp in vitro từ 2 chủng bố mẹ khác nhau,

bằng cách cho nhiễm cùng lúc 2 chủng PCV2 khác nhau trên môi trường tế bào PK15

(Lefebvre và ctv, 2009). Về vị trí tái tổ hợp (recombinant breakpoint), Ma và ctv (2007)

ước đoán rằng, vị trí tái tổ hợp định vị ở giữa vùng gốc sao chép (Ori) và gen Rep của

PCV2. Tương tự, Kim và ctv (2009a) cho rằng, vị trí tái tổ hợp xảy ra ở gen Rep, còn

theo kết quả nghiên cứu của các tác giả khác lại cho rằng sự tái tổ hợp tự nhiên xảy ra

bên trong gen Cap của PCV2 (Cheung, 2009; Lefebvre và ctv, 2009; Cai và ctv, 2012).

1.3.2. Các nghiên cứu về biến đổi di truyền của PCV2 ở Việt Nam

Các ca nghi ngờ PMWS trên heo được báo cáo đầu tiên ở Việt Nam vào cuối

năm 2004 có liên quan đến việc gia tăng tình trạng còi trên các đàn heo sau cai sữa

(Lâm Thị Thu Hương và ctv, 2005). Nghiên cứu hồi cứu cho thấy PCV2 xuất hiện ở

miền Nam Việt Nam từ năm 2000 hoặc sớm hơn (Nguyễn Thị Thu Hồng và ctv,

2006). Phân tích trình tự nucleotide bộ gen của 4 phân lập PCV2 thu thập ở miền

Nam Việt Nam giữa năm 2002 và 2007 (vietnam1 (2002), vietnam2 (2006) và

vietnam3 (2004) và vietnam5 (2007)), kết quả 3 phân lập thu thập vào năm 2002,

2004 và 2006 thuộc về cùng một nhánh và có mức độ tương đồng trình tự nucleotide

rất cao từ 99,66% đến 99,83%, trong khi đó phân lập thu thập năm 2007 được xếp

vào nhánh khác so với 3 phân lập trên và có mức độ tương đồng từ 96,15% đến

96,42% so với cả 3 phân lập này. Điều này cho thấy, ba phân lập vienam1, vietnam2

và vietnam3 có thể chung nguồn gốc và chúng khác biệt so với phân lập vietnam5

(Nguyễn Thị Thu Hồng và ctv, 2008). Một nghiên cứu khác phân tích trình tự một

phần đoạn ORF2 của PCV2 của 2 chủng PCV2 thu nhận tại thành phố Hồ Chí Minh

và 11 chủng thu nhận từ tỉnh Đồng Nai trong năm 2010 của Nguyễn Ngọc Hải và ctv

(2013), kết quả có 5 chủng PCV2 (1 chủng thu nhận từ thành phố Hồ Chí Minh và 4

chủng thu nhận từ Đồng Nai) thuộc genotype PCV2b các chủng còn lại đều thuộc

genotype PCV2d.

Huỳnh Thị Mỹ Lệ và ctv (2013) phân tích trình tự bộ gen và protein Cap của 30

chủng PCV2 được thu nhận từ năm 2008 đến 2011 từ các tỉnh ở Việt Nam, kết quả có

8 chủng thuộc genotype PCV2b và các chủng còn lại thuộc nhóm tái tổ hợp giữa PCV2a

và PCV2b. Cũng theo tác giả Huỳnh Thị Mỹ Lệ và ctv (2012), ứng dụng kỹ thuật nested

PCR khảo sát trên 583 mẫu bệnh phẩm thu thập từ năm 2011 đến 2012 từ đàn heo nuôi

tại 4 tỉnh: Hà Nội, Hòa Bình, Bắc Giang và Hải Dương, kết quả cho thấy tất cả các

chủng PCV2 lưu hành ở đàn heo thuộc 4 tỉnh trên đều thuộc genotype PCV2b. Gần

đây nhất là nghiên cứu Phạm Hồng Quân và ctv (2017) ghi nhận ở Việt Nam lưu hành

đồng thời PCV2b, nhóm tái tổ hợp và PCV2d.

Nhìn chung, các nghiên cứu về di truyền PCV2 trên thế giới và ở Việt Nam

ghi nhận PCV2 lưu hành phổ biến hiện nay thuộc genotype PCV2b và PCV2d.

1.4. Các nghiên cứu về vắc-xin PCV2

1.4.1. Các loại vắc-xin PCV2

1.4.1.1. Vắc-xin cổ điển

Các nghiên cứu đầu tiên nhằm cố gắng tìm ra vắc-xin phòng bệnh PMWS là

loại vắc-xin vô hoạt thông thường. Pogranichnyy và ctv (2004) đã thử nghiệm tính

an toàn và hiệu lực của 2 loại vắc-xin vô hoạt (vi-rút được vô hoạt bằng UV hoặc

BEI) trên heo CD/CD, theo mô hình đồng nhiễm với PRRSV và chất kích thích miễn

dịch (keyhole limpet hemocyanin - KLH) kết hợp với chất bổ trợ Freund không hoàn

chỉnh. Kết quả cho thấy, việc tiêm vắc-xin PCV2 vô hoạt nhũ dầu giúp cải thiện tăng

trọng bình quân hàng ngày cũng như làm giảm tỉ lệ chết. Cũng nghiên cứu vắc-xin

vô hoạt phòng bệnh PMWS trên heo con, Yang và ctv (2012) đã thử nghiệm vắc-xin

PCV2 dựa trên chủng WuHan (mã số GenBank: FJ598044) thuộc genotype PCV2b,

vô hoạt bằng formalin phối trộn với chất bổ trợ dầu (oil-adjuvant) trên heo con 28

ngày tuổi. Kết quả heo được tiêm vắc-xin có sự chuyển đổi huyết thanh chống PCV2

và đạt hiệu giá kháng thể cao ở 28 ngày sau tiêm vắc-xin. Sau khi công cường độc,

PCV2 được phát hiện ở 3/5 heo được tiêm vắc-xin, trong khi đó ở nhóm heo đối

chứng là 5/5. Ngoài ra, điểm bệnh tích ở nhóm heo được tiêm vắc-xin (0,2 – 0,4) nhẹ

hơn so với heo đối chứng (0,8 – 2,4). Điều này cho thấy vắc-xin vô hoạt với tá dược

dầu có khả năng gây đáp ứng miễn dịch, cũng như có thể giúp bảo vệ heo khỏi phát

bệnh PMWS. Vắc-xin vô hoạt dạng prototype cũng được đánh giá trên heo nái

(Reynaud và ctv, 2004a) và heo nái mang thai (Reynaud và ctv, 2004b), kết quả cho

thấy vắc-xin vô hoạt thí nghiệm an toàn trên nái mang thai và có sự đáp ứng kháng

thể chống PCV2 trên heo nái được tiêm vắc-xin.

Vắc-xin vô hoạt phòng bệnh do PCV2 được thương mại đầu tiên trên thế giới

là Circovac® (Merial) vào năm 2004. Đây là vắc-xin vô hoạt với tá dược dầu, chứa

vi-rút vô hoạt PCV2a, được sử dụng trên heo nái, heo hậu bị và heo con. Đến nay, có

khá nhiều loại vắc-xin PCV2 vô hoạt, không những dựa trên genotype PCV2a mà còn

dựa trên PCV2b được thương mại hóa ở Trung Quốc (Zhai và ctv, 2014), Hàn Quốc

(Chae, 2012a).

1.4.1.2. Vắc-xin thế hệ mới

(1) Vắc-xin tái tổ hợp thể ghép PCV1-2

Fenaux và ctv (2003; 2004a) chứng minh PCV1-2 tái tổ hợp thể ghép (trên khung

bộ gen của PCV1, thay thế ORF2 của PCV1 bằng ORF2 của PCV2) tạo ra đáp ứng

kháng thể với protein capsid của PCV2. Vi-rút tái tổ hợp thể ghép này có khả năng kích

thích sinh miễn dịch bảo hộ chống lại PCV2 trên heo khi công cường độc. Vắc-xin tái tổ

hợp thể ghép vô hoạt đã được thương mại với nhãn hiệu Suvaxyn PCV2® One doseTM

(Fort Dodge). Vắc-xin này được tạo nên từ vi-rút tái tổ hợp thể ghép PCV1-2a (ghép

ORF2 của PCV2a vào PCV1) (Fenaux và ctv, 2003; 2004a; Gillespie và ctv, 2008). Tuy

nhiên đến năm 2008, vắc-xin này tạm thời bị loại khỏi thị trường vì phát hiện sự hiện

diện của vi-rút tái tổ hợp thể ghép PCV1-2a trong thực địa do vi-rút vắc-xin không được

vô hoạt hoàn toàn (Gagnon và ctv, 2010). Vào năm 2011, vắc-xin tái tổ hợp thể ghép

PCV1-2a phiên bản mới trở lại thị trường, đã được kiểm chứng tính an toàn và hiệu quả

trên heo con (Seo và ctv, 2012).

(2) Vắc-xin tái tổ hợp biểu hiện protein Cap của PCV2

Công nghệ ADN tái tổ hợp cho phép sản xuất một lượng lớn protein của vi-

rút và được ứng dụng trong nghiên cứu cũng như sản xuất vắc-xin tiểu phần phòng

bệnh do vi-rút. Protein capsid của PCV2 là protein cấu trúc duy nhất của vi-rút, có

khả năng kích thích thích sinh miễn dịch. Đến nay, có khá nhiều công trình nghiên

cứu về vắc-xin tiểu phần phòng bệnh PCV2 được thử nghiệm trên chuột và cả trên

heo, một số đã được thương mại hóa.

- Vắc-xin tái tổ hợp biểu hiện protein Cap PCV2 trên baculovirus

Vắc-xin PCV2 tiểu phần đầu tiên trên heo được nghiên cứu là vắc-xin biểu

hiện ORF2 PCV2 thông qua baculovirus và đã chứng minh được tính sinh miễn dịch

của protein capsid của PCV2, có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch, giúp bảo vệ

heo chống lại PCV2 qua công cường độc (Blanchard và ctv, 2003). Ngoài ra, tiêm

vắc-xin protein capsid của PCV2 được biểu hiện qua baculovirus có thể gây đáp ứng

miễn dịch dịch thể cũng như miễn dịch qua trung gian tế bào trên heo (Fan và ctv,

2007). Có bốn loại vắc-xin tiểu phần dựa trên ORF2 của PCV2a biểu hiện qua

baculovirus đã được thương mại hóa trên toàn thế giới đó là Ingelvac®

CircoFLEXTM (Boehringer Ingelheim), Porcilis® PCV, CircumventTM PCV và

Circumvent G2 PCV (MSD/Merck Animal Health).

- Vắc-xin tái tổ hợp biểu hiện protein Cap PCV2 trên các loại vi-rút, vi khuẩn khác

Ngoài baculovirus, các loại vi-rút, vi khuẩn và thực thuẩn thể cũng được sử

dụng để nghiên cứu vắc-xin tái tổ hợp tiểu đơn vị phòng bệnh PCVD. Cụ thể như

biểu hiện protein capsid của PCV2 thông qua adenovirus (Wang và ctv, 2006; 2007),

vi-rút giả dại (Ju và ctv, 2005; Song và ctv, 2007), vi-rút đậu heo (Lin và ctv, 2012),

porcine parvovirus (Pan và ctv, 2008), vi khuẩn Bordetella bronchoseptica aroA

(Kim và ctv, 2009b), vi khuẩn Escherichia coli (Xi và ctv (2016), và thực khuẩn thể

lamda (bacteriophage lambda) (Gamage và ctv, 2009; Hayes và ctv, 2010). Thí

nghiệm trên chuột và trên heo cho thấy, các vắc-xin tiểu phần biểu hiện protein Cap

của PCV2 qua các đối tượng trên đều có khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch đặc

hiệu chống PCV2 cũng như có thể bảo vệ heo chống lại PCV2 sau công cường độc.

Bảng 1.2. Tổng kết các nghiên cứu về vắc-xin PCV2

Genotype

Loại vắc-xin

Tham khảo

PCV2a

Vô hoạt

Cổ điển

Vô hoạt

Thể ghép PCV1-2

Nhược độc

Trên baculovirus

Pogranichiy và ctv (2004); Reynaud và ctv, 2004a, b) Yang và ctv (2012) Fenaux và ctv (2003) Xujie và ctv (2011) Hemann và ctv (2014) Beach và ctv (2011) Hemann và ctv (2014) Huan và ctv (2018) Blanchard và ctv (2003) Fan và ctv (2007) Pérez-Martín và ctv (2010) Đặng Vũ Hoàng và ctv (2018)

Trên adenovirus

Trên pseudorabies virus

Thế hệ mới

Biểu hiện protein Cap

PCV2b PCV2a KTT PCV2a PCV2b PCV2a PCV2b PCV2a KTT PCV2a KTT PCV2b PCV2b PCV2b KTT KTT PCV2a PCV2b PCV2b KTT

Thử nghiệm Trên Trên chuột heo x x x x x x x x x x x x x x x x

x Wang và ctv, 2006 Wang và ctv (2007) Feng và ctv (2008) x Genmei và ctv (2011) x Ju và ctv (2005) x Song và ctv (2007) Zheng và ctv (2015) x Lin và ctv (2012) Pan và ctv (2008) x

KTT

Kim và ctv (2009)

PCV2b

Trên vi-rút đậu heo Trên porcine parvovirus Trên Bordetella bronchiseptica aroA Trên thực khuẩn thể lamda Trên L. lactis Trên nấm men Trên E. coli

PCV2b PCV2a PCV2b PCV2a

Bucarey và ctv (2009) Xi và ctv (2016) Blanchard và ctv (2003)

x x

KTT

Kamstrup và ctv (2004)

ADN

Plasmid chứa ORF2 của PCV2

PCV2b PCV2b KTT

Gamage và ctv (2009) Hayes và ctv (2010) x Wang và ctv (2008) x x x x x

Shen và ctv (2008) Fu và ctv (2011) Sylla và ctv (2014)

*Ghi chú: KTT: không có thông tin

Bên cạnh đường tiêm, một số thí nghiệm gây miễn dịch trên chuột bằng vắc-xin

tái tổ hợp tiểu phần biểu hiện protein capsid của PCV2 vào Lactococcus lactis (Wang

và ctv, 2008) hoặc vào nấm men (Bucarey và ctv, 2009) qua đường uống cũng giúp tạo

được kháng thể đặc hiệu chống PCV2 trên chuột thí nghiệm. Kết quả này cho thấy có

khả năng tạo vắc-xin tiểu phần phòng bệnh PCV2 cấp qua đường uống. Tuy nhiên, các

nghiên cứu trên được thực hiện trên chuột nên cần phải đánh giá khả năng gây đáp ứng

miễn dịch của các loại vắc-xin tiểu phần thử nghiệm này trên heo.

1.4.2. Các nghiên cứu vắc-xin PCV2 ở Việt Nam

Ở Việt Nam cũng có các nghiên cứu bước đầu nhằm phát triển vắc-xin PCV2

từ các chủng phân lập ở Việt Nam. Nguyễn Thị Thu Hồng và ctv (2008) đã phân lập

được 2 chủng PCV2 trên môi trường tế bào PK15A. Kết quả gây bệnh thực nghiệm

trên heo cho thấy phân lập NAVET-vietanm3/2004 (mã số GenBank JX506730) có

thể gây nhiễm, nhân lên và kích thích sinh miễn dịch trên heo thì nghiệm. Huỳnh Thị

Mỹ Lệ và Nguyễn Văn Giáp (2013) bước đầu cũng đã phân lập và xác định được đặc

tính sinh học của PCV2 ở đàn heo nuôi tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam, kết quả

phân lập được 8 chủng với hiệu giá dao động từ 102,7 đến 104,2TCID50/ml. Tác giả

Huỳnh Thị Mỹ Lệ và ctv (2015) cũng đã lựa chọn được 5 chủng từ 7 chủng thuộc

genotype PCVb để tiếp tục nghiên cứu chế tạo vắc-xin phòng hội chứng còi ở heo

con. Hiệu giá qua các lần tiếp đời của 5 chủng này dao động từ 102,00 đến

105,75TCID50/0,1ml. Tiếp đó, ba chủng đã được chọn làm giống gốc để tiếp tục nghiên

cứu khả năng gây miễn dịch trên heo, kết quả cho thấy cả 3 chủng này đều kích thích

heo thí nghiệm sản sinh đáp ứng miễn dịch dịch thể trong vòng 14 đến 21 ngày và

kéo dài tối thiểu đến 56 ngày (Huỳnh Thị Mỹ Lệ và ctv, 2016).

Đặng Vũ Hoàng và ctv (2016) đã ứng dụng thành công hệ thống biểu hiện

baculovirus nhằm sản xuất protein ORF2 tái tổ hợp của PCV2. Nhóm tác giả này

cũng đã chứng minh khả năng sinh miễn dịch của kháng nguyên PCV2-ORF2 tái tổ

hợp này trên heo (Đặng Vũ Hoàng và ctv, 2018) hứa hẹn một tương lai không xa về

vắc-xin PCV2 tái tổ hợp được sản xuất ở Việt Nam.

Ở Việt Nam hiện nay chưa có vắc-xin PCV2 sản xuất trong nước. Các loại

vắc-xin PCV2 thương mại hiện hành đều là ngoại nhập (Bảng 1.3). Điều đáng lưu ý

là tất cả các loại vắc-xin này đều dựa trên genotype PCV2a. Trong khi, PCV2 lưu

hành phổ biến ở Việt Nam lại thuộc genotype PCV2b, PCV2d và nhóm tái tổi hợp

(Nguyễn Ngọc Hải và ctv, 2013; Huỳnh Thị Mỹ Lệ và ctv, 2012, 2013; Phạm Hồng

Quân và ctv, 2017).

Bảng 1.3. Các loại vắc-xin PCV2 thương mại ở Việt Nam

Loại vắc-xin Công ty sản xuất

Đối tượng Nái Heo con x x

x x Merial Haerbin Weike Trung Quốc

Vô hoạt Tên thương mại Circovac PCV2 vô hoạt nhũ dầu Circo pigvac Daesung Cổ điển Vô hoạt PCV2a

SuiShot Circo One x

Microbiological Labs, Hàn Quốc Choongang Vaccine Laboratory (CAVAC), Hàn Quốc Zoetis x

x Boehringer Ingelheim, Đức Vô hoạt PCV1-2a ORF2- PCV2a trên baculovirus x Thể ghép Biểu hiện protein Cap Thế hệ mới MSD Animal Health x

x x Fostera PCV2 Ingelvac CircoFLEX Porcilis PCV Circumvent PCV PROVAC Circomaster Komipharm (Hàn Quốc)

1.4.3. Hiệu quả của việc tiêm phòng vắc-xin PCV2

1.4.3.1. Lâm sàng

Tiêm phòng vắc-xin PCV2 giúp cải thiện tình trạng PMWS ở góc độ lâm sàng

như giảm tỉ lệ chết, cải thiện tăng trọng bình quân hằng ngày. Kristensen và ctv (2011)

phân tích tổng hợp từ 24 nghiên cứu thí nghiệm (study) và 66 thử nghiệm thực địa

(trial) về hiệu quả của các vắc-xin PCV2 thương mại được công bố từ năm 2006 đến

2008; kết quả cho thấy, việc tiêm vắc-xin PCV2 giúp cải thiện đáng kể tăng trọng

bình quân hàng ngày (TTHN) và giảm tỉ lệ chết. Cụ thể, trên heo thịt gần xuất chuồng

có TTHN tăng 41,5 g và tỉ lệ chết giảm 4,4%, trên heo từ giai đoạn sau cai sữa đến

xuất chuồng có TTHN tăng 33,6 g và tỉ lệ chết giảm 5,4%, trên heo cai sữa thì ít cải

thiện hơn với TTHN chỉ tăng 10,6g và tỉ lệ chết chỉ giảm 0,25%. Một điều đáng ghi

nhận là, việc tiêm vắc-xin PCV2 cho các đàn heo âm tính với PRRSV có TTHN cải

thiện đáng kể hơn so với đàn heo dương tính với PRRSV (36,5 g so với 20,6 g), tuy

nhiên, tình trạng nhiễm PRRSV lại không ảnh hưởng đến tỉ lệ chết. Kết quả phân tích

tổng hợp của da Silva và ctv (2014) cho thấy sự khác biệt về TTHN giữa nhóm heo

tiêm vắc-xin và không tiêm vắc-xin PCV2 là 22,87 g, và tình trạng nhiễm PRRSV

ảnh hưởng đáng kể đến TTHN. Nếu xét về góc độ kinh tế, gia tăng TTHN như thế là

quá ít để chứng minh hiệu quả của việc tiêm vắc-xin PCV2. Tuy nhiên, việc giảm

đáng kể tỉ lệ chết trên heo tiêm vắc-xin PCV2 đã đem lại hiệu quả đáng kể về kinh tế

(Kristensen và ctv, 2011).

Các nghiên cứu đánh giá hiệu quả tiêm vắc-xin phòng PCV2 trên heo ở Việt

Nam cho thấy, tiêm vắc-xin cho nái giúp làm giảm tỉ lệ còi và loại thải trong giai

đoạn heo con theo mẹ và sau cai sữa. Cụ thể, heo con sinh ra từ nái được tiêm vắc-

xin có tỉ lệ loại còi và loại thải ở giai đoạn theo mẹ và sau cai sữa là 4,79% và 4,47%

thấp hơn so với lô đối chứng 6,86% và 10,29% (Nguyễn Đức Nhân, 2009). Khảo sát

của Phan Thanh Đoàn (2012) cũng cho thấy việc tiêm vắc-xin phòng PCV2 trên heo

nái giúp làm giảm đáng kể tỉ lệ heo mắc PMWS trên heo con (27,27% so với 64,52%).

Ngoài ra, theo Trần Thị Dân và ctv (2013) việc tiêm vắc-xin phòng PCV2 cho heo

con, dù là tiêm loại 1 liều (CircoFLEX) hay 2 liều (Circumvent), đều giúp cải thiện

TTHN và giảm tỉ lệ loại thải. Cụ thể, nhóm heo tiêm vắc-xin 2 liều có tỉ lệ loại thải

là 3,6%, nhóm tiêm 1 liều là 5,2%, thấp hơn rất nhiều so với nhóm đối chứng với tỉ

lệ loại thải lên đến 14,4%.

1.4.4.2. Cận lâm sàng

Về vi-rút

Trong điều kiện thí nghiệm, tiêm vắc-xin PCV2 làm giảm tình trạng vi-rút

huyết từ 42,0 – 86,1% trong thí nghiệm tiêm vắc-xin và công cường độc với PCV2

(Fort và ctv, 2009b; Opriessnig và ctv, 2010). Đồng thời, lượng vi-rút trong máu của

heo được tiêm vắc-xin sau đó công cường độc không vượt quá ngưỡng 107 bản sao

ADN/ml (Brunborg và ctv, 2004; Fort và ctv, 2009b; Opriessnig và ctv, 2009a, 2010;

Shen và ctv, 2010). Trong các thử nghiệm thực địa, kết quả cũng cho thấy, trên heo

được tiêm vắc-xin PCV2, tỉ lệ heo có vi-rút huyết và lượng vi-rút trong máu giảm so

với heo không được tiêm vắc-xin (Horlen và ctv, 2008; Kixmoller và ctv, 2008; Fraile

và ctv, 2012a). Cụ thể, kết quả nghiên cứu thực địa của Kixmoller và ctv (2008) cho

thấy, tiêm vắc-xin PCV2 trên heo lúc 3 tuần tuổi giúp giảm tỉ lệ heo có PCV2 huyết

còn 35% so với nhóm đối chứng là 85% lúc 11-16 tuần tuổi. Tương tự, kết quả ghi

nhận của Fraile và ctv (2012a) cũng cho thấy, nhóm heo được tiêm vắc-xin có tỉ lệ

heo dương tính PCV2 trong huyết thanh giảm đáng kể (P < 0,05) so với nhóm heo

đối chứng ở thời điểm 98, 119 và 140 ngày sau tiêm vắc-xin.

Ngoài việc giúp giảm tình trạng vi-rút huyết cũng như giai đoạn vi-rút huyết

ngắn thì tiêm vắc-xin PCV2 trên heo còn giúp làm giảm lượng vi-rút bài thải qua mũi

và qua phân trong điều kiện thí nghiệm (Fort và ctv, 2009b; Seo và ctv, 2014b), cũng

như trong điều kiện thực địa (Fraile và ctv, 2012a). Do đó, tiêm vắc-xin PCV2 là

phương pháp khá hữu hiệu trong việc kiểm soát PCV2 không những ở mức độ cá thể

mà còn ở mức độ quần thể (Chae, 2012b).

Về miễn dịch

Các nghiên cứu thí nghiệm và thử nghiệm thực địa đều chứng minh khả năng

kích thích sinh đáp ứng kháng thể trung hòa cũng như miễn dịch qua trung gian tế

bào của các loại vắc-xin PCV2 thương mại hiện hành (Fort và ctv, 2009b; Opriessnig

và ctv, 2009a, 2010; Martelli và ctv, 2011; Seo và ctv, 2014b; Jeong và ctv, 2015).

Kháng thể trung hòa kết hợp với đáp ứng miễn dịch trung gian tế bào (thông qua các

tế bào tiết IFN- đặc hiệu PCV2) có tác dụng loại trừ PCV2 trên heo (Fort và ctv,

2009a). Mặc dù, chỉ cần 1 liều cũng có khả năng kích thích sinh đáp ứng miễn dịch

trung hòa trên hầu hết các heo được tiêm vắc-xin PCV2, nhưng hiệu giá kháng thể

trung hòa trên heo được tiêm 2 liều vắc-xin cao hơn nhiều so với tiêm 1 liều (Fort và

ctv, 2008, 2009b).

Về bệnh lý: Trong điều kiện thí nghiệm và cả điều kiện thực địa, sự giảm vi-rút

huyết và giảm kháng nguyên PCV2 trong mô có liên quan chặt chẽ với điểm mô bệnh

học ở các hạch bạch huyết (Segalés và ctv, 2009; Kim và ctv, 2011). Điều này có nghĩa

là vắc-xin PCV2 có thể làm giảm lượng PCV2 có trong huyết thanh và trong hạch bạch

huyết dẫn đến kết quả làm giảm bệnh tích vi thể ở các mô bạch huyết.

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của kháng thể thụ động (KTTĐ) lên hiệu lực

vắc-xin PCV2 của Opriessnig và ctv (2008a) cho thấy, mặc dù có sự hiện hiện của

KTTĐ nhưng tiêm vắc-xin vẫn giúp làm giảm bệnh tích vi thể gây ra bởi PCV2 ở các

cơ quan bạch huyết và phổi. Ngoài ra, cũng theo Opriessnig và ctv (2009a), tiêm vắc-

xin PCV2 giúp giảm đáng kể bệnh tích vi thể ở các mô bạch huyết. Trong đó, ở các

heo được tiêm 1 liều giảm 78,7% và ở heo tiêm 2 liều giảm 81,8% so với các heo

không tiêm vắc-xin. Còn kết quả nghiên cứu của Shen và ctv (2010) cho thấy không

có sự khác biệt về bệnh tích vi thể nói chung giữa heo tiêm vắc-xin và heo không

tiêm, cũng như không có sự khác biệt về điểm bệnh tích vi thể giữa nhóm heo tiêm 1

liều (1,1  0,5) và tiêm 2 liều (1,5  0,7) vắc-xin. Tuy nhiên, một điều đáng ghi nhận

là có sự khác biệt ý nghĩa giữa nhóm heo tiêm vắc-xin và heo không tiêm vắc-xin về

sự hiện diện của kháng nguyên PCV2 bên trong bệnh tích vi thể (được đánh giá thông

qua điểm PCV2 IHC). Trong đó, nhóm heo được tiêm vắc-xin nói chung có điểm

PCV2 IHC thấp hơn so với nhóm heo đối chứng dương (P < 0,05). Tương tự, kết quả

nghiên cứu so sánh hiệu lực của 4 loại vắc-xin PCV2 thương mại của Seo và ctv (2014b)

cho thấy, sau khi công cường độc heo được tiêm vắc-xin có điểm bệnh tích mô học thấp

hơn (biến động từ 0,3 0,48 đến 0,9  0,51) so với heo không tiêm vắc-xin (1,7  0,7)

(P < 0,05). Đồng thời, điểm PCV2 IHC của heo tiêm vắc-xin (biến động từ 2,9  4,31

đến 7,1  4,65) cũng thấp hơn so với heo không tiêm vắc-xin (23,2  6,67).

1.4.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tiêm phòng vắc-xin PCV2

1.4.5.1. Kháng thể thụ động

Hiệu quả tiêm phòng vắc-xin PCV2 ở heo con có thể sẽ gặp phải trở ngại bởi

KTTĐ chống PCV2 tại thời điểm tiêm vắc-xin. Trong thực tế, phần lớn heo nái hoặc

phơi nhiễm tự nhiên với PCV2, hoặc được tiêm phòng vắc-xin PCV2 nên hầu hết heo

con sinh ra đều nhận được KTTĐ chống PCV2 qua sữa đầu từ heo mẹ. Tuy nhiên,

hàm lượng KTTĐ ở heo con rất biến động (Grau-Roma và ctv, 2009). Theo Fort và

ctv (2009b), hiệu giá IPMA ≥ 10log2 (hoặc NA > 8,8log2) có khả năng ức chế sản sinh

đáp ứng miễn dịch dịch thể sau tiêm vắc-xin, tuy nhiên, đáp ứng miễn dịch dịch thể sau

tiêm vắc-xin không bị ảnh hưởng nếu hiệu giá IPMA < 8log2 hoặc NA < 5,5log2. Kết

quả nghiên cứu thực địa của Fraile và ctv (2012a) cho thấy, có mối tương quan nghịch

có ý nghĩa giữa hiệu giá KTTĐ và đáp ứng kháng thể sau tiêm vắc-xin PCV2. Không

có sự gia tăng hiệu giá kháng thể sau tiêm vắc-xin 21 ngày khi hiệu giá KTTĐ tại thời

điểm tiêm phòng là IPMA > 10log2 (Fraile và ctv, 2012a). Điều này có nghĩa là, hiệu

giá KTTĐ cao có khả năng ngăn trở đáp ứng miễn dịch dịch thể sau tiêm phòng vắc-

xin PCV2. Do đó, để xây dựng một chương trình phòng PMWS bằng vắc-xin đạt hiệu

quả cao cần thiết phải có sự cân bằng về lợi ích giữa việc trì hoãn tiêm phòng trong

trường hợp heo ở lứa tuổi cai sữa có hiệu giá KTTĐ cao với yêu cầu tạo miễn dịch chủ

động cho heo con trước lúc chúng phơi nhiễm với tác nhân gây bệnh trong điều kiện

thực địa. Theo Fort và ctv (2009b), việc tiêm phòng vắc-xin PCV2 cho heo nên được

thực hiện tại thời điểm hiệu giá KTTĐ IPMA < 10log2, nhưng cũng không nên tiêm

phòng quá muộn vì heo sẽ trở nên nhạy cảm với PCV2 khi KTTĐ IPMA < 5,5log2.

1.4.5.2. Quy trình tiêm phòng

Hiện nay, có một số quy trình tiêm vắc-xin khác nhau nhằm phòng ngừa

PMWS bao gồm tiêm cho heo nái hoặc tiêm phòng cho heo con hoặc kết hợp tiêm

phòng cho cả heo nái và heo con. Tuy nhiên, mỗi quy trình có những ưu, nhược điểm

và ảnh hưởng khác nhau đến hiệu quả phòng PMWS bằng vắc-xin. Nguyên tắc của

việc tiêm phòng cho heo nái là thông qua miễn dịch thụ động truyền qua sữa đầu để

bảo vệ heo con chống lại phơi nhiễm PCV2. Việc áp dụng quy trình tiêm vắc-xin kết

hợp cho heo nái và heo con có lẽ sẽ mang lại hiệu quả bảo hộ tốt hơn vì heo con vừa

bảo vệ bởi miễn dịch thụ động vừa được bảo vệ bằng miễn dịch chủ động. Tuy nhiên,

câu hỏi đặt ra là, liệu quy trình tiêm phòng kết hợp trên nái và heo con có mang lại

hiệu quả cao hơn so với quy trình chỉ tiêm phòng trên heo nái hoặc chỉ tiêm phòng

trên heo con.

Pejsak và ctv (2010) nghiên cứu thực địa về hiệu lực của 3 quy trình tiêm

phòng vắc-xin PCV2 (Circovac, Merial) ở trại heo bị ảnh hưởng bởi PMWS. Quy

trình thứ nhất là tiêm vắc-xin 2 lần cách nhau 3 – 4 tuần cho heo nái trước khi sinh,

quy trình thứ 2 là tiêm cho heo con 4 tuần tuổi và quy trình thứ 3 là kết hợp tiêm cho

heo nái và heo con sinh ra được tiêm vắc-xin lúc 7 tuần tuổi. Kết quả cho thấy không

có sự khác biệt về tỉ lệ chết và chỉ số chuyển biến thức ăn giữa 3 quy trình tiêm phòng,

và việc tiêm phòng đã giúp cải thiện được tỉ lệ chết và chỉ số chuyển biến thức ăn so

với không tiêm phòng (P < 0,05). Tăng trọng hàng ngày được cải thiện rõ rệt trên

nhóm heo thực hiện theo quy trình kết hợp tiêm phòng cho nái và heo con so với 2

quy trình còn lại (P < 0,05). Tuy nhiên, khối lượng lúc xuất chuồng trên nhóm heo

theo quy trình tiêm phòng cho nái đạt cao nhất (P < 0,05).

Fraile và ctv (2012b) khi đánh giá ảnh hưởng của việc tiêm vắc-xin PCV2

(Porcillis, MSD) trên heo nái và/ hoặc trên heo con lúc 4 tuần tuổi đến các chỉ tiêu tỉ lệ

chết, tình trạng vi-rút huyết, hiệu giá kháng thể và năng suất sản xuất của heo con ở trại

heo nhiễm PCV2 tiềm ẩn, ghi nhận, heo nái được tiêm phòng vắc-xin PCV2 một tuần

trước khi phối có thể truyền kháng thể cho heo con lúc 4 tuần tuổi với hiệu giá cao hơn

đáng kể so với nái không được tiêm vắc-xin. Không phụ thuộc vào việc heo mẹ có

được tiêm vắc-xin PCV2 hay không, việc tiêm vắc-xin PCV2 cho heo con lúc 4 tuần

tuổi giúp cải thiện đáng kể tăng trọng hàng ngày và giảm tỉ lệ thú nhiễm PCV2. Mặc

dù, việc tiêm phòng kết hợp vừa heo nái vừa heo con lúc 4 tuần có khả năng làm giảm

tình trạng nhiễm PCV2, nhưng lại gây một số ngăn trở đến đáp ứng miễn dịch dịch thể

chủ động ở heo con do ảnh hưởng của kháng thể thụ động (Fraile và ctv, 2012b).

Tương tự, Oh và ctv (2014) tiến hành thí nghiệm so sánh hiệu quả của các quy

trình tiêm phòng cho heo nái (âm tính ADN-PCV2 và âm tính kháng thể chống PCV2)

và/hoặc heo con. Trong đó, heo con từ nái được tiêm vắc-xin 2 lần (86 và 21 ngày)

trước khi đẻ được tiêm vắc-xin PCV2 lúc 21 ngày hoặc 49 ngày hoặc không tiêm và

nhóm heo con từ nái không tiêm vắc-xin được tiêm vắc xin PCV2 lúc 21 ngày hoặc

lúc 49 ngày tuổi, với 3 loại vắc-xin thương mại (Fostera PCV, Circoflex và Circovac).

Sau đó, heo thí nghiệm được công cường độc lúc 84 ngày tuổi với chỉ tiêu đánh giá

là miễn dịch học, vi-rút học và bệnh lý học. Kết cho thấy không xét đến loại vắc-xin

thì quy trình tiêm kết hợp tiêm cho heo nái và tiêm cho heo con lúc 49 ngày tuổi giúp

giảm đáng kể tình trạng PCV2 huyết, hiệu giá kháng thể trung hòa cao hơn và đáp

ứng CD4+CD8+IFN-γ+ cao hơn so với quy trình chỉ tiêm cho nái, hoặc chỉ tiêm

cho heo con (lúc 21 ngày hoặc 49 ngày), hoặc kết hợp giữa tiêm cho nái và heo con

lúc 21 ngày tuổi. Đồng thời, có mối tương quan nghịch giữa hiệu giá KTTĐ tại thời

điểm tiêm phòng với hiệu giá kháng thể chống PCV2 lúc 28 ngày sau tiêm vắc-xin

trên nhóm heo thực hiện quy trình tiêm kết hợp giữa nái và heo con lúc 21 ngày tuổi.

Từ kết quả của các nghiên cứu trên cho thấy việc áp dụng quy trình tiêm phòng

vắc-xin PCV2 cho heo nái kết hợp với tiêm cho heo con hoặc chỉ tiêm heo nái hoặc

chỉ tiêm trên heo con đều mang lại hiệu quả phòng bệnh PCVD. Tuy nhiên, việc lựa

chọn áp dụng quy trình tiêm phòng nào còn tùy thuộc vào mục tiêu của người chăn

nuôi, áp lực dịch bệnh cũng như đặc điểm dịch tễ cụ thể của từng trại.

1.4.5.3. Các tác nhân đồng nhiễm

Hiệu quả tiêm phòng vắc-xin PCV2 còn chịu ảnh hưởng bởi các tác nhân đồng

nhiễm. Kết quả phân tích hồi cứu các ca bệnh PCVD có đồng nhiễm với tác nhân gây

bệnh khác được thực hiện bởi phòng thí nghiệm chẩn đoán thú y ở bang Iowa – Mỹ

năm 2002 cho thấy tỉ lệ đồng nhiễm lên đến trên 98%. Đồng nhiễm PRRSV chiếm tỉ

lệ cao nhất (51,9%), kế đến là Mycoplasma hyopneumoniae (35,5%), các vi khuẩn

gây nhiễm trùng huyết (14%), các vi khuẩn đường hô hấp (7,6%) và vi-rút cúm heo

(SIV – swine influenza virus) (5,4%). Trong khi đó, tình trạng nhiễm đơn độc PCV2

chỉ chiếm một tỉ lệ rất thấp (1,9%) trong các ca bệnh (Pallares và ctv, 2002).

Kết quả phân tích tổng hợp (meta-analysis) của Kristensen và ctv (2011) cho

thấy, tiêm vắc-xin PCV2 trên các đàn heo âm tính với PRRSV giúp gia tăng đáng kể

tăng trọng bình quân hàng ngày so với các đàn dương tính với PRRSV, nhưng tình

trạng nhiễm PRRSV lại không ảnh hưởng đến tỉ lệ chết. Theo Canelli và ctv (2016),

tình trạng nhiễm PRRSV có ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch sau tiêm phòng vắc-

xin PCV2. Tình trạng PRRSV huyết không ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch dịch

thể, nhưng lại ảnh hưởng đáng kể đến đáp ứng miễn dịch trung gian tế bào chống

PCV2. Điều này có lẽ do việc nhiễm PRRSV ở giai đoạn sớm ảnh hưởng bất lợi đến

sự phát triển và hoạt hóa của các tế bào lym-phô T nguyên bản (naïve) từ đó ảnh

hưởng không tốt đến đến đáp ứng miễn dịch chống các tác nhân gây bệnh khác

(Canelli và ctv, 2016).

1.4.5.4. Sự biến đổi di truyền của PCV2

Các nghiên cứu cho thấy có sự biến đổi toàn cầu về genotype của PCV2 từ

PCV2a sang PCV2b và sự xuất hiện vượt trội của PCV2b từ sau năm 2003 (Olvera

và ctv, 2007; Dupont và ctv, 2008). Gần đây, có sự xuất hiện của biến chủng PCV2

mới mPCV2b (PCV2d). Vấn đề ở đây là hiệu lực của các vắc-xin dựa trên PCV2a có

bị ảnh hưởng hay không khi PCV2b trở nên phổ biến, cũng như sự xuất hiện và trở

nên phổ biến của PCV2d. Các nghiên cứu cho thấy, vắc-xin dựa trên PCV2a vẫn có

thể bảo hộ với các chủng PCV2a, PCV2b và cả với biến chủng mPCV2b (PCV2d)

(Opriessnig và ctv, 2014a; Jeong và ctv, 2015; Park và ctv, 2019) do có phản ứng

chéo giữa các genotype (Fort và ctv, 2008; Kurtz và ctv, 2014). Tuy nhiên, Takahagi

và ctv (2010) cho rằng, hiệu quả làm giảm tỷ lệ chết trên heo từ việc tiêm vắc-xin

PCV2 có thể phụ thuộc vào genotype của PCV2. Tương tự, kết quả nghiên cứu của

Opriessnig và ctv (2013a) cho thấy vắc-xin dựa trên genotype PCV2b tỏ ra có hiệu

quả cao hơn so với vắc-xin dựa trên genotype PCV2a trong việc bảo hộ chống lại

PCV2b hoặc kết hợp PCV2a/2b. Cụ thể, sau công cường độc 21 ngày, vắc-xin PCV1-

2b giúp giảm 100% tình trạng vi-rút huyết (ở cả 2 nhóm heo: tiêm vắc-xin PCV1-2b

công độc với PCV2b-PRRS-PPV và tiêm vắc-xin PCV1-2b công độc với PCV2a-

PCV2b-PRRS-PPV), trong khi đó vắc-xin PCV1-2a chỉ giúp giảm tình trạng vi-rút

huyết 25% (nhóm heo được tiêm vắc-xin PCV1-2a công độc với PCV2b-PRRS-PPV)

và 44,1% (nhóm heo được tiêm vắc-xin PCV1-2a công độc với PCV2a-PCV2b-

PRRS-PPV) (Opriessnig và ctv, 2013a). Đến nay, có một số vắc-xin dựa trên PCV2b

của Hàn Quốc (Chae, 2012a) và Trung Quốc (Zhai và ctv, 2014) đã được cấp chứng

nhận sản phẩm hoặc trong tương lai có thể phát triển thêm các loại vắc-xin đa giá

chứa từ 2 genotype trở lên.

1.4.6. Thất bại sau tiêm phòng vắc-xin PCV2

Tuy vắc-xin PCV2 được chứng minh là có hiệu quả trong việc bảo vệ heo

chống lại PMWS cả trong điều kiện thí nghiệm và trong thực địa, nhưng vẫn có các

báo cáo về việc thất bại trong tiêm phòng vắc-xin PCV2 trong thực địa. Có nhiều lý

do đưa ra để lý giải về sự thất bại này, trong đó tựu chung gồm 4 lý do chính như sau:

(1) ảnh hưởng của kháng thể mẹ truyền; (2) tiêm chủng sau khi thú đã bị nhiễm bệnh;

(3) sự suy giảm miễn dịch tại thời điểm tiêm phòng và (4) do vắc-xin. Các yếu tố liên

quan đến vắc-xin dẫn đến thất bại sau tiêm phòng bao gồm sự tương đồng giữa chủng

vi-rút vắc-xin và chủng vi-rút thực địa, loại tá dược, số lượng kháng nguyên có trong

vắc-xin, bảo quản và quy trình tiêm chủng. Trong đó, đáng lưu ý nhất là sự tương

đồng giữa chủng vi-rút vắc-xin và chủng vi-rút thực địa. Hầu hết các loại vắc-xin

PCV2 thương mại hiện nay đều dựa trên genotype PCV2a, trong khi đó genotype

PCV2b, và mới đây nhất là genotype PCV2d lại là genotype hiện hành phổ biến.

Ngoài ra, biến chủng mPCV2b (PCV2d) được nhận diện từ các ca tiêm vắc-xin PCV2

thất bại ở Mỹ (Xiao và ctv, 2012; Opriessnig và ctv, 2013b) và Hàn Quốc (Seo và

ctv, 2014a) nên gia tăng lo ngại khả năng các vắc-xin dựa trên PCV2a không thể bảo

hộ hoàn toàn chống lại PCV2b cũng như PCV2d.

1.5. Cơ sở khoa học nghiên cứu sản xuất vắc-xin PCV2

1.5.1. Cơ sở chọn thể loại vắc-xin để nghiên cứu

Đến nay, trên thế giới có rất nhiều nghiên cứu về vắc-xin phòng bệnh PCVD

(trình bày ở phần 1.4). Trong đó, các nhà khoa học không những nghiên cứu vắc-xin

cổ điển mà còn nghiên cứu các loại vắc-xin thế hệ mới (thể ghép, tiểu đơn vị, vắc-xin

ADN) nhằm phòng bệnh PMWS trên heo. Các loại vắc-xin PCV2 thương mại hiện nay

trên thế giới tập trung chủ yếu vào 3 loại đó là vắc-xin vô hoạt PCV2 toàn phần, vắc-

xin vô hoạt thể ghép PCV1-2, vắc-xin tiểu đơn vị dựa vào protein capsid của PCV2.

Kết quả phân tích tổng hợp của Kristensen và ctv (2011) cho thấy, không có

sự khác biệt về hiệu lực (xét ở gốc độ cải thiện năng suất sản xuất và tỉ lệ chết) giữa

các loại vắc-xin thương mại Circovac® (Merial) chứa PCV2 toàn phần vô hoạt;

Ingelvac® CircoFLEX (Boehringer Ingelheim), Circumvent® PCV và Porcilis

®PCV (MSD Animal Health) chứa protein capsid của PCV2 biểu hiện qua

baculovirus; Suvaxyn® PCV2 (Fort Dodge) chứa PCV1-2 vô hoạt. Về khả năng kích

thích đáp ứng miễn dịch, vắc-xin thể ghép PCV1-2 vô hoạt gây đáp ứng miễn dịch

với hiệu giá NA cao hơn so với các vắc-xin tiểu phần (Opriessnig và ctv, 2009a). Tuy

nhiên, không có sự khác biệt về hiệu giá NA giữa vắc-xin tiểu phần và vắc-xin toàn

phần PCV2 vô hoạt (Opriessnig và ctv, 2010). Bên cạnh đó, Seo và ctv (2014b)

nghiên cứu so sánh cùng lúc 4 loại vắc-xin thương mại phổ biến hiện nay (Fostera,

Circovac, Circoflex và Porcillis) cho thấy, vắc-xin toàn phần PCV2 vô hoạt và thể

ghép PCV1-2 vô hoạt gây đáp ứng miễn dịch với hiệu giá NA và IFN--SC cao hơn so

với các loại vắc-xin tiểu phần. Điều này cho thấy vắc-xin vô hoạt PCV2 toàn phần cổ

điển vẫn có hiệu lực tương đương với các loại vắc-xin PCV2 thế hệ mới. Ngoài ra,

việc nghiên cứu sản xuất vắc-xin vô hoạt PCV2 toàn phần cổ điển còn có ưu điểm là

công nghệ sản xuất đơn giản với chi phí đầu tư thấp hơn so với các loại vắc-xin dựa

trên công nghệ tái tổ hợp.

1.5.2. Cơ sở chọn chủng vi-rút vắc-xin

Soulebot và ctv (1997) đề xuất một số tiêu chí để chọn chủng vi-rút trong

nghiên cứu sản xuất vắc-xin bao gồm:

(1) Chủng vi-rút đó phải có khả năng gây đáp ứng miễn dịch bảo hộ chống lại

tác nhân gây bệnh. Sự bảo hộ này có thể là giúp con thú chống lại tình trạng lâm sàng

bệnh, hoặc chống lại ảnh hưởng bất lợi của bệnh lên các chỉ tiêu năng suất tăng trưởng

và sinh sản như giảm tăng trọng, giảm năng suất sữa… Đây là tiêu chí quan trọng

nhất trong việc lựa chọn chủng vi-rút vắc-xin. Đối với một số vắc-xin, không những

giúp bảo hộ bản thân con thú được chủng ngừa mà còn giúp bảo hộ đời con của chúng

thông qua miễn dịch thụ động. Trong trường hợp này cần chú ý đến cường độ gây

đáp ứng miễn dịch của chủng vắc-xin.

(2) Chủng vi-rút vắc-xin phải có phổ kháng nguyên rộng, có thể kích thích

sinh miễn dịch bảo hộ chống lại càng nhiều chủng thực địa càng tốt.

(3) Về cơ bản, chủng vi-rút vắc-xin có nguồn gốc từ các phân lập thực địa, các

chủng này có thể có độc lực cao, độc lực trung bình hoặc không có độc lực. Do đó,

tùy đặc tính độc lực của chủng vắc-xin mà chế tạo các loại vắc-xin khác nhau (sống

nhược độc, vô hoạt).

(4) Khả năng nhân lên của chủng vắc-xin trong môi trường nuôi cấy (tế bào

sơ cấp, tế bào dòng, phôi trứng…) để có thể phục vụ sản xuất vắc-xin ở quy mô lớn.

1.5.3. Cơ sở lựa chọn chất vô hoạt PCV2

Có nhiều phương pháp để vô hoạt vi sinh vật trong nghiên cứu, sản xuất vắc-

xin vô hoạt; bao gồm sử dụng các tác nhân vật lý (tia cực tím, tia gamma, nhiệt độ…)

và các tác nhân hóa học (kết tinh tím, formalin, beta-propiolactone, binary

ethyleneimine…). Yêu cầu của vắc-xin vô hoạt là phải an toàn và hiệu lực. Do đó, các

vi sinh vật dùng để chế tạo vắc-xin, sau khi bị vô hoạt phải không còn khả năng gây

bệnh nhưng vẫn phải giữ được tính kháng nguyên, nghĩa là có khả năng kích thích hệ

thống miễn dịch. Vì thế, cần phải lựa chọn phương pháp vô hoạt vi sinh vật phù hợp.

Formalin và binary ethyleneimine (BEI) thường được dùng trong các nghiên

cứu vắc-xin vô hoạt, cũng như trong các loại vắc-xin thương mại phòng bệnh PMWS.

Xujie và ctv (2011) sử dụng formalin ở nồng độ cuối cùng 1/1000 ở 40C, trong 12

giờ, và tiếp tục ở 370C trong 12 giờ để vô hoạt vi-rút thể ghép PCV1-2 trong nghiên

cứu vắc-xin thể ghép phòng bệnh PMWS. Tương tự, Yang và ctv (2012) vô hoạt

PCV2 bằng formalin với nồng độ cuối cùng 0,3% trong thời gian 48 giờ ở 370C trong

nghiên cứu vắc-xin vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh PMWS. Một số vắc-xin PCV2

thương mại hiện nay cũng dùng formalin để vô hoạt vi-rút như vắc-xin DS CIRCO

PIGVAC của Hàn Quốc, vắc-xin vô hoạt dựa trên chủng LG của Trung Quốc. Bên

cạnh formalin, binary ethyleneimine cũng được dùng, không chỉ trong nghiên cứu

chế tạo vắc-xin vi-rút toàn phần vô hoạt phòng PMWS (Pogranichnyy và ctv, 2004)

mà còn dùng trong một số sản phẩm vắc-xin tiểu phần thương mại như Porcilis PCV

(MSD Animal Health), Circoflex (Boehringer Ingelheim Vetmedica), Suvaxyn PCV2

(Fort Dodge).

Ưu điểm của formalin là vô hoạt vi-rút nhanh do formalin phản ứng mạnh với

protein, a-xít a-min và a-xít nhân, ổn định, hiệu quả cao, giá thành rẻ, dễ sản xuất.

Tuy nhiên, formalin lại có nhược điểm là không vô hoạt hoàn toàn một số vi-rút như

FMDV (foot and mouth disease virus) (King và ctv, 1981), vi-rút gây viêm não trên

ngựa Venezuela (Venezuelan equine encephalitis virus – VEEV) (Brown, 1993) dẫn

đến nổ ra dịch bệnh do sử dụng vắc-xin chứa vi-rút chưa được vô hoạt hoàn toàn.

Formalin có thời gian phân giải chậm nên quá trình vô hoạt kéo dài, có thể phá hủy

cấu trúc vi-rút từ đó biến đổi tính kháng nguyên và làm giảm khả năng gây đáp ứng

miễn dịch. Ngoài ra, hàm lượng formalin cao ảnh hưởng đến sức khỏe vật nuôi.

BEI vô hoạt vi-rút thông qua cơ chế tác động trên a-xít nhân, do đó không làm

thay đổi cấu trúc protein, cũng như không làm mất tính kháng nguyên của vi-rút bị

vô hoạt (Delrue và ctv, 2012). Đây là ưu điểm vượt trội của BEI so với formalin.

Ngoài ra, BEI hoạt động ổn định, hiệu quả vô hoạt cao. Tuy nhiên, BEI có nhược

điểm là quy trình chuẩn bị BEI phức tạp. BEI là chất độc hại nên phải cận thận trong

quá trình thao tác.

1.5.4. Cơ sở lựa chọn chất bổ trợ

Chất bổ trợ (adjuvant) là những chất được bổ sung vào vắc-xin, có khả năng

kích thích sinh miễn dịch nhằm nâng cao hiệu lực và độ dài miễn dịch của vắc-xin.

Nhũ dầu là chất bổ trợ thường được dùng trong các loại vắc-xin phòng bệnh trên heo

nói chung và phòng PMWS nói riêng. Heo là loài vật khá nhạy cảm, có lớp mỡ dưới

da dày, cần các công thức vắc-xin chuyên biệt nhằm ngăn ngừa các phản ứng cục bộ

và bảo đảm chất lượng thịt tại vị trí tiêm. Do đó, các chất bổ trợ có pha nước liên tục

như chất bổ trợ dầu trong nước (oil in water – O/W), nước trong dầu trong nước

(water in oil in water – W/O/W) thường được sử dụng trong các công thức vắc-xin

dạng tiêm trên heo (Heegaard và ctv, 2011). Nhũ dầu dạng O/W lỏng (fluid), khá bền

(tolerated) và gây các đáp ứng miễn dịch mạnh trong thời gian ngắn. Quy trình sản

xuất rất tiện lợi vì chỉ cần sự pha trộn thấp với tỉ lệ pha dầu chỉ từ 15 - 25%

(Aucouturier và ctv, 2001). Với dạng nhũ dầu kép W/O/W, khởi đầu do Herbert

(1965) phát triển, thực hiện gồm 2 bước với quy trình tạo nhũ khá phức tạp và tính

ổn định của nhũ cũng không cao. Đến nay, với quy trình tạo nhũ một bước đã tạo

được loại nhũ kép ổn định, lỏng và dễ dàng thực hiện. Điều đáng quan tâm là các loại

nhũ kép có độ nhớt thấp, đồng thời có khả năng kích thích vừa đáp ứng miễn dịch

ngắn hạn và dài hạn. Trong công thức nhũ kép, kháng nguyên ở trong pha nước bên

ngoài sẽ kích thích hệ thống miễn dịch ngay khi tiêm vào và kháng nguyên trong pha

nước ở trong sẽ được giải phóng từ từ, vì thế các vắc-xin nhũ kép sẽ kích thích đáp

ứng miễn dịch nhanh chóng và kéo dài. Loại nhũ kép này dựa trên dầu khoáng được

khuyến cáo dùng cho heo. Tuy nhiên, với các loại kháng nguyên có tính kích ứng

(reactive) nên tránh phối hợp với loại nhũ này cho heo thịt vì nó có thể gây tổn hại

quầy thịt (Aucouturier và ctv, 2001). Do đó, tùy từng loại kháng nguyên cụ thể mà

nhà sản xuất sẽ lựa chọn công thức nhũ phù hợp, vừa nâng cao hiệu lực của vắc-xin

vừa đảm bảo an toàn cho heo, cũng như đảm bảo chất lượng quầy thịt.

1.5.5. Tiêu chuẩn đánh giá vắc-xin

Các tiêu chuẩn đánh giá vắc-xin bao gồm tính ổn định, vô trùng, thuần khiết,

không độc, an toàn, hiệu lực, độ dài miễn dịch tốt, trong đó 2 tiêu chí quan trọng nhất

đó là tính an toàn và hiệu lực.

1.5.5.1. An toàn

An toàn là một trong những tiêu chuẩn quan trọng đầu tiên để đánh giá vắc-

xin. Một vắc-xin lý tưởng khi sử dụng sẽ không gây bệnh, không gây độc và không

gây phản ứng. Các phản ứng sau tiêm vắc-xin thường gặp bao gồm:

Phản ứng tại chỗ: Những phản ứng nhẹ thường gặp sau tiêm chủng là nơi tiêm

có thể hơi đau, mẩn đỏ, hơi sưng hoặc nổi cục nhỏ. Những phản ứng này sẽ mất đi

nhanh chóng sau một vài ngày, không cần phải can thiệp gì. Nếu tiêm chủng không

đảm bảo vô trùng, thì nơi tiêm chủng có thể bị viêm nhiễm, làm mủ.

Phản ứng toàn thân: Trong các phản ứng toàn thân, sốt hay gặp hơn cả. Sốt

thường hết nhanh sau một vài ngày. Một số vắc-xin có thể gây ra phản ứng nguy hiểm

hơn, trong đó có sốc phản vệ, tuy nhiên rất hiếm gặp.

Theo quy định của Tổ chức Dịch tễ Thế giới (Office International des

Epizooties - OIE) năm 2015, các nghiên cứu tính an toàn trong suốt quá trình phát

triển và cấp chứng nhận cho vắc-xin phải bao gồm tính an toàn với liều đơn đối với

tất cả các sản phẩm, cũng như tính an toàn với liều cao (overdose) đối với vắc-xin

sống và lặp lại các liều đơn đối với các loại vắc-xin cần dùng nhiều hơn 1 liều trong

suốt đời sống của con thú. Đối với các loại vắc-xin vi-rút vô hoạt, việc kiểm tra tính

an toàn có thể được thực hiện bằng cách đo lường các phản ứng cục bộ và toàn thân

của thú được tiêm vắc-xin trong các thí nghiệm đánh giá hiệu lực trước khi tiến hành

công cường độc.

1.5.5.2. Hiệu lực

Theo Soulebot và ctv (1997), hiệu lực vắc-xin có thể được định nghĩa là khả

năng bảo hộ các thú được tiêm vắc-xin chống lại tác động bất lợi của nhiễm trùng,

hoặc khả năng sinh kháng thể - kháng thể này được truyền cho đời con của thú được

tiêm vắc-xin - giúp bảo hộ thú sơ sinh chống lại bệnh. Sự bảo hộ không những giúp

bảo vệ thú chống lại nhiễm trùng mà còn bảo vệ thú chống lại biểu hiện lâm sàng của

bệnh cũng như giảm năng suất sản xuất…

Vắc-xin có hiệu lực cao là vắc-xin gây được miễn dịch ở mức độ cao và tồn

tại trong một thời gian dài. Hiệu lực gây miễn dịch của vắc-xin trước hết được đánh

giá trên động vật thí nghiệm, sau đó trên thực địa. Hiệu lực vắc-xin được chứng minh

một cách thuyết phục nhất trong điều kiện thí nghiệm bằng thử nghiệm chủng ngừa -

công cường độc trên các loài động vật đích. Tuy nhiên, đối với một số bệnh chỉ gây

giảm hiệu quả kinh tế như chậm tăng trưởng và khó tái gây bệnh trong điều kiện

phòng thí nghiệm như PCVD, cần thiết phải thực hiện các thử nghiệm hiệu lực vắc-

xin trong điều kiện thực địa để đánh giá tác động của vắc-xin trong việc cải thiện các

chỉ tiêu năng suất của đàn.

Các thông số để đánh giá hiệu lực vắc-xin PCV2: Hiệu quả của các vắc-xin

PCV2 thương mại đã được khảo nghiệm một cách rộng rãi trong các thí nghiệm công

cường độc được kiểm soát trên heo. Các thí nghiệm gây nhiễm đơn độc PCV2 rất khó

để có thể tái gây các biểu hiện lâm sàng bệnh PMWS như trong thực địa (Allan và

ctv, 1999; Albina và ctv, 2001; Resendes và ctv, 2004a). Do đó, hầu hết các nghiên

cứu hiệu lực vắc-xin PCV2 thường sử dụng các mô hình công cường độc kết hợp giữa

PCV2 với một hoặc hai tác nhân gây bệnh trên heo như: kết hợp PCV2 với PRRSV

(Opriessnig và ctv, 2008b), PCV2 với SIV và PRRSV (Opriessnig và ctv, 2009a) hoặc

PCV2 với PRRS và PPV (Shen và ctv, 2010). Đồng thời, có khá nhiều nghiên cứu

nhằm đánh giá hiệu lực của các vắc-xin thương mại trong điều kiện thực địa (Fachinger

và ctv, 2008; Kixmöller và ctv, 2008; Segalés và ctv, 2009; Pejsak và ctv, 2010). Do

không thể tái gây bệnh PMWS điển hình như trong thực địa nên trở ngại lớn nhất đối

với vắc-xin PCV2 là việc thiết lập các thông số để đánh giá hiệu lực vắc-xin PCV2.

Một số nghiên cứu cho thấy, lượng ADN-PCV2 trong huyết thanh của heo

mắc PMWS cao hơn so với heo nhiễm PCV2 tiềm ẩn và heo khỏe mạnh (Rosell và

ctv, 1999; Liu và ctv, 2000; Ladekjær-Mikkelsen và ctv, 2002). Lượng PCV2 có trong

máu được định lượng bằng phương pháp real-time PCR với hàm lượng <106, 106 -

107 và >107 bản sao ADN/ml được dùng để xác định heo nhiễm PCV2, heo nghi ngờ

và heo dương tính PMWS tương ứng (Liu và ctv, 2000; Olvera và ctv, 2004;

Opriessnig và ctv, 2009a). Cách xếp loại này được dùng để đánh giá hiệu lực vắc-xin

PCV2. Tuy nhiên, ngưỡng để xác định heo mắc PMWS cần được xem xét thực tế ở

mỗi phòng thí nghiệm và mỗi quy trình xét nghiệm riêng biệt (Hjulsager và ctv, 2008).

Chae (2012b) cho rằng, việc thiết lập các thông số để đánh giá hiệu lực vắc-

xin PCV2 chủ yếu dựa vào các tiêu chí để chẩn đoán bệnh PMWS bao gồm (1) sự

hiện diện của các dấu hiệu lâm sàng, (2) sự hiện diện của các bệnh tích vi thể đặc

trưng, (3) sự hiện diện của PCV2 bên trong các mô có biểu hiện bệnh tích đặc trưng.

Ngoài ra, còn một tiêu chí để chẩn đoán bệnh PMWS nữa đó là lượng vi-rút trong

huyết thanh kết hợp với các dấu hiệu lâm sàng (Liu và ctv, 2000; Brunborg và ctv,

2004; Olvera và ctv, 2004; Segalés và ctv, 2005a). Do đó, để đánh giá hiệu lực vắc-

xin PCV2 cần dựa vào (1) lâm sàng (tăng trọng bình quân hàng ngày, tỉ lệ bệnh, tỉ lệ

chết) và (2) cận lâm sàng: vi-rút học (vi-rút huyết, bài thải vi-rút), miễn dịch học (sự

hiện diện của kháng thể trung hòa và các tế bào tiết interferon  đặc hiệu PCV2) và

bệnh lý học (bệnh tích ở các mô lym-phô và sự hiện diện của kháng nguyên PCV2

bên trong các bệnh tích).

1.6. Nhận xét chung

PCV2 lưu hành phổ biến toàn cầu và gây PCVD trên heo, trong đó quan trọng

nhất là PMWS, gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi heo. Sự biến đổi từ

genotype PCV2a sang PCV2b xảy ra trên toàn thế giới; sự xuất hiện và trở nên phổ

biến của genotype PCV2d, điều đáng lưu ý là genotype PCV2d được phân lập từ các

ca tiêm phòng vắc-xin PCV2 thất bại.

Vắc-xin PCV2 kích thích sinh đáp ứng miễn dịch dịch thể và miễn dịch trung

gian tế bào. Tiêm vắc-xin PCV2 mang lại hiệu quả trong việc phòng bệnh PMWS như

giảm tỉ lệ chết, cải thiện tăng trọng bình quân hàng ngày, giảm tiêu tốn thức ăn. Ngoài

ra, tiêm vắc-xin cho heo nái giúp bảo vệ heo con chống lại PMWS thông qua miễn dịch

thụ động. Tuy nhiên, vấn đề tồn tại là các loại vắc-xin PCV2 hiện nay ở Việt Nam

đều là ngoại nhập và dựa trên genotype PCV2a, trong khi đó, PCV2 lưu hành phổ

biến ở Việt Nam lại thuộc genotype PCV2b và PCV2d. Đồng thời, có bằng chứng

cho thấy khả năng bảo hộ vượt trội của vắc-xin dựa trên genotype PCV2b so với

PCV2a. Do đó, nghiên cứu sản xuất vắc-xin từ chủng PCV2 phù hợp với genotype

hiện hành phổ biến ở Việt Nam là rất cần thiết, nhằm nâng cao hiệu quả tiêm phòng

PMWS, giảm được giá thành trong chăn nuôi, chủ động được nguồn vắc-xin, không

phải phụ thuộc vào các công ty nước ngoài.

1.7. Những vấn đề luận án cần tập trung nghiên cứu giải quyết

Vấn đề đặt ra cần giải quyết là nghiên cứu chế tạo vắc-xin PCV2 nội địa phù

hợp với dịch tễ, cũng như khả năng sản xuất của Việt Nam nhằm nâng cao hiệu quả

phòng bệnh PMWS và giảm giá thành vắc-xin. Để thực hiện được điều này cần giải

quyết các vấn đề như sau:

+ Giải trình tự và phân tích di truyền PCV2, từ đó xác định genotype PCV2

lưu hành phổ biến tại một số tỉnh ở Việt Nam.

+ Khảo sát đặc tính sinh học của một số chủng PCV2 đang lưu hành ở Việt

Nam. Đánh giá và chọn chủng PCV2 thích hợp sản xuất thử nghiệm vắc-xin phòng

bệnh liên quan PCV2 trên heo sau cai sữa.

+ Nghiên cứu chế tạo vắc-xin PCV2 vô hoạt: xây dựng quy trình vô hoạt

PCV2, chọn chất bổ trợ miễn dịch phù hợp, xác định tính an toàn và hiệu lực của vắc-

xin PCV2 thử nghiệm.

Chương 2

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Phạm vi và đối tượng nghiên cứu

 Trung tâm Nghiên Cứu Thú Y – Công ty cổ phần Thuốc Thú Y Trung

2.1.1. Địa điểm

 Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh

 Bốn mươi bốn trại heo ở 13 tỉnh thành ở Việt Nam bao gồm 12 tỉnh thành

Ương NAVETCO

phía Nam (Cà Mau, Cần Thơ, Bến Tre, Long An, Tp. Hồ Chí Minh, Tây

Ninh, Bình Dương, Đồng Nai, Lâm Đồng, Khánh Hòa, Phú Yên và Bình

Định) và 1 tỉnh Bắc Trung Bộ (Nghệ An).

2.1.2. Thời gian: Từ tháng 06/2012 đến 06/2018

2.1.3. Đối tượng nghiên cứu:

PCV2 và vắc-xin phòng bệnh liên quan PCV2 trên heo sau cai sữa

2.2. Nội dung nghiên cứu

 Khảo sát đa dạng di truyền của PCV2 tại 13 tỉnh thành ở Việt Nam .

 Khảo sát đặc tính sinh học của một số chủng PCV2 phân lập.

 Nghiên cứu chế tạo vắc-xin PCV2 vô hoạt nhũ dầu từ chủng PCV2 phân lập:

bất hoạt vi-rút chế tạo kháng nguyên, đánh giá tính an toàn và hiệu lực của

vắc-xin PCV2 vô hoạt nhũ dầu trong điều kiện phòng thí nghiệm.

2.3. Vật liệu, hóa chất

2.3.1. Vật liệu thí nghiệm

 Các mẫu bệnh phẩm (hạch, lách, phổi và huyết thanh) dương tính ADN-PCV2

thu thập từ 44 trại heo nuôi ở 13 tỉnh thành Việt Nam từ năm 2007 đến 2016

được lưu giữ ở - 700C tại Trung tâm nghiên cứu thú y – NAVETCO.

 Heo con 3 tuần tuổi từ một trại heo thương phẩm đã được kiểm tra âm tính với

kháng nguyên PCV2, CSFV, PRRSV và Mycoplasma hyopneumoniae bằng

 Vắcxin PCV2 vô hoạt nhũ dầu thử nghiệm.

phương pháp PCR và RT-PCR.

MẪU THỰC ĐỊA (+) PCR PCV2

Chọn chủng giống gốc

Phân lập PCV2 trên PK15A

KHẢO SÁT ĐA DẠNG DI TRUYỀN Nhân lên tạo sinh khối

Đặc điểm phát triển của PCV2 trên PK15A

Vô hoạt vi-rút

KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH SINH HỌC Đánh giá độc lực và Tính sinh miễn dịch của PCV2

Nhũ hóa

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VẮC-XIN Tính an toàn, hiệu lực So sánh sự tương đồng kháng nguyên giữa các chủng PCV2

Hình 2.1. Tóm tắt nội dung nghiên cứu

 Hóa chất tách chiết ADN: bộ kít ly trích ADN QIAamp® Mini kit (QIAGEN, Đức).

 Hóa chất dùng trong phản ứng PCR: Taq DNA polymerase (Promega, Mỹ),

2.3.2. Hóa chất và các sinh phẩm

 Tế bào dòng thận heo PK15A do Phòng thí nghiệm sức khỏe động vật quốc

dNTPs (Promega, Mỹ).

 Đối chứng dương vi-rút PCV2b do AAHL cung cấp.

gia Úc (Australian Animal Health Laboratory – AAHL) cung cấp.

 Các hóa chất nuôi cấy tế bào: Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM), huyết

 Hóa chất dùng trong phản ứng IPMA: HRP protein A (Invitrogen, Mỹ)

 Bộ kít ELISA Ingezim PCV IgG® (Ingenasa, Madrid, Tây Ban Nha) phát hiện

thanh bào thai bê, penicilline/streptomycine, fungizone, trypsin 0,25% (Gibco, Mỹ).

 Các hóa chất dùng trong quy trình bất hoạt vi-rút: 2-bromoethylamine (Sigma,

kháng thể IgG đặc hiệu chống PCV2 trong huyết thanh.

 Chất bổ trợ: nhũ dầu dạng dầu trong nước (oil in water - O/W).

Mỹ), sodium thiosulfate (Merck, Đức).

2.3.3. Dụng cụ và trang thiết bị

Máy ly tâm lạnh (Hermle, Đức), máy luân nhiệt (Life Technologies), bộ điện

di ngang (Wealtec, Đài Loan), buồng cấy vô trùng cấp II (NUAIRE, Mỹ), tủ lạnh -

200C (Sanyo, Nhật), -700C (Panasonic, Nhật), tủ ấm (Memmert, Đức), tủ ấm CO2

(Binder, Đức), kính hiển vi soi ngược (Oplympus, Nhật), kính hiển vi soi ngược kỹ

thuật số (EVOS, Mỹ).

2.4. Phương pháp nghiên cứu

2.4.1. Phân tích di truyền của PCV2 tại một số tỉnh thành Việt Nam

(a) Mục tiêu: Định genotype PCV2 đang lưu hành tại một số tỉnh thành Việt Nam.

(b) Phương pháp thực hiện

Thu thập mẫu: tổng cộng 48 mẫu bệnh phẩm heo dương tính ADN-PCV2 được

thu thập từ năm 2007-2016 từ 44 trại heo ở 13 tỉnh thành Việt Nam (Bảng 2.1). Mẫu

bệnh phẩm được lưu trữ ở –700C tại phòng thí nghiệm Trung tâm Nghiên cứu Thú y

– NAVETCO gồm 10 mẫu huyết thanh, 19 mẫu hạch, 17 mẫu phổi, 1 mẫu lách, và 1

mẫu cuống rốn. Các chủng PCV2 tham khảo: vietnam1/2002, vietnam2/2006,

NAVET-vietnam3/2004 (có mã số GenBank JX506730) và vietnam5/2007 (Nguyễn

Thị Thu Hồng và ctv, 2008) (Phụ lục 1) và một chủng có nguồn gốc từ Úc ký hiệu là

AAHL-strain thuộc genotype PCV2b (chủng PCV2 này được phòng thí nghiệm quốc

gia Úc – Australian Animal Health Laboratory – cung cấp) được dùng trong nghiên

cứu này.

Cặp mồi dùng phát hiện và giải trình tự: ORF2-PCV2 được khuếch đại và giải

trình tự nucleotide bằng cặp mồi capFw 5’-CTT TTT TAT CAC TTC GTA ATG-3’

và cap Rw 5’-CGC ACT TCT TTC GTT TTC-3’ được tham khảo từ Fort và ctv

(2007). Sản phẩm khuếch đại được giải trình tự có chiều dài 760 bp (chứa toàn bộ

ORF2).

Xác định mẫu dương tính ADN-PCV2 bằng phương pháp PCR được thực hiện

tại NAVETCO. Sản phẩm PCR được tinh sạch và giải trình tự toàn bộ ORF2 theo 2

chiều (xuôi và ngược) bằng phương pháp Sanger được thực hiện tại công ty 1st BASE,

Malaysia.

Bảng 2.1. Các mẫu dương tính ADN-PCV2 thu nhận từ năm 2007 đến 2016

Năm

2007 2008 2009 2010 2012 2013 2014 2015 2016 Tổng cộng

Nguồn gốc S T T

1 Cà Mau 1 1

2 Cần Thơ 1 1

3 Bến Tre 1 1

4 Long An 3 3

5 Tp. HCM 1 7 8

6 Tây Ninh 1 1

7 Bình Dương 5 1 2 2 1 1 12

8 Đồng Nai 2 1 1 2 2 8

9 Lâm Đồng 3 3

10 Khánh Hòa 1 1

11 Phú Yên 1 1

12 Bình Định 6 6

13 Nghệ An 2 2

7 3 Tổng cộng 2 7 7 5 12 4 48 1 Tp. HCM: thành phố Hồ Chí Minh

Phân tích kết quả giải trình tự gen

Trình tự chuỗi nucleotide ORF2 được phân tích bằng phần mềm BioEdit phiên

bản 7.2.5 (2013) trên cơ sở đối chiếu so sánh giữa trình tự nucleotide được giải trình

tự theo chiều xuôi và chiều ngược và với trình tự toàn bộ bộ gen PCV2 tham chiếu

công bố trên ngân hàng gen.

Trình tự chuỗi nucleotide ORF2 của các chủng PCV2 khảo sát (Phụ lục 8) và

các chủng vi-rút tham khảo (Phụ lục 1 và 2) được sắp xếp vào cột và so sánh tương

đồng bằng phần mềm BioEdit phiên bản 7.2.5 (2013). Sử dụng phần mềm MEGA

phiên bản 5.2.2 (2012) để xác định khoảng cách di truyền (p-distances) trong cùng

genotype và giữa các genotype PCV2 khảo sát.

Xác định genotype của các phân lập PCV2 bằng cách thiết lập cây phát sinh

chủng loại (phylogenetic tree) dựa trên trình tự ORF2 của các phân lập PCV2 khảo

sát với các chủng tham khảo đã biết trước genotype. Cây phát sinh chủng loại được

xây dựng bằng phần mềm MEGA phiên bản 5.2.2 (2012) theo mô hình Kimura-2

parameter, phương pháp Neighbor-joining (NJ) với bootstrap 1000 lần lặp lại.

Phân tích sự tái tổ hợp: Sử dụng phần mềm RDP phiên bản 4.39 (2015) và

SimPlot phiên bản 3.5.1 (2003) để phân tích sự tái tổ hợp và ước đoán vị trí tái tổ hợp

(recombinant breakpoint) trên gen ORF2.

Xác định genotype của các chủng PCV2 thu nhận được. Sự lưu hành của các

genotype PCV2 tại các tỉnh thành theo thời gian và theo địa phương khảo sát.

Mức độ tương đồng giữa các phân lập PCV2 lưu hành tại Việt Nam với nhau

và với các chủng PCV2 đã được công bố trên thế giới.

Khoảng cách di truyền giữa các phân lập PCV2 trong cùng genotype và giữa

các genotype.

2.4.2. Khảo sát đặc tính sinh học của các chủng PCV2 phân lập

2.4.2.1. Phân lập PCV2 trên môi trường tế bào PK15A

(a) Mục tiêu: Thu nhận PCV2 từ các mẫu thực địa trên môi trường tế bào PK15A.

(b) Phương pháp thực hiện

Phân lập PCV2 từ 21 mẫu bệnh phẩm (9 mẫu hạch, 9 mẫu phổi, 2 mẫu huyết

thanh và 1 mẫu lách) từ 48 mẫu dương tính ADN-PCV2 (đã được xác định genotype)

bằng cách nuôi cấy trên tế bào dòng PK15A theo quy trình được chuyển giao kỹ thuật

từ Phòng thí nghiệm sức khỏe động vật quốc gia Úc (trình bày ở phần 2.5.4). Mỗi

mẫu được tiếp đời 3 lần. Ở lần tiếp đời thứ 3, mẫu được xác định dương tính bằng

phương pháp PCR hoặc nhuộm IPX, sau đó được xác định hiệu giá vi-rút. Chuẩn độ

hiệu giá PCV2 phân lập trên môi trường tế bào PK15A theo quy trình của AAHL.

Hiệu giá vi-rút được thể hiện log10 TCID50/ml bằng phương pháp Reed-Muench

(1938) (Phụ lục 6).

Tỉ lệ mẫu phân lập dương tính (%).

Hiệu giá PCV2 phân lập ở lần tiếp đời thứ 3 (trình bày dạng log10 TCID50/ml).

2.4.2.2. Xác định liều lượng vi-rút gây nhiễm

(a) Mục tiêu

Xác định liều lượng vi-rút gây nhiễm để thu hoạch được dịch vi-rút đạt hiệu

giá mong đợi.

(b) Phương pháp thực hiện:

Từ kết quả xác định sự lưu hành của các genotype PCV2 trong thực địa, kết

quả hiệu giá vi-rút ở lần tiếp đời thứ 3, cũng như dựa vào các thông tin về triệu

chứng, bệnh tích của heo mắc bệnh được thu mẫu của các phân lập PCV2. Chủng

NAVET-DongNai2/2009 được chọn để tiếp tục nghiên cứu đặc điểm nuôi cấy trên

tế bào PK15A, tính gây bệnh và sinh miễn dịch trên heo do chủng này thuộc PCV2b,

(genotype lưu hành phổ biến ở Việt Nam), có đầy đủ các thông tin về nguồn gốc,

được lấy từ heo có biểu hiện PMWS, có hiệu giá ở lần tiếp đời thứ 3 trên PK15A

cao (4,50log10 TCID50/ml), đã được kiểm tra tính thuần khiết (không tạp nhiễm các

vi-rút khác, Phụ lục 7).

Sử dụng dịch nuôi cấy vi-rút chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b) ở lần

tiếp đời thứ 6 (P6) (chọn P6 vì cần phải nhân vi-rút với lượng đủ lớn) để nghiên cứu

để khảo sát hiệu giá vi-rút PCV2 trên tế bào PK15A với 5 tỉ số gây nhiễm (lượng vi-

rút/ lượng tế bào), MOI (multiplicity of infection) khác nhau gồm 0,01; 0,02; 0,05;

0,1 và 1. Cụ thể, tế bào PK15A dạng tế bào tươi (tế bào sau khi được tách rời bằng

trypsin) được nhiễm vi-rút với lượng vi-rút/lượng tế bào được tính toán để đạt các tỉ

số gây nhiễm MOI như trên. Tế bào nhiễm được nuôi trên chai 25 cm2 (T25) với số

lượng 2 chai T25/nồng độ/thời điểm thu hoạch. Sau 24 giờ gây nhiễm tiến hành xử

lý D-glucosamine như mô tả trong mục 2.5.4. Thu hoạch vi-rút ở 3 thời điểm khác

nhau: 72, 96 và 120 giờ sau gây nhiễm. Thí nghiệm được lặp lại 4 lần. Chuẩn độ

hiệu giá PCV2 trên môi trường tế bào PK15A theo quy trình của AAHL. Hiệu giá

vi-rút được thể hiện log10 TCID50/ml bằng phương pháp Reed-Muench (1938).

Hiệu giá vi-rút thu được ở các tỉ số gây nhiễm và thời gian thu hoạch khác

nhau (log10 TCID50/ml).

Xác định liều lượng vi-rút gây nhiễm và thời gian thu hoạch để thu được dịch

vi-rút có hiệu giá cao nhất.

2.4.2.3. Xác định thời gian thu hoạch tối ưu đối với các chủng phân lập

(a) Mục tiêu: Xác định thời gian thu hoạch để đạt hiệu giá vi-rút thu được tối ưu.

(b) Phương pháp thực hiện

Ba chủng có hiệu giá vi-rút cao nhất ở mỗi genotype ở lần tiếp đời thứ 3 - được

kiểm tra tính thuần khiết, không tạp nhiễm các vi-rút khác (Phụ lục 7) - được chọn để

tiếp tục nghiên cứu các đặc tính nuôi cấy, tính ổn định nhằm tạo nguồn giống PCV2

đa dạng phục vụ cho nghiên cứu vắc-xin sau này. Cụ thể, chọn chủng NAVET-

DongNai2/2009 (PCV2b), chủng NAVET-LongAn2/2012 (thuộc PCV2d, có hiệu giá

ở P3 đạt 5,50log10 TCID50/ml) và NAVET-vietnam3/2004 (PCV2-Re (2h)) (chủng

này đã được nhóm tác giả Nguyễn Thị Thu Hồng và ctv (2008) phân lập và khảo sát

về đặc tính gây bệnh và tính sinh miễn dịch trên heo kết quả nghiên cứu được đăng

trong tạp chí Thú y số 2, 2008).

Từ kết quả xác định liều lượng vi-rút gây nhiễm để đạt hiệu giá vi-rút thu

hoạch mong đợi ở mục 2.4.2.2. Ba chủng được chọn (ở lần tiếp đời thứ 7, P7) được

gây nhiễm trên môi trường tế bào PK15A với tỉ số gây nhiễm MOI = 0,1. Cụ thể, tiến

hành gây nhiễm vi-rút trên tế bào PK15A (dạng tế bào tươi) với lượng vi-rút/tế bào

được tính toán để đạt tỉ số gây nhiễm MOI = 0,1. Tế bào nhiễm được nuôi trên chai

25 cm2 (T25), với số lượng 2 chai T25/chủng/thời điểm thu hoạch. Sau 24 giờ gây

nhiễm, tiến hành xử lý D-glucosamine như mô tả trong mục 2.5.4. Thu hoạch vi-rút

theo thời gian mỗi 12 giờ, từ thời điểm 36 giờ đến 120 giờ sau gây nhiễm. Thí nghiệm

được thực hiện lặp lại 2 lần. Chuẩn độ hiệu giá PCV2 trên môi trường tế bào PK15A

theo quy trình của AAHL. Hiệu giá vi-rút được thể hiện log10 TCID50/ml bằng phương

pháp Reed-Muench (1938).

Hiệu giá vi-rút thu được theo thời gian thu hoạch (log10 TCID50/ml)/ chủng phân lập.

Xác định thời gian thu hoạch để thu được dịch vi-rút có hiệu giá cao nhất đối với

từng chủng.

2.4.2.4. So sánh sự tương đồng kháng nguyên giữa các chủng PCV2 phân lập

thuộc các genotype khác nhau

(a) Mục tiêu

Sự so sánh này được tiến hành nhằm ước đoán khả năng bảo hộ của vắc-xin.

(b) Phương pháp thực hiện

Thực hiện phản ứng trung hòa chéo giữa 3 chủng PCV2 phân lập thuộc

genotype PCV2b, PCV2d và PCV2-Re (2h) với các mẫu huyết thanh heo chứa kháng

thể chống lại PCV2b, PCV2d và PCV2-Re (2h), mỗi mẫu huyết thanh được thực hiện

lặp lại 2 lần. Thí nghiệm được bố trí theo Bảng 2.2. Phương pháp trung hòa được thực

hiện dựa theo quy trình của Fort và ctv (2007) (trình bày ở mục 2.5.3.3).

Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm phản ứng trung hòa chéo giữa 3 chủng PCV2 phân lập

Mẫu huyết thanh heo PCV2b Vi-rút trung hòa PCV2d PCV2-Re (2h)*

Chống PCV2b Trung hòa chéo Trung hòa chéo Trung hòa

Chống PCV2d Trung hòa chéo Trung hòa chéo Trung hòa

* PCV2-Re (2h): recombinant (nhóm tái tổ hợp), 2h: theo phân loại mới của Franzo và Segalés (2018)

Chống PCV2-Re (2h)* Trung hòa chéo Trung hòa chéo Trung hòa

Các chủng vi-rút dùng trong thí nghiệm này là chủng NAVET-DongNai2/2009

(PCV2b), NAVET-LongAn2/2012 (PCV2d) và NAVET-vietnam3/2004 (PCV2-Re

(2h)). Các mẫu huyết thanh heo chứa kháng thể chống PCV2b: thu thập từ các heo

đối chứng (6ĐC3, 8ĐC3 và 10ĐC3) ở 28 dpc trong thí nghiệm 3; chống PCV2d: 3

mẫu huyết thanh từ heo thu thập ở 28 ngày sau gây nhiễm với chủng NAVET-

LongAn2/2012 (PCV2d) (số liệu thí nghiệm chưa công bố); chống PCV2-Re (2h): 3

mẫu huyết thanh lưu trữ từ thí nghiệm gây nhiễm chủng NAVET-vietnam3/2004 trên

heo của tác giả Nguyễn Thị Thu Hồng và ctv (2008).

Hiệu giá kháng thể trung hòa giữa huyết thanh heo chống genotype PCV2b,

PCV2d và PCV2-Re (2h) với các chủng vi-rút thuộc các genotype PCV2b và PCV2d

và PCV2-Re (2h).

Hệ số tương đồng kháng nguyên giữa các chủng vi-rút phân lập.

(d) Đánh giá kết quả

Hiệu giá kháng thể trung hòa được xác định VNT50 (trình bày ở phần 2.5.3.3),

được trình bày dạng log2.

Đánh giá sự tương đồng kháng nguyên giữa 2 vi-rút dựa vào giá trị hệ số tương

đồng kháng nguyên (coefficient of antigenic similarity) r. Cách tính giá trị r dựa theo

R = 100

Trong đó: r1 =

phương pháp của Archetti và Horsfall (1950):

Hiệu giá trung hòa của kháng thể 2 chống lại vi-rút 1 Hiệu giá trung hòa của kháng thể 1 chống lại vi-rút 1

r2 =

Hiệu giá trung hòa của kháng thể 1 chống lại vi-rút 2 Hiệu giá trung hòa của kháng thể 2 chống lại vi-rút 2

Theo Giambrone và Solano (1988), sự khác biệt kháng nguyên giữa hai chủng

vi-rút được xác định dựa vào giá trị R như sau:

R: 0-10 %: khác hoàn toàn về kháng nguyên

R: 11-32 %: rất ít tương đồng về kháng nguyên

R: 33-70 %: khá tương đồng về kháng nguyên

R:> 70 %: tương đồng về kháng nguyên

2.4.2.5. Thí nghiệm 1: Đánh giá khả năng gây bệnh và tính sinh miễn dịch

của chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b)

(a) Mục tiêu: Nội dung này được thực hiện nhằm mục đích công cường độc đánh

giá vắc-xin.

Chủng vi-rút dùng trong thí nghiệm: chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b)

được phân lập từ hạch heo 16 tuần tuổi có biểu hiện triệu chứng và bệnh tích của

PMWS, đã được khảo sát các đặc tính di truyền, đặc tính nuôi cấy trên môi trường tế

bào PK15A và tính thuần khiết.

Liều gây nhiễm: mỗi heo ở lô thí nghiệm được nhỏ mũi 2 ml và tiêm bắp 2 ml

dịch vi-rút phân lập ở tiếp đời thứ 6 với hiệu giá 5,33log10 TCID50/ml. Sử dụng dịch

chiết tế bào PK15A trên lô đối chứng.

Hình 2.2. Mô tả thiết kế thí nghiệm 1. (M): lấy mẫu, (C): cân, (t): tuần tuổi.

Heo thí nghiệm: 9 heo 3 tuần tuổi (đã được xác định âm tính với PCV2,

PRRSV và CSFV bằng phương pháp PCR và RT-PCR) được chọn từ 2 heo mẹ không

được tiêm vắc-xin PCV2 ở một trại heo thương phẩm và được chuyển về khu chăn

nuôi thú thí nghiệm của Công ty cổ phần thuốc thú y trung ương NAVETCO. Tại

thời điểm chuyển về cả 9 heo này đều có kháng thể thụ động chống PCV2, heo được

lấy máu để kiểm tra kháng thể PCV2 bằng phương pháp IPMA. Tiến hành gây nhiễm

thí nghiệm lúc heo 10 tuần tuổi (Hình 2.2). Nhằm tránh ảnh hưởng của kháng thể thụ

động đến việc đánh giá tính gây bệnh của PCV2 trên heo, 6 heo (có ký hiệu 1TN1,

4TN1, 5TN1, 6TN1, 10TN1, 12TN1) có hiệu giá kháng thể thụ động  5,32log2 được

chọn vào lô thí nghiệm. Ba heo (có ký hiệu 2ĐC1, 3ĐC1, 11ĐC1) vẫn còn kháng thể

thụ động (trung bình 10,31log2) được xếp vào lô đối chứng. Hai lô heo được nuôi ở 2

khu chuồng riêng biệt.

Kháng thể chống PCV2: (1) Kháng thể tổng cộng được xác định bằng phương

pháp IPMA. (2) Kháng thể IgG được xác định bằng phương pháp ELISA. (3) Kháng

thể trung hòa được xác định bằng phương pháp trung hòa. Các phương pháp xét

nghiệm kháng thể chống PCV2 được mô tả ở mục 2.5.3.

Xác định ADN-PCV2 trong máu và trong mẫu mô bằng phương pháp PCR.

Chọn những heo có điểm thể trạng và khối lượng thấp nhất ở mỗi lô để mổ

khảo sát bệnh tích.

+ Biểu hiện lâm sàng được theo dõi hàng ngày từ thời điểm trước gây nhiễm 3

ngày đến sau gây nhiễm 21 ngày: các biểu hiện về hô hấp (khó thở, ho, chảy

dịch mũi), tiêu chảy, sưng hạch bẹn cạn, tình trạng lông, da.

+ Thân nhiệt: đo nhiệt độ trực tràng heo ngày 2 lần, sáng (8 giờ) và chiều (16 giờ)

từ thời điểm trước gây nhiễm 3 ngày đến sau gây nhiễm 21 ngày,

+ Tăng trọng: cân khối lượng heo tại các thời điểm 0, 7, 14 và 21 ngày sau khi

gây nhiễm,

+ Số lượng bạch cầu, tình trạng vi-rút huyết, kháng thể chống PCV2: được kiểm

tra vào các ngày 0, 7, 14 và 21 ngày sau gây nhiễm,

+ Bệnh tích đại thể và vi thể: mổ khảo sát bệnh tích heo ở 7 dpc (heo 6TN1 lô

thí nghiệm), 14 dpc (heo 5TN1 lô thí nghiệm và heo 3ĐC1 lô đối chứng) và

21 dpc (heo 10TN1 lô thí nghiệm).

+ Sự hiện diện ADN-PCV2 trong các tổ chức lymphô.

+ Tỉ lệ heo có biểu hiện PMWS.

(d) Cách theo dõi chỉ tiêu

 Heo được đánh giá là sốt khi thân nhiệt cao hơn 400C.

 Đánh giá bệnh tích đại thể và vi thể bằng phương pháp cho điểm theo Fenaux

và ctv (2003) như sau:

Bệnh tích đại thể ở hạch lym-phô (hạch bẹn, hạch phổi, hạch màng treo

ruột) được xếp hạng như sau: 0: bình thường, 1: sưng hơn bình thường, 2: sưng

gấp đôi và 3: kích thước sưng gấp 3 lần bình thường, đánh giá riêng cho từng

loại hạch.

Bệnh tích vi thể của mô hạch (hạch bẹn, hạch phổi, hạch màng treo

ruột), hạch amidan và lách được cho điểm theo mức độ thoái triển các mô từ

không đến nặng (0-3). 0: không có biến đổi mô lym-phô nhưng có thể có bệnh

tích khác; 1: nang bạch huyết giảm số lượng và kích thước nhưng hình ảnh

còn khá rõ; 2: nang bạch huyết biến mất khoảng 1/2 đến 2/3 so với cấu trúc

bình thường; 3: nang bạch huyết biến mất hơn 2/3 so với bình thường.

Bệnh tích vi thể ở phổi được cho điểm từ 0: bình thường; 1: viêm phổi

kẽ nhẹ; 2: viêm phổi kẽ trung bình; 3: viêm phổi kẽ nghiêm trọng.

 Heo được đánh giá điểm thể trạng theo thang điểm từ 1 đến 4 theo Đỗ Tiến

Duy và Nguyễn Tất Toàn (2013) như sau 1: heo gầy/ suy nhược/ lông da xù

xì; 2: heo hơi gầy, lông da khô; 3: heo có thể trạng bình thường/ lông da bóng

mượt; 4: heo mập hơn bình thường.

 Heo được đánh giá là có biểu hiện còi khi có khối lượng thấp hơn 25% so với

khối lượng trung bình của nhóm (Kixmöller và ctv, 2008).

 Heo được đánh giá là có biểu hiện PMWS khi và chỉ khi hội tụ 3 điều kiện:

(1) có biểu hiện còi, (2) suy giảm lymphô nghiêm trọng và thay thế mô bào

của các nang trong các mô lymphô, (3) có sự hiện diện của kháng nguyên

PCV2 hoặc a-xít nhân của PCV2 bên trong các bệnh tích vi thể đặc trưng

(Sorden, 2000).

Từ kết quả nghiên cứu đặc tính nuôi cấy trên môi trường tế bào PK15A, độc lực

và tính sinh miễn dịch trên heo, và mức độ tương đồng kháng nguyên của các chủng

phân lập, chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b) được chọn làm giống gốc để

nghiên cứu sản xuất vắc-xin vô hoạt nhũ dầu và công độc thử hiệu lực vắc-xin. Chủng

PCV2 này đáp ứng các yêu cầu như có khả năng gây bệnh cũng như gây kích thích

sinh đáp ứng miễn dịch tốt và đạt hiệu giá vi-rút cao trên môi trường tế bào, thuộc

genotype lưu hành phổ biến trong thực địa, có khả năng tạo phản ứng miễn dịch chéo

với các chủng lưu hành thực địa khác.

2.4.3. Nghiên cứu chế tạo vắc-xin PCV2 vô hoạt nhũ dầu

2.4.3.1. Quy trình vô hoạt PCV2

(a) Mục tiêu: Chế tạo kháng nguyên PCV2 đảm bảo vi-rút được vô hoạt hoàn

toàn nhưng phải còn tính kháng nguyên và tính sinh miễn dịch.

(b) Phương pháp thực hiện

- Xác định nồng BEI bất hoạt hoàn toàn PCV2

Vi-rút: dịch nuôi cấy chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b) ở lần tiếp đời

thứ 8 đã chuẩn độ hiệu giá vi-rút đạt 6log10 TCID50/ml.

Quy trình vô hoạt PCV2 được xây dựng dựa trên quy trình của Bahnemann

(1975; 1990). Binary ethylenimine (BEI) 0,1 M được chuẩn bị bằng cách tạo vòng 2-

bromoethylamine trong 0,2 M NaOH trong 1 giờ ở 370C, trữ ở 40C và sử dụng trong

vòng 18 giờ sau khi chuẩn bị. PCV2 được vô hoạt bằng cách ủ với các nồng độ BEI

cuối cùng khác nhau 1 mM, 3 mM và 5 mM ở nhiệt độ 370C trong vòng 24 giờ. Thể

tích dịch vi-rút ở mỗi nồng độ BEI là 200ml. Lấy mẫu kiểm tra hiệu giá vi-rút mỗi

giờ trong 10 giờ đầu vô hoạt. BEI được trung hòa bằng sodium thiosulphate 1 M với

thể tích bằng 10% thể tích BEI sử dụng, trong vòng 2 giờ ở 370C. Vi-rút sau khi vô

hoạt được trữ ở -700C.

Thí nghiệm trên được thực hiện lặp lại 2 lần.

- Xác định khả năng bất hoạt hoàn toàn PCV2 thuộc các chủng khác nhau

với nồng độ BEI 3 mM

Nhằm xác nhận khả năng vô hoạt hoàn toàn các chủng PCV2 thuộc các

genotype khác nhau của BEI ở nồng độ thích hợp. Sau khi xác định được nồng độ

BEI 3 mM có thể vô hoạt hoàn toàn PCV2 chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b),

tiến hành vô hoạt đồng thời các chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b), NAVET-

LongAn2/2012 (PCV2d) và NAVET-vietnam3/2004 (PCV2-Re (2h)) ở nồng độ BEI

3 mM, nhiệt độ 370C trong vòng 24 giờ. Thể tích dịch vi-rút mỗi chủng là 200ml. Lấy

mẫu kiểm tra hiệu giá vi-rút mỗi giờ trong 10 giờ đầu vô hoạt. BEI được trung hòa

bằng sodium thiosulphate 1 M với thể tích bằng 10% thể tích BEI sử dụng, trong

vòng 2 giờ ở 370C. Vi-rút sau khi vô hoạt được trữ ở -700C.

Kiểm tra vi-rút đã được vô hoạt hoàn toàn hay chưa bằng cách ủ dịch vi-rút

sau khi vô hoạt với tế bào PK15A (1ml/ chai T25, 2 chai T25/lần tiếp đời), đánh giá

như trong quy trình phân lập PCV2.

Hiệu giá vi-rút (log10 TCID50/ml) giảm theo thời gian vô hoạt.

Xác định vi-rút được vô hoạt hoàn toàn.

(d) Cách theo dõi chỉ tiêu

Hiệu giá vi-rút: lấy mẫu kiểm tra hiệu giá vi-rút mỗi giờ suốt 10 giờ đầu vô

hoạt. Chuẩn độ hiệu giá PCV2 trên môi trường tế bào PK15A theo quy trình của

AAHL. Hiệu giá vi-rút được thể hiện log10 TCID50/ml bằng phương pháp Reed-

Muench (1938).

PCV2 được xem là được vô hoạt hoàn toàn khi kết quả phân lập dịch vi-rút

sau khi bất hoạt ở 3 lần tiếp đời đều âm tính.

2.4.3.2. Chế tạo vắc-xin PCV2 vô hoạt nhũ dầu

Từ các kết quả nghiên cứu trên, lựa chọn được chủng vi-rút làm giống gốc, tỉ số

gây nhiễm và thời gian thu hoạch tối ưu, xây dựng được quy trình vô hoạt vi-rút chế

tạo kháng nguyên. Chúng tôi tiến hành nhân vi-rút tạo sinh khối để chế tạo vắc-xin. Vi-

rút chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b) sau khi vô hoạt (đã được kiểm tra vô hoạt

hoàn toàn) được phối trộn với nhũ dầu theo công thức nhũ của Công ty NAVETCO,

mỗi liều vắc-xin (2 ml) chứa lượng kháng nguyên vi-rút lần lượt là 4,5log10 hoặc

TCID50/liều (hiệu giá vi-rút trước khi vô hoạt). Lý do chọn 2 liều trên vì tham

6,0log10

khảo một số sản phẩm vắc-xin vô hoạt toàn phần PCV2 trên thị trường cho thấy có loại

Microbiological Labs, Hàn Quốc), có loại chứa tối thiểu 106,0FAID50/ml (SuiShot® Circo

chứa lượng vi-rút trong 1 liều tối thiểu là 104,7TCID50/1ml (Circo pigvac, Daesung

One, Choongang Vaccine Laboratory, Hàn Quốc).

2.4.3.3. Tính an toàn và hiệu lực của vắc-xin vô hoạt nhũ dầu thử nghiệm

(a) Mục tiêu: Đánh giá tính an toàn, tính sinh miễn dịch và khả năng bảo hộ của vắc-

xin vô hoạt nhũ dầu thử nghiệm chống lại PCV2 trên heo sau cai sữa.

(b) Phương pháp thực hiện và chỉ tiêu theo dõi

Thí nghiệm 2: Đánh giá an toàn và khả năng gây đáp ứng miễn dịch của vắc-

xin thử nghiệm (Hình 2.3). Năm heo 3 tuần tuổi (âm tính với PCV2, CSFV và PRRSV

được xác định bằng phương pháp PCR và RT-PCR) được chọn từ 2 heo mẹ không

được tiêm vắc-xin ngừa PCV2 ở một trại heo thương phẩm và được chuyển về trại

chăn nuôi của Công ty NAVETCO. Tại thời điểm chuyển về heo vẫn còn kháng thể

thụ động chống PCV2. Lúc 7 tuần tuổi, 3 heo có hiệu giá kháng thể thụ động giảm

xuống thấp (hiệu giá IPMA trung bình 6,64log2) được bố trí vào lô vắc-xin gồm 3

heo (các heo có ký hiệu 5TN2, 9TN2, 11TN2) được tiêm vắc-xin 2 lần (2 ml/ liều,

chứa lượng kháng nguyên 4,5log10 TCID50/liều) cách nhau 21 ngày, và lô đối chứng

gồm 2 heo (heo có ký hiệu 14ĐC2, 15ĐC2) (có hiệu giá kháng thể thụ động còn cao,

hiệu giá IPMA trung bình 9,64log2) mỗi heo được tiêm 2 ml dịch chiết tế bào PK15A.

Hình 2.3. Mô tả thiết kế thí nghiệm 2. (M): lấy mẫu, (C): cân, (t): tuần tuổi

Chỉ tiêu theo dõi

+ Đánh giá tính an toàn của vắc-xin

Biểu hiện lâm sàng được theo dõi hàng ngày từ thời điểm trước tiêm vắc-xin

3 ngày đến sau tiêm vắc-xin lần thứ nhất 21 ngày và sau tiêm vắc-xin lần thứ hai 28

ngày bao gồm: phản ứng viêm ngay vị trí tiêm, phản ứng toàn thân, các biểu hiện về

hô hấp, tiêu hóa, tình trạng lông, da.

Thân nhiệt: đo nhiệt độ trực tràng heo ngày 2 lần sáng (8 giờ) và chiều (16

giờ) từ thời điểm trước tiêm vắc-xin 3 ngày đến sau tiêm vắc-xin 21 ngày,

Khối lượng: cân khối lượng heo lúc 0 và 21 sau tiêm vắc-xin lần 1 và 28 ngày

sau tiêm vắc-xin lần 2

+ Đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch của vắc-xin

Kháng thể chống PCV2 được kiểm tra vào lúc 0, 7, 14, 21 ngày sau tiêm vắc-

xin lần 1, và vào các thời điểm 7, 14, 21, 28 ngày sau tiêm vắc-xin lần 2.

Thí nghiệm 3: Đánh giá an toàn và hiệu lực của vắc-xin thử nghiệm (Hình 2.4).

Mười heo 3 tuần tuổi (âm tính với PCV2, CSFV, PRRSV và Mycoplasma

hyopneumoniae được xác định bằng phương pháp PCR và RT-PCR) được chọn lựa

có kháng thể thụ động IPMA thấp (5,64log2 – 6,64log2) từ hai nái không được tiêm

vắc-xin PCV2, được chuyển về trại chăn nuôi của Công ty NAVETCO. Heo được bố

trí gồm 2 lô: lô vắc-xin gồm 6 heo (các heo có ký hiệu 1TN3, 2TN3, 3TN3, 4TN3,

5TN3, 7TN3) được tiêm 1 liều vắc-xin thử nghiệm (2 ml/ liều, chứa lượng kháng

nguyên 6,0log10 TCID50/liều) và lô đối chứng gồm 4 heo (các heo có ký hiệu 6ĐC3,

8ĐC3, 9ĐC3, 10ĐC3) được tiêm 2 ml dịch chiết tế bào PK15A lúc heo 4 tuần tuổi.

Sau tiêm vắc-xin 28 ngày, tất cả heo được công cường độc bằng cách nhỏ mũi 2 ml

và tiêm bắp 2 ml với vi-rút chủng NAVET-DongNai2/2009 ở tiếp đời thứ 6 với hiệu

giá 5,33log10 TCID50/ml.

Hình 2.4. Mô tả thiết kế thí nghiệm 3. (M): lấy mẫu, (C): cân, (t): tuần tuổi

Các chỉ tiêu theo dõi

Từ ngày 0 – 28 ngày sau tiêm vắc-xin: Đánh giá tính an toàn và khả năng gây

đáp ứng miễn dịch của vắc-xin như đề cập ở thí nghiệm 2.

Từ ngày công cường độc đến ngày 28 sau công cường độc

+ Đánh giá hiệu lực của vắc-xin về lâm sàng:

Biểu hiện lâm sàng được theo dõi hàng ngày từ thời điểm công cường độc đến

sau công cường độc 28 ngày,

Thân nhiệt: đo nhiệt độ trực tràng heo ngày 2 lần sáng (8 giờ) và chiều (16

giờ) từ ngày 0 - 28 sau công cường độc.

Khối lượng: cân heo vào ngày 28 sau công cường độc.

+ Đánh giá hiệu lực của vắc-xin về cận lâm sàng:

Hàm lượng kháng thể, tình trạng vi-rút huyết, số lượng bạch cầu, tình trạng bài

xuất vi-rút qua phân và dịch tiết mũi được kiểm tra vào lúc 0, 7, 14, 21 và 28 ngày sau

công cường độc.

Bệnh tích đại thể và vi thể: lúc 28 ngày sau công độc, dựa vào khối lượng và biểu

hiện lâm sàng chọn 2 heo ở lô thí nghiệm (heo 4TN3 và 7TN3) và 2 heo ở lô đối chứng

(heo 6ĐC3 và 9ĐC3) để mổ khảo sát bệnh tích. Xác định sự hiện diện của PCV2 và hiệu

giá vi-rút ở các mô phổi, hạch, lách và a-mi-đan của các heo mổ khảo sát bệnh tích.

+ Tỉ lệ bệnh.

2.5. Các kỹ thuật dùng trong nghiên cứu

2.5.1. Phương pháp ly trích ADN

Tách chiết ADN từ huyết thanh, mẫu mô, ngoáy mũi và mẫu phân bằng bộ kít

ly trích ADN QIAamp ® DNA Mini Kit (QIAGEN) (code 51304). Thực hiện quy

trình tách chiết theo hướng dẫn của nhà cung cấp.

2.5.2. Kỹ thuật PCR phát hiện PCV2

Cặp mồi và quy trình phản ứng PCR (theo Fort và ctv, 2007)

Sử dụng cặp mồi capFw 5’-CTT TTT TAT CAC TTC GTA ATG-3’ và cap

Rw 5’-CGC ACT TCT TTC GTT TTC-3’ được đặt từ IDT (Singapore).

Các thành phần cho một phản ứng PCR bao gồm PCR buffer 1X, 1,5 mM

MgCl2, 0,2 mM dNTPs, 0,5 M mỗi đoạn mồi, 2,5 UI Taq DNA polymerase và 1 l

ADN khuôn mẫu/ 25 l.

Quy trình PCR: 940C/ 2 phút, 35 chu kỳ (940C 15 giây, 550C 1 phút, 680C 20

giây), 680C 7 phút, giữ ở 40C.

Điện di sản phẩm PCR bằng agarose 2% trong dung dịch TAE 1X có chứa

chất nhuộm màu SYBR® Safe, ở 90V, 130mA, trong 30 phút. Sản phẩm khuếch đại

có kích thước 760 bp.

Xác định kết quả bằng cách so sánh các băng ADN của mẫu với đối chứng

dương PCV2b (do AAHL cung cấp) và thang ADN chuẩn.

2.5.3. Các phương pháp huyết thanh học

2.5.3.1. Phương pháp miễn dịch peroxidase trên tế bào một lớp (IPMA) định

lượng kháng thể

Thực hiện phương pháp IPMA theo quy trình của AAHL (Phụ lục 3). Mẫu huyết

thanh kiểm tra được pha loãng 1/20, sau đó pha loãng bậc 2. Hiệu giá kháng thể là số

đảo của độ pha loãng cao nhất mà tế bào có nhuộm màu. Hiệu giá kháng thể của mẫu

kiểm tra  5,32log2 (1/40) được đánh giá là dương tính với kháng thể chống PCV2.

2.5.3.2. Phương pháp ELISA phát hiện IgG

Sử dụng kít thương mại Ingezim CIRCO IgG (Ingenasa, Madrid, Tây Ban

Nha) để phát hiện kháng thể IgG chống PCV2. Thực hiện quy trình phản ứng theo

hướng dẫn của nhà cung cấp (Phụ lục 4).

2.5.3.3. Phương pháp trung hòa

Phương pháp trung hòa được thực hiện theo quy trình của Fort và ctv (2007).

(a) Các bước thực hiện: Mẫu huyết thanh heo kiểm tra, huyết thanh đối chứng

dương PCV2, huyết thanh đối chứng âm PCV2 được pha loãng bậc 2 trong dung dịch

pha loãng mẫu (môi trường EMEM).

- Vi-rút dùng trong phản ứng được pha loãng ở nồng độ 400 TCID50/ 50μl.

- 25 μl huyết thanh kiểm tra và huyết thanh đối chứng được pha loãng bậc 2 trong

đĩa 96 giếng pha loãng từ 1:4 – 1: 8192 (giếng 1- giếng 12) tiếp theo cho 50 μl

vi-rút được pha loãng ở nồng độ 400 TCID50/50 μl vào tất cả các giếng. Ủ đĩa 1

giờ ở 370C trong tủ ấm 5% CO2. Thêm 100 μl (2x104 tế bào) huyễn dịch tế bào

PK15A vào tất cả các giếng. Ủ đĩa 72 giờ ở 370C trong tủ ấm 5% CO2. Cố định

tế bào và nhuộm đĩa phản ứng bằng phương pháp IPX.

(b) Ghi nhận kết quả

- Sử dụng phương pháp tính phần trăm vi-rút được trung hòa (%VNT) được tính

là số đảo ngược của độ pha loãng huyết thanh cao nhất làm giảm 50%

(VNT50) hoặc 90% (VNT90) số tế bào nhiễm PCV2, trong đó thường dùng là

hiệu giá VNT50 (Fort và ctv, 2007). Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng hiệu

giá VNT50 để xác định hiệu giá kháng thể trung hòa.

- Công thức tính %VN như sau: ở mỗi giếng phản ứng chọn 3 vùng ngẫu nhiên

(ở độ phóng đại 100 lần), đếm số lượng tế bào nhiễm ở 3 vùng được chọn này

(Phụ lục 5). %VN = [(1- bình quân số tế bào nhiễm ở mỗi độ pha loãng/bình

quân số tế bào nhiễm ở các giếng đối chứng âm)] x100.

2.5.4. Phương pháp phân lập PCV2 trên tế bào PK15A

Mẫu có kết quả PCR dương tính với PCV2 thì được dùng để phân lập vi-rút

trên môi trường PK15A theo quy trình của AAHL.

(a) Các bước thực hiện

- Nghiền mẫu mô thành huyễn dịch 10 % trong môi trường EMEM.

- Đông tan 1 lần ở -700C, ly tâm 4000 vòng/30 phút lấy dịch nổi.

- Xử lý dịch nổi bằng chloroform trong 10 phút và lắc liên tục 10 phút ở nhiệt

độ phòng. Ly tâm 3000 vòng/10 phút, lấy nước trong và bảo quản ở -700C.

- Cho 500 µl huyễn dịch mô 10% sau khi đã xử lý chloroform vào 6 ml huyễn

dịch tế bào PK15A (không nhiễm PCV1).

- Cho hỗn hợp trên cho vào chai nhựa 25 cm2 (T25) dùng để nuôi cấy tế bào.

Đem ủ trong tủ ấm 370C.

- Sau khoảng 18 – 24 giờ, tế bào phát triển được khoảng 50 – 60 % thì được xử

lý bằng D(+)-glucosamine 300 mM (C6H13NO5HCl Sigma cat. No. 14065-

031). Xử lý như sau:

 Rửa tế bào 1 lần bằng PBS, sau đó cho vào 2 ml D(+)-glucosamine 300 mM

/T25. Ủ tế bào ở 370C trong vòng 30 phút.

 Rửa tế bào 2 lần bằng PBS, sau đó cho vào môi trường MEM. Đem ủ ở tủ ấm

370C trong vòng 48 đến 72 giờ.

- Sau 48 - 72 giờ thu hoạch dịch phân lập bằng cách đông tan 3 lần ở -700C.

- Mỗi mẫu phân lập được tiếp đời 3 lần trên tế bào PK15A.

(b) Ghi nhận kết quả

Xác định mẫu dương tính bằng phương pháp PCR phát hiện ADN-PCV2 trong

dịch phân lập hoặc nhuộm IPX tế bào nhiễm ở lần tiếp đời thứ 3.

2.5.5. Phương pháp chuẩn độ PCV2

Chuẩn độ PCV2 trên môi trường tế bào PK15A theo quy trình của AAHL:

- Dịch phân lập vi-rút được pha loãng bậc 10 trong môi trường EMEM từ 10-1

đến 10-6.

- Cho vào mỗi giếng 100 µl dịch phân lập vi-rút đã pha loãng, với mỗi nồng độ

pha loãng cho vào 4 giếng.

- Cho tế bào PK15A (dạng tế bào tươi) với số lượng 2x104 tế bào/giếng.

- Ủ đĩa chuẩn độ ở 370C, 5% CO2 trong vòng 4 ngày.

- Cố định tế bào và nhuộm đĩa chuẩn độ bằng phương pháp IPX.

- Hiệu giá vi-rút được tính theo phương pháp Reed-Muench (1938) (Phụ lục 6)

và biểu thị dưới dạng log10 TCID50/ml.

2.6. Xử lý thống kê

Phân tích ANOVA để đánh giá sự khác biệt giữa các lô thí nghiệm: hiệu giá

vi-rút, hiệu giá kháng thể và tăng trọng.

Xác định mối tương quan giữa hiệu giá vi-rút và thời gian bất hoạt bằng

phương trình hồi quy.

Các số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel và phần mềm thống kê Minitab

phiên bản 16.2.0.

Chương 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Phân tích di truyền của các mẫu PCV2 tại một số tỉnh thànhViệt Nam

3.1.1. Phân tích cây phát sinh chủng loại dựa trên ORF2 của PCV2

Kết quả phân tích cây phát sinh chủng loại dựa trên ORF2 của 48 mẫu PCV2

thu thập từ năm 2007 đến 2016 từ 13 tỉnh thành Việt Nam (Hình 3.1) cho thấy, các

mẫu PCV2 được xếp vào genotype PCV2b chiếm 50,00% (24/48), genotype PCV2d

chiếm 33,33% (16/48) và PCV2-Re (2h) chiếm 16,67% (8/48), không có mẫu PCV2

nào được xếp vào genotype PCV2a.

Việc phân tích cây phát sinh chủng loại có thể giúp phân loại các chủng PCV2

thành các genotype khác nhau dựa trên một số tiêu chí nhất định như đã trình bày ở

phần tổng quan. Tương tự, dựa vào việc phân tích trình tự nucleotide bằng các phần

mềm sinh tin học có thể giúp dự đoán sự tái tổ hợp và chủng bố mẹ ước đoán của các

chủng tái tổ hợp. Tuy nhiên, có một số trường hợp, có thể trước đây các chủng PCV2

được xếp vào nhóm này nhưng sau đó lại được xếp thành genotype riêng biệt khác.

Điển hình như nhóm mPCV2b (mutant PCV2b) sau này được xếp vào nhóm PCV2d.

Tương tự như thế, theo tiêu chí phân loại mới của Franzo và Segalés (2018), một số

chủng trước đây xếp vào nhóm tái tổ hợp thì nay được xếp vào PCV2g hoặc PCV2h.

Điều đó tùy thuộc vào số lượng các trình tự chuỗi được đưa vào phân tích, cũng như

phương pháp và mô hình mà các tác giả sử dụng để phân tích. Xiao và ctv (2015) sử

dụng cùng lúc nhiều phương pháp khác nhau để phân tích trên cùng một cơ sở dữ liệu

trình tự chuỗi (1680 trình tự chuỗi) như neighbour-joining (NJ), maximum-likelihood

(ML), suy luận Bayesian và phân tích network. Kết quả xảy ra một số trường hợp,

cùng 1 chủng nhưng được xếp vào các genotype khác nhau tùy vào phương pháp

phân tích được áp dụng. Ví dụ như chủng JX099781/isolate P477LG/Vietnam/2009,

tác giả Huỳnh Thị Mỹ Lệ và ctv (2012) dựa vào phân tích cây phát sinh chủng loại

với phương pháp đáng tin cậy tối đa (maximum clade credibility) bằng phần mềm

TreeAnnotator v1.6.1 và FigTree v1.3.1 chủng này được xếp vào nhóm tái tổ hợp.

Xiao và ctv (2015) sử dụng các phương pháp NJ và ML thì chủng này được xếp vào

nhóm trung gian 1 (intermediate strains 1, IM1, hay còn gọi là nhóm tái tổ hợp) còn

phương pháp phân tích network thì chủng này được xếp vào PCV2b. Trong báo cáo

của Franzo và Segalés (2018) thì chủng này được xếp vào PCV2h. Theo Xiao và ctv

(2015), có đến 4,6% (78/1680) các chủng PCV2 trên thế giới được xếp vào các

genotype khác nhau tùy thuộc vào phương pháp phân tích được áp dụng.

Nguyễn Thị Thu Hồng và ctv (2008) đã phân tích trình tự toàn bộ bộ gen của 4

mẫu dương tính với ADN-PCV2 thu thập ở miền Nam Việt Nam giữa năm 2002 và

2007 (vietnam1/2002, vietnam2/2006 và NAVET-vietnam3/2004 và vietnam5/2007)

kết quả 3 mẫu PCV2 thu thập vào năm 2002, 2004 và 2006 thuộc về cùng một nhánh

và có mức độ tương đồng trình tự nucleotide rất cao từ 99,66% đến 99,83%. Trong khi

đó, mẫu PCV2 thu thập năm 2007 (vietnam5/2007) được xếp vào nhánh khác và có

mức độ tương đồng so với 3 mẫu trên từ 96,15% đến 96,42%. Điều này cho thấy ba

mẫu vienam1/2002, vietnam2/2006 và NAVET-vietnam3/2004 có thể chung nguồn

gốc và chúng khác biệt so với mẫu vietnam5/2007. Tuy nhiên, nghiên cứu này vẫn

chưa xác định genotype của các chủng PCV2 lưu hành ở Việt Nam. Kết quả phân tích

trình tự ORF2 và cây phát sinh chủng loại giữa 48 mẫu PCV2 trong nghiên cứu này

cùng với 4 mẫu PCV2 tham khảo nêu trên và 46 chủng PCV2 tham khảo từ GenBank

cho thấy ba mẫu vietnam1/2002, vietnam2/2006 và vietnam3/2004 được xếp vào

genotype PCV2-Re (2h), riêng mẫu vietnam5/2007 được xếp vào genotype PCV2b.

Huỳnh Thị Mỹ Lệ và ctv (2013) phân tích trình tự toàn bộ bộ gen và protein

Cap của 30 mẫu PCV2 được thu nhận từ năm 2008 đến năm 2011. Kết quả có 8 mẫu

thuộc genotype PCV2b. Ngoài ra, nhóm tác giả này đã dùng kỹ thuật nested PCR để

xác định genotype 148 mẫu bệnh phẩm dương tính với PCV2 thu thập từ năm 2011

đến 2012 từ đàn heo nuôi tại 4 tỉnh (Hà Nội, Hòa Bình, Bắc Giang và Hải Dương).

Kết quả cho thấy các PCV2 lưu hành ở đàn heo ở 4 tỉnh trên đều thuộc genotype

PCV2b (Huỳnh Thị Mỹ Lệ và ctv, 2012). Từ các kết quả nghiên cứu trên cho thấy sự

lưu hành vượt trội của genotype PCV2b và có thể genotype PCV2b xuất hiện ở Việt

Nam vào năm 2007.

Hình 3.1. Cây phát sinh chủng loại của các chủng PCV2 dựa trên trình tự nucleotide ORF2 của 48 mẫu PCV2 trong nghiên cứu này, 5 phân lập PCV2 tham khảo () và 46 chủng tham khảo đăng ký trên GenBank. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng bằng phần mềm MEGA phiên bản 5.2.2 (2012) theo mô hình Kimura- 2 parameter, phương pháp Neighbor-joining (NJ) với bootstrap 1000 lần lặp lại.

Các nghiên cứu dịch tễ học trên toàn thế giới đã chứng minh sự phân bố theo

thời gian của các genotype PCV2, có sự biến đổi toàn cầu từ PCV2a sang PCV2b và

sự xuất hiện vượt trội của PCV2b từ sau năm 2003 (Olvera và ctv, 2007; Cortey và

ctv, 2011). Các nghiên cứu gần đây cho thấy, PCV2d đặc biệt là PCV2d-2 lưu hành

khá phổ biến và thậm chí trở nên vượt trội hơn so với PCV2b (Xiao và ctv, 2016;

Kwon và ctv, 2017). Nguyễn Ngọc Hải và ctv (2013) phân tích trình tự một phần

ORF2 của 2 mẫu PCV2 thu nhận tại thành phố Hồ Chí Minh và 11 mẫu PCV2 thu

nhận từ tỉnh Đồng Nai trong năm 2010. Kết quả có 5/13 mẫu PCV2 được xếp vào

genotype PCV2b, các mẫu PCV2 còn lại đều thuộc genotype PCV2d (8/13). Đây

được xem là báo cáo đầu tiên về sự lưu hành của PCV2d ở Việt Nam. Gần đây nhất,

nghiên cứu của Phạm Hồng Quân và ctv (2017) cho thấy các chủng thuộc PCV2d ở

Việt Nam đều có nguồn gốc đầu tiên từ Trung Quốc nhưng nằm ở các nhánh khác

nhau của di truyền.

Sự phân bố theo thời gian và nguồn gốc địa lý của 48 mẫu PCV2 trong nghiên

cứu này được thể hiện qua Biểu đồ 3.1 và Biểu đồ 3.2, Phụ lục 8. Qua đó cho thấy sự

lưu hành phổ biến của genotype PCV2b qua các năm khảo sát (24/48 mẫu khảo sát),

đồng thời có sự xuất hiện và ngày càng trở nên phổ biến của genotype PCV2d (16/48

mẫu khảo sát), đặc biệt là PCV2d-2 (15/16 mẫu PCV2d). Có sự lưu hành cùng lúc

nhiều genotype trên cùng địa phương.

Một điều thú vị là các chủng NAVET-vietnam3/2004, BinhDuong6/2012 và

BinhDuong7/2013 được phát hiện trong cùng một trại qua các năm khác nhau (Hình

3.1 và Phụ lục 8), trong đó chủng NAVET-vietnam3/2004, BinhDuong6/2012 được

xếp vào genotype PCV2-Re (2h), còn chủng BinhDuong7/2013 lại được xếp vào

genotype PCV2b. Điều này có thể do nhập mới hậu bị mang theo vi-rút PCV2b hoặc

có thể có sự biến đổi di truyền của PCV2 đang lưu hành trong trại. Sự biến đổi

genotype xảy ra theo thời gian ở mức độ trại cũng đã được Kwon và ctv (2017) ghi

nhận khi nghiên cứu sự đa dạng di truyền và sự biến đổi genotype PCV2 xảy ra ở

Hàn Quốc. Tuy nhiên, vấn đề này cần được nghiên cứu thêm.

SỐ LƯỢNG

14

12 PCV2b

3 PCV2d

10 PCV2-Re (2h)

8

4

6

3

4

1

4

7

5

3

2

4

3

2

1

0 NĂM

2007

2008

2009

2010

2012

2013

2014

2015

2016

Biểu đồ 3.1. Phân bố theo thời gian của các mẫu PCV2 thu thập ở một số tỉnh

thành Việt Nam từ năm 2007 đến 2016

SỐ LƯỢNG

14

12

1

PCV2-Re (2h) PCV2d PCV2b

10

4

8

2

3

6

3

4

7

6

5

1

2

3

2

1

0 NGUỒN GỐC

Biểu đồ 3.2. Phân bố theo địa lý của các mẫu PCV2 thu thập ở một số tỉnh

thành Việt Nam từ năm 2007 đến 2016

3.1.2. Phân tích đa dạng di truyền của PCV2 dựa vào ORF2

Phân tích sự đa dạng di truyền giữa các mẫu PCV2 lưu hành ở miền Nam Việt

Nam trong khoảng thời gian từ năm 2007 đến 2016 bằng cách xác định khoảng cách

di truyền (p-distance) trong cùng genotype và giữa các genotype PCV2 dựa trên

ORF2 bằng phần mềm MEGA phiên bản 5.2.2 (2012) (Bảng 3.1). Kết quả cho thấy

các mẫu PCV2 được xếp vào genotype PCV2d có tính đa dạng di truyền cao nhất với

khoảng cách di truyền p = 0,0078  0,0018, cao gần gấp đôi so với các mẫu PCV2

được xếp vào PCV2b (p = 0,0038  0,0014) và PCV2-Re (2h) (p = 0,0038  0,0010).

Bảng 3.1. Khoảng cách di truyền (p-distances) trong cùng genotype và giữa

các genotype lưu hành ở các tỉnh thành Việt Nam từ năm 2007 đến 2016

Genotype

Trung bình khoảng cách di truyền giữa các genotype (x̅  SE)

PCV2b (n = 24) PCV2d (n = 16) PCV2-Re (2h) (n = 8)

- PCV2b Trung bình khoảng cách di truyền trong cùng genotype (x̅  SE) 0,0038  0,0014

- PCV2d 0,0078  0,0018 0,0663  0,0102

PCV2-Re (2h) 0,0038  0,0010 0,0595  0,0096 0,0605  0,0097

PCV2-Re (2h): recombinant (nhóm tái tổ hợp), 2h: theo phân loại mới của Franzo và Segalés

(2018)

Ngoài ra, khoảng cách di truyền giữa các genotype biến động từ 0,0595  0,0096

đến 0,0663  0,0102, các giá trị này cao hơn rất nhiều so với giá trị ngưỡng phân chia

genotype p = 0,035 (Segalés và ctv, 2008). Nhìn chung, khoảng cách di truyền giữa

các genotype khá cao, là một trong những cơ sở để phân chia PCV2 thành các genotype

riêng biệt.

3.1.3. Đặc điểm ORF2 của các chủng PCV2 ở Việt Nam

ORF2 mã hóa protein cấu trúc Cap (capsid) với kích thước khoảng 27,8 kDa.

Protein Cap của PCV2 có tính sinh miễn dịch, kích thích sinh miễn dịch dịch thể và

miễn dịch tế bào (Fort và ctv, 2010). Ngoài ra, protein Cap còn có chức năng rất quan

trọng trong việc giúp vi-rút bám và xâm nhập vào tế bào ký chủ (Khayat và ctv, 2011).

Fenaux và ctv (2004b) cho rằng sự đột biến xảy ra ở protein Cap khi tiếp đời liên tục

vi-rút trên môi trường tế bào PK15 đã thúc đẩy khả năng nhân lên của PCV2 in vitro

cũng như làm nhược độc vi-rút in vivo. Cụ thể, Fenaux và ctv (2004b) đã tiếp đời PCV2

trên môi trường tế bào PK15. Kết quả ở lần tiếp đời thứ 120 xảy ra sự đột biến 2

nucleotide ở ORF2. Vi-rút ở lần tiếp đời 120 chứa các đột biến P110A (P: proline; A:

alanine) và R191S (R: arginine; S: serine) ở ORF2. Vi-rút ở tiếp đời 120 nhân lên trên

tế bào PK15 với hiệu giá cao hơn so với tiếp đời 1. Vi-rút tiếp đời 1 gây tình trang vi-

rút huyết, bệnh tích vi thể và đại thể nặng hơn so với vi-rút tiếp đời 120 khi gây nhiễm

thí nghiệm cả 2 loại vi-rút này trên heo (Fenaux và ctv, 2004b). Điều này cho thấy, sự

biến đổi xảy ra ở ORF2 có thể sẽ ảnh hưởng đến khả năng gây bệnh của PCV2.

Bảng 3.2. Các a-xít a-min của protein Cap khác nhau giữa các genotype PCV2

PCV2-Re (2h): recombinant (nhóm tái tổ hợp), 2h: theo phân loại mới của Franzo

và Segalés (2018).

Viết tắt A: alanine; F: phenylalanine; G: glycine; H: histidine; I: isoleucine; K: lysine; L: leucine; M: methionine; N: asparagine; P: proline; R: arginine; S: serine; T: threonine; V: valine; Y: tyrosine.

PCV2b F R A R S T T T S T/A G V LNP - Vị trí 53 59 68 89 90 131 134 151 169 190 191 215 231-233 234 PCV2d I K/A N L T T N T/P R/G T G I LNP K PCV2-Re (2h) F K A L T P T T S S A V LHP K

Phân tích kết quả giải trình tự toàn bộ ORF2 của 48 mẫu PCV2 trong nghiên

cứu này cho thấy, chiều dài toàn bộ ORF2 là 702 nt (24/48) đối với các mẫu PCV2

được xếp vào genotype PCV2b, hoặc 705 nt (24/48) đối với các mẫu PCV2 được xếp

vào PCV2d hoặc PCV2-Re (2h). Chiều dài chuỗi polypeptide của protein capsid suy

ra từ trình tự chuỗi nucleotide tương ứng là 233 hoặc 234 aa. Phân tích sự tương đồng

về a-xít a-min giữa các genotype của PCV2 cho thấy, chiều dài toàn bộ protein capsid

của PCV2b là 233 aa, của PCV2d và PCV2-Re (2h) thì chiều dài protein capsid là

234 aa, thêm lysine (ký hiệu K) ở vị trí 234 (Bảng 3.2 và Phụ lục 9). Xiao và ctv

(2015) cho rằng, chiều dài a-xít a-min của protein capsid không liên quan đến việc xác

định genotype PCV2d vì có một số chủng thuộc PCV2d nhưng có chiều dài protein

capsid là 233 aa thay vì 234 aa. Trong nghiên cứu này, các mẫu PCV2 được xếp vào

genotype PCV2d đều có chiều dài protein capsid là 234 aa.

Các nghiên cứu về các quyết định kháng nguyên (epitope) của protein Cap cho

thấy, có một số vị trí a-xít a-min chuyên biệt có tầm quan trọng trong sự trung hòa

PCV2 như vị trí 59 (Huang và ctv, 2011), các vị trí 131, 151, 190, 191 (Saha và ctv,

2012) và vị trí từ 231-233 (Shang và ctv, 2009). Có hai trường hợp xảy ra: (1) sự biến

đổi a-xít a-min làm giảm hoặc làm mất hoạt tính trung hòa, như sự biến đổi tại vị trí

59 từ alanine thành arginine (A  R), vị trí 131 từ threonine thành proline (T  P)

và vị trí 190 từ threonine thành alanine (T  A) (Huang và ctv, 2011; Saha và ctv,

2012); (2) sự biến đổi làm tăng hoạt tính trung hòa như sự biến đổi a-xít a-min tại vị

trí 151 proline thành threonine (P  T) (Saha và ctv, 2012). Cụ thể, Huang và ctv

(2011) cho rằng, sự biến đổi a-xít a-min ở vị trí 59 từ alanine thành arginine ở các

chủng PCV2a (các chủng LG, CL và JF2) đã làm ngăn trở hoàn toàn hoạt tính miễn

dịch của các chủng này đối với mAb 8E4. Tương tự, Saha và ctv (2012) đã chứng

minh sự đột biến từ threonine thành proline ở vị trí 131 và từ threonine thành alanine

ở vị trí aa 190 làm mất tính trung hòa của chủng PCV2 chứa đột biến điểm này đối

với mAbs (monoclonal antibodies) đặc hiệu PCV2. Sự khác biệt chính giữa threonine

và alanine, giữa threonine và proline chính là nhóm hydroxyl có trên threonine, nhưng

không có ở alanine và proline, có lẽ chính nhóm hydroxyl này đóng vai trò quan trọng

như là một phần của vị trí gắn kết mAbs (Saha và ctv, 2012).

Kết quả so sánh trình tự chuỗi a-xít a-min giữa các mẫu PCV2 trong nghiên cứu

này và các chủng tham khảo đại diện genotype PCV2 cho thấy, các mẫu PCV2 thuộc

genotype PCV2b trong nghiên cứu này chứa arginine (R) ở vị trí 59, trong khi đó các

mẫu PCV2 thuộc genotype PCV2d và PCV2-Re (2h) đều chứa lysine (K). Ở vị trí 131,

tất cả các mẫu PCV2 thuộc genotype 2b và 2d đều chứa threonine (T), trong khi đó các

mẫu PCV2 thuộc PCV2-Re (2h) đều chứa proline (P). Riêng vị trí 151, tất cả các mẫu

PCV2 trong nghiên cứu này không phân biệt genotype đều chứa threonine (T), chỉ trừ

mẫu NAVET-BenTre/2014 thuộc PCV2d chứa proline (P). Các mẫu PCV2 thuộc

genotype PCV2b trong nghiên cứu này đa số chứa alanine (A) ở vị trí 190, chỉ có vài

mẫu PCV2 chứa threonine (T) tại vị trí này (các mẫu NAVET-BinhDuong2/2009,

TpHCM3/2010 và TpHCM6/2010). Trong khi đó, tất cả các mẫu PCV2 thuộc PCV2d

chứa T (threonine) và PCV2-Re (2h) thì S (serine) ở vị trí 190.

Ngoài ra, protein Cap cũng chứa các vùng bảo tồn như vùng motif gắn kết

heparin (heparin-binding motif) ở vị trí a-xít a-min 98IRKVKV103 (Misinzo và ctv,

2006) và vùng CP (169-180) 169STIDYFQPNNKR180 (Trible và ctv, 2011). Trong đó

các a-xít a-min ở vị trí 173-tyrosine (Y), 174-phenylalanine (F), 175-glutamine (Q)

và 179-lysine (K) được xem là các điểm quan trọng để nhận diện kháng thể. Kết quả

98IRKVKV103 ở tất cả các mẫu PCV2 trong nghiên cứu này. Tuy nhiên, có sự khác

phân tích trình tự chuỗi a-xít a-min cho thấy không có sự biến đổi ở vùng

biệt về a-xít a-min ở vị trí 169 giữa genotype PCV2d so với các genotype khác (Bảng

3.2; Phụ lục 9). Đối với genotype PCV2d ở vị trí 169 là arginine (ký hiệu là R) hoặc

glycine (ký hiệu là G), trong khi đó ở các genotype còn lại thì ở vị trí 169 đều là serine

(ký hiệu là S). Do đó, cần phải nghiên cứu thêm về sự biến đổi về a-xít a-min ở vùng

CP (169-180) này.

Bảng 3.3. Mức độ tương đồng (%) về trình tự nucleotide và a-xít a-min giữa

Tương đồng (%) về nucleotide và về a-xít a-min giữa 3 chủng

Tương đồng (%) với các chủng trong cùng genotype

Chủng PCV2

Nucleotide A-xít a-min

NAVET- DongNai2/2009

NAVET- LongAn2/2012

NAVET- vietnam3/2004

98,7 -100

97,8 - 100

NAVET- DongNai2/2009 (PCV2b)

98,5 - 100 98,2 - 100

94,0

NAVET- LongAn2/2012 (PCV2d)

98,7 - 100 98,7 - 100

94,8

96,1

NAVET- vietnam3/2004 (PCV2-Re (2h))

PCV2-Re (2h): recombinant (nhóm tái tổ hợp), 2h: theo phân loại mới của Franzo và Segalés

(2018)

các chủng PCV2

Mức độ tương đồng giữa 24 mẫu PCV2 (từ năm 2007 đến 2016) được xếp vào

genotype PCV2b khá cao, từ 98,7% đến 100% về nucleotide và từ 97,8% đến 100%

về a-xít a-min (Bảng 3.3). Tương đồng với chủng AAHL-strain từ 99,0 - 100% và từ

98,7 - 100%, tương ứng về nucleotide và a-xít a-min. Ngoài ra, các mẫu PCV2 này

cũng tương đồng với chủng 48285 (ở Pháp vào năm 1998, chủng tham khảo genotype

PCV2b) từ 99,1% đến 99,8% về nucleotide và từ 97,8% đến 99,5% về a-xít a-min;

tương đồng với chủng WuHan (ở Trung Quốc năm 2008) từ 98,5% đến 99,4% về

nucleotide và từ 98,2 đến 99,5% về a-xít a-min.

So sánh tương đồng giữa các mẫu thuộc genotype PCV2d-2 trong nghiên cứu

này với nhau và với một số chủng tham khảo trên thế giới cho thấy chúng tương đồng

với nhau rất cao (98,5 – 100% về nucleotide và 98,2 – 100% về a-xít a-min, Bảng

3.3) và chúng tương đồng với chủng BDH (ở Trung Quốc vào năm 2008, chủng tham

khảo genotype PCV2d), phân lập 22625-33 (ở Mỹ vào năm 2012), và chủng

SNUVR130689 (ở Hàn Quốc vào năm 2013) từ 99,0% đến 99,8% về nucleotide và

từ 99,1 đến 100% về a-xít a-min.

Mức độ tương đồng giữa các mẫu PCV2 được xếp vào PCV2-Re (2h) biến

động từ 98,7% đến 100% về nucleotide và về a-xít a-min (Bảng 3.3), các mẫu PCV2

này tương đồng rất cao với phân lập HUN-11 (ở Trung Quốc năm 2009).

So sánh mức độ tương đồng giữa chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b),

NAVET-LongAn2/2012 (PCV2d) và NAVET-vietnam3/2004 (PCV2-Re (2h)),

thuộc 3 genotype khác nhau (Bảng 3.3). Kết quả cho thấy, phần trăm tương đồng giữa

các chủng này từ 94,0 đến 96,1% về nucleotide và a-xít a-min (suy ra từ trình tự chuỗi

nucleotide ORF2).

3.1.4. Phân tích sự tái tổ hợp

Bảng 3.4. Phần trăm tương đồng giữa các mẫu PCV2-Re (2h) với chủng bố

mẹ giả định dựa trên ORF2

Phần trăm tương đồng (%)

Chủng

CanTho/2008 TpHCM2/2010 TpHCM4/2010 TpHCM5/2010 BinhDuong6/2012 BinhDinh2/2013 BinhDinh3/2013 BinhDinh4/2013 AF465211/strain SC/Taiwan/2002 (PCV2a) 95,9 96,2 95,1 96,2 96,2 96,2 96,2 96,2 AY181946/strain TJ/China/2002 (PCV2d) 95,7 96,3 96,1 95,9 96,3 96,3 96,3 96,3

Kết quả phân tích bằng phần mềm RDP4 v.4.39 và SimPlot 3.5.1 dựa trên

ORF2 cho thấy có sự tái tổ hợp xảy ra trên 8 mẫu PCV2 thuộc genotype PCV2-Re

(2h)), bao gồm các mẫu CanTho/2008, TpHCM2/2010, TpHCM4/2010, TpHCM5/2010,

BinhDuong6/2012, BinhDinh2/2013, BinhDinh3/2013, BinhDinh4/2013. Bố mẹ giả định

là chủng AY181946/strain TJ/China/2002 (PCV2d) (major parent) và

AF465211/strain SC/Taiwan/2002 (PCV2a) (minor parent) với phần trăm tương đồng

tương ứng là 95,7 - 96,3% và 95,1 - 96,2% (Bảng 3.4 và Biểu đồ 3.3). Các chủng bố

mẹ giả định này có nguồn gốc từ Trung Quốc và Đài Loan.

Biểu đồ 3.3. Phân tích tương đồng của các mẫu PCV2-Re (2h) và 2 chủng bố

mẹ giả định AF465211 (PCV2a) và AY181946 (PCV2d) bằng phần mềm SimPlot

3.5.1 dựa trên ORF2

Xác định vị trí tái tổ hợp (breakpoint) của 8 mẫu PCV2-Re (2h) bằng RDP4

v.4.39. Kết quả cho thấy 7/8 mẫu có vị trí tái tổ hợp bắt đầu ở nucleotide 96 và kết

thúc ở vị trí 227 hoặc 238, riêng mẫu CanTho/2008 tuy có cùng bố mẹ giả định, nhưng

vị trí tái tổ hợp khác biệt so với các mẫu còn lại với điểm bắt đầu ở vị trí 677 và kết

thúc ở vị trí 227 (vị trí trên ORF2) (Hình 3.2 và Hình 3.3). Kết quả này cũng phù hợp

với kết quả phân tích cây phát sinh chủng loại. Trong đó, mẫu CanTho/2008 xếp trong

genotype PCV2-Re (2h) nhưng lại nằm ở 1 nhánh riêng biệt so với các mẫu còn lại

trong nhóm (Hình 3.1). Ma và ctv (2007) ước đoán rằng vị trí tái tổ hợp định vị ở

giữa vùng gốc sao chép (Ori) và gen Rep của PCV2. Tương tự, Kim và ctv (2009a)

cho rằng vị trí tái tổ hợp xảy ra ở gen Rep, còn theo kết quả nghiên cứu của các tác

giả khác lại cho rằng sự tái tổ hợp tự nhiên xảy ra bên trong gen Cap của PCV2

(Cheung, 2009; Lefebvre và ctv, 2009; Cai và ctv, 2012).

Hình 3.2. Phân tích các mẫu PCV2-Re (2h) bằng phần mềm RDP4 v.4.39 dựa

trên ORF2. Màu đỏ thể hiện trình tự chủng AF465211/strain SC/Taiwan/2002

(PCV2a) (minor parent) và màu xám thể hiện chủng AY181946/strain TJ/China/2002

(PCV2d) (major parent)

Hình 3.3. So sánh nucleotide giữa các mẫu PCV2-Re (2h) và chủng bố mẹ giả

định. Các vị trí tô màu xanh lá cây (■) thể hiện điểm bắt đầu, các vị trí tô màu vàng

(■) thể hiện điểm kết thúc tái tổ hợp của mỗi mẫu trên ORF2

Theo Franzo và ctv (2016) có đến 33% (304/898) chuỗi trình tự được xếp vào

nhóm tái tổ hợp với 15 sự kiện tái tổ hợp (recombinant events) xảy ra. Các chủng

PCV2 tái tổ hợp lưu hành hầu khắp các quốc gia trên thế giới, trong đó phổ biến nhất

là ở Trung Quốc, Ý và Hàn Quốc. Các nghiên cứu trước đây ghi nhận sự tái tổ hợp

giữa PCV2a và PCV2b. Hesse và ctv (2008) đã mô tả một chủng PCV2 (phân lập

0737A) sở hữu gen ORF1 từ PCV2a và ORF2 từ PCV2b. Tiếp theo đó, nhiều tác giả

cũng báo cáo về sự phổ biến của vi-rút thể ghép PCV2a/b xảy ra trên heo ở Mỹ

(Cheung, 2009), Hàn Quốc (Kim và ctv, 2009a) và Trung Quốc (Cai và ctv, 2012).

Gần đây nhất, Neira và ctv (2017) đã ghi nhận sự lưu hành của chủng PCV2 tái tổ

hợp giữa PCV2a và PCV2d ở Chile với tỉ lệ lên đến 34% (10/29) số chủng khảo sát.

Một số nghiên cứu trước đây cũng đã báo cáo về sự lưu hành trong thực địa

của các chủng PCV2 thuộc nhóm tái tổ hợp ở Việt Nam. Cụ thể, Huỳnh Thị Mỹ Lệ

và ctv (2013) cũng đã ghi nhận sự lưu hành trong thực địa của các chủng PCV2 thuộc

nhóm tái tổ hợp với tỉ lệ cũng khá cao 22/30 chủng khảo sát. Các chủng này có mối

quan hệ rất gần với các chủng tái tổ hợp lưu hành phổ biến ở Trung Quốc và có cùng

vị trí tái tổ hợp ước đoán trên ORF2. Trong nghiên cứu này, dựa vào kết quả phân

tích tái tổ hợp bằng phần mềm RDP4 v.4.39 và SimPlot 3.5.1 chúng tôi đã ghi nhận

được có sự tái tổ hợp giữa PCV2a và PCV2d ở Việt Nam từ chủng bố mẹ giả định có

nguồn gốc từ Trung Quốc và Đài Loan. Do tốc độ thay thế nucleotide của PCV2 cao

(Firth và tcv, 2009; Peréz và ctv, 2011) cũng như các các báo cáo cho thấy có hiện

tượng nhiễm đồng thời 2 genotype PCV2 trên cùng một cá thể heo (Horlen và ctv,

2007; Hesse và ctv, 2008) nên khả năng xảy ra hiện tượng tái tổ hợp của PCV2 trong

tự nhiên là hoàn toàn có thể xẩy ra. Ngoài ra, Lefebvre và ctv (2009) cũng đã ghi

nhận có sự tái tổ hợp in vitro của PCV2 khi nhiễm cùng lúc 2 chủng vi-rút khác nhau

trên môi trường tế bào PK15.

3.2. Kết quả phân lập PCV2 và đặc tính nuôi cấy của một số phân lập PCV2

3.2.1. Kết quả phân lập PCV2 từ các mẫu thực địa

Phân lập được PCV2 ở 21 mẫu bệnh phẩm (9 mẫu hạch, 9 mẫu phổi, 2 mẫu

huyết thanh và 1 mẫu lách) từ 48 mẫu dương tính ADN-PCV2 (đã được xác định

genotype ở phần 3.1) trên tế bào dòng PK15A. Phương pháp PCR (Hình 3.4) và IPX

được dùng để phát hiện vi-rút trong tế bào nhiễm (Hình 3.5), kết quả sau 3 lần tiếp

đời phân lập được 18/21 (85,71%) mẫu dương tính PCV2 (Bảng 3.5). Trong các loại

mẫu bệnh phẩm dùng phân lập PCV2 thì mẫu hạch đạt tỉ lệ phân lập dương tính cao

nhất 100% (9/9) với hiệu giá vi-rút ở lần tiếp đời thứ 3 biến động từ 1,67 đến 5,50log10

TCID50/ml. Ngoài ra, PCV2 cũng phân lập được từ mẫu huyết thanh, nhưng hiệu giá

vi-rút ở lần tiếp đời thứ 3 khá thấp, chỉ đạt 1,67log10 TCID50/ml. Tuy nhiên, chưa

phân lập được PCV2 từ mẫu lách (0/1), điều này có thể do số lượng mẫu lách dùng

trong nghiên cứu này quá ít. Đã phân lập được 9/18 (50%) mẫu PCV2 dương tính

thuộc genotype PCV2b, 6/18 (33,33%) mẫu dương tính thuộc genotype PCV2d và

3/18 (16,67%) mẫu dương tính thuộc genotype PCV2-Re (2h). Ngoài ra, PCV2 có

thể nuôi cấy được trên môi trường tế bào ST (swine testis cell line - tế bào tinh hoàn

heo). Tuy nhiên, hiệu giá vi-rút đạt được không cao như khi phân lập trên tế bào

PK15A (số liệu không công bố).

Ký hiệu mẫu

Loại heo

ST T

Geno type

Loại mẫu

Triệu chứng lâm sànga

Kết quả phân lập

Phổi Phổi Hạch Hạch Hạch Hạch Hạch Phổi

Sau cai sữa Sau cai sữa Sau cai sữa Sau cai sữa Sau cai sữa Sau cai sữa 16 tuần Sau cai sữa

Mắc bệnh tai xanh Còi Còi Còi Còi Còi Còi, khó thở, viêm da, da nhợt nhạt Triệu chứng hô hấp: ho, khó thở Mắc bệnh tai xanh, sinh ra heo con chết Mắc bệnh tai xanh, sẩy thai Thai khô Mắc bệnh tai xanh, viêm da Thai sẩy Mắc bệnh tai xanh, viêm da Còi Còi Không có dữ liệu

Huyết thanh Nái Huyết thanh Nái Thai Sau cai sữa Thai 12 tuần Sau cai sữa Sau cai sữa Cai sữa

Không có dữ liệu

Sau cai sữa

2b 2b 2b 2b 2b 2b 2b 2b 2b 2b 2b 2d-2 2d-2 2d-2 2d-2 2d-2 2d-1 Re (2h)* Re (2h) Re (2h) Re (2h)

Phổi Hạch Phổi Phổi Hạch Phổi Hạch Lách Hạch Phổi Phổi

Mắc bệnh tai xanh, viêm da Gầy trơ xương, tiêu chảy nặng Không có dữ liệu

Hiệu giáb (P3) log10 TCID50/ml - - 1,67 3,67 1,67 3,67 4,50 1,67 1,67 1,67 4,00 5,50 1,67 1,67 5,50 5,00 5,00 - 4,33 1,67 1,67

- - + + + + + + + + + + + + + + + - + + +

1 CaMau/2007 2 KhanhHoa/2007 3 BinhDuong1/2009 4 NAVET-BinhDuong2/2009 5 BinhDuong3/2009 6 BinhDuong4/2009 7 NAVET-DongNai2/2009 8 TpHCM6/2010 9 BinhDinh5/2013 10 BinhDinh6/2013 11 NAVET-TpHCM8/2016 12 NAVET-LongAn2/2012 13 BinhDinh1/2013 14 LamDong1/2013 15 NAVET-NgheAn1/2015 16 NAVET-NgheAn2/2015 17 NAVET-BenTre/2014 18 CanTho/2008 Sau cai sữa 19 TpHCM4/2010 1 tuần tuổi 20 BinhDuong6/2012 21 BinhDinh3/2013 Sau cai sữa * Re: recombinant (nhóm tái tổ hợp), 2h: theo phân loại mới của Franzo và Segalés (2018) a: Các heo được xác định mắc bệnh tai xanh và dịch tả heo thông qua triệu chứng lâm sàng, bệnh tích và xác định có sự hiện diện của vi-rút PRRS và CSF trong mẫu bệnh phẩm bằng phương pháp RT-PCR. b: xem Phụ lục 6

Bảng 3.5. Kết quả phân lập PCV2 trên môi trường tế bào PK15A

760 bp

Hình 3.4. Điện di sản phẩm PCR 760 bp để phát hiện ADN-PCV2

Hình 3.5. Phản ứng IPMA phát hiện PCV2 phân lập trên môi trường tế bào

PK15A. (A): Tế bào PK15A đối chứng (không nhiễm PCV2) được nhuộm IPX; (B):

Tế bào PK15A nhiễm PCV2 được nhuộm IPX (màu đỏ gạch). Độ phong đại 100X.

Các nghiên cứu cho thấy PCV2 là vi-rút khó phân lập, với tỉ lệ phân lập được

cũng như hiệu giá vi-rút phân lập được không cao. Guo và ctv (2010) phân lập được

19 chủng PCV2 từ 42 mẫu bệnh phẩm (hạch, lách, phổi, gan, thận và huyết thanh)

heo mắc bệnh PCVD ở Trung Quốc, chiếm tỉ lệ 45,24%; trong đó, 15/19 chủng thuộc

genotype PCV2b, 2/19 chủng thuộc PCV2a và 2/19 chủng thuộc PCV2d. Huỳnh Thị

Mỹ Lệ và Nguyễn Văn Giáp (2013) cũng phân lập được 8/38 (23,53%) chủng PCV2

thuộc genotype PCV2b với hiệu giá biến động từ 102,7 đến 104,2 TCID50/ml. Việc khó

phân lập được PCV2 có thể do vi-rút thiếu enzyme ADN polymerase nên sự tái bản bộ

gen của chúng phụ thuộc hoàn toàn vào ADN polymerase của tế bào ký chủ. Vì thế,

vi-rút cần các tế bào đang nhân lên để hoàn thành chu kỳ gây nhiễm (Tischer và ctv,

1987). PCV2 là vi-rút phát triển chậm, một chu kỳ nhân lên của PCV2 mất khoảng 30

- 36 giờ trên tế bào PK15 (Cheung và Bolin, 2002; Meert và ctv, 2005a). Ngoài ra,

lượng vi-rút có trong bệnh phẩm, tình trạng bệnh phẩm và điều kiện bảo quản mẫu

cũng ảnh hưởng đến kết quả phân lập.

Hình 3.7. Thai khô ở các giai đoạn khác nhau Hình 3.6. Heo 16 tuần tuổi có biểu hiện viêm da

Ngoài phân lập được PCV2 từ mẫu bệnh phẩm trên heo sau cai sữa (Hình 3.6),

chúng tôi còn phân lập được PCV2 từ mẫu huyết thanh nái sẩy thai và từ mẫu phổi lấy

từ thai khô (Hình 3.7). Điều thú vị là các PCV2 được phân lập từ các ca heo nái có biểu

hiện rối loạn sinh sản đều thuộc genotype PCV2b. Các phân lập BinhDinh5/2013, Binh

Dinh6/2013 được phân lập từ mẫu huyết thanh heo nái dương tính với vi-rút PRRS,

sẩy thai và sinh ra heo con chết tươi. Riêng phân lập NAVET-TpHCM8/2016 được

phân lập từ phổi của thai khô ở heo nái có biểu hiện rối loạn sinh sản (thai khô, sinh ra

heo con yếu) và âm tính với các tác nhân gây rối loạn sinh sản khác như PRRSV,

CSFV, PPV. Điều này cho thấy, PCV2 ngoài liên quan đến PMWS còn liên quan đến

rối loạn sinh sản trên heo nái như nhận định của West và ctv (1999). Tương tự, một số

tác giả khác cũng phân lập được PCV2 từ mẫu mô (tim, phổi, gan và thận) của thai sẩy

(Meehan và ctv, 2001), từ huyết thanh của heo con sinh ra chết tươi (stillborn)

(Farnham và ctv, 2003). Từ các nghiên cứu này cho thấy PCV2 có khả năng truyền dọc

và gây chết thai trong điều kiện thực địa.

Từ kết quả phân tích đặc điểm di truyền, xác định genotype của các mẫu PCV2

thu nhận từ năm 2007-2016, kết quả phân lập, chuẩn độ hiệu giá ở đời thứ 3, cũng như

dựa vào các thông tin về triệu chứng, bệnh tích của heo mắc bệnh được thu mẫu của

các phân lập PCV2, chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b) được chọn để tiếp tục

nghiên cứu tiếp các đặc tính nuôi cấy, tính gây bệnh và khả năng kích thích sinh miễn

dịch. Chủng này thuộc genotype PCV2b lưu hành phổ biến, có hiệu giá vi-rút đạt được

ở lần tiếp đời thứ 3 khá cao (4,50log10 TCID50/ml), được thu nhận từ heo có các triệu

chứng, bệnh tích điển hình PMWS.

3.2.2. Xác định liều lượng gây nhiễm của chủng NAVET-DongNai2/2009

trên tế bào PK15A

Xác định liều lượng gây nhiễm thông qua việc xác định tỉ số gây nhiễm

(multiplicity of infection - MOI). Tiến hành gây nhiễm chủng NAVET-

DongNai2/2009 (PCV2b) trên tế bào PK15A với 5 tỉ số gây nhiễm (TCID50/tế bào)

khác nhau: 0,01; 0,02; 0,05; 0,1 và 1, thu hoạch vi-rút ở ba thời điểm khác nhau lúc

72, 96 và 120 giờ sau gây nhiễm. Thí nghiệm được lặp lại 4 lần. Kết quả chuẩn độ

hiệu giá vi-rút được thể hiện dưới dạng log10 TCID50/ml được trình bày qua Biểu đồ

3.4. Kết quả ghi nhận, có sự gia tăng hiệu giá vi-rút cùng với sự gia tăng của tỉ số

MOI. Trung bình hiệu giá vi-rút thu hoạch ở thời điểm 96 giờ (5,32  0,65log10

TCID50/ml) sau nhiễm đạt cao hơn so với thời điểm thu hoạch 72 giờ (5,26  0,66log10

TCID50/ml) và 120 giờ (5,14  0,57log10 TCID50/ml), tuy nhiên, không có sự khác

biệt thống kê (P > 0,05). Kết quả so sánh hiệu giá vi-rút thu được giữa các tỉ số MOI

cho thấy không có sự khác biệt về hiệu giá vi-rút thu được giữa tỉ số MOI = 1 (5,86

 0,29 log10 TCID50/ml) và MOI = 0,1 (5,72  0,30log10 TCID50/ml); MOI = 0,1 (5,72

 0,30log10 TCID50/ml) và MOI = 0,05 (5,46  0,35log10 TCID50/ml); MOI = 0,02

(4,67  0,26log10 TCID50/ml) và MOI = 0,01 (4,50  0,17log10 TCID50/ml). Tuy nhiên,

có sự khác biệt có ý nghĩa giữa hiệu giá thu được ở tỉ số MOI = 0,05 và MOI = 1;

MOI = 0,01 và 0,02 so với MOI = 0,05; 0,1 và 1 (P < 0,05). Từ kết quả nghiên cứu

này chúng tôi chọn tỉ số MOI = 0,1 để tiếp tục khảo sát khả năng nhân lên của các

phân lập PCV2 trên môi trường tế bào PK15A.

Hiệu giá (log10 TCID50/ml)

6.5

6.0

5.72bc

5.86c

5.46b

5.5

4.67a

72 g 96 g 120 g

5.0

4.50a

4.5

4.0

3.5

3.0

MOI

0,01

0,02

0,05

0,1

1,0

Biểu đồ 3.4. Hiệu giá vi-rút theo tỉ số MOI và thời gian thu hoạch của chủng

NAVET-DongNai2/2009. a, b, c: khác biệt thống kê với P < 0,05

3.2.3. Khả năng gây bệnh tích tế bào

In vitro, tế bào PK15A (dòng không nhiễm PCV1) được sử dụng rộng rãi để

phân lập PCV2. Chưa có báo cáo về PCV2 gây bệnh tích tế bào điển hình (cytopathic

effect - CPE) nên sự hiện diện của vi-rút thường được xác định thông qua nhuộm

miễn dịch huỳnh quang (immunofluorescence - IF) hoặc miễn dịch enzyme

(immunoperoxidase - IPX) trên tế bào nhiễm (Allan và Ellis 2000). Một điều thú vị

là, trong nghiên cứu này, khi gây nhiễm PCV2 trên tế bào PK15A với tỉ số MOI thấp

0,01 - 0,02 không ghi nhận được sự khác biệt về hình dạng giữa tế bào bị nhiễm vi-

rút và tế bào đối chứng. Tuy nhiên, khi gây nhiễm vi-rút với tỉ số MOI từ 0,05 trở lên

nhận thấy có sự thay đổi hình dạng ở các tế bào bị nhiễm vi-rút: tế bào có vẻ to hơn, co

tròn, đậm màu và có nhiều tế bào chết so với tế bào đối chứng không nhiễm (Hình 3.8).

Hình 3.8. Hình dạng tế bào tế bào PK15A nhiễm PCV2. (A) Đối chứng, (B)

MOI = 0,01 và (C) MOI = 0,1 (ghi nhận tại thời điểm 96 giờ sau nhiễm PCV2)

Kết quả nghiên cứu này tương tự như báo cáo của Dvorak và ctv (2013) khi

gây nhiễm PCV2 trên dòng tế bào võng mạc bào thai heo VR1BL (porcine fetal retina

cell line). Kết quả nghiên cứu từ nhóm tác giả này cho thấy, khi gây nhiễm PCV2 ở

nồng độ thấp (MOI = 0,01) tế bào bị nhiễm vẫn có thể phát triển sau khi tiếp đời. Tuy

nhiên, khi gây nhiễm PCV2 với nồng độ cao (MOI = 1), phần lớn các tế bào bị nhiễm

không thể phát triển được khi tiếp đời, có sự thay đổi về hình dạng tế bào xảy ra sau

3 ngày gây nhiễm, và xảy ra hiện tượng tế bào chết theo chương trình (apoptosis)

(Drorak và ctv, 2013). Như trình bày ở trên, hiệu giá vi-rút thu được ở các mức MOI

thấp cũng thấp hơn so với các mức MOI cao. Điều này cho thấy có mối liên hệ giữa

MOI và hiệu giá vi-rút thu nhận được và biểu hiện về hình dạng của tế bào nhiễm.

Có thể ghi nhận được bệnh tích tế bào ở tỉ số MOI cao ( 0,1).

3.2.4. Khả năng nhân lên của PCV2 trên môi trường tế bào PK15A

Nhằm tạo nguồn giống vi-rút đa dạng từ các chủng PCV2 thuộc các genotype

khác nhau phục vụ cho việc nghiên cứu chế tạo vắc-xin. Các phân lập có hiệu giá vi-

rút cao nhất ở mỗi genotype ở lần tiếp đời thứ ba - được kiểm tra tính thuần khiết,

không tạp nhiễm các tác nhân khác như CSFV, PRRS, PPV, PRV, PEDV, TGEV,

PCV1 và Mycoplasma (Phụ lục 7) - được chọn để tiếp tục nghiên cứu các đặc tính

sinh học trên môi trường tế bào PK15A. Các phân lập đó là NAVET-DongNai2/2009

(PCV2b), NAVET-LongAn2/2012 ( PCV2d) và NAVET-vietnam3/2004 (PCV2-Re

(2h) (riêng phân lập NAVET-vietnam3/2004 đã được nhóm tác giả Nguyễn Thị Thu

Hồng và ctv (2008) phân lập và khảo sát về đặc tính gây bệnh và tính sinh miễn dịch

trên heo kết quả nghiên cứu được đăng trong tạp chí Thú y số 2, 2008). Các phân lập

này được tiếp tục lựa chọn trong khảo sát các đặc tính sinh học như tính ổn định qua

các lần tiếp đời, đặc điểm phát triển và thời gian thu hoạch để đạt hiệu giá vi-rút tối

ưu khi nuôi cấy trên môi trường tế bào PK15A.

Kết quả đường cong sinh trưởng các chủng NAVET-DongNai2/2009,

NAVET-LongAn2/2012 và NAVET-vietnam3/2004 trên tế bào PK15A với tỉ số gây

nhiễm MOI = 0,1 được biểu diễn qua Biểu đồ 3.5. Trung bình hiệu giá vi-rút (thể hiện

dưới dạng log10 TCID50/ml) qua các thời điểm thu hoạch khác nhau của chủng

NAVET-vietnam3/2004 cao nhất (5,20  0,31log10 TCID50/ml), kế đến là chủng

NAVET-LongAn2/2012 (4,75  0,60log10 TCID50/ml) và thấp nhất là chủng

NAVET-DongNai2/2009 (4,30  0,62log10 TCID50/ml) (P < 0,01). Ngoài ra, có sự

khác biệt về trung bình hiệu giá vi-rút ở các thời điểm thu hoạch khác nhau (P < 0,01).

Phân tích đường cong sinh trưởng cho thấy, thời điểm thu hoạch để đạt hiệu giá vi-

rút cao nhất khác nhau tùy theo chủng PCV2, cụ thể, đối với chủng NAVET-

vietnam3/2004 là 72 giờ, chủng NAVET-DongNai2/2009 là 84 giờ và chủng

NAVET-LongAn2/2012 là 108 giờ sau nhiễm. Từ kết quả nghiên cứu này giúp chọn

lựa được thời gian thu hoạch thích hợp cho từng chủng để đạt hiệu giá vi-rút tối ưu

trong chế tạo vắc-xin.

Hiệu giá (log10 TCID50/ml) 6.0

5.0

4.0

3.0

NAVET-DongNai2/2009 NAVET-LongAn2/2012 NAVET-vietnam3/2004

2.0

1.0

0.0

Giờ sau nhiễm

108

120

Biểu đồ 3.5. Đường cong sinh trưởng của các chủng NAVET-DongNai2/2009,

NAVET-LongAn2/2012 và NAVET-vietnam3/2004 trên tế bào PK15A

3.2.5. Tính ổn định

Bảng 3.6. Hiệu giá của các chủng NAVET-DongNai2/2009, NAVET-

LongAn2/2012 và NAVET-vietnam3/2004 qua các lần tiếp đời trên tế bào PK15A

Tiếp đời

P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12 P13 P14 P15 𝐱̅ SD NAVET- DongNai2/2009 4,50 4,50 4,67 5,00 5,50 6,00 5,33 5,50 5,33 5,33 5,50 5,50 5,33 5,23 0,44 Hiệu giá vi-rút (log10 TCID50/ml) NAVET- LongAn2/2012 5,50 5,50 5,50 5,00 5,00 6,67 5,50 6,00 6,00 5,50 5,50 5,50 5,50 5,59 0,43 NAVET- vietnam3/2004 4,50 4,50 4,50 4,50 5,50 5,00 5,67 5,67 5,50 5,50 5,67 5,50 5,67 5,21 0,52

Các chủng NAVET-DongNai2/2009, NAVET-LongAn2/2012 và NAVET-

vietnam3/2004 được tiếp đời liên tục trên tế bào PK15A, kết quả được trình bày qua

Bảng 3.6. Dựa vào kết quả khảo sát tỉ số gây nhiễm MOI và đường cong sinh trưởng,

từ lần tiếp đời thứ 7 trở đi các chủng chọn khảo sát được tiếp đời với tỉ số MOI = 0,1

và được thu hoạch ở thời gian thích hợp để đạt hiệu giá vi-rút cao nhất.

Trung bình chung qua 15 lần tiếp đời hiệu giá vi-rút của chủng NAVET-

LongAn2/2012 cao nhất (5,59  0,43log10 TCID50/ml) kế đến là chủng NAVET-

vietnam3/2004 (5,21  0,52log10 TCID50/ml) và thấp nhất là chủng NAVET-

DongNai2/2009 (5,15  0,38log10 TCID50/ml), không có sự khác biệt về trung bình

hiệu giá giữa 3 chủng này qua 15 lần tiếp đời (P > 0,05). Điều này cho thấy 3 chủng

này phát triển ổn định trên tế bào PK15A với hiệu giá  5,0log10 TCID50/ml.

3.3. Sự tương đồng kháng nguyên giữa các phân lập PCV2 thuộc các

genotype khác nhau

Chứng minh tính đa dạng về kháng nguyên bằng phản ứng trung hòa chéo

được sử dụng trên rất nhiều vi-rút khác nhau: capripoxvirus (Davies và Otema, 1981),

vi-rút gây viêm khớp trên gà - avian reoviruses (Giambrone và Solano, 1988);

psittacine herpesviruses (Gravendyck và ctv, 1996); vi-rút dịch tả vịt – duck plague

virus (Zuhara và ctv, 2004). Ngoài ra, phản ứng trung hòa chéo cũng được dùng để

đánh giá mối tương quan về tính kháng nguyên giữa vi-rút vắc-xin với vi-rút thực địa

như đánh giá mối tương quan về tính kháng nguyên giữa vi-rút đậu cừu trong vắc-

xin với vi-rút đậu dê thực địa (Abu Elzein, 2004), giữa vi-rút đậu dê vắc-xin nhược

độc và vi-rút dậu dê thực địa (Nguyễn Thị Lam Hương, 2012).

Trong nghiên cứu này, tương đồng kháng nguyên giữa các chủng PCV2 thuộc

các genotype khác nhau cũng được đánh giá thông qua giá trị R (%). Hiệu giá kháng

thể trung hòa trung bình của phản ứng chéo giữa huyết thanh heo kháng các chủng

PCV2 thuộc các genotype 2b, 2d và PCV2-Re (2h) với các vi-rút tương ứng được

trình bày ở Bảng 3.7 và hệ số tương đồng kháng nguyên R (%) theo công thức tính

của Archetti và Horsfall (1950) được thể hiện qua Bảng 3.8. Kết quả cho thấy giữa

chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b) và NAVET-vietnam3/2004 (PCV2-Re

(2h)) tương đồng hoàn toàn về kháng nguyên với hệ số R là 104,20%. Hệ số R giữa

chủng NAVET-DongNai2/2009 và chủng NAVET-LongAn2/2012; giữa NAVET-

LongAn2/2012 và NAVET-vietnam3/2004 tương ứng là 91,60% và 91,30%.

Bảng 3.7. Hiệu giá kháng thể trung hòa (log2) của phản ứng trung hòa chéo

giữa huyết thanh heo với các genotype PCV2 phân lập

Vi-rút trung hòa

Mẫu huyết thanh heo

NAVET- DongNai2/2009 (PCV2b) NAVET- LongAn2/2012 (PCV2d) NAVET- vietnam3/2004 (PCV2-Re (2h))*

9,33 12,67 12,67

11,33 10,33 7,00

11,67 10,67 9,33

Kháng vi-rút NAVET-DongNai2/2009 Kháng vi-rút NAVET-LongAn2/2012 Kháng vi-rút NAVET-vietnam3/2004 * Re: recombinant (nhóm tái tổ hợp), 2h: theo phân loại mới của Franzo và Segalés (2018)

Bảng 3.8. Hệ số tương đồng kháng nguyên R* (%) giữa ba chủng PCV2 khảo sát

Vi-rút trung hòa

Mẫu huyết thanh heo

NAVET- DongNai2/2009 (PCV2b) NAVET- LongAn2/2012 (PCV2d) NAVET- vietnam3/2004 (PCV2-Re (2h))

91,60

*: R > 70 %: tương đồng hoàn toàn về kháng nguyên, R từ 33-70 %: khá tương đồng về kháng nguyên, R từ 11-32 %: Rất ít tương đồng về kháng nguyên, R từ 0-10 %: Khác hoàn toàn về kháng nguyên (Giambrone và Solano, 1988)

104,20 91,30 Kháng vi-rút NAVET-DongNai2/2009 Kháng vi-rút NAVET-LongAn2/2012 Kháng vi-rút NAVET-vietnam3/2004

Theo Giambrone và Solano (1988), khi đánh giá sự tương đồng kháng nguyên

giữa 2 chủng vi-rút dựa vào giá trị R thì hai chủng được xem là tương đồng về kháng

nguyên (antigen identity) với nhau khi R > 70%. Giá trị R tính từng cặp giữa các

chủng PCV2 NAVET-DongNai2/2009, NAVET-LongAn2/2012 và NAVET-

vietnam3/2004 đều > 70%. Bên cạnh đó, mức độ tương đồng về nucleotide và a-xít

a-min protein capsid giữa ba chủng này biến thiên từ 94,0% đến 96,1% (Bảng 3.3).

Kết quả trên cho thấy, cả 3 chủng này tuy khác nhau về genotype nhưng tương

đồng với nhau về kháng nguyên. Ngoài ra, một số thí nghiệm tiêm vắc-xin và công

cường độc cũng đã chứng minh khả năng bảo hộ chéo giữa các genotype PCV2, như

khả năng bảo hộ chéo giữa vắc-xin dựa trên PCV2a đối với vi-rút thực địa PCV2b và

PCV2d (Opriessnig và ctv, 2014b, Jeong và ctv, 2015), cũng như giữa vắc-xin dựa

trên PCV2b đối với vi-rút thực địa PCV2d (Opriessnig và ctv, 2014a) đối với PCV2b

và PCV2d (Huan và ctv, 2018). Tuy nhiên, cần nghiên cứu thêm về vấn đề này.

3.4. Thí nghiệm 1: Khả năng gây bệnh và tính sinh miễn dịch của chủng

NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b)

Biểu hiện lâm sàng và tăng trọng

Trong suốt thí nghiệm, heo ở cả lô thí nghiệm và lô đối chứng đều có thân

nhiệt biến động từ 39,0 đến 40,50C, không có các biểu hiện hô hấp hay tiêu hóa trên

tất cả các heo. Heo ở lô thí nghiệm có tình trạng lông da không bóng mượt như trên

nhóm heo đối chứng.

Bảng 3.9. Khối lượng (kg) và điểm thể trạng heo thí nghiệm 1

Trước khi gây nhiễm Sau khi gây nhiễm (ngày) 14 21 7 Lô Ký hiệu heo Khối lượng Khối lượng Khối lượng Khối lượng

TN1 (gây nhiễm)

ĐC1 (đối chứng)

KS: Mổ khảo sát bệnh tích

1TN1 4TN1 5TN1 6TN1 10TN1 12TN1 𝐱̅ SD 2ĐC1 3ĐC1 11ĐC1 𝐱̅ SD Điểm thể trạng 4 4 3 3 3 4 3 3 4 24,0 22,2 19,8 19,0 20,4 22,8 21,4 1,9 21,0 20,6 22,0 21,2 0,7 23,8 21,8 19,8 19,2 20,4 22,8 21,3 1,8 20,8 20,6 21,8 21,1 0,6 Điểm thể trạng 4 4 3 2 3 4 3 3 4 Điểm thể trạng 4 3 3 4 4 4 3 4 28,0 25,6 22,4 KS 25,4 27,6 25,8 2,2 24,6 23,4 27,4 25,1 2,1 Điểm thể trạng 3 3 3 4 4 4 30,2 30,0 KS 26,8 32,2 29,8 2,2 29,4 KS 31,4 30,4 1,4

Kết quả cân khối lượng, điểm thể trạng và tăng trọng bình quân hàng ngày

(TTHN) heo ở thí nghiệm 1 qua các thời điểm khảo sát được trình bày qua Bảng 3.9

và Bảng 3.10. Heo trước khi đưa vào thí nghiệm đồng đều nhau về trọng lượng từ

19,2 đến 23,8kg, thể trạng từ 3 đến 4 điểm. Sau gây nhiễm 7 ngày, heo ở cả 2 nhóm

hầu như không tăng trọng, có thể do việc cân, lấy máu và gây nhiễm làm heo bị stress.

Tăng trọng bình quân hàng ngày (TTHN) ở nhóm heo tiêm gây nhiễm qua các thời

điểm khảo sát đều thấp hơn so với nhóm đối chứng (Bảng 3.10). Tuy nhiên, không

có sự khác biệt thống kê về TTHN giữa 2 nhóm heo (P > 0,05).

Bảng 3.10. Tăng trọng bình quân hàng ngày trên heo ở thí nghiệm 1

Lô Số lượng heo 0 – 7 dpv TTHN (gram)* 7 – 14 dpc 14-21 dpc

6 9,52 ± 29,51 485,71 ± 167,82 357,14 ± 187,36

3 19,05 ± 16,50 561,90 ± 190,24 628,57 ± 80,81

* TTHN được trình bày ở dạng x̅  SD; dpc: ngày sau công độc

TN1 (gây nhiễm) ĐC1 (đối chứng) P > 0,05 P > 0,05 P > 0,05

Sự hiện diện của ADN-PCV2

Phát hiện ADN-PCV2 trong huyết thanh và trong mô heo thí nghiệm vào ngày

thứ 14 sau gây nhiễm (Bảng 3.11). Kết quả kiểm tra sự hiện diện của ADN-PCV2

trong các mẫu thu thập qua các thời điểm khác nhau trên heo sau gây nhiễm, bằng

phương pháp PCR cho thấy, không có sự hiện diện của ADN-PCV2 trong huyết thanh

và trong mô của heo ở lô đối chứng trong suốt quá trình thí nghiệm. Ở lô thí nghiệm,

ghi nhận sự hiện diện của ADN-PCV2 trong huyết thanh ở các thời điểm 7, 14 và 21

ngày sau gây nhiễm (day post challenge - dpc) tương ứng là 0/6, 5/5 và 3/4. Trong

khi đó, trong mô của heo mổ khảo sát bệnh tích ở các thời điểm 7, 14 và 21 ngày sau

gây nhiễm, phát hiện sự hiện diện của ADN-PCV2 tương ứng là 0/1, 1/1 và 0/1.

Ở thí nghiệm 1, đến 14 ngày sau gây nhiễm mới phát hiện được sự hiện diện

của ADN-PCV2 trong huyết thanh, trong khi đó kết quả ghi nhận của Nguyễn Thị

Thu Hồng và ctv (2008) khi gây nhiễm phân lập NAVET/vietnam3/2004 (PCV2-Re

(2h)) trên heo lúc 35 ngày tuổi, ở thời điểm 7 ngày sau gây nhiễm đã phát hiện được

1/4 heo dương tính ADN-PCV2 trong huyết thanh. Trong các thí nghiệm gây nhiễm

PCV2 trên heo của một số tác giả, hiện tượng vi-rút huyết được phát hiện đầu tiên

khoảng 7 ngày sau gây nhiễm PCV2, lượng vi-rút tăng và tỉ lệ heo có hiện tượng vi-

rút huyết đạt mức cao nhất vào ngày 14 đến ngày 21 sau gây nhiễm (Rovira và ctv,

2002; Fort và ctv, 2007). Sự xuất hiện vi-rút huyết trong thí nghiệm này chậm hơn so

với các thí nghiệm gây nhiễm khác có thể do lứa tuổi heo dùng trong thí nghiệm này

là 10 tuần. Trong khi đó, Nguyễn Thị Thu Hồng và ctv (2008) gây nhiễm thí nghiệm

trên heo 35 ngày tuổi; Rovira và ctv (2002) thí nghiệm trên heo từ 31-40 ngày tuổi.

Bảng 3.11. Phát hiện ADN-PCV2 trong huyết thanh và mô của heo ở thí nghiệm 1

Trước khi gây nhiễm Sau khi gây nhiễm (ngày) 14 21 Lô Hạch Ký hiệu heo Huyết thanh

TN1 (gây nhiễm)

(a): Mẫu hạch được thu thập tại thời điểm mổ khảo sát bệnh tích heo 6TN1 lúc 7dpc, heo 5TN1 và 3ĐC1 lúc 14 dpc và heo 10TN1 lúc 21 dpc

1TN1 4TN1 5TN1 6TN1 10TN1 12TN1 2ĐC1 3ĐC1 11ĐC1 ĐC1 (đối chứng) - - - - - - - - - 7 Huyết thanh - - - - - - - - - Hạch Huyết thanh + + + + + - - - -(a) Hạch Huyết thanh + + - + - - +(a) -(a) -(a)

Số lượng bạch cầu

Kết quả kiểm tra số lượng bạch cầu trên heo sau gây nhiễm chủng NAVET-

DongNai2/2009 được trình bày qua Bảng 3.12. Các heo ở lô đối chúng có số lượng

bạch cầu ổn định đến cuối thí nghiệm. Ở lô thí nghiệm, 2/6 heo (heo 10TN1 và

12TN1) có số lượng bạch cầu giảm nhẹ (biến động từ 8.400 đến 9.600 BC/mm3 máu)

ở thời điểm 7 và 14dpc, sau đó số lượng bạch cầu trở lại bình thường lúc 21dpc. Kết

quả nghiên cứu của Nielsen và ctv (2003) cho thấy, số lượng bạch cầu trên các heo

nhiễm có biểu hiện PMWS thấp hơn so với ở các heo nhiễm PCV2 tiềm ẩn. Tương

tự, Okuda và ctv (2003) cũng ghi nhận sự khác biệt về số lượng bạch cầu trên heo

gây nhiễm có biểu hiện lâm sàng bệnh so với các heo đối chứng.

Bảng 3.12. Số lượng bạch cầu (BC/mm3 máu) của heo ở thí nghiệm 1

Lô

TN1 (gây nhiễm) Ký hiệu heo 1TN1 4TN1 5TN1 6TN1 10TN1 12TN1 Trước khi gây nhiễm 10.550 15.050 17.300 13.450 18.400 12.500 Sau khi gây nhiễm (ngày) 21 14 7 10.850 15.050 18.800 9.300 11.050 12.250 KM 26.600 16.550 KM 16.050 KM 18.200 9.300 8.400 16.100 8.850 9.600

𝐱̅ SD

2ĐC1 3ĐC1 11ĐC1 14.542 2.968 11.300 18.750 10.750 13.608 4.162 10.300 19.900 18.250 14.170 7.366 18.100 17.650 21.500 13.613 4.221 15.250 KM 16.100 ĐC1 (đối chứng)

𝐱̅ SD

KM: không mẫu

13.600 4.469 16.150 5.133 19.083 2.105 15.675 601

Đáp ứng kháng thể

Kết quả kiểm tra kháng thể tổng cộng chống PCV2 bằng phương pháp IPMA

được trình bày qua Bảng 3.13 và Biểu đồ 3.6A. Bắt đầu có sự chuyển đổi kháng thể

tổng cộng từ 4,82 ± 0,55log2 (ở thời điểm 0 dpc) lên 6,04 ± 1,76log2 lúc 7 ngày sau

gây nhiễm và hiệu giá kháng thể tăng dần và đạt khá cao ở 21 dpc (10,39  1,50log2)

ở lô thí nghiệm. Ngược lại, ở lô đối chứng hiệu kháng thể (kháng thể thụ động) giảm

dần và tiến đến âm tính ở 21 dpc.

So với kháng thể IPMA, kháng thể trung hòa có sự chuyển đổi muộn hơn. Bắt

đầu có sự chuyển đổi kháng thể trung hòa (neutralising antibody - NA) (VNT50) từ

3,50 ± 0,55log2 ở 0dpc lên 6,6 ± 1,14log2 lúc 14 dpc và tăng lên đến 8,75 ± 0,50log2

ở 21 dpc trên nhóm heo thí nghiệm. Trong khi đó, các heo đối chứng có kháng thể

trung hòa giảm dần và âm tính lúc 21 dpc (Bảng 3.13, Biểu đồ 3.6B). Trên heo nhiễm

vi-rút cận lâm sàng thì kháng thể trung hòa chống PCV2 xuất hiện lúc 15 ngày sau

gây nhiễm thí nghiệm trở đi (Meerts và ctv, 2006; Fort và ctv, 2007).

Bảng 3.13. Diễn biến kháng thể chống PCV2 trên heo ở thí nghiệm 1

Sau khi gây nhiễm (ngày) Lô Chỉ tiêu KH heo 7 14 21

1TN1

4TN1

5TN1

TN1 (gây nhiễm) 6TN1

10TN1

12TN1 5,32 3 0,23 5,32 3 0,17 5,32 3 0,16 5,32 4 0,20 9,64 3 0,87 5,32 4 0,18 9,64 9 1,14 9,64 9 0,59 KM KM KM KM KM KM 9,64 9 0,75 12,64 8 0,62

𝐱̅ ± SD

2ĐC1

3ĐC1 ĐC1 (đối chứng)

11ĐC Trước khi gây nhiễm (10 tuần tuổi) 4,32 3 0,25 5,32 4 0,43 4,32 3 0,34 5,32 4 0,35 4,32 3 0,22 5,32 4 0,23 4,82 ± 0,55 3,50 ± 0,55 0,30 ± 0,09 10,64 9 1,17 10,64 10 1,24 9,64 9 1,25 8,64 7 0,68 8,64 2 0,59 0 6 0,25

𝐱̅ ± SD

KM: không mẫu

IPMA VNT50 OD IgG IPMA VNT50 OD IgG IPMA VNT50 OD IgG IPMA VNT50 OD IgG IPMA VNT50 OD IgG IPMA VNT50 OD IgG IPMA VNT50 OD IgG IPMA VNT50 OD IgG IPMA VNT50 OD IgG IPMA VNT50 OD IgG IPMA VNT50 OD IgG 7,64 6 0,28 5,32 7 0,18 8,64 5 0,36 KM KM KM 9,64 8 0,73 6,64 7 0,16 6,04 ± 1,76 7,58 ± 1,69 10,39 ± 1,50 8,75 ± 0,50 3,33 ± 0,52 6,60 ± 1,14 0,78 ± 0,26 0,30 ± 0,28 0,34 ± 0,23 8,64 2 0,74 KM KM KM 0 0 0,25 4,32 ± 6,11 1,00 ± 1,41 0,49 ± 0,34 9,64 8 0,77 8,64 7 0,70 4,32 8 0,19 10,31 ± 0,58 7,54 ± 2,83 5,76 ± 4,99 7,67 ± 0,58 5,00 ± 2,65 9,33 ± 0,58 0,55 ± 0,32 0,51 ± 0,23 1,22 ± 0,04

TN1 (IPMA)

ĐC1(IPMA)

)

2 g o l (

10.31

10.39

7.54

7.58

6.04

5.76

4.82

4.32

A M P I á i g u ệ i H

7 Ngày sau nhiễm

)

2 g o l (

9.33

8.75

7.67

6.60

5.00

3.33

3.50

0 5 T N V á i g u ệ i H

1.00

7 Ngày sau nhiễm

1.4

1.22

)

1.2

TN1 (OD)

ĐC1 (OD)

D O

1.0

0.78

0.8

0.55

0.51

0.6

0.49

0.4

( g n a u q ộ đ t ậ M

0.34

0.30

0.2

0.0

Ngày sau nhiễm

Biểu đồ 3.6. Diễn biến đáp ứng kháng thể trên heo ở thí nghiệm 1. (A) Kháng

thể tổng cộng. (B) Kháng thể trung hòa. (C) Mật độ quang (OD) ELISA phát hiện

kháng thể IgG. TN1: lô thí nghiệm 1, ĐC1: lô đối chứng 1

Kết quả kiểm tra kháng thể IgG bằng phương pháp ELISA cho thấy có sự gia

tăng OD lúc 14 dpc ở lô thí nghiệm, với cùng chiều hướng tăng dần như kháng thể

trung hòa (Bảng 3.13, Biểu đồ 3.6C). Theo Fort và ctv (2007), kháng thể IgG xuất

hiện vào lúc 14 đến 21 ngày sau gây nhiễm. Kết quả thí nghiệm gây nhiễm PCV2

trên heo 7 tuần tuổi của nhóm tác giả Opriessnig và ctv (2006b) cho thấy, sau gây

nhiễm kháng thể IgG cũng bắt đầu xuất hiện vào thời điểm 14 dpc trên nhóm heo thí

nghiệm, ngược lại, trên nhóm heo đối chứng (còn kháng thể thụ động) hàm lượng

IgG giảm dần đến kết thúc thí nghiệm lúc 28 dpc. Fort và ctv (2007) dựa trên kết quả

so sánh giữa các lớp kháng thể IgG và IgM (xác định bằng phản ứng ELISA) và

kháng thể trung hòa (xác định bằng phương pháp trung hòa) cho thấy, có mối tương

quan thuận giữa IgG và NA nhưng lại không có mối liên quan nào giữa IgM và NA.

Điều này cho thấy rằng kháng thể trung hòa đối với PCV2 chủ yếu là IgG (Fort và

ctv, 2007). Tuy nhiên, Opriessnig và ctv (2010) thì cho rằng không có mối tương

quan rõ ràng giữa IgG và NA.

Bệnh tích

Các heo được chọn mổ khảo sát bệnh tích dựa vào khối lượng và điểm thể

trạng (Bảng 3.10). Mổ khảo sát bệnh tích các heo 6TN1 (ở 7 dpc), 5TN1 (ở 14 dpc),

10TN1 (ở 21 dpc) của lô thí nghiệm và heo 3ĐC1 (ở 14 dpc) của lô đối chứng. Kết

quả ghi nhận, ở những heo được gây nhiễm với chủng NAVET-DongNai2/2009 có

biểu hiện bệnh tích đại thể như hạch bẹn cạn sưng, thủy thủng, xuất huyết; hạch phổi

sưng lớn và xuất huyết; hạch màng treo ruột sưng; phổi dai và có đốm nâu; màng thận

khó bóc, thận có các nang nước trên heo mổ khảo sát bệnh tích ở 14 và 21 dpc.

Bệnh tích vi thể: bệnh tích đáng chú ý nhất là sự suy giảm tế bào lym-phô và

sự hiện diện các tế bào đa nhân khổng lồ ở nốt bạch huyết (Hình 3.9a, b) và viêm

phổi kẽ (Hình 3.10a, b).

Nhìn chung, heo được gây nhiễm với PCV2 chủng NAVET-DongNai2/2009

(PCV2b) có TTHN thấp hơn so với heo đối chứng, có xuất hiện các bệnh tích đặc

trưng của bệnh PMWS và đã phát hiện ADN-PCV2 trong các mẫu mô bệnh thời điểm

14 dpc. Kết quả gây nhiễm PCV2 chủng NAVET/vietnam3/2004 (PCV2-Re (2h))

trên heo của nhóm tác giả Nguyễn Thị Thu Hồng và ctv (2008) cho thấy, không có

biểu hiện lâm sàng PMWS trên heo thí nghiệm trong suốt quá trình thí nghiệm và

bệnh tích ghi nhận được ở heo gây nhiễm chỉ có ở hạch bẹn cạn và hạch ruột. Một số

tác giả khác cũng ghi nhận kết quả tương tự, heo không thể hiện triệu chứng lâm sàng

bệnh PMWS khi gây nhiễm đơn độc PCV2 (Balasch và ctv, 1999; Ellis và ctv, 1999).

Tuy nhiên, một số tác giả khác báo cáo rằng, đơn độc PCV2 có thể gây bệnh còi trên

một số heo thí nghiệm (Allan và ctv, 1999; Harms và ctv, 2001; Gauger và ctv, 2011).

Hình 3.9a. Nang bạch huyết bình thường ở heo đối chứng (HE, 400X) Hình 3.9b. Suy giảm tế bào lym-phô và xuất hiện tế bào đa nhân khổng lồ ở nang bạch huyết ở heo thí nghiệm (HE, 400X)

Hình 3.10a. Phổi heo đối chứng Hình 3.10b. Viêm phổi kẽ ở heo thí nghiệm (HE, 400 X) (HE, 400X)

PMWS là bệnh đa yếu tố. Theo kết quả phân tích tổng hợp (meta-analysis) của

Tomás và ctv (2008) từ 44 thí nghiệm tái gây PMWS trên heo của các tác giả trên thế

giới từ năm 1999 đến 2008 cho thấy, để thiết kế một thí nghiệm tái gây PMWS thành

công trên heo cần thỏa mãn các điều sau: (1) heo con không bú sữa đầu; (2) heo thí

nghiệm nhỏ hơn 3 tuần tuổi; (3) liều gây nhiễm cao (> 105,0 TCID50/ heo); (4)

genotype PCV2b và (5) đồng nhiễm với một tác nhân khác gây bệnh trên heo xem

như một yếu tố khởi động.

Sự xuất hiện và trở nên vượt trội của PCV2d được cho là có độc lực cao hơn

PCV2a và PCV2b (Guo và ctv, 2012). Tuy nhiên, Opriessnig và ctv (2008c) cho rằng

độc lực của các phân lập PCV2 không liên quan đến genotype (PCV2a và PCV2b),

nhưng lại có sự khác biệt về độc lực giữa các phân lập trong cùng genotype. Nhóm

tác giả Opriessnig và ctv (2014c) đã thí nghiệm gây nhiễm PCV2 trên heo nhằm so

sánh độc lực giữa PCV2a, PCV2b và PCV2b, kết quả cho thấy không có sự khác biệt

về độc lực giữa các genotype nghiên cứu. Sự khác nhau giữa các kết quả nghiên cứu

có thể do việc sử dụng các chủng PCV2 khác nhau, dạng dịch chứa vi-rút gây bệnh

(huyễn dịch đồng nhất từ bệnh phẩm hay dịch chứa vi-rút phân lập từ môi trường tế

bào), đường gây bệnh, liều lượng vi-rút, số lần tiếp đời của vi-rút trên môi trường tế

bào và tình trạng miễn dịch và lức tuổi heo dùng để gây bệnh.

3.5. Kết quả vô hoạt PCV2

3.5.1. Vô hoạt PCV2 với các nồng độ chất vô hoạt khác nhau

Bảng 3.14. Hiệu giá vi-rút chủng NAVET-DongNai2/2009 (log10TCID50/ml)

theo thời gian vô hoạt ở các nồng độ BEI

Nồng độ BEI

KPH: không phát hiện tế bào dương tính với PCV2 theo phương pháp nhuộm IPX

3 mM 6,00 4,17 3,84 3,59 3,42 2,59 1,67 KPH KPH KPH KPH 0,86 5 mM 6,00 3,42 2,84 2,59 2,42 1,67 KPH KPH KPH KPH KPH 1,00 1 mM 6,00 4,59 4,50 4,33 3,84 3,17 2,59 2,17 1,67 KPH KPH 0,67 Giờ sau vô hoạt 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Tốc độ vô hoạt (log10 TCID50/giờ)

Dịch vi-rút phân lập NAVET-DongNai2/2009 ở lần tiếp đời thứ 8 được dùng

để xác định công thức vô hoạt. Dùng BEI với các nồng độ khác nhau: 1 mM, 3 mM

và 5 mM để vô hoạt PCV2 ở 370C, thí nghiệm được lặp lại 2 lần. Lấy mẫu kiểm tra

hiệu giá vi-rút mỗi giờ trong 10 giờ đầu vô hoạt, nhằm xác định động học (kenetic)

của quá trình vô hoạt. Trung bình hiệu giá vi-rút giảm theo thời gian vô hoạt ở các

nồng độ BEI được trình bày qua Bảng 3.14 và Biểu đồ 3.7.

y = - 0,49x + 5,62; P < 0,05 y = - 0,59x + 5,38; P < 0,05 y = - 0,71x + 4,93; P < 0,05

1 mM BEI 3 mM BEI 5 mM BEI

0 5

á i g u ệ i H

D C T 0 1 g o l

Giờ

Biểu đồ 3.7. Khuynh hướng giảm hiệu giá vi-rút chủng NAVET-

DongNai2/2009 (log10 TCID50/ml) theo thời gian vô hoạt ở các nồng độ BEI. Phương

trình hồi quy giữa hiệu giá vi-rút và thời gian bất hoạt được xây dựng bằng phần mềm

Minitab 16.2.0

Kết quả xác định hiệu giá vi-rút giảm theo thời gian vô hoạt cho thấy, nồng độ

BEI càng cao thì thời gian không phát hiện vi-rút ở độ pha loãng thấp nhất (10-1)

trong mẫu lấy mỗi giờ sau vô hoạt để đánh giá động học (kenetic) càng ngắn. Cụ thể,

ở nồng độ BEI 1 mM là 9 hpi (hour post inactivation – giờ sau bất hoạt), trong khi đó

ở nồng độ BEI 3 mM và 5 mM tương ứng là 7 và 6 hpi (Bảng 3.14). Tốc độ vô hoạt

tương ứng với các nồng độ BEI 1 mM, 3 mM và 5 mM lần lượt là 0,67; 0,86 và

1,00log10 TCID50/giờ. Điều này cho thấy có sự tương quan giữa sự gia tăng nồng độ

BEI và tốc độ vô hoạt như nhận định của Aarthi và ctv (2004). Nhóm tác giả này đã

sử dụng BEI với các nồng độ khác nhau (0,4 mM, 0,8 mM, 1,2 mM, 1,6 mM và 2,0

mM) để vô hoạt các serotype (O, A, Asia1) vi-rút lở mồm long móng (LMLM). Kết

quả, ở nồng độ BEI 0,4 mM, vẫn phát hiện vi-rút ở độ pha loãng thấp nhất (10-1) trong

mẫu lấy mỗi giờ sau vô hoạt ở thời điểm 7-10 hpi. Trong khi đó, không phát hiện vi-

rút ở độ pha loãng thấp nhất (10-1) trong mẫu lấy mỗi giờ sau vô hoạt ở thời điểm 4-

5 hpi, ở nồng độ BEI 1,6 mM hoặc 2,0 mM. Tương tự, Ismail và ctv (2013) cũng sử

dụng BEI với các nồng độ khác nhau (0,1 mM, 0,4 mM, 0,8 mM, 1,2 mM, 1,6 mM)

để vô hoạt vi-rút LMLM serotype SAT2. Kết quả ghi nhận, có sự gia tăng tốc độ vô

hoạt cùng với sự gia tăng nồng độ BEI, tốc độ vô hoạt biến động từ 0,53 – 1,15log10

TCID50/giờ tương ứng với nồng độ BEI từ 0,4 - 1,6 mM, ở 370C.

Kiểm tra khả năng vô hoạt vi-rút hoàn toàn:

Dịch vi-rút 24 giờ sau vô hoạt ở nhiệt độ 370C được kiểm tra xem vi-rút đã được

vô hoạt hoàn toàn hay chưa (không còn khả năng gây nhiễm) bằng cách tiếp đời liên tục

3 lần trên tế bào PK15A. Ở lần tiếp đời thứ 3 kiểm tra sự hiện diện của PCV2 bằng phản

ứng PCR và nhuộm IPX tế bào nhiễm.

Kết quả cho thấy ở nồng độ BEI 3 mM và 5 mM vi-rút được vô hoạt hoàn toàn.

Ngược lại, ở nồng độ BEI 1 mM sau 24 giờ vi-rút vẫn chưa được vô hoạt hoàn toàn,

bằng chứng là sau 3 lần tiếp đời dịch phân lập từ mẫu vi-rút thu 24 hpi ở lô có nồng độ

Trong quá trình chế kháng nguyên để tạo vắc-xin vô hoạt, việc vô hoạt

vi-rút hoàn toàn nhưng vẫn còn giữ được đặc tính kháng nguyên đóng vai trò

rất quan trọng. Thực tế cho thấy đã từng nổ ra dịch bệnh do việc tiêm vắc-xin

vô hoạt mà vi-rút chưa được vô hoạt hoàn toàn, như dịch lở mồm long móng

xảy ra ở Anh năm 1981 (King và ctv, 1981). Ngay cả vắc-xin vô hoạt thể ghép

PCV1-2 cũng đã xảy ra trường hợp tương tự là phát hiện được vi-rút vắc-xin

lưu hành trong thực địa (Gagnon và ctv, 2010). Trong thí nghiệm này, với nồng

độ BEI 1 mM, ở nhiệt độ 370C, sau 24 giờ vẫn chưa vô hoạt được PCV2 hoàn

toàn. PCV2 được vô hoạt hoàn toàn ở nồng độ BEI 3 mM và 5 mM trong thời

gian 24 giờ ở nhiệt độ 370C.

BEI 1 mM dương tính với ADN-PCV2 (Hình 3.11) và IPX (Hình 3.12).

Giếng 1: Đối chứng âm

Giếng 2: Thang 100 bp

Giếng 3: P3 - 5 mM BEI

760 bp

Giếng 4: P3 - 3 mM BEI

Giếng 5: P3 - 1 mM BEI

Giếng 6: Đối chứng dương

100

Hình 3.11. Điện di sản phẩm PCR phát hiện ADN-PCV2 trong dịch tế bào ở

lần tiếp đời thứ 3 để kiểm tra vô hoạt vi-rút hoàn toàn ở các nồng độ BEI

Hình 3.12. Nhuộm IPX xác định sự hiện diện của PCV2 trong tế bào PK15A

nhiễm ở lần tiếp đời thứ 3 để kiểm tra vô hoạt vi-rút hoàn toàn ở các nồng độ BEI.

(A) tế bào đối chứng âm, (B) tế bào nhiễm PCV2 (màu đỏ gạch) đối chứng dương,

3.5.2. Kết quả vô hoạt ba chủng PCV2 phân lập với nồng độ BEI 3 mM

Dịch vi-rút phân lập NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b), NAVET-

LongAn2/2012 (PCV2d) và chủng NAVET-vietnam3/2004 (PCV2-Re (2h)) ở lần

tiếp đời thứ 8 được vô hoạt với nồng độ BEI 3 mM. Lấy mẫu kiểm tra hiệu giá vi-rút

mỗi giờ trong 10 giờ đầu vô hoạt. Trung bình hiệu giá vi-rút giảm theo thời gian vô

hoạt ở các nồng độ BEI được trình bày qua Bảng 3.15 và Biểu đồ 3.8.

101

Bảng 3.15. Hiệu giá vi-rút (log10 TCID50/ml) của ba chủng PCV2 phân lập

giảm theo thời gian vô hoạt ở nồng độ BEI 3 mM

Giờ sau vô hoạt

NAVET- DongNai2/2009 6,00 4,50 4,00 3,50 3,33 2,50 1,67 KPH KPH KPH KPH Chủng NAVET- LongAn2/2012 6,67 4,50 3,00 2,50 2,33 1,67 KPH KPH KPH KPH KPH NAVET- vietnam3/2004 5,00 3,50 2,67 2,50 2,33 2,00 1,67 KPH KPH KPH KPH

KPH: không phát hiện tế bào dương tính với PCV2 theo phương pháp nhuộm IPX

0,86 1,33 0,71 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Tốc độ vô hoạt (log10 TCID50/giờ)

Kết quả xác định, hiệu giá vi-rút giảm theo thời gian vô hoạt, với nồng độ BEI

3 mM, ở nhiệt độ 370C, thời gian không phát hiện vi-rút nồng độ pha loãng 10-1 trong

mẫu lấy mỗi giờ sau vô hoạt để đánh giá động học của hai chủng NAVET-

DongNai2/2009, chủng NAVET-vietnam3/2004 là 7 hpi và 6 hpi đối với chủng

NAVET-LongAn2/2012. Tốc độ bất hoạt tương ứng với các chủng lần lượt là 0,71;

0,86 và 1,33log10 TCID50/giờ tương ứng với các chủng NAVET-vietnam3/2004,

NAVET-DongNai2/2009 và NAVET-LongAn2/2012. Chủng NAVET-

LongAn2/2012 có hiệu giá vi-rút trước khi vô hoạt cao nhất, nhưng thời gian không

phát hiện vi-rút nồng độ pha loãng 10-1 trong mẫu lấy mỗi giờ sau vô hoạt để đánh

giá động học lại ngắn nhất, kết quả là tốc độ vô hoạt của chủng này cao nhất so với 2

chủng còn lại. Điều này cho thấy đặc điểm đề kháng của PCV2 có thể thay đổi tuỳ

theo chủng. Kết quả kiểm tra khả năng vi-rút bị vô hoạt hoàn toàn cho thấy ở nồng

độ BEI 3 mM, ở nhiệt độ 370C, sau 24 giờ có thể vô hoạt hoàn toàn các vi-rút thuộc

các chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b) và NAVET-LongAn2/2012 (PCV2d)

và NAVET-vietnam3/2004 (PCV2-Re (2h)) (Hình 3.13).

102

y = -0,63x + 5,54; P < 0,05

y = -0,92x + 5,73; P < 0,05 y = -0,48x + 4,24; P < 0,05

NAVET-DongNai2/2009 NAVET-LongAn2/2012 NAVET-vietnam3/2004

0 5

á i g u ệ i H

D C T 0 1 g o l

Giờ

Biểu đồ 3.8. Khuynh hướng giảm hiệu giá vi-rút (TCID50/ml) của các chủng PCV2

phân lập theo thời gian vô hoạt ở nồng độ BEI 3 mM. Phương trình hồi quy giữa hiệu

giá vi-rút và thời gian bất hoạt được xây dựng bằng phần mềm Minitab 16.2.0

Hình 3.13. Điện di sản phẩm PCR phát hiện ADN-PCV2 trong dịch tế bào ở

lần tiếp đời thứ 3 kiểm tra khả năng vô hoạt vi-rút hoàn toàn đối với ba chủng PCV2

phân lập trong nghiên cứu

Nhìn chung, với nồng độ BEI 3 mM, ở nhiệt độ 370C, sau 24 giờ vô hoạt hoàn

toàn ba chủng PCV2 phân lập trong nghiên cứu này. Từ kết quả này xác định được

quy trình vô hoạt PCV2 nhằm chế tạo kháng nguyên trong nghiên cứu sản xuất vắc-

xin PCV2.

103

3.6. Đánh giá an toàn và hiệu lực của vắc-xin PCV2 vô hoạt nhũ dầu thử

nghiệm chủng NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b)

3.6.1. Thí nghiệm 2

+ An toàn

Biểu hiện lâm sàng: Sau khi tiêm vắc-xin PCV2 thử nghiệm (2ml/heo, chứa

lượng kháng nguyên 4,5log10 TCID50/liều) 2 lần cách nhau 21 ngày, tất cả 3 heo ở lô

thí nghiệm và 2 heo đối chứng (tiêm dịch chiết tế bào PK15A) đều ăn uống bình

thường. Tại vị trí tiêm ở các heo của lô tiêm vắc-xin có biểu hiện sưng nhẹ tại vị trí

tiêm ở lần tiêm vắc-xin thứ 2. Không có sự khác biệt về tăng trọng hàng ngày giữa 2

lô tiêm vắc-xin và lô đối chứng đến kết thúc thí nghiệm (Bảng 3.16, Phụ lục 10).

Bảng 3.16. Khối lượng ban đầu và tăng trọng bình quân hàng ngày trên heo ở

thí nghiệm 2

TTHN (gram)*

Lô Từ 0-21 dpv1 Từ 0 – 28 dpv2 Khối lượng heo trước tiêm vắc-xin (7 tuần tuổi) (kg)* Số lượng heo

3 15,3 ± 0,6 301,59 ± 60,30 680,95 ± 44,08

* Khối lượng và TTHN được trình bày ở dạng x̅  SD; dpv1: ngày sau tiêm vắc-xin lần 1, dpv2: ngày sau tiêm vắc-xin lần 2

2 15,5 ± 0,4 319,05 ± 30,30 671,43 ± 15,15 TN2 (tiêm vắc-xin) ĐC2 (đối chứng)

Diễn biến thân nhiệt: Theo dõi thân nhiệt của heo ở cả 2 lô thí nghiệm và đối

chứng trước tiêm vắc-xin 3 ngày, sau khi tiêm vắc-xin lần thứ nhất 21 ngày và sau

khi tiêm vắc-xin lần thứ hai 7 ngày. Thân nhiệt heo giao động từ 38,30C đến 40,50C.

Trong đó, heo 5TN2 sốt nhẹ (40,50C) ở thời điểm 1 ngày sau vắc-xin lần thứ nhất và

1 ngày sau vắc-xin lần hai.

Sự hiện diện của vi-rút PCV2 trong máu heo sau tiêm vắc-xin: Để chứng minh

vi-rút PCV2 trong vắc-xin đã được bất hoạt hoàn toàn và không còn khả năng nhân lên

trong heo, chúng tôi đã kiểm tra ADN-PCV2 trong máu của tất cả heo được tiêm vắc-

xin và heo đối chứng trước và sau khi tiêm vắc-xin lần 1 lúc 7, 14 và 21 ngày. Kết quả

PCR xác định sự hiện diện của ADN-PCV2 trong máu heo thí nghiệm cho thấy cả

104

heo tiêm vắc-xin và heo đối chứng đều âm tính với ADN-PCV2. Điều này cho thấy

vi-rút PCV2 dùng chế tạo kháng nguyên đã được bất hoạt hoàn toàn không còn tính

gây nhiễm trên heo.

+ Đáp ứng miễn dịch

Ở thí nghiệm 2, heo được tiêm vắc-xin lần đầu lúc 7 tuần tuổi, với quy trình

tiêm 2 lần cách nhau 21 ngày. Như đã trình bày ở phần các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu

quả tiêm phòng vắc-xin PCV2 (phần 1.4.5.1), kháng thể thụ động tại thời điểm tiêm

vắc-xin lần đầu có ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch sau tiêm phòng. Có mối tương

quan nghịch có ý nghĩa giữa hiệu giá KTTĐ và đáp ứng kháng thể sau tiêm vắc-xin

(Fraile và ctv, 2012a). Tại thời điểm chuyển heo về ở thí nghiệm 2 (lúc 3 tuần tuổi),

tất cả heo đều có KTTĐ IPMA khá cao từ 8,64 – 11,64log2 (Phụ lục 11). Do đó, nhằm

tránh ảnh hưởng của KTTĐ đến đáp ứng miễn dịch sau tiêm vắc-xin nên ở thí nghiệm

2 heo được tiêm vắc-xin thử nghiệm vào lúc 7 tuần tuổi (hiệu giá kháng thể IPMA ở

nhóm heo TN2 là 6,64log2).

Kháng thể tổng cộng: kết quả diễn biến đáp ứng kháng thể theo thời gian được

trình bày qua Bảng 3.17 và Biểu đồ 3.9A. Hiệu giá kháng thể thụ động IMPA lúc tiêm

vắc-xin lần một là 6,64log2; sau tiêm vắc-xin lần một hiệu giá kháng thể trên cả 3 heo

thí nghiệm giảm dần. Tuy nhiên, có sự chuyển đổi huyết thanh sau khi tiêm vắc-xin lần

thứ hai 7 ngày, sau đó hiệu giá kháng thể IPMA tăng dần và đến 28 ngày hiệu giá kháng

thể IPMA đạt khá cao 11,31  0,58log2. Điều này cho thấy có đáp ứng miễn dịch nhớ

trên các heo được tiêm vắc-xin và vắc-xin PCV2 vô hoạt nhũ dầu có khả năng gây đáp

ứng miễn dịch trên heo. Trong khi đó, trên heo đối chứng hiệu giá IPMA giảm dần từ

lúc đầu thí nghiệm là 9,64log2 đến kết thúc thí nghiệm còn 5,64log2.

Kết quả diễn biến hiệu giá kháng thể tổng cộng trên heo được tiêm vắc-xin

trong thí nghiệm này cũng tương tự kết quả nghiên cứu của Fort và ctv (2008), tiêm

vắc-xin PCV2 hai lần cách nhau 2 tuần, kết quả cho thấy hiệu giá kháng thể IPMA

tăng cao sau tiêm lần hai 14 ngày. Theo Fort và ctv (2009b) việc tiêm 2 liều vắc-xin

PCV2 sẽ kích thích sinh đáp ứng miễn dịch cao hơn so với tiêm 1 liều, do đáp ứng

nhớ của các tế bào miễn dịch khi tiếp xúc với kháng nguyên lần 2.

105

Bảng 3.17. Diễn biến kháng thể chống PCV2 trên heo ở thí nghiệm 2

Sau tiêm vắc-xin lần 1 (ngày) Sau tiêm vắc-xin lần 2 (ngày)

5TN2

9TN2

Lô KH heo Chỉ tiêu 7 14 21 7 14 21 28

11TN2

TN2 (tiêm vắc-xin)

8,64 7 1,20 9,64 0 0,80 9,64 7 1,03 5,64 0 0,39 6,64 0 0,35 6,64 0 0,34 4,64 0 0,49 4,64 0 0,30 5,64 0 0,49 0 0 0,59 4,64 0 0,34 5,64 0 0,73 9,64 7 1,13 10,64 5 0,77 10,64 7 1,27 10,64 6 1,11 11,64 7 0,88 11,64 6 1,45

Trước tiêm (7 tuần tuổi) 6,64 0 0,44 6,64 0 0,23 6,64 0 0,33 6,64 ± 0 0

0 𝐱̅ ± SD

14ĐC2 15ĐC2

ĐC2 (đối chứng)

6,64 6 0,58 6,64 0 0.37 6,64 ± 0 8,64 8 0,87 8,64 9 0.62 8,64 ± 0 8,50 ± 0,71 9,64 9 0,91 9,64 9 0,76 9,64 ± 0 9,00 ± 0 8,64 8 0,68 8,64 8 0,59 8,64 ± 0 8,00 ± 0

𝐱̅ ± SD

IPMA VNT50 OD IgG IPMA VNT50 OD IgG IPMA VNT50 OD IgG IPMA 4,00 ± 3,61 4,67 ± 4,04 VNT50 OD IgG 0,33 ± 0,10 0,36 ± 0,03 0,43 ± 0,11 0,55 ± 0,20 0,78 ± 0,17 1,01 ± 0,20 6,64 7,64 IPMA 6 7 VNT50 0,60 0,66 OD IgG 6,64 8,64 IPMA 7 8 VNT50 0,43 0,49 OD IgG 8,14 ± 0,71 6,64 ± 0 IPMA VNT50 7,50 ± 0,71 6,50 ± 0,71 3,00 ± 4,24 OD IgG 0,83 ± 0,11 0,74 ± 0,17 0,63 ± 0,07 0,58 ± 0,12 0,51 ± 0,12 0,48 ± 0,15

7,64 5 0,63 8,64 0 0,96 8,64 7 0,74 6,31 ± 0,58 4,98 ± 0,58 3,43 ± 3,01 8,31 ± 0,58 9,31 ± 0,58 10,31 ± 0,58 11,31 ± 0,58 6,33 ±0,58 1,15 ± 0,29 5,64 0 0,47 5,64 0 0,40 5,64 ± 0 0 0,44 ± 0,05

6,33 ± 1,15 1,06 ± 0,26 6,64 0 0,44 6,64 0 0,31 6,64 ± 0 0 0,37 ± 0,10

106

A

11.31

)

Tiêm văc-xin lần 1

10.31

Tiêm văc-xin lần 2

9.31

8.31

2 g o l (

6.64

6.31

4.98

3.43

TN2 (IPMA) ĐC2 (IPMA)

A M P I á i g u ệ i H

21 0

Ngày

Sau tiêm vắc-xin lần 1

Sau tiêm vắc-xin lần 2

TN2 (VNT50) ĐC2 (VNT50)

Tiêm văc-xin lần 1

Tiêm văc-xin lần 2

) 2 g o l (

6.33

4.67

4.00

0 5 T N V á i g u ệ i H

Ngày

21 0

Sau tiêm vắc-xin lần 1

7 Sau tiêm vắc-xin lần 2

TN2 (OD) ĐC2 (OD)

)

1.15

Tiêm văc-xin lần 1

D O

1.06

1.01

Tiêm văc-xin lần 2

0.78

0.55

0.43

0.33

0.36

( g n a u q ộ đ t ậ M

1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0

21 0

Sau tiêm vắc-xin lần 1

Ngày

Sau tiêm vắc-xin lần 2

Biểu đồ 3.9. Diễn biến đáp ứng kháng thể trên heo ở thí nghiệm 2. (A) Kháng thể tổng cộng. (B) Kháng thể trung hòa. (C) Mật độ quang (OD) ELISA phát hiện

kháng thể IgG. TN2: lô thí nghiệm 2, tiêm vắc-xin; ĐC2: lô đối chứng 2, tiêm dịch chiết tế bào PK15A

107

Kháng thể trung hòa: Tương tự kháng thể tổng cộng, cũng không có sự chuyển

đổi kháng thể trung hòa ở heo sau tiêm vắc-xin lần 1. Tuy nhiên, sau tiêm vắc-xin lần

hai 7 ngày có sự chuyển đổi kháng thể trung hòa ở lô tiêm vắc-xin và đạt 6,33 

1,15log2 ở 21dpv (Bảng 3.17, Biểu đồ 3.9B).

Kháng thể IgG: kết quả kiểm tra kháng thể IgG chống PCV2 bằng phương pháp

ELISA qua các thời điểm khác nhau sau tiêm vắc-xin lần 1 và lần 2 cho thấy ở lô tiêm

vắc-xin bắt đầu có sự gia tăng trung bình mật độ quang (OD) ở 14 ngày sau tiêm vắc-

xin (day post vaccination - dpv) lần một từ 0,33  0,10 (0 dpv) lên 0,43  0,11 (14 dpv),

và tiếp tục tăng cao đến kết thúc thí nghiệm (Bảng 3.17 và Biểu đồ 3.9C).

Giải thích kết quả đáp ứng kháng thể trong thí nghiệm 2 này sẽ được trình bày

chung trong thảo luận của thí nghiệm 3.

3.6.2. Thí nghiệm 3

+ An toàn: Từ 0 - 28 ngày sau tiêm vắc-xin, tất cả heo ở lô thí nghiệm (tiêm

vắc-xin PCV2 thử nghiệm, với liều 2 ml/heo, chứa lượng kháng nguyên 6log10

TCID50/liều), và heo ở lô đối chứng (tiêm dịch chiết tế bào PK15A) đều khỏe mạnh,

ăn uống bình thường, không có sự gia tăng thân nhiệt (vượt quá 400C). Không có

phản ứng cục bộ hay phản ứng toàn thân xảy ra sau tiêm ở cả 2 lô.

+ Hiệu lực về lâm sàng

Từ 0 - 28 ngày sau công độc, ở lô vắc-xin không heo nào có thân nhiệt vượt

quá 400C, riêng ở lô heo đối chứng có một heo (heo 9ĐC3) có biểu hiện sốt khoảng

40,50C ở 9 – 13 dpc sau đó trở lại bình thường. Heo 9ĐC3 này cũng có biểu hiện ho,

xù lông, lông dài, thô ráp, chậm tăng trọng hơn so với tất cả các heo còn lại.

Thể trạng: Heo được đánh giá thể trạng theo thang điểm từ 1 đến 4 theo Đỗ

Tiến Duy và Nguyễn Tất Toàn (2013) và heo được xem là còi khi có khối lượng thấp

hơn 25% so với khối lượng trung bình của nhóm (Kixmöller và ctv, 2008). Kết quả

đánh giá điểm thể trạng được trình bày qua Bảng 3.18.

Ở thời điểm trước tiêm vắc-xin và trước công độc tất cả heo ở lô vắc-xin và lô

đối chứng đều có thể trạng tốt với điểm thể trạng từ 3 đến 4 điểm. Sau công độc 28

ngày, tất cả các heo ở lô vắc-xin vẫn duy trì được thể trạng tốt, riêng nhóm heo đối

chứng có một heo số 9ĐC3 có điểm thể trạng kém nhất (1 điểm) với khối lượng nhỏ

108

hơn 60% khối lượng bình quân của nhóm. Từ kết quả tăng trọng và đánh giá thể trạng

cho thấy tỉ lệ heo còi ở lô đối chứng là 1/4 và trên lô vắc-xin là 0/6.

Bảng 3.18. Khối lượng (kg) và điểm thể trạng heo thí nghiệm 3

Trước tiêm vắc-xin Sau công độc 28 ngày

Lô Heo

TN3 (tiêm vắc-xin)

ĐC3 (đối chứng)

Tăng trọng bình quân hàng ngày (TTHN)

1TN3 2TN3 3TN3 4TN3 5TN3 7TN3 𝐱̅ SD 6ĐC3 8ĐC3 9ĐC3 10ĐC3 𝐱̅ SD Khối lượng (kg) 7,7 8,7 8,1 7,4 7,8 8,4 8,0 0,5 8,2 7,4 8,3 9,4 8,3 0,8 Điểm thể trạng 3 4 3 3 3 4 3 3 3 4 Sau tiêm vắc-xin 28 ngày Điểm Khối thể lượng trạng (kg) 3 20,0 4 23,0 4 22,0 3 18,0 3 20,0 3 20,0 20,5 1,8 4 22,0 3 20,0 3 18,0 4 24,0 21,0 2,6 Khối lượng (kg) 45,0 42,0 45,0 30,0 42,0 39,0 40,5 5,6 40,0 40,0 22,0 45,0 36,8 10,1 Điểm thể trạng 4 3 4 3 4 3 3 3 1 4

Bảng 3.19. Tăng trọng bình quân hàng ngày của heo ở thí nghiệm 3

TTHN (gram)* Lô Số lượng heo 0 – 28 dpv 0 – 28 dpc

6 445,83  49,87 714,29  162,88

4 452,68  76,67 562,50  283,29 TN3 (tiêm vắc-xin) ĐC3 (đối chứng)

P > 0,05 P > 0,05

* TTHN được trình bày ở dạng x̅  SD dpv: ngày sau tiêm vắc-xin, dpc: ngày sau công độc

Từ 0 - 28 dpv nhóm heo đối chứng có TTHN trung bình 452,68  76,67 g cao

hơn một ít so với nhóm heo tiêm vắc-xin 445,83  49,87 g. Ngược lại, từ 0 - 28 dpc,

109

nhóm heo được tiêm vắc-xin PCV2 có TTHN (714,29  162,88 g) cao vượt trội hơn

so nhóm đối chứng TTHN chỉ có 562,50  283,29 g. Tuy nhiên, kết quả xử lý thống

kê cho thấy, không có sự khác biệt về TTHN giữa nhóm heo thí nghiệm và nhóm heo

đối chứng ở 28 ngày sau tiêm vắc-xin và 28 ngày sau công cường độc (Bảng 3.19).

Kết quả này tương tự kết quả nghiên cứu của Yang và ctv (2012) trong nghiên

cứu đánh giá hiệu lực của vắc-xin PCV2 vô hoạt, không có sự khác biệt về TTHN

giữa nhóm heo tiêm vắc-xin và nhóm heo đối chứng ở 28 dpv và 28 dpc. Seo và ctv

(2014b) đánh giá hiệu lực của 4 loại vắc-xin Fostera, Circovac, Circoflex và Porcillis.

Kết quả cho thấy không có sự khác biệt về TTHN giữa nhóm heo tiêm vắc-xin so với

nhóm đối chứng ở giai đoạn 28 dpv và 14 dpc. Ở giai đoạn 2 - 14 tuần sau công cường

độc, nhóm heo tiêm vắc-xin có TTHN cao hơn so với đối chứng (P < 0,05). Tuy

nhiên, tính chung từ lúc tiêm vắc-xin (3 tuần tuổi) đến kết thúc thí nghiệm (25 tuần

tuổi), tuy nhóm heo vắc-xin có TTHN cao hơn (645 ± 41 g đến 654 ± 33 g) so với

nhóm đối chứng (627 ± 35 g), nhưng không khác biệt có ý nghĩa về TTHN giữa các

nhóm heo (P > 0,05) (Seo và ctv, 2014b). Kristensen và ctv (2011) phân tích tổng

hợp của từ 24 nghiên cứu thí nghiệm (study) và 66 thử nghiệm thực địa (trial) về hiệu

quả của các vắc-xin PCV2 thương mại được công bố từ năm 2006 đến 2008. Kết quả

cho thấy việc tiêm vắc-xin PCV2 giúp cải thiện TTHN và giảm tỉ lệ chết. Cụ thể, trên

heo xuất chuồng (finishing pigs) có TTHN tăng 41,5 g và tỉ lệ chết giảm 4,4%, trên

heo từ giai đoạn sau cai sữa đến xuất chuồng (nursery-finishing pigs) có TTHN tăng

33,6 g và tỉ lệ chết giảm 5,4%, trên heo cai sữa thì ít cải thiện hơn với TTHN chỉ tăng

10,6g và tỉ lệ chết chỉ giảm 0,25%. Nếu xét về gốc độ kinh tế, việc gia tăng TTHN

như thế là quá ít để chứng minh hiệu quả của việc tiêm vắc-xin PCV2. Tuy nhiên, với

việc giảm đáng kể tỉ lệ chết trên heo tiêm vắc-xin PCV2 lại đem lại hiệu quả đáng kể

về kinh tế (Kristensen và ctv, 2011).

+ Hiệu lực về cận lâm sàng

Đáp ứng miễn dịch: Kết quả diễn biến đáp ứng kháng thể sau tiêm vắc-xin và

sau công cường độc thí nghiệm 3 được trình bày qua Bảng 3.20 và Biểu đồ 3.10.

110

Bảng 3.20. Diễn biến kháng thể chống PCV2 trên heo ở thí nghiệm 3

Sau tiêm vắc-xin (ngày) Sau công cường độc (ngày)

Lô KH heo Chỉ tiêu 7 14 21 28 0 7 14 21 28 Trước tiêm vắc- xin (4 tuần tuổi)

IPMA 6,64 6,64 8,64 10,64 11,64 13,64 14,64 15,64 9,64

1TN3

2TN3

TN3 3TN3

(tiêm

vắc-xin)

4TN3

5TN3

7TN3 VNT50 OD IgG IPMA VNT50 OD IgG IPMA VNT50 OD IgG IPMA VNT50 OD IgG IPMA VNT50 OD IgG IPMA VNT50 OD IgG 4 0,42 6,64 4 0,38 6,64 4 0,37 6,64 3 0,37 5,64 4 0,23 6,64 4 0,36 4 0,34 6,64 4 0,85 6,64 4 0,79 6,64 3 0,41 5,64 4 0,27 6,64 4 1,09 5 0,75 964 4 1,73 9,64 4 1,51 8,64 3 0,97 9,64 4 0,50 7,64 4 1,61 7 0,98 10,64 8 1,72 10,64 8 1,38 9,64 7 0,67 9,64 6 0,70 10,64 6 1,39 7 2,03 12,64 10 2,30 13,64 8 1,93 11,64 9 1,19 13,64 9 2,08 13,64 9 2,44 9 2,07 13,64 9 2,21 13,64 10 1,80 15,64 9 1,50 15,64 11 2,11 15,64 9 2,23 11 2,02 12,64 10 1,92 15,64 11 1,98 15,64 8 1,24 15,64 10 2,02 15,64 9 2,22 11 2,06 14,64 9 1,94 15,64 11 1,87 15,64 9 1,28 15,64 12 2,03 15,64 11 2,16 6 1,07 10,64 5 1,92 9,64 6 1,30 9,64 6 0,87 8,64 5 0,59 7,64 5 1,48

111

Sau tiêm vắc-xin (ngày) Sau công cường độc (ngày)

Lô KH heo Chỉ tiêu 7 14 21 28 0 7 14 21 28 Trước tiêm vắc- xin (4 tuần tuổi)

6,48 ±0,41a

6,48±0,41a 8,98±0,82a 9,31±1,03a 10,31 ± 0,52a 12,81±0,98a 14,64± 1,10a 14,98±1,21a 15,48±0,41a

IPMA TN3

3,83±0,41a

3,83±0,41a 4,00±0,63a 5,50±0,55a

7,00±0,89a

8,67±1,03a

9,50±0,84a

9,83±1,17a

10,50±1,22a

VNT50

𝐱̅ ± SD

0,35±0,07a

0,62±0,33a 1,18±0,51a 1,21±0,47a

1,14±0,43a

2,00±0,44a

1,99±0,28a

1,90±0,34a

1,89±0,32a

OD IgG

6ĐC3

8ĐC3

ĐC3 (đối chứng) 9ĐC3

10ĐC 3 IPMA VNT50 OD IgG IPMA VNT50 OD IgG IPMA VNT50 OD IgG IPMA VNT50 OD IgG 6,64 3 0,40 6,64 4 0,41 6,64 0 0,22 6,64 4 0,22 6,64 3 0,27 6,64 3 0,30 5,64 0 0,20 6,64 3 0,19 5,64 2 0,18 5,64 2 0,28 5,64 0 0,17 6,64 0 0,17 4,64 0 0,14 4,64 0 0,22 5,64 0 0,15 5,64 0 0,14 4,64 0 0,14 4,64 0 0,23 5,64 0 0,20 5,64 0 0,17 9,64 5 0,80 9,64 6 0,91 6,64 0 0,60 7,64 6 0,35 10,64 8 1,01 10,64 5 1,22 7,64 2 0,67 8,64 8 0,54 11,64 9 1,42 12,64 8 1,66 8,64 3 0,98 10,64 11 1,05 4,64 0 0,17 4,64 0 0,28 5,64 0 0,16 6,64 0 0,17

6,64±0a

6,39±0,50a 5,89±0,50b 5,39±0,96b

5,14±0,58b

8,39±1,50b

9,39±1,50b

10,89±1,71b

IPMA

2,75±1,89a

2,25±1,50a 1,00±1,15b

0b

4,25±2,87b

5,75±2,87b

7,75±3,40a

VNT50 ĐC3 𝐱̅ ± SD

0,31±0,11a

0,24±0,05a 0,20±0,05b 0,20±0,05b

0,16±0,04b

0,18±0,04b

0,66±0,25b

0,86±0,31b

1,27±0,32b

a, b: khác biệt thống kê với P < 0,05

OD IgG

112

14.98a 15.48a

)

Công độc

14.64a

12.81a

2 g o l (

10.31a

Tiêm vắc-xin

10.89b

9.31a

8.98a

9.39b

6.48a

8.39b

6.48a

6.64a

5.14b

6.39a

5.89b

5.14b

5.39b

TN3 (IPMA) ĐC3 (IPMA)

A M P I á i g u ệ i H

18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

Ngày

28 0

Sau tiêm vắc-xin

7 21 14 Sau công cường độc

)

TN3 (VNT50) ĐC3 (VNT50)

10.50a

Công độc

9.83a

9.50a

2 g o l (

8.67a

Tiêm vắc-xin

7.00a

7.75a

5.50a

5.75b

4.00a

4.25b

3.83a

2.75a

1.00b

0 5 T N V á i g u ệ i H

2.25a

0.00b

Ngày

28 0

Sau tiêm vắc-xin

Sau công cường độc

3.0

)

2.5

TN3 (OD) ĐC3 (OD)

D O

1.99a

2.00a

Công độc

1.89a

1.90a

2.0

1.5

Tiêm vắc-xin

1.27b

1.21a

1.18a

1.14a

0.86b

1.0

0.66b

0.62a

0.35a

0.20b

0.18b

0.5

0.16b

0.24a

( g n a u q ộ đ t ậ M

0.31a

0.0

Ngày

28 0

Sau tiêm vắc-xin

Sau công cường độc

Biểu đồ 3.10. Diễn biến đáp ứng kháng thể chống PCV2 trên heo thí nghiệm 3. (A) Kháng thể tổng công. (B) Kháng thể trung hòa. (C) Mật độ quang (OD) ELISA phát hiện kháng thể IgG. TN3: lô thí nghiệm 3, tiêm vắc-xin; ĐC3: lô đối chứng 3. a, b: khác biệt thống kê với P < 0,05

113

Kháng thể tổng cộng: có sự chuyển biến kháng thể tổng cộng trên nhóm heo

tiêm vắc-xin PCV2 thử nghiệm từ 6,48  0,41log2 ở 0 dpv lên 8,98  0,82log2 lúc 14

dpv và lên đến 10,31  0,52log2 ở 28 dpv. Trong khi đó, tất cả heo ở lô đối chứng có

hiệu giá kháng thể (HGKT) tổng cộng giảm từ 6,64log2 xuống còn 5,14  0,58log2 ở

28 dpv. Sau công cường độc, HGKT tổng cộng của heo ở lô tiêm vắc-xin tăng mạnh

ở 7 dpc, tiếp tục tăng và duy trì ở mức cao từ 12,81  0,98log2 đến 15,48  0,41log2

đến kết thúc thí nghiệm lúc 28 dpc. Điều này có thể do các heo này được tiếp xúc với

kháng nguyên PCV2 lần 2 nên đáp ứng miễn dịch diễn ra nhanh và mạnh hơn. Ở lô

đối chứng, bắt đầu có sự chuyển đổi kháng thể tổng cộng xảy ra vào thời điểm 14 dpc

sau đó HGKT tiếp tục tăng nhưng không tăng nhanh và mạnh như trên lô tiêm vắc-

xin (Bảng 3.20, Biểu đồ 3.10A).

Kháng thể trung hòa: heo sau khi tiêm vắc-xin 21 ngày mới bắt đầu có sự

chuyển đổi rõ ràng từ 3,83  2,75log2 lên 5,50  0,55log2, so với kháng thể tổng cộng

và kháng thể IgG thì kháng thể NA xuất hiện muộn hơn. Sau khi công cường độc,

kháng thể NA ở lô heo được tiêm vắc-xin tiếp tục tăng trung bình lên đến 10,50 

1,22log2 ở 28 dpc. Trong khi đó ở lô đối chứng phải đến 14 ngày sau công độc mới

có sự chuyển đổi kháng thể NA (từ 0 lên 4,25  2,87log2), sau đó tăng nhanh lên đến

7,75  3,40log2 ở 28 dpc, nhưng hiệu giá này vẫn thấp hơn so với lô heo tiêm vắc-xin

(Bảng 3.20 và Biểu đồ 3.10B).

Kháng thể IgG: cũng có xu hướng diễn biến như kháng thể tổng cộng và kháng

thể trung hòa. So với kháng thể tổng cộng và kháng thể trung hòa, sự chuyển đổi

kháng thể IgG ở lô heo tiêm vắc-xin xảy ra khá sớm ở 7 dpv, trong khi đó ở lô đối

chứng IgG âm tính đến 28 dpv. Sau công cường độc, IgG tăng nhanh từ 7 dpc và duy

trì mức cao đến 28 dpc ở lô tiêm vắc-xin, còn ở lô đối chứng mãi đến 14 dpc mới có

sự chuyển đổi kháng thể IgG với mức đáp ứng thấp hơn so với lô tiêm vắc-xin (Bảng

3.20 và Biểu đồ 3.10C).

Kết quả xử lý thống kê so sánh HGKT tổng cộng IPMA và OD (ELISA phát

hiện IgG) cho thấy không có sự khác biệt về HGKT IPMA và OD giữa lô thí nghiệm

và lô đối chứng thời điểm 0 và 7 dpv (P > 0,05). Tuy nhiên, có sự khác biệt rất có ý

114

nghĩa về HGKT IPMA và OD phát hiện IgG giữa 2 lô từ thời điểm 14 dpv đến kết

thúc thí nghiệm lúc 28 dpc (P < 0,01). Ngoài ra, không có sự khác biệt về trung bình

hiệu giá kháng thể NA giữa lô tiêm vắc-xin và lô đối chứng ở các thời điểm 0 dpv, 7

dpv và 28 dpc (P > 0,05). Các thời điểm còn lại có sự khác biệt có ý nghĩa về trung

bình hiệu giá kháng thể NA giữa 2 lô (P < 0,05).

Nhìn chung, heo tiêm vắc-xin PCV2 thử nghiệm trong thí nghiệm 3 có sự

chuyển đổi kháng thể từ 14 – 21 dpv. Kết quả này tương tự kết quả nghiên cứu của

Yang và ctv (2012) và Huỳnh Thị Mỹ Lệ và ctv (2016), có sự chuyển đổi kháng thể

ở lô tiêm vắc-xin ở thời điểm 14 – 21 dpv (phát hiện bằng kỹ thuật ELISA).

Sau công cường độc, nhóm heo đối chứng trong thí nghiệm 3 bắt đầu có sự

chuyển đổi kháng thể ở 14 dpc. Tuy nhiên, hàm lượng các loại kháng thể thấp hơn so

với heo tiêm vắc-xin. Riêng heo 9ĐC3, có biểu hiện lâm sàng PMWS, cũng có sự

chuyển đổi kháng thể trung hòa ở 21 -28 dpc, tuy nhiên, hiệu giá VNT50 rất thấp, chỉ

đạt 2 – 3log2. Kết quả này phù hợp với nhận định của một số tác giả khi nghiên cứu

khả năng gây bệnh của PCV2 trên heo. Những heo gây nhiễm với PCV2 có biểu hiện

PMWS có sự chuyển đổi huyết thanh muộn hơn so với heo không có biểu hiện PMWS

(Bolin và ctv, 2001; Rovira và ctv, 2002; Okuda và ctv, 2003). Hiệu giá kháng thể

tổng cộng trên heo có biểu hiện PMWS thấp hơn so với heo nhiễm PCV2 tiềm ẩn

(Meerts và ctv, 2006). Kháng thể trung hòa chống PCV2 không có, hoặc có với lượng

rất thấp trên các heo gây nhiễm thí nghiệm có biểu hiện PMWS (Meerts và ctv, 2006).

Vì thế, nhóm tác giả này đưa ra giả thuyết rằng trên các heo mắc PMWS có lẽ không

thể tạo được kháng thể chống lại các quyết định kháng nguyên trung hòa của vi-rút.

Còn theo Fort và ctv (2007), đáp ứng miễn dịch dịch thể trên heo mắc PMWS yếu,

đặc biệt là những heo này thiếu khả năng đáp ứng kháng thể trung hòa chống PCV2.

Ở thí nghiệm 3, heo được tiêm vắc-xin 1 lần (lúc 28 ngày tuổi) có sự chuyển

đổi kháng thể IgG, tổng cộng và kháng thể trung hòa lần lượt vào các ngày 7, 14 và

21 dpv. Trong khi đó, ở thí nghiệm 2, phải đến 7 ngày sau tiêm vắc-xin lần 2 mới

xuất hiện sự chuyển đổi kháng thể tổng cộng và kháng thể trung hòa, mặc dù tiêm

vắc-xin lúc 49 ngày. Điều này có thể do lượng vi-rút kháng nguyên trong vắc-xin thử

nghiệm ở thí nghiệm 2 chỉ có 4,5log10 TCID50/liều, trong khi đó ở thí nghiệm 3, vắc-

115

xin thử nghiệm được chuẩn bị với hàm lượng vi-rút kháng nguyên lên đến 6,0log10

TCID50/liều. Kết quả cũng tương tự như các thí nghiệm của Zhu và ctv (2016), đánh

giá đáp ứng miễn dịch đối với PCV2 trên các heo được tiêm vắc-xin tái tổ hợp với

lượng kháng nguyên tái tổ hợp 200 µg và 500 µg/liều. Kết quả heo được tiêm 500 µg

có đáp ứng miễn dịch sớm và mạnh hơn so với heo được tiêm 200 µg (Zhu và ctv,

2016). Điều này cho thấy, lượng kháng nguyên có trong 1 liều vắc-xin có thể ảnh

hưởng đến đáp ứng miễn dịch sau tiêm phòng vắc-xin PCV2.

Số lượng bạch cầu

Bảng 3.21. Số lượng bạch cầu (BC/mm3máu) ở heo sau công cường độc ở thí nghiệm 3

Lô Heo

TN3 (tiêm vắc-xin) 0 21.050 18.050 15.900 14.150 21.950 23.900 Sau công cường độc (ngày) 14 12.300 11.450 24.500 22.400 16.950 16.550 21 17.150 19.700 17.350 16.400 23.750 18.300 7 17.400 16.750 19.650 14.900 15.550 16950 28 14.300 23150 18.550 18.050 22.500 17.450

19.167 3.763 20.000 14.500 24.000 13.250 16.867 1.652 20.100 19.450 9650 14500 17.358 5.249 9.050 17.050 9.300 19.100 18.775 2.689 9.000 12.800 9.400 13.300 19.000 3319 9.100 10.450 9.050 16.000 ĐC3 (đối chứng)

1TN3 2TN3 3TN3 4TN3 5TN3 7TN3 𝐱̅ SD 6ĐC3 8ĐC3 9ĐC3 10ĐC3 𝐱̅ SD 17.938 4.993 15925 4.874 13.625 5.207 11.125 2.238 11.150 3.298

P > 0,05 P > 0,05 P > 0,05 P < 0,01 P < 0,01

Kết quả số lượng bạch cầu trên heo sau công cường độc ở thí nghiệm 2 được

trình bày qua Bảng 3.21. Không có sự suy giảm lượng bạch cầu trên nhóm heo tiêm

vắc-xin. Trong khi đó, có sự giảm nhẹ số lượng bạch cầu trên các heo 6ĐC3 và 9ĐC3

ở nhóm đối chứng (biến động từ 9.050 đến 9.650 BC/mm3 máu) tương tự như thí

nghiệm gây nhiễm chủng NAVET-DongNai2/2009 trên heo được trình bày ở phần

3.4. Không có sự khác biệt về số lượng bạch cầu giữa nhóm heo tiêm vắc-xin và

nhóm đối chứng ở các thời điểm 0, 7 và 14 dpc. Tuy nhiên, ở các thời điểm 21 và 28

116

dpc, số lượng bạch cầu ở nhóm heo đối chứng giảm thấp hơn so với nhóm tiêm vắc-

xin (P < 0,01). Theo Mạc Thị Yến (2014), số lượng bạch cầu giảm trên heo mắc

PMWS tự nhiên (11,83 ± 0,49 nghìn/mm3 máu) thấp hơn so với heo khỏe mạnh (15,25

± 0,48 nghìn/mm3 máu). Ngoài ra, lượng bạch cầu đa nhân trung tính của heo bệnh

cao hơn heo khỏe, ngược lại lượng tế bào lym-phô lại giảm trên heo bệnh (Mạc Thị

Yến, 2014).

Sự hiện diện của ADN-PCV2

Sự hiện diện của ADN-PCV2 trong huyết thanh, mẫu ngoáy mũi và mẫu ngoáy

trực tràng trên heo sau công cường độc được xác định bằng phương pháp PCR (Bảng

3.22 và Biểu đồ 3.11). Ở thời điểm trước tiêm vắc-xin và trước khi công cường độc,

tất cả heo ở lô được tiêm vắc-xin và lô đối chứng đều âm tính với ADN-PCV2 trong

huyết thanh, mẫu ngoáy mũi, mẫu ngoáy trực tràng.

Bảng 3.22. Phát hiện ADN-PCV2 trong huyết thanh, mẫu ngoáy mũi và mẫu

ngoáy trực tràng trên heo sau công cường độc ở thí nghiệm 3

Lô 0 7 21 28 KH heo

- - + - - - + TN3 (tiêm vắc-xin) - - - - - - + + - + + - - + + + - + + + - - - - - - - - - - Sau công cường độc (ngày) 14 H M P H M P H M P H M P H M P - - - - - - - + - - - - - + + - - + - - + + - - + - - - - + - - - + + - - - - - + - - - - - - + - - - + -

0 0 0 4 4 2 0 3 3 1 2 2 2 1 0

- - - - - - - - - + + + + + + + + + + - + - + + + + + + + + + - - - - + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + - ĐC3 (đối chứng)

H: huyết thanh, M: mẫu ngoáy mũi, P: mẫu ngoáy trực tràng

0 0 0 4 4 4 4 4 4 4 4 4 3 2 2 1TN3 2TN3 3TN3 4TN3 5TN3 7TN3 Tổng (+) 6ĐC3 8ĐC3 9ĐC3 10ĐC3 Tổng (+)

Sau công cường độc, ở nhóm heo được tiêm vắc-xin tình trạng vi-rút huyết

qua các thời điểm khảo sát như sau: 7 dpc với tỉ lệ 66,67% (4/6 heo), đến 14 dpc

117

không phát hiện sự hiện diện của ADN-PCV2 trong huyết thanh (0/6 heo), 21 dpc là

16,67% (1/6 heo) và 28 dpc là 33,33% (2/6 heo). Cụ thể, 4 heo có vi-rút huyết ở thời

điểm 7 dpc và sau đó không phát hiện sự hiện diện ADN-PCV2 trong huyết thanh

của 4 heo này; 1 heo khác (heo 7TN3) có vi-rút huyết ở 21 dpc, đặc biệt có 1 heo

(heo 1TN3) mãi đến 28 dpc mới xuất hiện tình trạng vi-rút huyết. Trong khi đó, nhóm

heo đối chứng sau công cường độc vi-rút huyết khá sớm 7 dpc với tỉ lệ 100% (4/4

heo) và kéo dài đến 28 dpc với tỉ lệ 75% (3/4 heo). Điều này có nghĩa là vắc-xin thử

nghiệm có khả năng làm giảm tình trạng vi-rút huyết sau khi công độc ở heo được

120

)

100

tiêm vắc-xin so với heo không được tiêm vắc-xin.

2 g o l (

%

ệ l ỉ

T

0 5 T N V á i g u ệ i H

0 dpc

7 dpc

14 dpc

21 dpc

28 dpc

TN3 (M) ĐC3 (P)

TN3 (H) ĐC3 (M) TN3 (VNT50)

ĐC3 (H) TN3 (P) ĐC3 (VNT50)

Biểu đồ 3.11. Tỉ lệ phát hiện ADN-PCV2 trong huyết thanh, mẫu ngoáy mũi

và mẫu ngoáy trực tràng, hiệu giá kháng thể trung hòa chống PCV2 ở heo sau công cường độc thí nghiệm 3. TN3: lô thí nghiệm, tiêm vắc-xin; ĐC3: lô đối chứng, H: huyết thanh, M: mẫu ngoáy mũi, P: mẫu ngoáy trực tràng

Tỉ lệ dương tính ADN-PCV2 trong mẫu ngoáy mũi ở lô heo tiêm vắc-xin cao

nhất lúc 7 dpc với 4/6 heo chiếm tỉ lệ 66,67%, sau đó tỉ lệ này giảm dần và chỉ còn

16,67% (1/6 heo) lúc 28 dpc. So với mẫu ngoáy mũi thì mẫu ngoáy trực tràng có tỉ lệ

dương tính ADN-PCV2 thấp hơn với tỉ lệ cao nhất 50% lúc 14 dpc và đến 28 dpc

không phát hiện ADN-PCV2 trong mẫu ngoáy trực tràng. Trong khi đó ở nhóm heo

118

đối chứng, 100% (4/4 heo) dương tính với ADN-PCV2 trong mẫu ngoáy mũi và mẫu

ngoáy trực tràng vào các thời điểm 7, 14 và 21 dpc; đến 28 dpc tỉ lệ này giảm xuống

còn 50% (2/4 heo). Điều này cho thấy, vắc-xin thử nghiệm có khả năng làm giảm tỉ

lệ heo bài thải vi-rút qua mũi và qua phân sau công cường độc ở heo được tiêm vắc-

xin so với nhóm heo đối chứng không được tiêm vắc-xin. Kết quả này phù hợp với

nhận định của một số tác giả như Fort và ctv (2009b), Seo và ctv (2014b), Fraile và

ctv (2012a). Việc tiêm vắc-xin PCV2 trên heo không những làm giảm tình trạng vi-

rút huyết, cũng như giai đoạn vi-rút huyết ngắn mà còn giúp làm giảm vi-rút bài thải

qua mũi và qua phân trong điều kiện thí nghiệm (Fort và ctv, 2009b; Seo và ctv, 2014b),

hay làm giảm bài thải vi-rút qua phân trong điều kiện thực địa (Fraile và ctv, 2012a).

Tại thời điểm công cường độc, heo tiêm vắc-xin có hiệu giá kháng thể trung

hòa trung bình là 7,0  0,89log2. Sau công cường độc, có sự gia tăng kháng thể trung

hòa và hiệu giá này đạt 10,50  1,22log2 lúc 28 dpc, cùng với đó là tình trạng vi-rút

huyết ngắn hoặc trì hoãn sự xuất hiện tình trạng vi-rút huyết, cũng như giảm tỉ lệ heo

bài thải vi-rút qua mũi và qua phân. Ngược lại, ở nhóm heo đối chứng, tại thời điểm

0 dpc không có kháng thể trung hòa, 100% (4/4) heo có vi-rút huyết và bài thải vi-rút

qua mũi và qua phân ở giai đoạn 7 – 21 dpc, đến 28 dpc khi lượng kháng thể trung

hòa tăng lên 7,75  3,40log2 thì heo có vi-rút huyết giảm xuống còn 75% (3/4) và bài

thải vi-rút qua mũi và phân xuống còn 50% (2/4) (Biểu đồ 3.11). Điều này cho thấy,

việc tiêm vắc-xin giúp hạn chế sự nhân lên của vi-rút từ đó giúp làm giảm bài thải vi-

rút như nhận định của Fort và ctv (2009b).

Điều đáng lưu ý là heo 9ĐC3, nhóm heo đối chứng trong thí nghiệm 3, có hiệu

giá NA rất thấp (3log2) ở 28 dpc (Bảng 3.20). Ngoài ra, heo này còn có các biểu hiện

triệu chứng sốt, ho, xù lông, còi, có sự hiện diện của vi-rút PCV2 trong các mô khi

mổ khảo sát lúc 28 dpc với hiệu giá rất cao (Bảng 3.24). Điều này phù hợp với các

kết quả nghiên cứu của Meerts và ctv (2005b; 2006) và Fort và ctv (2007) về mối

tương quan giữa kháng thể trung hòa và sự nhân lên của PCV2 đã được công bố trước

đây. Cụ thể, Meerts và ctv (2005b) cho rằng, có mối liên quan giữa việc thiếu hụt

kháng thể trung hòa và việc gia tăng sự nhân lên của PCV2. Cũng chính nhóm tác giả

này đã chứng minh mối quan hệ giữa đáp ứng miễn dịch trung hòa kém và sự tiến

119

triển của PMWS (Meerts và ctv, 2006). Tương tự, Fort và ctv (2007) cũng đã xác

định mối tương quan nghịch giữa hiệu giá kháng thể NA và lượng vi-rút trong huyết

thanh, mặc dù giá trị P chỉ gần đến mức có ý nghĩa (P = 0,07). Có sự tồn tại đồng thời

vừa kháng thể NA, vừa ADN-PCV2 ở một số heo mắc PMWS hoặc nhiễm PCV2

nhưng không có biểu hiện PMWS. Điều này cho thấy, chỉ đơn độc kháng thể NA có

lẽ không đủ khả năng để loại trừ hoàn toàn PCV2 (Fort và ctv, 2007). Có thể là cần

sự kết hợp đồng thời giữa miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào trong việc loại trừ

PCV2 như nhận định của Fort và ctv (2009b). Việc PCV2 giảm trong máu xảy ra đồng

thời với việc xuất hiện cả kháng thể đặc hiệu, đặc biệt là kháng thể trung hòa, và IFN-

-SC đặc hiệu PCV2 (Fort và ctv, 2009b). Vì điều kiện không cho phép nên chúng tôi

chưa khảo sát đáp ứng miễn dịch trung gian tế bào trên heo trong nghiên cứu này.

Sự hiện diện vi-rút trong các loại mô (lách, hạch, a-mi-đan và phổi) được xác

định bằng phương pháp PCR và chuẩn độ xác định hiệu giá vi-rút. Kết quả được trình

bày qua Bảng 3.23. Các heo đối chứng đặc biệt là heo 9ĐC3 có hàm lượng vi-rút trong

các mô bạch huyết và phổi cao hơn so với các heo được tiêm vắc-xin. Kết này tương

tự như ghi nhận của Okuda và ctv (2003), trên các heo được gây nhiễm PCV2, hàm

lượng vi-rút khá cao ở hầu hết các mô của những heo có biểu hiện lâm sàng bệnh.

Bảng 3.23. Hiệu giá vi-rút ở mô heo thí nghiệm 3, mổ khảo sát lúc 28 dpc

Loại mô (log10 TCID50/0,1g mô) Lô Heo

4TN3* Hạch KL Lách KL A-mi-đan KL Phổi KL

7TN3 2,50 2,50 2,00 KPH**

6ĐC3 3,33 3,00 2,67 2,00

* âm tính PCR, KL: không làm ** KPH: dương tính PCR nhưng chuẩn độ không phát hiện tế bào nhiễm vi-rút

9ĐC3 5,33 4,67 5,00 5,33 TN3 (tiêm vắc-xin) ĐC3 (đối chứng)

Bệnh tích: Lúc 28 ngày sau công độc, chọn ở mỗi lô 2 heo có khối lượng và

điểm thể trạng thấp ở mỗi lô để mổ khảo sát bệnh tích: heo 4TN3 và 7TN3 ở nhóm

heo tiêm vắc-xin và heo 6ĐC3 và 9ĐC3 ở nhóm heo đối chứng.

120

Hình 3.14. Các bệnh tích đại thể trên heo sau công cường độc 28 ngày

Heo tiêm vắc-xin: (A): hạch bẹn, (B): phổi;

Heo đối chứng: (C) hạch bẹn sưng, nhạt màu, thủy thủng, (D) phổi viêm kẽ,

dai không xẹp, (E) hạch màng treo ruột sưng, (F) hạch phổi sưng lớn xuất huyết

121

Hình 3.15. Các bệnh tích vi thể trên heo sau công cường độc 28 ngày (HE, 400X)

Heo tiêm vắc-xin: (A): nốt bạch huyết, (E): phổi. Heo đối chứng: (B): Suy giảm bạch cầu và thay thế mô bào nhẹ ở nang bạch huyết; (C): Tế bào khổng lồ đa nhân ở nang bạch huyết, (D): Suy giảm bạch cầu và thay thế mô bào từ trung bình đến nặng ở nang bạch huyết, (F): Viêm phổi kẽ.

122

Kết quả khảo sát bệnh tích đại thể cho thấy, heo 4TN3 và 7TN3 ở nhóm tiêm

vắc-xin không có biểu hiện bệnh tích (Hình 3.14A, B). Trong khi đó, heo 9ĐC3 ở

nhóm đối chứng có các biểu hiện bệnh tích như hạch bẹn sưng, nhạt màu, thủy thủng,

hạch phổi sưng lớn xuất huyết, hạch màng treo ruột sưng, viêm phổi kẽ, phổi không

xẹp (Hình 3.14C, D, E, F); heo 6ĐC3 có hạch bẹn hơi sưng và phổi có đốm nâu. Bệnh

tích đại thể của PMWS phổ biến chính là hạch lym-phô có biến đổi rõ rệt, các hạch

bẹn, màng treo ruột, phế quản, hạch trung thất sưng to, vết cắt có màu trắng và đồng

nhất. Phổi không xẹp và có đốm nâu (Opriessnig và ctv, 2007; Segalés, 2012). Thực

tế, kết quả khảo sát của Lâm Thị Thu Hương (2012) cho thấy các bệnh tích sưng hạch

bẹn cạn, sưng hạch màng treo ruột, phổi không xẹp hoặc viêm phổi kẽ xuất hiện trên

50% số ca heo mắc PMWS.

Kết quả khảo sát bệnh tích vi thể cho thấy, hai heo 4TN3 và 7TN3 được tiêm

vắc-xin sau công độc không có biểu hiện bệnh tích ở các mô bạch huyết như hạch

bẹn cạn, hạch ruột, hạch phổi, lách và phổi (Hình 3.15A, E). Trong khi đó, 2 heo đối

chứng 6ĐC3 và 9ĐC3 có các biểu hiện bệnh tích như các nốt bạch huyết có sự suy

giảm bạch cầu và thay thế mô bào ở mức trung bình (heo 6ĐC3), đến nặng (heo

9ĐC3), ở hạch bẹn cạn, hạch phổi, hạch ruột, a-mi-đan, lách, cùng với sự hiện diện

của tế bào đa nhân khổng lồ ở nang bạch huyết, và viêm phổi kẽ (Hình 3.15B, C, D,

F). Đây được xem là các bệnh tích vi thể điển hình ở heo mắc PMWS (Opriessnig và

ctv, 2007; Segalés, 2012).

Các nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả của việc tiêm vắc-xin PCV2 trên heo

giúp giảm đáng kể bệnh tích vi thể ở các mô bạch huyết (Opriessnig và ctv, 2009a;

Trần Thị Dân và ctv, 2010; Seo và ctv, 2014b). Theo Trần Thị Dân và ctv (2010),

bệnh tích ở các hạch của heo không tiêm vắc-xin ngừa PCV2 xuất hiện nhiều hơn ở

heo được tiêm 2 liều vắc-xin ngừa PCV2, sự khác biệt này rõ nhất về bệnh tích đại

thể lẫn vi thể ở hạch bẹn và hạch ruột.

Kết hợp các kết quả thu được về thể trạng, tăng trọng, sự hiện diện của vi-rút

kết hợp với các bệnh tích đặc trưng ở 28 dpc cho thấy, heo 9ĐC3 ở lô đối chứng mắc

PMWS theo tiêu chí đánh giá của Sorden (2000). Như vậy tỉ lệ heo mắc PMWS sau

công độc trên lô vắc-xin là 0/6 và ở lô đối chứng 1/4.

123

Nhìn chung, heo sau tiêm vắc-xin và công cường độc đều khỏe mạnh, tăng

trọng bình thường, có đáp ứng miễn dịch chống PCV2 tốt, không có biểu hiện lâm

sàng cũng như bệnh tích PMWS, có thời gian vi-rút huyết ngắn, bài thải vi-rút qua

phân và dịch tiết mũi với tỉ lệ thấp hơn so với heo đối chứng. Điều này chứng tỏ vắc-

xin thử nghiệm này đạt yêu cầu về an toàn và hiệu lực trên heo.

124

Chương 4

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

Xác định genotype và phân tích tương đồng di truyền PCV2

PCV2 lưu hành ở 13 tỉnh thành Việt Nam bao gồm genotype 2b, 2d và (PCV2-

Re (2h), trong đó phổ biến là PCV2b (24/48) và PCV2d (16/48), đặc biệt là sự lưu

hành vượt trội của PCV2d-2 (15/16). Có sự lưu hành đồng thời nhiều genotype PCV2

trên cùng địa phương.

Các chủng PCV2 xếp trong cùng genotype có mức độ tương đồng về

nucleotide ở ORF2 khá cao từ 98,7% - 100% đối với PCV2b, từ 98,5 - 100% đối với

PCV2d-2 và từ 98,7% đến 100% đối với PCV2-Re (2h).

Khoảng cách di truyền giữa genotype khá cao, biến động từ 0,0595 ± 0,0096

đến 0,0663 ± 0,0102.

Phân lập và khảo sát đặc tính sinh học một số chủng PCV2

Phân lập được 18 chủng PCV2 từ 21 mẫu bệnh phẩm dương tính PCV2 - thu

nhận từ heo có biểu hiện triệu chứng và bệnh tích bệnh do circovirus (PCVD). Hiệu giá

vi-rút phân lập đạt được dao động từ 1,67 đến 5,50log10 TCID50/ml ở lần tiếp đời thứ

3. Phân lập PCV2 từ mẫu hạch đạt tỉ lệ dương tính cao hơn so với các loại mẫu bệnh

phẩm khác.

PCV2 thuộc các genotype khác nhau như chủng NAVET-DongNai2/2009

(PCV2b), NAVET-LongAn2/2012 (PCV2d) và NAVET-vietnam3/2004 (PCV2-Re

(2h)) có tương đồng kháng nguyên cao (R >70%).

Nghiên cứu thử nghiệm vắc-xin PCV2

Binary ethylenimine (BEI) với nồng độ 3 mM, ở nhiệt độ 370C có thể vô hoạt

hoàn toàn PCV2 sau 24 giờ, với tốc độ vô hoạt khác nhau tùy từng chủng.

125

Có sự chuyển đổi kháng thể chống PCV2 trên heo ở thời điểm 14 - 21 ngày

sau tiêm vắc-xin vắc-xin vô hoạt nhũ dầu thử nghiệm từ chủng phân lập NAVET-

DongNai2/2009 (PCV2b).

Vắc-xin PCV2 thử nghiệm đạt yêu cầu về an toàn, có khả năng kích thích đáp

ứng miễn dịch cũng như bảo hộ heo về mặt lâm sàng chống lại PCV2b, làm giảm sự

nhân lên và bài thải PCV2 ở heo được tiêm vắc-xin và công cường độc.

Đề nghị

Tiếp tục nghiên cứu đánh giá hiệu lực của vắc-xin vô hoạt nhũ dầu từ chủng

NAVET-DongNai2/2009 (PCV2b) trong thực địa.

Nếu có điều kiện nên nghiên cứu khả năng gây đáp ứng miễn dịch trung gian

tế bào trên heo của vắc-xin vô hoạt nhũ dầu từ chủng NAVET-DongNai2/2009.

Tiếp tục nghiên cứu chế tạo vắc-xin PCV2 đa giá chứa cùng lúc nhiều chủng

PCV2 và nhiều genotype khác nhau.

126

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ

1. Lê Thị Thu Phương, Nguyễn Ngọc Hải, Nguyễn Thị Thu Hồng, Quách Vô Ngôn, Nguyễn Ngọc Hồng Phúc, Trần Xuân Hạnh, Nguyễn Văn Dung, 2018. Phân tích đặc điểm di truyền ORF2 của porcine circovirus type 2 (PCV2) thu thập ở một số tỉnh thành Việt Nam giai đoạn từ 2007 đến 2016. Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, tập XXV, số 3, trang 23-31.

2. Lê Thị Thu Phương, Nguyễn Ngọc Hải, Nguyễn Thị Thu Hồng, Đặng Hùng, Quách Vô Ngôn, Nguyễn Ngọc Hồng Phúc, Nguyễn Tấn Liêm, Trần Xuân Hạnh, Nguyễn Văn Dung, 2018. Phân lập và xác định đặc tính sinh học của một số chủng porcine circovirus type 2 (PCV2) từ heo nuôi tại khu vực phía Nam Việt Nam. Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển, tập 17, số 4 (2018), trang 68-75.

127

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Aarthi D., Ananda Rao K., Robinson R. and Srinivasan V. A., 2004. Validation of binary ethyleneimine (BEI) used as an inactivant for foot and mouth disease tissue culture vaccine. Biologicals 32(3): 153–156.

2. Abu Elzein E. M. E., Housawi F. M. T., Al-Afaleq A. I. and Ibrahim A. O., 2004. Protection of goats, with a sheeppox vaccine, against a virulent field capripoxvirus with high affinity to goats. Scientific Journal of King Faisal University 5 (2):263 – 274.

3. Albina E., Truong C., Hutet E., Blanchard P., Cariolet R., L’Hospitalier R., Mahe D., Allee C., Morvan H., Amenna N., Le Dimna M., Madec F. and Jestin A., 2001. An experimental model for post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) in growing piglets. Journal of Comparative Pathology 125: 292–303.

4. Allan G.M., Phenix K., Todd D. and McNulty M., 1994. Some biological and physico-chemical properties or porcine circovirus. Journal of Veterinary Medicine B 41: 17–26.

5. Allan G.M., Kennedy S., McNeilly F., Foster J.C., Ellis J.A., Krakowka S.J., Meehan B.M. and Adair B.M. 1999. Experimental reproduction of severe wasting disease by co-infection of pigs with porcine circovirus and porcine parvovirus. Journal of Comparative Pathology 121: 1-11.

6. Allan G.M. and Ellis J.A., 2000. Porcine circoviruses: a review. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 12: 3–14.

7. Allan G.M., McNeilly F., McNair I., Curran M.D., Walker I., Ellis J., Konoby C., Kennedy S. and Meehan B., 2000. Absence of evidence for porcine circovirus type 2 in cattle and humans, and lack of seroconversion or lesions in experimentally infected sheep. Archives of Virology 145: 853–857.

8. Allan G.M., Krakowka S.J. and Ellis J.A., 2002. PCV2: ticking time bomb? Pig Progress 18:14–15.

9. Allan G., Krakowka S., Ellis J. and Charreyre C., 2012. Discovery and evolving history of two genetically related but phenotypically different viruses porcine circoviruses 1 and 2. Virus Research 164 (1-2): 4–9.

10. Andraud M., Grasland B., Durand B., Cariolet R., Jestin A., Madec F. and Rose N., 2008. Quantification of porcine circovirus type 2 (PCV-2) within- and between-pen transmission in pigs. Veterinary Research 39: 43.

incomplete neutrolization

11. Archetti I.M. D. and Horsfall F.L.Jr., 1950. Persistant antigenic variation influanza a viruses after in ovo with heterologous immune serum. Journal of Experimental Medicine 92 (5): 441 – 462.

128

12. Aucouturier J., Dupuis L. and Ganne V., 2001. Adjuvants designed for veterinary and human vaccines. Vaccine 19: 2666–2672.

13. Bahnemann H.G., 1975. Binary ethyleneimine as an inactivant for foot nad mouth disease virus and its application for vaccine production. Archives of Virology 47:47-56.

14. Bahnemann H.G., 1990. Inactivation of viral antigens for vaccine preparation with particular reference to the application of binary ethylenimine. Vaccine 8: 299-303.

15. Balasch M., Segalés J., Rosell C., Domingo M., Mankertz A., Urniza A. and Plana-Durán J., 1999. Experimental inoculation of conventional pigs with tissue homogenates from pigs with post-weaning multisystemic wasting syndrome. Journal of Comparative Pathology 121: 139–148.

16. Balmelli C., Steiner E., Moulin H., Peduto N., Herrmann B., Summerfield A. and McCullough K., 2011. Porcine circovirus type 2 DNA influences cytoskeleton rearrangements in plasmacytoid and monocyte-derived dendritic cells. Immunology 132: 57–65.

17. Bao F., Mi S., Luo Q., Guo H., Tu C., Zhu G. and Gong W., 2017. Retrospective study of porcine circovirus type 2 infection reveals a novel genotype PCV2f. Transboundary and Emerging Diseases 65 (2): 432–440.

18. Baumann A., McCullough K.C. and Summerfield A., 2013. Porcine circovirus type 2 stimulates plasmacytoid dendritic cells in the presence of IFN-gamma. Veterinary Immunology and Immunopathology 156 (3-4): 223–228.

19. Beach N.M., Ramamoorthy S., Opriessnig T., Wu S.Q. and Meng X., 2011. Novel chimeric porcine circovirus (PCV) with the capsid gene of the emerging PCV2b subtype cloned in the genomic backbone of the non-pathogenic PCV1 is attenuated in vivo and induces protective and cross-protective immunity against PCV2b and PCV2a subtypes in pigs. Vaccine 29 (2): 221–232.

20. Biagini P., Gallian P., Attoui H., Cantaloube J.F., De Micco P. and De Lamballerie X., 1999. Determination and phylogenetic analysis of partial sequences from TT virus isolates. Journal of General Virology 80: 419-424.

21. Blanchard P., Mahe D., Cariolet R., Keranflec'h A., Baudouard M.A., Cordioli P., Albina E. and Jestin A., 2003. Protection of swine against post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) by porcine circovirus type 2 (PCV2) proteins. Vaccine 21: 4565-4575.

22. Bolin S.R., Stoffregen W.C., Nayar G.P. and Hamel A.L., 2001. Postweaning multisystemic wasting syndrome induced after experimental inoculation of cesarean-derived, colostrum-deprived piglets with type 2 porcine circovirus. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 13: 185–194.

129

23. Breitbart M., Delwart E., Rosario K., Segales J., Varsani A. and ICTV Report Consortium, 2017. ICTV Virus taxonomy profile: Circoviridae. Journal of General Virology 98:1997–1998.

24. Brown, 1993. Review of accidents caused by imcomplete inactivation of viruses. Developments in Biological Standardization 81: 103-107.

25. Brunborg I.M., Moldal T. and Jonassen C.M., 2004. Quantitation of porcine circovirus type 2 isolated from serum/plasma and tissue samples of healthy pigs and pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome using a TaqMan-based real-time PCR. Journal of Virological Methods 122: 171–178.

26. Brunborg I.M., Jonassen C.M., Moldal T., Bratberg B., Lium B., Koenen F. and Schonheit J., 2007. Association of myocarditis with high viral load of porcine circovirus type 2 in several tissues in cases of fetal death and high mortality in piglets. A case study. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 19: 368– 375.

27. Bucarey S.A., Noriega J., Reyes, P., Tapia, C., Saenz L., Zuniga A. and Tobar J.A., 2009. The optimized capsid gene of porcine circovirus type 2 expressed in yeast forms virus-like particles and elicits antibody responses in mice fed with recombinant yeast extracts. Vaccine 27 (42): 5781–5790.

28. Cai L., Ni J., Xia Y., Zi Z., Ning K., Qiu P., Li X., Wang B., Liu Q., Hu D., Yu X., Zhou Z., Zhai X., Han X. and Tian K., 2012. Identification of an emerging recombinant cluster in porcine circovirus type 2. Virus Research 165 (1): 95–102.

29. Calsamiglia M., Fraile L., Espinal A., Cuxart A., Seminati C., Martín M., Mateu E., Domingo M. and Segalés J., 2007. Sow porcine circovirus type 2 (PCV2) status effect on litter mortality in postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS). Research in Veterinary Science 82: 299–304.

30. Canelli E., Borghetti P., Ferrari L., De Angelis E., Ferrarini G., Catella A., Ongo G. and Martelli P., 2016. Immune response to PCV2 vaccination in PRRSV viraemic piglets. Veterinary Record 178 (8): 193.

31. Chae, C., 2012a. Porcine circovirus type 2 and its associated diseases in Korea. Virus Research 164: 107–113.

32. Chae C., 2012b. Commercial porcine circovirus type 2 vaccines: efficacy and

clinical application. Veterinary Journal 194: 151-157.

33. Chang H.W., Jeng C.R., Lin T.L., Liu J.J., Chiou M.T., Tsai Y.C., Chia M.Y., Jan T.R. and Pang V.F., 2006. Immunopathological effects of porcine circovirus type 2 (PCV2) on swine alveolar macrophages by in vitro inoculation. Veterinary Immunology and Immunopathology 110: 207-219.

34. Cheung A.K., Bolin S.R., 2002. Kinetics of porcine circovirus type 2 replication. Archives of Virology 147: 43–58.

130

35. Cheung A.K., 2003. The essential and nonessential transcription units for viral protein synthesis and DNA replication of porcine circovirus type 2. Virology 313: 452-459.

36. Cheung A.K., 2009. Homologous recombination within the capsid gene of porcine circovirus type 2 subgroup viruses via natural co-infection. Archives of Virology 154 (3): 531–534.

37. Clark E., 1996. Post-weaning multisystemic wasting syndrome. In Proceedings of the Western Canadian Association of Swine Practitioners, pp. 19–20.

38. Coffman R. L., Sher A. and Seder R. A., 2010. Vaccine adjuvants: putting innate immunity to work. Immunity 33(4), 492–503.

39. Cortey M., Pileri E., Sibila M., Pujols J., Balasch M., Plana J. and Segalés J., 2011. Genotypic shift of porcine circovirus type 2 from PCV-2a to PCV- 2b in Spain from 1985 to 2008. Veterinary Journal 187 (3): 363–368.

40. Crowther R.A., Berriman J.A., Curran W.L., Allan G.M. and Todd D., 2003. Comparison of the structures of three circoviruses: chicken anemia virus, porcine circovirus type 2, and beak and feather disease virus. Journal of Virology 77: 13036-13041.

41. da Silva N., Carriquiry A., O’Neill K., Opriessnig T. and O’Connor A.M., 2014. Mixed treatment comparison meta-analysis of porcine circovirus type 2 (PCV2) vaccines used in piglets. Preventive Veterinary Medicine 117: 413–424.

42. Darwich L., Segalés J., Domingo M. and Mateu E., 2002. Changes in CD4+, CD8+, CD4/CD8, double positive cells and IgM+ cell subsets in peripheral blood mononuclear cells from postweaning multisystemic wasting syndrome affected pigs and age matched uninfected wasted and healthy pigs correlate with lesions and porcine circovirus type 2 load in lymphoid tissues. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 9: 236–242.

43. Darwich L., Balasch M., Plana-Durán J., Segalés J., Domingo M. and Mateu E., 2003a. Cytokine profiles of peripheral blood mononuclear cells from pigs with post-weaning multisystemic wasting syndrome in response to mitogen, superantigen or recall viral antigens. Journal of General Virology 84 (12): 3453–3457.

44. Darwich L., Pie S., Rovira A., Segalés J., Domingo M., Oswald I.P. and Mateu E., 2003b. Cytokine mRNA expression profiles in lymphoid tissues of pigs naturally affected by postweaning multisystemic wasting syndrome. Journal of General Virology 84: 2117–2125.

45. Darwich L., Segalés J., Resendes A., Balasch M., Plana-Durán J. and Mateu E., 2008. Transient correlation between viremia levels and IL-10 expression

131

in pigs subclinically infected with porcine circovirus type 2 (PCV2). Research in Veterinary Science 84 (2): 194–198.

46. Darwich L. and Mateu E., 2012. Immunology of porcine circovirus type 2 (PCV2). Virus Research 164 (1-2): 61-67.

47. Davies F. G., Otema C., 1981. Relationship of Capripoxviruses found in Kenya with two Middle Eastern strains and some Orthopox viruses. Research in Veterinary Science 31 (2): 253–255.

48. Davies B., Wang X., Dvorak C.M., Marthaler D., Murtaugh M.P., 2016. Diagnostic phylogenetics reveals a new Porcine circovirus 2 cluster. Virus Research 217: 32–37.

49. Delrue I., Verzele D., Madder A. and Nauwynck H.J., 2012. Inactivated virus vaccines from chemistry to prophylaxis: merits, risks and challenges. Expert Review Vaccines 11: 695–719.

50. Doster A.R., Subramaniam S., Yhee J.Y., Kwon B.J., Yu C.H., Kwon S.Y., Osorio F.A. and Sur J.H., 2010. Distribution and characterization of IL- 10-secreting cells in lymphoid tissues of PCV2-infected pigs. Journal of Veterinary Science 11 (3): 177–183.

51. Drolet R., Thibault S., D’Allaire S., Thomson J.R. and Done S.H., 1999. Porcine dermatitis and nephropathy syndrome (PDNS): an overview of the disease. Journal of Swine Health and Production 7: 283–285.

52. Dupont K., Nielsen E.O., Baekbo P., Larsen L.E., 2008. Genomic analysis of PCV2 isolates from Danish archives and a current PMWS case–control study supports a shift in genotypes with time. Veterinary Microbiology 128: 56–64.

53. Dvorak C.M.T., Puvanendiran S. and Murtaugh M.P., 2013. Cellular pathogenesis of porcine circovirus type 2 infection. Virus Research 1–9.

54. Đặng Vũ Hoàng, Trương Quốc Phong, Trần Thị Thanh Hà, Nguyễn Thị Huyền, Takehiro Kokuho, 2016. Ứng dụng hệ thống biểu hiện baculovirus nhằm sản xuất protein ORF2 tái tổ hợp của virus PCV2. Tạp chí Khoa học Kỹ Thuật Thú y XXXIII (2): 14-21.

55. Đặng Vũ Hoàng, Trần Thị Thanh Hà, Nguyễn Thị Huyền, Đặng Thị Kiều Anh, Lý Đức Việt, Nguyễn Thúy Duyên, Nguyễn Thế Vinh, Hoàng Việt Hưng, Takehiro Kokuho, 2018. Nghiên cứu tính sinh miễn dịch trên lợn của kháng nguyên PCV2-ORF2 tái tổ hợp bằng hệ thống biểu hiện Balculovirus. Tạp chí Khoa học Kỹ Thuật Thú y XXV (5): 27-34.

56. Đỗ Tiến Duy và Nguyễn Tất Toàn, 2013. Khảo sát biểu hiện lâm sàng, bệnh lý mô học phổi viêm và căn nguyên gây bệnh trên heo sau cai sữa có triệu chứng hô hấp tại một số trại chăn nuôi khu vực phía Nam. Tạp chí KHKT Thú Y XX (7): 41-51.

132

57. Ellis J., Krakowka S., Lairmore M., Haines D., Bratanich A., Clark E., Allan G., Konoby C., Hassard L., Meehan B., Martin K., Harding J., Kennedy S. and McNeilly F., 1999. Reproduction of lesions of postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic piglets. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 11: 3–14.

58. Ellis J.A., Konoby C., West K.H., Allan G.M., Krakowka S., McNeilly F., Meehan B. and Walker I., 2001. Lack of antibodies to porcine circovirus type 2 virus in beef and dairy cattle and horses in western Canada. Canadian Veterinary Journal 42: 461–464.

59. Ellis J., Spinato M., Yong C., West K., McNeilly F., Meehan B., Kennedy S., Clark E., Krakowka S. and Allan G., 2003. Porcine circovirus 2-associated disease in Eurasian wild boar. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 15: 364–368.

60. Fachinger V., Bischoff R., Jedidia S.B., Saalmüller A. and Elbers K., 2008. The effect of vaccination against porcine circovirus type 2 in pigs suffering from porcine respiratory disease complex. Vaccine 26: 1488–1499.

61. Fan H., Ju C., Tong T., Huang H., Lv J. and Chen H., 2007. Immunogenicity of empty capsids of porcine circovirus type 2 produced in insect cells. Veterinary Research Communications 31 (4): 487-496.

62. Farnham M.W., Choi Y.K., Goyal S.M. and Joo H.S., 2003. Isolation and characterization of porcine circovirus type-2 from sera of stillborn fetuses. The Canadian Journal of Veterinary Research 67: 108–113.

63. Faurez F., Dory D., Grasland B. and Jestin A., 2009. Replication of porcine circovirus.Virology journal 6: 60.

64. Fenaux M., Opriessnig T., Halbur P.G. and Meng X.J., 2003. Immunogenicity and pathogenicity of chimeric infectious DNA clones of pathogenic porcine circovirus type 2 (PCV2) and nonpathogenic PCV1 in weanling pigs. Journal of Virology 77 (20): 11232-11243.

65. Fenaux M., Opriessnig T., Halbur P.G., Elvinger F. and Meng X.J., 2004a. A chimeric porcine circovirus (PCV) with the immunogenic capsid gene of the pathogenic pcv type 2 (PCV2) cloned into the genomic backbone of the nonpathogenic PCV1 induces protective immunity against PCV2 infection in pigs. Journal of Virology 78 (12): 6297-6303.

66. Fenaux M., Opriessnig T., Halbur P.G., Elvinger F. and Meng X.J., 2004b. Two amino acid mutations in the capsid protein of type 2 porcine circovirus (PCV2) enhanced PCV2 replication in vitro and attenuated the virus in vivo. Journal of Virology 78 (24): 13440-13446.

67. Finlaison D., Kirkland P., Luong R. and Ross A., 2007. Survey of porcine circovirus 2 and postweaning multisystemic wasting syndrome in New South Wales piggeries. Australian Veterinary Journal 85: 304–310.

133

68. Firth C., Charleston M.A., Duffy S., Shapiro B. and Holmes E.C., 2009. Insights into the evolutionary history of an emerging livestock pathogen: porcine circovirus 2. Journal of Virology 83: 12813–12821.

non-PMWS-affected pigs. and 69. Fort M., Olvera A., Sibila M., Segalés J. and Mateu E., 2007. Detection of neutralizing antibodies in postweaning multisystemic wasting syndrome Veterinary (PMWS)-affected Microbiology 125 (3–4): 244-255.

70. Fort M., Sibila M., Allepuz A., Mateu E., Roerink F. and Segalés J., 2008. Porcine circovirus type 2 (PCV2) vaccination of conventional pigs prevents viremia against PCV2 isolates of different genotypes and geographic origins. Vaccine 26 (8): 1063-1071.

71. Fort M., Fernandes L.T., Nofrarias M., Díaz I., Sibila M., Pujols J., Mateu E. and Segalés J., 2009a. Development of cell-mediated immunity to porcine circovirus type 2 (PCV2) in caesarean-derived, colostrum-deprived piglets. Veterinary Immunology and Immunopathology 129: 101–107.

72. Fort M., Sibila, M., Pérez-Martín, E., Nofrarías M., Mateu E. and Segalés J., 2009b. One dose of a porcine circovirus 2 (PCV2) sub-unit vaccine administered to 3-week-old conventional piglets elicits cell-mediated immunity and significantly reduces PCV2 viremia in an experimental model. Vaccine 27: 4031–4037.

73. Fort M., Sibila M., Nofrarías M., Pérez-Martín E., Olvera A., Mateu E. and Segalés, J., 2010. Porcine circovirus type 2 (PCV2) Cap and Rep proteins are involved in the development of cell-mediated immunity upon PCV2 infection. Veterinary Immunology and Immunopathology 137 (3–4): 226–234.

74. Fort M., Sibila M., Nofrarías M., Pérez-martín E., Olvera A., Mateu E. and Segalés J., 2012. Evaluation of cell-mediated immune responses against porcine circovirus type 2 (PCV2) Cap and Rep proteins after vaccination with a commercial PCV2 sub-unit vaccine. Veterinary Immunology and Immunopathology 150 (1-2): 128–132.

75. Fraile L., Sarasola P., Sinovas N., Nofrarías M., López-Jimenez R., López-Soria S., Sibila M. and Segalés J., 2012a. Inactivated PCV2 one shot vaccine applied in 3-week-old piglets: Improvement of production parameters and interaction with maternally derived immunity. Vaccine 30: 1986-1992.

76. Fraile L., Sibila M., Nofrarías M., López-Jimenez R., Huerta E., Llorens A., López- Soria S., Pérez D. and Segalés J., 2012b. Effect of sow and piglet porcine circovirus type 2 (PCV2) vaccination on piglet mortality, viraemia, antibody titre and production parameters. Veterinary Microbiology 161: 229-234.

77. Fraile L., Segalés J., Ticó, G., López-Soria S., Valero O., Nofrarías M., Huerta E., Llorens A., López-Jiménez R., Pérez D. and Sibila M., 2015. Virological and serological characterization of vaccinated and non-

134

vaccinated piglet subpopulations coming from vaccinated and non- vaccinated sows. Preventive Veterinary Medicine 119: 153–161.

78. Franzo G., Cortey M., Castro A.M.M.G. De, Piovezan U., Szabo M.P.J., Drigo M., Segalés J. and Richtzenhain L.J., 2015. Genetic characterisation of Porcine circovirus type 2 (PCV2) strains from feral pigs in the Brazilian Pantanal: An opportunity to reconstruct the history of PCV2 evolution. Veterinary Microbiology 178 (1-2): 158-162.

79. Franzo G., Cortey M., Segalés J., Hughes J. and Drigo M., 2016. Phylodynamic analysis of porcine circovirus type 2 reveals global waves of emerging genotypes and the circulation of recombinant forms. Molecular Phylogenetics and Evolution 100: 269–280.

80. Franzo G. and Segalés J., 2018. Porcine circovirus 2 (PCV-2) genotype update and proposal of a new genotyping methodology. PLoS ONE 13 (12): e0208585.

81. Gagnon C.A, Music N., Fontaine G., Tremblay D. and Harel J., 2010. Emergence of a new type of porcine circovirus in swine (PCV): a type 1 and type 2 PCV recombinant. Veterinary Microbiology 144: 18-23.

82. Gamage L.N., Ellis J. and Hayes S., 2009. Immunogenicity of bacteriophage lambda particles displaying porcine Circovirus 2 (PCV2) capsid protein epitopes. Vaccine 27 (47): 6595–6604.

83. Gauger P.C., Lager K.M., Vincent A.L., Opriessnig T., Kehrli M.E.Jr. and Cheung A.K., 2011. Postweaning multisystemic wasting syndrome produced in gnotobiotic pigs following exposure to various amounts of porcine circovirus type 2a or type 2b. Veterinary Microbiology 153(3–4): 229–239.

84. Ge X., Wang F., Guo X. and Yang H., 2012. Porcine circovirus type 2 and its associated diseases in China. Virus Research 164: 100–106.

85. Giambrone J.J. and Solano W., 1988. Serologic comparison of avian reovirus isolates using virus neutralization and an enzyme-linked immunosorbent assay. Avian Diseases 32: 678-680.

86. Gillespie J., Juhan N. M., DiCristina J., Key K. F. and Ramamoorthy S., Meng X. J., 2008. A genetically engineered chimeric vaccine against porcine circovirus type 2 (PCV2) is genetically stable in vitro and in vivo. Vaccine 26 (33): 4231–4236.

87. Gilpin D.F., McCullough K., Meehan B.M., McNeilly F., McNair I., Stevenson L.S., Foster J.C., Ellis J.A., Krakowka S., Adair B.M. and Allan G.M., 2003. In vitro studies on the infection and replication of porcine circovirus type 2 in cells of the porcine immune system. Veterinary Immunology and Immunopathology 94: 149-161.

135

88. Goubier A., Chapat L., Toma S., Piras F., Joisel F., Maurin-Bernaud L., Charreyre C., Andreoni C. and Juillard V., 2008. Transfer of maternal immunity from sows vaccinated against PCV2 with Circovac to their piglets. In: Proceedings of the 18th IPVS Congress. Vancouver, Canada, vol. 1, p. 16.

89. Grau-Roma L., Crisci E., Sibila M., López-Soria S., Nofrarías M., Cortey M., Fraile L., Olvera A. and Segalés J., 2008. A proposal on porcine circovirus type 2 (PCV2) genotype definition and their relation with postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) occurrence. Veterinary Microbiology 128: 23-35.

90. Grau-Roma L., Hjulsager C.K., Sibila M., Kristensen C.S., López-Soria S., Enoe C., Casal J., Botner A., Nofrarias M., Bille-Hansen V., Fraile L., Baekbo P., Segalés J. and Larsen L.E., 2009. Infection, excretion and seroconversion dynamics of porcine circovirus type 2 (PCV2) in pigs from post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) affected farms in Spain and Denmark. Veterinary Microbiology 135: 272-282.

91. Grau-Roma L., Fraile L. and Segalés J., 2011. Recent advances in the epidemiology, diagnosis and control of diseases caused by porcine circovirus type 2. Veterinary Journal 187: 23–32.

92. Gravendyck M., Tritt S., Spenkoch-Piper H. and Kaleta, E. F., 1996. Antigenic diversity of psittacine herpesviruses: cluster analysis of antigenic differences obtained from cross-neutralization tests. Avian Pathology 25(2): 435-357.

93. Guo L.J., Lu Y.H., Wei Y.W., Huang L.P. and Liu C.M., 2010. Porcine circovirus type 2 (PCV2): genetic variation and newly emerging genotypes in China. Virology Journal 7(273): 1-13

94. Guo L., Fu Y., Wang Y., Lu Y., Wei Y., Tang Q., Fan P., Liu J., Zhang L., Zhang F., Huang L., Liu D., Li S., Wu H. and Liu C., 2012. A porcine circovirus type 2 (PCV2) mutant with 234 amino acids in capsid protein showed more virulence in vivo, compared with classical PCV2a/b strain. PLoS One 7, e41463.

95. Ha Y., Ahn K.K., Kim B., Cho K.D., Lee B.H., Oh Y.S., Kim S.H. and Chae C., 2009. Evidence of shedding of porcine circovirus type 2 in milk from experimentally infected sows. Research in Veterinary Science 86: 108– 110.

96. Hamberg A., Ringler S. and Krakowka S., 2007. A novel method for the detection of porcine circovirus type 2 replicative double stranded viral DNA and nonreplicative single stranded viral DNA in tissue sections. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 19: 135–141.

97. Hamel A.L., Lin L.L. and Nayar G.P.S., 1998. Nucleotide sequence of porcine circovirus associated with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs. Journal of Virology 72: 5262–5267.

136

98. Harding J.C., 1996. Postweaning multisystemic wasting syndrome: preliminary epidemiology and clinical findings. In Proceedings of the Western Canadian Association of Swine Practitioners, p. 21.

99. Harding J.C., 2007. Porcine circovirus diseases (PCVD): the brutal facts. In Proc. Annu. Meet. Am. Assoc. Swine Pract. vol. 38, p. 4.

100. Harms P.A., Sorden S.D., Halbur P.G., Bolin S.R., Lager K.M., Morozov I. and Paul P.S., 2001. Experimental reproduction of severe disease in CD/CD pigs concurrently infected with type 2 porcine circovirus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Veterinary Pathology 38: 528–539.

101. Hasslung F., Wallgren P., Ladekjaer-Hansen A.S., Botner A., Nielsen J., Wattrang E., Allan G.M., McNeilly F., Ellis J., Timmusk S., Belák K., Segall T., Melin L., Berg M. and Fossum C., 2005. Experimental reproduction of postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) in pigs in Sweden and Denmark with a Swedish isolate of porcine circovirus type 2. Veterinary Microbiology 106 (1–2): 49–60.

102. Hayes S., Gamage L.N. and Hayes C., 2010. Dual expression system for assembling phage lambda display particle (LDP) vaccine to porcine Circovirus 2 (PCV2). Vaccine 28 (41): 6789–6799.

103. He J., Cao J., Zhou N., Jin Y., Wu J. and Zhou J., 2013. Identification and functional analysis of the novel ORF4 protein encoded by porcine circovirus type 2. Journal of Virology 87 (3): 1420–1429.

104. Heegaard P.M.H., Dedieu L., Johnson N., Le Potier M.F., Mockey M., Mutinelli F., Vahlenkamp T., Vascellari M. and Sørensen N.S., 2011 Adjuvants and delivery systems in veterinary vaccinology: current state and future developments. Archives of Virology 156: 183-202.

105. Herbert W.J., 1965. Multiple emulsions: a new form of mineral oil antigen adjuvants. Lancet 2: 771.

106. Hesse R., Kerrigan M. and Rowland R.R.R, 2008. Evidence for recombination between PCV2a and PCV2b in the field. Virus Research 132: 201-207.

107. Hjulsager C.K., Grau-Roma L., Sibila M., Enoe C., Larsen L. and Segalés J., 2009. Inter-laboratory and inter-assay comparison on two real-time PCR techniques for quantification of PCV2 nucleic acid extracted from field samples. Veterinary Microbiology 133: 172–178.

108. Horlen K.P., Schneider P., Anderson J., Nietfeld J.C., Henry S.C., Tokach L.M. and Rowland R.R., 2007. A cluster of farms experiencing severe porcine circovirus associated disease: clinical features and association with the PCV2b genotype. Journal of Swine Health and Production 15: 270–278.

109. Horlen K.P., Dritz S.S., Nietfeld J.C., Henry S.C., Hesse R.A., Oberst R., Hays M., Anderson J. and Rowland R.R., 2008. A field evaluation of mortality

137

rate and growth performance in pigs vaccinated against porcine circovirus type 2. Journal of the American Veterinary Medical Association 232: 906- 912.

110. Huan C., Fan M., Cheng Q., Wang X., Gao Q., Wang W., Gao S. and Liu X., 2018. Evaluation of the efficacy and cross-protective immunity of live- attenuated chimeric PCV1-2b vaccine against PCV2b and PCV2d subtype challenge in Pigs. Frontiers in Microbiology 9: 455.

111. Huang Y.L., Pan, V.F., Li, C.M., Tsa, Y.C., Chia M.Y., Deng M.C., Chang C. Y. and Jeng C.R., 2011. Porcine circovirus type 2 (PCV2) infection decreases the efficacy of an attenuated classical swine fever virus (CSFV) vaccine. Veterinary Research 42 (1): 115.

112. Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Nguyễn Văn Giáp, Đặng Hữu Anh, Trần Thị Hương Giang, Mai Thị Ngân, Vũ Thị Ngọc, Lâm Văn Trường, Ngô Minh Hà và Bong Kyun Park, 2012. Ứng dụng kỹ thuật nested PCR phát hiện và định typ Porcine circovirus type 2 (PCV2) ở đàn lợn nuôi tại một số tỉnh miền Bắc. Tạp chí KHKT Thú Y XIX (5): 18-25.

113. Huynh T.M.L., Nguyen B.H., Nguyen V.G., Dang H.A, Mai T.N., Tran T.H.G., Ngo M.H., Le V.T., Vu T.N., Ta T.K.C., Kim H.K. and Park B.K., 2013. Phylogenetic and phylogeographic analyses of porcine circovirus type 2 among pig farms in Vietnam. Transboundary and Emerging Diseases 61 (6): e25-34.

114. Huỳnh Thị Mỹ Lệ và Nguyễn Văn Giáp, 2013. Phân lập và xác định đặc tính sinh học của porcine circovirus type 2 (PCV2) ở đàn lợn nuôi tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam. Tạp chí Khoa học và Phát triển 11(3): 304-309.

115. Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Lê Văn Phan, Nguyễn Văn Giáp, Trịnh Đình Thâu, 2015. Lựa chọn chủng giống Porcine circovirus type 2 (PCV2) để sản xuất vacxin phòng hội chứng còi cọc ở lợn con. Tạp chí Khoa học và Phát triển 13(3): 405-415.

116. Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Tạ Thị Kim Chung, Mai Thị Ngân, Trần Thị Hương Giang, Vũ Thị Ngọc, Cao Thị Bích Phượng, 2016. Đặc tính sinh miễn dịch của một số chủng porcine circovirus type 2 phân lập tại Việt Nam. Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 14(4): 598-604.

117. Ismail A.H., El-Mahdy S.A., Mossad W.G., Abd El-Krim A.S., Abou El-Yazid M. and Ali S.M., 2013. Optimization of the Inactivation Process of FMD Virus Optimization of the Inactivation Process of FMD Virus Serotype SAT-2 by Binary Ethyleneimine. Journal of Veterinary Advances 3(3): 117–124.

118. Jensen T.K., Vigre H., Svensmark B. and Bille-Hansen V., 2006. Distinction between porcine circovirus type 2 enteritis and porcine proliferative enteropathy caused by Lawsonia intracellularis. Journal of Comparative Pathology 135: 176–182.

138

119. Jeong J., Park C., Choi K. and Chae C., 2015. Comparison of three commercial one-dose porcine circovirus type 2 (PCV2) vaccines in a herd with concurrent circulation of PCV2b and mutant PCV2b. Veterinary Microbiology 177 (1-2):43-52

120. Ju C., Fan H., Tan Y., Liu Z., Xi X., Cao S., Wu B. and Chen H., 2005. Immunogenicity of a recombinant pseudorabies virus expressing ORF1- ORF2 fusion protein of porcine circovirus type 2. Veterinary Microbiology 109 (3-4): 179–190.

121. Kekarainen T., McCullough K., Fort M., Fossum C., Segalés J. and Allan G.M., 2010. Immune responses and vaccine-induced immunity against porcine circovirus type 2. Veterinary Immunology and Immunopathology 136 (3– 4): 185–193.

122. Kennedy S., Moffett D., McNeilly F., Meehan B., Ellis J., Krakowka S. and Allan G.M., 2000. Reproduction of lesions of postweaning multisystemic wasting syndrome by infection of conventional pigs with porcine circovirus type 2 alone or in combination with porcine parvovirus. Journal of Comparative Pathology 122: 9–24.

123. Khayat R., Brunn N., Speir J.A., Hardham J.M., Ankenbauer R.G., Schneemann A. and Johnson J.E., 2011. The 2,3-angstrom structure of porcine circovirus 2. Journal of Virology 85 (15): 7856–7862.

124. Kim H.K., Luo Y., Moon H.J., Park S.J., Keum H.O., Rho S. and Park B.K., 2009a. Phylogenetic and recombination analysis of genomic sequences of PCV2 isolated in Korea. Virus Genes 39: 352–358.

125. Kim T., Toan N.T., Seo J., Jung B., Lee J. and Lee B., 2009b. Bordetella bronchiseptica aroA mutant as a live vaccine vehicle for heterologous porcine circovirus type 2 major capsid protein expression. Veterinary Microbiology 138: 318-324.

126. Kim H.B., Lyoo K.S. and Joo H.S., 2009c. Efficacy of different disinfectants in vitro against porcine circovirus type 2. Veterinary Record 164: 599–600.

127. Kim D., Kim C.H., Han K., Seo H.W., Oh Y., Park C., Kang I. and Chae C., 2011. Comparative efficacy of commercial Mycoplasma hyopneumoniae and porcine circovirus 2 (PCV2) vaccines in pigs experimentally infected with M. hyopneumoniae and PCV2. Vaccine 29: 3206–3212.

128. King A.M., Underwood B.O., McCahon D., Newman J.W. and Brown F., 1981. Biochemical identification of viruses causing the 1981 outbreaks of foot and mount disease in UK. Nature 293 (5832): 479-480.

129. King A.M.Q, Adams M.J., Carstens E.B. and Lefkowitz E.J., 2012. Virus Taxonomy, classification and nomenclature of viruses, Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Elsevier Inc, pp. 343- 349.

139

130. Kixmöller M., Ritzmann M., Eddicks M., Saalmüller A., Elbers K. and Fachinger V., 2008. Reduction of PMWS-associated clinical signs and co- infections by vaccination against PCV2. Vaccine 26 (27-28): 3443-3451.

131. Krakowka S., Ellis J.A., Meehan B., Kennedy S., McNeilly F. and Allan G., 2000. Viral wasting syndrome of swine: experimental reproduction of postweaning multisystemic wasting syndrome in gnotobiotic swine by coinfection with porcine circovirus 2 and porcine parvovirus. Veterinary Pathology 37: 254– 263.

132. Kristensen C.S., Baekbo P., Bille-Hansen V., Botner A., Vigre H., Enoe C. and Larsen L.E., 2009. Induction of porcine post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) in pigs from PMWS unaffected herds following mingling with pigs from PMWS-affected herds. Veterinary Microbiology 138 (3-4): 244-50.

133. Kristensen C.S., Baadsgaard N.P. and Toft N., 2011. A meta-analysis comparing the effect of PCV2 vaccines on average daily weight gain and mortality rate in pigs from weaning to slaughter. Preventive Veterinary Medicine 98 (4): 250-258.

134. Kumar S., Tamura K., Jakobsen I.B. and Nei M., 2001. MEGA2: molecular evolutionary genetics analysis software. Bioinformatics 17: 1244-1245.

135. Kurmann, J., Sydler T., Brugnera E., Buergi E., Haessig M., Suter M. and Sidler X., 2011. Vaccination of dams increases antibody titer and improves growth parameters in finisher pigs subclinically infected with porcine circovirus type 2. Clinical and Vaccine Immunology 18 (10): 1644-1649.

136. Kurtz S., Grau-roma L., Cortey M., Fort M., Rodríguez F. and Sibila M., 2014. Pigs naturally exposed to porcine circovirus type 2 (PCV2) generate antibody responses capable to neutralise PCV2 isolates of different genotypes and geographic origins. Veterinary Research 45 (29): 1–10.

137. Kwon T., Lee D., Yoo S.J., Je S.H., Shin J.Y. and Lyoo Y.S., 2017. Genotypic diversity of porcine circovirus type 2 (PCV2) and genotype shift to PCV2d in Korean pig population. Virus Research 228: 24–29.

syndrome (PMWS)

138. Ladekjær-Mikkelsen A.S., Nielsen J., Stadejek T., Storgaad T., Krakowka S., Ellis J., McNeilly F., Allan G. and Bøtner A., 2002. Reproduction of postweaning multisystemic wasting in immunostimulated and non-immunostimulated 3-week-old piglets experimentally infected with porcine circovirus type 2 (PCV2). Veterinary Microbiology 89: 97–114.

139. Lâm Thị Thu Hương và Đường Chi Mai, Trần Hoàn Vũ, 2005. Bước đầu ghi nhận sự hiện diện của porcine circovirus type 2 trên heo biểu hiện còi tại một số trại heo công nghiệp ở thành phố Hồ Chí Minh và vùng lân cận. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Nông Lâm nghiệp: 2 và 3/ 2005: 107 – 109.

140

140. Lâm Thị Thu Hương, 2012. Bệnh tích và tỉ lệ một số vi khuẩn cộng nhiễm trên heo mắc hội chứng gầy còm sau cai sữa. Tạp chí KHKT Thú Y 3:22-28.

141. Larochelle R., Magar R. and D’Allaire S., 2002. Genetic characterization and phylogenetic analysis of porcine circovirus type 2 (PCV2) strains from cases presenting various clinical conditions. Virus Research 90: 101–112.

142. Larochelle R., Magar R. and D’Allaire S., 2003. Comparative serologic and virologic study of commercial swine herds with and without postweaning multisystemic wasting syndrome. Canadian Journal of Veterinary Research 67 114–120.

143. Lefebvre D.J., Van Doorsselaere J., Delputte P.L. and Nauwynck, H.J., 2009. Recombination of two porcine circovirus type 2 strains. Archives of Virology 154 (5): 875–9.

144. Lefkowitz E.J., Dempsey D.M., Hendrickson R.C., Orton R.J., Siddell S.G. and Smith D.B., 2018. Virus taxonomy: the database of the International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV). Nucleic Acids Research 46 (D1): D708–D717

145. Lin H., Ma Z., Fan H. and Lu C., 2012. Construction and immunogenicity of recombinant swinepox virus expressing capsid protein of PCV2. Vaccine 30 (44): 6307–6313.

146. Lipej Z., Segalés J., Jemersic L., Olvera A., Roic B., Novosel D., Mihaljevic Z. and Manojlovic L., 2007. First description of postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) in wild boar (Sus scrofa) in Croatia and phylogenetic analysis of partial PCV2 sequences. Acta Veterinaria Hungarica 55: 389–404.

147. Liu Q., Wang L., Willson P. and Babiuk A., 2000. Quantitative, competitive PCR analysis of porcine circovirus DNA in serum from pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome. Journal of Clinical Microbiology 38: 3474–3477.

148. Liu J., Chen I., Du Q., Chua H. and Kwang J., 2006. The ORF3 protein of porcine circovirus type 2 is involved in viral pathogenesis in vivo. Journal of Virology 80: 5065-5073.

149. Lv Q.Z., Guo K.K., Xu H.,Wang T. and Zhang Y., 2015. Identification of putative ORF5 protein of porcine circovirus type 2 and functional analysis of GFP-fused ORF5 protein. PLoS ONE 10 (6): 1-23.

150. Lyoo K.S., 2009. Virologic, epidemiologic, and prophylactic investigation on porcine circovirus type 2 infection in pigs. PhD thesis, University of Minnesota, United States.

151. Ma C.M., Hon C.C., Lam T.Y., Li V.Y., Wong C.K., de Oliveira T. and Leung F.C., 2007. Evidence for recombination in natural populations of porcine

141

circovirus type 2 in Hong Kong and mainland China. Journal of General Virology 88:1733–1737.

152. Mạc Thị Yến, 2014. Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của lợn mắc PCV2 (porcine circovirus type 2) và áp dụng phương pháp hóa mô miễn dịch trong chẩn đoán bệnh. Luận văn Thạc sĩ, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Hà Nội, Việt Nam

153. Madec F., Rose N., Eveno E., et al., 2001. PMWS: on-farm observations and preliminary analytic epidemiology. Proceedings DNA viruses of plant, birds, pigs, primates, pp. 86-88.

154. Madson D., Patterson A., Ramamoorthy S., Pal N., Meng X.J. and Opriessnig T., 2009. Reproductive failure experimentally induced in sows via artificial insemination with semen spiked with porcine circovirus type 2 (PCV2). Veterinary Pathology 46: 707–716.

155. Madson D., 2018. PCV2: What pig farmers should know about this evolving .

156. Mahé D., Blanchard P., Truong C., Arnauld C., Le Cann P., Cariolet R., Madec F., Albina E. and Jestin A., 2000. Differential recognition of ORF2 protein from type 1 and type 2 porcine circoviruses and identification of immunorelevant epitopes. Journal of General Virology 81:1815–1824.

157. Mankertz A., Domingo M., Folch J.M., Le Cann P., Jestin A., Segalés J., Chmielewicz B., Plana-Duran J. and Soike D., 2000. Characterisation of PCV- 2 isolates from Spain, Germany and France. Virus Research 66: 65–77.

158. Mankertz A. and Hillenbrand B., 2002. Analysis of transcription of Porcine circovirus type 1. Journal of General Virology 83: 2743–2751.

159. Martelli P., Ferrari L., Morganti M., De Angelis E., Bonilauri P., Guazzetti S., Caleffi A. and Borghetti P., 2011. One dose of a porcine circovirus 2 subunit vaccine induces humoral and cell-mediated immunity and protects against porcine circovirus-associated disease under field conditions. Veterinary Microbiology 149 (3-4): 339-351.

160. Martin H., Le Potier M.F. and Maris P., 2008. Virucidal efficacy of nine commercial disinfectants against porcine circovirus type 2. Veterinary Journal 177: 388–393.

161. Mateusen B., Maes D.G., Van Soom A., Lefebvre D., Nauwynck H.J., 2007. Effect of a porcine circovirus type 2 infection on embryos during early pregnancy. Theriogenology 68 (6): 896–901.

162. McKeown N.E., Opriessnig T., Thomas P., Guenette D.K., Elvinger F., Fenaux M., Halbur P.G and Meng, X.J., 2005. Effects of porcine circovirus type 2 (PCV2) maternal antibodies on experimental infection of piglets with PCV2. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 12 (11): 1347-1351.

142

163. McNeilly F., Kennedy S., Moffett D., Meehan B. M., Foster J. C., Clarke E. G., Ellis J. A., Haines D. M., Adair B. M. and Allan G. M., 1999. A comparison of in situ hybridization and immunohistochemistry for the detection of a new porcine circovirus in formalin-fixed tissues from pigs with post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS). J Virol Methods 80: 123-8.

164. Meehan B.M., Creelan J.L., McNulty M.S. and Todd D., 1997. Sequence of porcine circovirus DNA: affinities with plant circoviruses. Journal of General Virology 78: 221-227.

165. Meehan B.M., McNeilly F., Todd D., Kennedy S., Jewhurst V.A., Ellis J.A., Hassard L.E., Clark E.G., Haines D.M. and Allan G.M., 1998. Characterization of novel circovirus DNAs associated with wasting syndromes in pigs. Journal of General Virology 79: 2171- 2179.

166. Meehan B.M., McNeilly F., McNair I., Walker I., Ellis J. A., Krakowka S. and Allan G.M., 2001. Isolation and characterization of porcine circovirus 2 from cases of sow abortion and porcine dermatitis and nephropathy syndrome. Archives of Virology 146(4): 835–842.

167. Meerts P., Misinzo G., McNeilly F. and Nauwynck H.J., 2005a. Replication kinetics of different porcine circovirus 2 strains in PK-15 cells, foetal ardiomyocytes and macrophages. Archives of Virology 150: 427-441.

168. Meerts P., Van Gucht S., Cox E., Vandebosch A. and Nauwynck H.J., 2005b. Correlation between type of adaptive immune response against porcine circovirus type 2 and level of virus replication. Viral Immunology 18: 333-341.

169. Meerts P., Misinzo G., Lefebvre D., Nielsen J., Bøtner A., Kristensen C.S. and Nauwynck H.J., 2006. Correlation between the presence of neutralizing antibodies against porcine circovirus 2 (PCV2) and protection against replication of the virus and development of PCV2-associated disease. BMC Veterinary Research 2: 6.

170. Misinzo G., Delputte P.L., Meerts P., Lefebvre D.J. and Nauwynck H.J., 2006. Porcine circovirus 2 uses heparan sulfate and chondroitin sulfate B glycosaminoglycans as receptors for its attachment to host cells. Journal of Virology 80: 3487-3494.

171. Morozov I., Sirinarumitr T., Sorden S.D. Halbur P.G., Morgan M.K., Yoon K.J. and Paul, P.S., 1998. Detection of a novel strain of porcine circovirus in pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome. Journal of Clinical Microbiology 36: 2535-2541.

172. Nawagitgul P., Morozov I., Bolin S.R., Harms P.A., Sorden S.D. and Paul P.S., 2000. Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein. Journal of General Virology 81: 2281-2287.

143

173. Nayar G.P., Hamel A.L., Lin L., Sachvie C., Grudeski E. and Spearman G., 1999. Evidence for circovirus in cattle with respiratory disease and from aborted bovine fetuses. Canadian Veterinary Journal 40: 277–278.

174. Neira V., Ramos N., Tapia R., Arbiza J., Neira-Carrillo A., Quezada M., RuiZ A. and Bucarey S.A., 2017. Genetic analysis of porcine circovirus type 2 from pigs affected with PMWS in Chile reveals intergenotypic recombination. Virology Journal 14(1): 1–7.

175. Nguyễn Đức Nhân, 2009. Đánh giá hiệu quả việc phòng hội chứng còi cọc sau cai sữa trên heo bằng biện pháp tiêm vắc xin cho nái. Luận văn thạc sĩ Khoa học nông nghiệp, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam.

176. Nguyễn Ngọc Hải, Võ Khánh Hưng và Nguyễn Thị Kim Hằng, 2013. Phân tích di truyền virut gây hội chứng còi cọc trên heo sau cai sữa tại tỉnh Đồng Nai và thành phố Hồ Chí Minh. Tạp chí KHKT Thú Y XX (1): 22-28.

177. Nguyễn Thị Lam Hương, 2012. Một số đặc tính sinh học của vi-rút đậu dê phân lập từ thực địa. Luận văn thạc sĩ, Trường đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Việt Nam.

178. Nguyễn Thị Thu Hồng, Phan Hoàng Dũng, Đặng Hùng, Nguyễn Tiến Hà và Chris Morrissy, 2006. Bước đầu khảo sát về tình hình nhiễm PCV2 trên đàn heo nuôi ở một số tỉnh thành phía Nam. Tạp chí KHKT Thú y XIII (3): 67-69.

179. Nguyễn Thị Thu Hồng, Lê Thị Thu Phương, Đặng Hùng, Nguyễn Tiến Hà, Nguyễn Ngọc Hải, Chris J. M. và Darren Schafer, 2008. Phân tích di truyền circovirus lợn typ 2 (PCV2) trên lợn tại khu vực Nam bộ. Tạp chí KHKT Thú Y XV (2): 5-12.

Immunology Veterinary syndrome (PMWS). 180. Nielsen J., Vincent I.E., Bøtner A., Ladekjaer-Mikkelsen A.S., Allan G., Summerfield A. and McCullough K.C., 2003. Association of lymphopenia with porcine circovirus type 2 induced postweaning multisystemic wasting and Immunopathology 92 (3–4), 97–111.

181. O’Dea M.A., Hughes A. P., Davies L. J., Muhling J., Buddle R. and Wilcox G. E., 2008. Thermal stability of porcine circovirus type 2 in cell culture. Journal of Virological Methods 147(1): 61–66.

182. Oh Y., Seo H.W., Han K., Park C. and Chae C., 2012. Protective effect of the maternally derived porcine circovirus type 2 (PCV2)-specific cellular immune response in piglets by dam vaccination against PCV2 challenge. Journal of General Virology 93: 1556–62.

183. Oh Y., Seo H.W., Park C. and Chae C., 2014. Comparison of sow and/or piglet vaccination of 3 commercial porcine circovirus type 2 (PCV2) single-dose vaccines on pigs under experimental PCV2 challenge. Veterinary Microbiology 172 (3-4): 371-80.

144

184. OIE, 2015. Principles of veterinary vaccine production.

185. Okuda Y., Ono M., Yazawa S. and Shibata I., 2003. Experimental reproduction of postweaning multisystemic wasting syndrome in cesarean-derived, colostrum-deprived piglets inoculated with porcine circovirus type 2 (PCV2): investigation of quantitative PCV2 distribution and antibody responses. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 15 (2): 107–14.

186. Olvera A., Sibila M., Calsamiglia M., Segalés J. and Domingo M., 2004. Comparison of porcine circovirus type 2 load in serum quantified by a real time PCR in postweaning multisystemic wasting syndrome and porcine dermatitis and nephropathy syndrome naturally affected pigs. Journal of Virological Methods 117(1): 75–80.

187. Olvera A., Cortey M. and Segalés J., 2007. Molecular evolution of porcine circovirus type 2 genomes: phylogeny and clonality. Virology 357: 175-185.

188. Opriessnig T., Thacker E.L., Yu S., Fenaux M., Meng X.J. and Halbur P.G., 2004a. Experimental reproduction of postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs by dual infection with Mycoplasma hyopneumoniae and porcine circovirus type 2. Veterinary Pathology 41: 624–640.

189. Opriessnig T., Fenaux M., Yu S., Evans R. B., Cavanaugh D., Gallup G. M., Pallares F.J., Thacker E.L., Lager K.M., Meng X.J. and Halbur P.G., 2004b. Effect of porcine parvovirus vaccination on the development of PMWS in segregated early weaned pigs coinfected with type 2 porcine circovirus and porcine parvovirus. Veterinary Microbiology 98: 209–220.

190. Opriessnig T., McKeown N.E., Harmon K.L., Meng X.J. and Halbur P.G., 2006a. Porcine circovirus type 2 infection decreases the efficacy of a modified live porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccine. Clinical and Vaccine Immunology 13: 923–929.

191. Opriessnig T., Mckeown N.E., Zhou E., Meng X. and Halbur P.G., 2006b. Genetic and experimental comparison of porcine circovirus type 2 (PCV2) isolates from cases with and without PCV2-associated lesions provides evidence for differences in virulence. Journal of General Virology 87: 2923–2932.

192. Opriessnig T., Meng X.J., Halbur P.G., 2007. Porcine circovirus type 2– associated disease: update on current terminology, clinical manifestations, pathogenesis, diagnosis, and intervention strategies. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 19:591–615.

193. Opriessnig T., Patterson A.R., Elsener J., Meng X.J. and Halbur P.G., 2008a. Influence of maternal antibodies on efficacy of porcine circovirus type 2 (PCV2) vaccination to protect pigs from experimental infection with PCV2. Clinicaland Vaccine Immunology 15 (3): 397–401.

145

194. Opriessnig T., Ramamoorthy S., Madson D.M., Patterson a R., Pal N., Carman S., Meng X.J. and Halbur P.G., 2008b. Differences in virulence among porcine circovirus type 2 isolates are unrelated to cluster type 2a or 2b and prior infection provides heterologous protection. Journal of General Virology 89: 2482–91.

195. Opriessnig T., Ramamoorthy S., Madson D.M., Patterson a R., Pal N., Carman S., Meng X.J. and Halbur P.G., 2008c. Differences in virulence among porcine circovirus type 2 isolates are unrelated to cluster type 2a or 2b and prior infection provides heterologous protection. Journal of General Virology 89: 2482–91.

196. Opriessnig T., Patterson A.R., Madson D.M., Pal N. and Halbur P.G., 2009a. Comparison of efficacy of commercial one dose and two dose PCV2 vaccines using a mixed PRRSV-PCV2-SIV clinical infection model 2–3 months post vaccination. Vaccine 27 (7): 1002–1007.

197. Opriessnig T., Patterson A.R., Meng X.J. and Halbur P.G., 2009b. Porcine circovirus type 2 in muscle and bone marrow is infectious and transmissible to naïve pigs by oral consumption. Veterinary Microbiology 133 (1–2): 54–64.

198. Opriessnig T., Patterson A.R., Madson D.M., Pal N., Ramamoorthy S., Meng X.J. and Halbur P.G., 2010. Comparison of the effectiveness of passive (dam) versus active (piglet) immunization against porcine circovirus type 2 (PCV2) and impact of passively derived PCV2 vaccine-induced immunity on vaccination. Veterinary Microbiology 142: 177–183.

199. Opriessnig T., Neill K.O., Gerber P.F., Castro A.M.M.G. De Gimenéz-lirola L.G., Beach N.M., Zhou L., Meng X., Wang C. and Halbur P.G., 2013a. A PCV2 vaccine based on genotype 2b is more effective than a 2a-based vaccine to protect against PCV2b or combined PCV2a/2b viremia in pigs with concurrent PCV2, PRRSV and PPV infection. Vaccine 31 (3): 487-94.

200. Opriessnig T., Xiao C.-T., Gerber P.F. and Halbur P.G., 2013b. Emergence of a novel mutant PCV2b variant associated with clinical PCVAD in two vaccinated pig farms in the U.S. concurrently infected with PPV2. Veterinary Microbiology 163 (1-2): 177-83.

201. Opriessnig T., Gerber P.F., Xiao C.T., Mogler M. and Halbur P.G., 2014a. A commercial vaccine based on PCV2a and an experimental vaccine based on a variant mPCV2b are both effective in protecting pigs against challenge with a 2013 U.S. variant mPCV2b strain. Vaccine 32 (2): 230-237.

202. Opriessnig T., Gerber P.F., Xiao C.T., Halbur P.G., Matzinger S.R. and Meng X.J., 2014b. Commercial PCV2a-based vaccines are effective in protecting naturally PCV2b-infected finisher pigs against experimental challenge with a 2012 mutant PCV2. Vaccine 32: 4342-8.

146

203. Opriessnig T., Xiao C.T., Gerber P.F., Halbur P.G., Matzinger S.R. and Meng X.J., 2014c. Mutant USA strain of porcine circovirus type 2 (mPCV2) exhibits similar virulence to the classical PCV2a and PCV2b strains in caesarean-derived, colostrum-deprived pigs. Journal of General Virology 95: 2495–2503.

204. Ostanello F., Caprioli A., Di Francesco A., Battilani M., Sala G., Sarli G., Mandrioli L., McNeilly F., Allan G.M. and Prosperi S., 2005. Experimental infection of 3-week-old conventional colostrum-fed pigs with porcine circovirus type 2 and porcine parvovirus. Veterinary Microbiology 108: 179–186.

205. Pallares F.J., Halbur P.G., Opriessnig T., Sorden S.D., Villar D., Janke B.H., Yaeger M.J., Larson D.J., Schwartz K. J., Yoon K.J and Hoffman L.J., 2002. Porcine circovirus type 2 (PCV-2) coinfections in US field cases of postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS). Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 14 (6): 515–519.

206. Pan Q., He K. and Huang K., 2008. Development of recombinant porcine parvovirus-like particles as an antigen carrier formed by the hybrid VP2 protein carrying immunoreactive epitope of porcine circovirus type 2. Vaccine 26: 2119-2126.

207. Park J. S., Kim Y., Jung K., Choi C., Lim J-K., Kim S-H., Chae C., 2005. Birth abnormalities in pregnant sows infected intranasally with porcine circovirus 2. Journal of Comparative Pathology 132: 130-144.

208. Park J.S., Ha Y., Kwon B., Cho K.D., Lee B.H. and Chae C., 2009. Detection of porcine circovirus 2 in mammary and other tissues from experimentally infected sows. Journal of Comparative Pathology 140: 208–211.

209. Park K.H., Oh T., Yang S., Cho H., Kang I. and Chae C., 2019. Evaluation of a porcine circovirus type 2a (PCV2a) vaccine efficacy against experimental PCV2a, PCV2b, and PCV2d challenge. Veterinary Microbiology 231: 87– 92.

210. Pasquale A.D., Preiss S., Da Silva F.T. and Garçon N., 2015. Vaccine adjuvants: from 1920 to 2015 and beyond. Vaccines 3: 320-343.

211. Pejsak Z., Podgorska K., Truszczynski M., Karbowiak P. and Stadejek T., 2010. Efficacy of different protocols of vaccination against porcine circovirus type 2 (PCV2) in a farm affected by postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS). Comparative Immunology, Microbiology, and Infectious Diseases 33: e1–e5.

212. Pérez L.J., De Arce H.D., Cortey M., Domínguez P., Percedo M.I., Perera C.L., Tarradas J., Frias M.T., Seglés J., Ganges L. and Núñez J.I., 2011. Phylogenetic networks to study the origin and evolution of porcine circovirus type 2 (PCV2) in Cuba. Veterinary Microbiology 151 (3-4): 245–254.

147

213. Pérez-Martín E., Rovira A., Calsamiglia M., Mankertz A., Rodríguez F., and Segalés J., 2007. A new method to identify cell types that support porcine circovirus type 2 replication in formalin-fixed, paraffin-embedded swine tissues. Journal of Virology Methods 146: 86–95.

214. Phạm Hồng Quân, Phạm Công Hoạt, Huỳnh Thị Mỹ Lê, 2017. Đặc điểm dịch tễ học phân tử theo không gian và thời gian của porcine circovirus genotype 2d (PCV2d) lưu hành ở Việt Nam. Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 15 (5): 553-564.

215. Phan Thanh Đoàn, 2012. Điều tra bệnh và phân lập một số vi khuẩn cơ hội trên heo mắc hội chứng gầy còm sau cai sữa. Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp. Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam.

216. Pogranichnyy R.M., Yoon K., Harms P.A., Swenson S.L., Zimmerman J.J. and Sorden S.D., 2000. Characterization of immune response of young Porcine Circovirus type 2 infection. Viral Immunology 13 (2): 143-153.

217. Pogranichniy R.M., Yoon K.J., Harms P.A, Sorden S.D. and Daniels M.,2002. Case-control study on the association of porcine circovirus type 2 and other swine viral pathogens with postweaning multisystemic wasting syndrome. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 14: 449–456.

218. Pogranichniy R.M., Yoon K.J., Yaeger M., Vaughn E., Harmon K., Stammer R. and Roof M., 2004. Efficacy of experimental inactivated PCV2 vaccines for preventing PMWS in CDCD pigs. In Proceedings of Annual Meeting American Association of Swine Veterinarians 35: 443-444.

219. Quintana J., Balasch M., Segalés J., Calsamiglia M., Rodríguez-Arrioja G.M., Plana-Duran J. and Domingo M., 2002. Experimental inoculation of porcine circoviruses type 1 (PCV1) and type 2 (PCV2) in rabbits and mice. Veterinary Research 33: 229–237.

220. Ramamoorthy S., Meng X.J., 2009. Porcine circoviruses: a minuscule yet mammoth paradox. Animal Health Research Reviews 10: 1–20.

221. Raye W., Muhling J., Warfe L., Buddle J.R., Palmer C. and Wilcox G.E., 2005. The detection of porcine circovirus in the Australian pig herd. Australian Veterinary Journal 83: 300–304.

222. Reed L.J. and Muench H., 1938. A simple method of estimating fifty per cent endpoints. American Journal of Epidemiology 27(3): 493–497.

223. Resendes A., Segalés J., Balasch M., Calsamiglia M., Sibila M., Elllerbrok H., Mateu E., Plana-Durán J., Mankertz A. and Domingo M., 2004a. Lack of an effect of a commercial vaccine adjuvant on the development of postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) in porcine circovirus type 2 (PCV2) experimentally infected conventional pigs. Veterinary Research 35: 83-90.

148

224. Resendes A.R., Majo N., Segalés J., Mateu E., Calsamiglia M. and Domingo M., 2004b. Apoptosis in lymphoid organs of pigs naturally infected by porcine circovirus type 2. Journal of General Virology 85: 2837–2844.

225. Reynaud G., Beseme S., Brun A., Charreyre C., Desgouilles S., Jeannin P. and Rehbein S., 2004a. Safety of a high dose administration of an inactivated adjuvanted PCV2 vaccine in conventional gilts. In Proceedings of the 18th International Pig Veterinary Society. Hamburg, Germany, p87.

226. Reynaud G., Brun A., Charreyre C., Desgouilles S. and Jeannin P., 2004b. Safety of repeated overdose on an inactivated adjuvanted PCV2 vaccine in conventional pregnant gilts and sows. In Proceedings of the 18th International Pig Veterinary Society Congress. Hamburg, Germany, p88.

227. Rodriguez-Arrioja G.M., Segalés J., Calsamiglia M., Resendes A. R., Balasch M., Plana-Duran J., Casal J. and Domingo M., 2002. Dynamics of porcine circovirus type 2 infection in a herd of pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome. American Journal of Veterinary Research 63: 354–357.

228. Rodríguez-Carĩno C., Sánchez-Chardi A. and Segalés J. 2010. Subcellular immunolocalization of porcine circovirus type 2 (PCV2) in lymph nodes from pigs with post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS). Journal of Comparative Pathology 142: 291-299.

229. Rodríguez-Carĩno C., Duffy C., Sánchez-Chardi A., McNeilly F., Allan G.M., and Segalés J., 2011. Porcine circovirus type 2 morphogenesis in a clone derived from the l35 lymphoblastoid cell line. Journal of Comparative Pathology 144 (2–3): 91–102.

230. Rogers A.R. and Harpending H., 1992. Population growth makes waves in the distribution of pairwise genetic differences. Molecular Biology and Evolution 9: 552-569.

231. Rosario K., Breitbart M., Harrach B., Segales J., Delwart E., Biagini P. and Varsani A., 2017. Revisiting the taxonomy of the family Circoviridae: establishment of the genus Cyclovirus and removal of the genus Gyrovirus. Archives of Virology 162:1447–1463.

232. Rose N., Abhervé-Guéguen A., Le Diguerher G., Eveno E., Jolly J.P., Blanchard P., Oger A., Jestin A. and Madec F., 2005. Effect of the Piétrain breed used as terminal boar on post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) in the offspring in four PMWS-affected farms. Livestock Production Science 95: 177-186.

233. Rosell C., Segalés J., Plana-Duran J., Balasch M., Rodríguez-Arrioja G.M., Kennedy S., Allan G. M., McNeilly F., Latimer K. S. and Domingo M. 1999. Pathological, immunohistochemical, and in-situ hybridization studies of natural cases of postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) in pigs. J Comp Pathol 120, 59-78.

149

234. Rosell C., Segalés J., Ramos-Vara J.A., Folch J.M., Rodrı´guez-Arrioja G.M., Duran C.O., Balasch M., Plana-Durán J. and Domingo M., 2000. Identification of porcine circovirus in tissues of pigs with porcine dermatitis and nephropathy syndrome. Veterinary Record 146: 40–43.

235. Rovira A., Balasch M., Segalés J., Garcia L., Plana-Duran J., Rosell C., Ellerbrock H., Mankertz A. and Domingo M., 2002. Experimental inoculation of conventional pigs with porcine reproductive and respiratory syndrome virus and porcine circovirus 2. Journal of Virology 76: 3232–3239.

236. Royer R., Nawagitgul P., Halbur P.G. and Paul P.S., 2001. Susceptibility of porcine circovirus type 2 to commercial and laboratory disinfectants. Journal of Swine Health and Production 9: 281-284.

237. Saha D., Lefebvre D.J., Ooms K., Huang L., Delputte P.L., Van Doorsselaere J. and Nauwynck H.J., 2012. Single amino acid mutations in the capsid switch the neutralization phenotype of porcine circovirus 2. Journal of General Virology 93: 1548–1555.

238. Sanchez R.E., Nauwynck H.J., McNeilly F., Allan G.M. and Pensaert M.B., 2001. Porcine circovirus 2 infection in swine foetuses inoculated at different stages of gestation. Veterinary Microbiology 83: 169-176.

239. Sanchez R.E., Jr., Meerts P., Nauwynck H. J., Ellis J. A. and Pensaert M.B. 2004. Characteristics of porcine circovirus-2 replication in lymphoid organs of pigs inoculated in late gestation or postnatally and possible relation to clinical and pathological outcome of infection. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 16: 175-185.

240. Schulze C., Segalés J., Neumann G., Hlinak A., Calsamiglia M. and Domingo M., 2004. Identification of postweaning multisystemic wasting syndrome in European wild boar (Sus scrofa). Veterinary Record 154: 694–696.

241. Segalés J., Piella J., Marco E., Mateu-de-Antonio E.M., Espuna E. and Domingo M., 1998. Porcine dermatitis and nephropathy syndrome in Spain. Veterinary Record 142 (18): 483–486.

242. Segalés J. and Domingo M., 2002. Postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) in pigs. A review. The Veterinary quarterly 24: 109- 124.

243. Segalés J., Rosell C. and Domingo M., 2004. Pathological findings associated with naturally acquired porcine circovirus type 2 associated disease. Veterinary Microbiology 98: 137–149.

244. Segalés J., Allan G. M. and Domingo, M. 2005a. Porcine circovirus diseases. Animal Health Research Reviews 6: 119-142.

245. Segalés J., Calsamiglia M., Olvera A., Sibila M., Badiella L. and Domingo M., 2005b. Quantification of porcine circovirus type 2 (PCV2) DNA in serum and tonsillar, nasal, tracheo-bronchial, urinary and faecal swabs of pigs

150

with and without postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS). Veterinary Microbiology 111: 223–229.

246. Segalés J., Olvera A., Grau-Roma L., Charreyre C., Nauwynck H., Larsen L., Dupont K., McCullough K., Ellis J., Krakowka S., Mankertz A., Fredholm M., Fossum C., Timmusk S., Stockhofe-Zurwieden N., Beattie V., Armstrong D., Grassland B., Baekbo P. and Allan G., 2008. PCV-2 genotype definition and nomenclature. Veterinary Record 162 (26): 867–868.

247. Segalés J., Urniza A., Alegre A., Bru T., Crisci E., Nofrarías M., Lop1ez-Soria S., Balasch M., Sibila M., Xu Z., Chu H.J., Fraile L. and Plana-Duran J., 2009. A genetically engineered chimeric vaccine against porcine circovirus type 2 (PCV2) improves clinical, pathological and virological outcomes in postweaning multisystemic wasting syndrome affected farms. Vaccine 27(52): 7313–7321.

248. Segalés J., 2012. Porcine circovirus type 2 (PCV2) infections: clinical signs, pathology and laboratory diagnosis. Virus Research 164 (1-2): 10–9.

249. Seo H.W., Oh Y., Han K., Park C. and Chae C., 2012. Reduction of porcine circovirus type 2 (PCV2) viremia by a reformulated inactivated chimeric immunity after PCV1-2 vaccine-induced humoral and cellular experimental PCV2 challenge. BMC Veterinary Research 8 (1): 194.

250. Seo H.W., Park C., Kang I., Choi K., Jeong J., Park S.J. and Chae C., 2014a. Genetic and antigenic characterization of a newly emerging porcine circovirus type 2b mutant first isolated in cases of vaccine failure in Korea. Archives of Virology 159: 3107–3111.

251. Seo H.W., Han K., Park C. and Chae C., 2014b. Clinical, virological, immunological and pathological evaluation of four porcine circovirus type 2 vaccines. Veterinary Journal 200 (1): 65–70.

252. Shang S. Bin, Jin Y.L., Jiang X.T., Zhou J.Y., Zhang X., Xing G., He J.L. and Yan Y., 2009. Fine mapping of antigenic epitopes on capsid proteins of porcine circovirus, and antigenic phenotype of porcine circovirus Type 2. Molecular Immunology 46: 327–334.

253. Shen H.G., Beach N.M., Huang Y.W., Halbur P.G., Meng X.J. and Opriessnig T., 2010. Comparison of commercial and experimental porcine circovirus type 2 (PCV2) vaccines using a triple challenge with PCV2, porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), and porcine parvovirus (PPV). Vaccine 28 (37): 5960–5966.

254. Shibahara, T., Sato, K., Ishikawa, Y. & Kadota, K. 2000. Porcine circovirus induces B lymphocyte depletion in pigs with wasting disease syndrome. Journal of Veterinary Medical Science 62: 1125-1131.

255. Shibata I., Okuda Y., Yazawa S., Ono M., Sasaki T., Itagaki M., Nakajima N., Okabe Y. and Hidejima I., 2003. PCR detection of porcine circovirus type

151

2 DNA in whole blood, serum, oropharyngeal swab, nasal swab, and feces from experimentally infected pigs and field cases. Journal of Veterinary Medical Science 65: 405–408.

256. Shibata I., Okuda Y., Kitajima K. and Asai T., 2006. Shedding of porcine circovirus into colostrum of sows. Journal of Veterinary Medicine Series B 53: 278–280.

257. Sibila M., Calsamiglia M., Segalés J., Blanchard P., Badiella L., Le Dimna M., Jestin A. and Domingo M., 2004. Use of a polymerase chain reaction assay and an ELISA to monitor porcine circovirus type 2 infection in pigs from farms with and without postweaning multisystemic wast- ing syndrome. American Journal of Veterinary Research 65: 88–92.

258. Song Y., Jin M., Zhang S., Xu X., Xiao S., Cao S. and Chen H., 2007. Generation and immunogenicity of a recombinant pseudorabies virus expressing cap protein of porcine circovirus type 2. Veterinary Microbiology 119 (2–4): 97–104.

259. Sorden S.D., 2000. Update on porcine circovirus and post- weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS). The Journal of Swine Health and Production 8: 133–136.

260. Soulebot J.P., Folkers C., Taylor J. and Pastoret P.P., 1997. Properties of vaccines. Veterinary vaccinology (P.P. Pastoret, J. Blancou, P. Vannier and C. Verschueren). Elsevier, Amsterdam, The Netherlands, pp. 159-166.

261. Steiner E., Balmelli C., Gerber H., Summerfield A. and Mccullough K., 2009. Cellular adaptive immune response against porcine circovirus type 2 in subclinically infected pigs. BMC Veterinary Research 5: 45.

262. Stevenson L.S., McCullough K., Vincent I., Gilpin D.F., Summerfield A., Nielsen J., McNeilly F., Adair B.M. and Allan G.M., 2006. Cytokine and C-reactive protein profiles induced by porcine circovirus type 2 experimental infection in 3-week-old piglets. Viral Immunology 19 (2): 189–195.

263. Takahagi Y., Toki S., Nishiyama Y., Morimatsu F. and Murakami H., 2010. Differential effects of porcine circovirus type 2 (PCV2) vaccination on PCV2 genotypes at Japanese pig farms. The Journal of Veterinary Medical Science 72 (1): 35-41.

264. Thacker B. and Thacker E., 2000. The PRDC battle continues. Pig Progress June 16–18.

265. Tischer I., Gelderblom H., Vettermann W. and Koch M.A., 1982. A very small porcine virus with circular single-stranded DNA. Nature 295 (5844): 64-66.

266. Tischer I., Peters D., Rasch R. and Pociuli S., 1987. Replication of porcine circovirus: induction by glucosamine and cell cycle dependence. Archives of Virology 96 (1–2): 39–57.

152

267. Tischer I., Bode L., Apodaca J., Timm H., Peters D., Rasch R., Pociuli S. and Gerike E., 1995. Presence of antibodies reacting with porcine circovirus in sera of humans, mice, and cattle. Archives of Virology 140: 1427–1439.

268. Tomás A., Fernandes L.T., Valero O., Segalés J., 2008. A meta-analysis on experimental infections with porcine circovirus type 2 (PCV2). Veterinary Microbiology 132: 260–273.

269. Trần Thị Dân, Nguyễn Tất Toàn, Nguyễn Thị Thu Năm, Võ Thị Trà An, Hồ Thị Nga, Nguyễn Thị Phước Ninh, Lê Hữu Ngọc, Nguyễn Đình Hòa, Bùi Văn Đông, Nguyễn Hữu Tín, 2010. Biến đổi chỉ tiêu huyết học và bệnh tích ở heo nuôi thịt được tiêm vắc-xin thể ORF2 phòng ngừa hội chứng gầy còm và viêm da – thận do circovirus type 2. Tạp chí KHKT Thý y XVII (3): 14-20.

270. Tran T. Dan, Nguyen T. Toan, Nguyen T.H. Diem, Van N. Dung, Vo K. Hung, Ngo B. Duy, Do T. Duy, Nguyen T.T. Nam, Nguyen T.P. Ninh and Le H. Ngoc, 2013. Comparision of one-dose vaccine vesus two-dose vaccine against porcine circovirus type 2 in piglets. In Proceedings of 6th Asian Pig Veterinary Society Congress, Ho Chi Minh City, Vietnam, 23-25 Sep 2013, p OR57.

271. Trible B.R., Kerrigan M., Crossland N., Potter M., Faaberg K., Hesse R. and Rowland, R.R.R., 2011. Antibody recognition of porcine circovirus type 2 capsid protein epitopes after vaccination, infection, and disease. Clinical and Vaccine Immunology 18 (5): 749–757.

272. Vicente J., Segalés J., Hofle U., Balasch M., Plana-Duran J., Domingo M. and Gortazar C., 2004. Epidemiological study on porcine circovirus type 2 (PCV2) infection in the European wild boar (Sus scrofa). Veterinary Research 35: 243–253.

273. Vincent I.E., Carrasco C.P., Herrmann B., Meehan B.M., Allan G.M., Summerfield A. and McCullough K.C., 2003. Dendritic cells harbor infectious porcine circovirus type 2 in the absence of apparent cell modulation or replication of the virus. Journal of Virology 77: 13288-13300.

274. Vincent I.E., Carrasco C.P., Guzylack-Piriou L., Herrmann B., McNeilly F., Allan G.M., Summerfield A. and McCullough K.C., 2005. Subset- dependent modulation of dendritic cell activity by circovirus type 2. Immunology 115 (3): 388–398.

275. Vincent I.E., Balmelli C., Meehan B., Allan G., Summerfield A. and McCullough K.C., 2007. Silencing of natural interferon producing cell activation by porcine circovirus type 2 DNA. Immunology 120 (1): 47–56.

276. Wang X., Jiang W., Jiang P., Li Y., Feng Z. and Xu J., 2006. Construction and immunogenicity of recombinant adenovirus expressing the capsid protein of porcine circovirus 2 (PCV2) in mice. Vaccine 24: 3374-3380.

153

277. Wang X., Jiang P., Li Y., Jiang W. and Dong X., 2007. Protection of pigs against postweaning multisystemic wasting syndrome by a recombinant adenovirus expressing the capsid protein of porcine circovirus type 2. Veterinary Microbiology 121: 215-224.

278. Wang K., Huang L.H., Kong J. and Zhang X.W., 2008. Expression of the capsid protein of porcine circovirus type 2 in Lactococcus lactis for oral vaccination. Journal of Virology Methods 150: 1-6.

279. Wang F., Guo X., Ge X., Wang Z., Chen Y., Cha Z. and Yang H., 2009. Genetic variation analysis of Chinese strains of porcine circovirus type 2. Virus Research 145 (1): 151–156.

280. Welch J., Bienek C., Gomperts E. and Simmonds P., 2006. Resistance of porcine circovirus and chicken anemia virus to virus inactivation procedures used for blood products. Transfusion 46: 1951-1958.

281. West K.H., Bystrom J.M., Wojnarowicz C., Shantz N., Jacobson M., Allan G.M., Haines D.M., Clark E.G., Krakowka S., McNeilly F., Konoby C., Martin K. and Ellis J.A., 1999. Myocarditis and abortion associated with intrauterine infection of sows with porcine circovirus 2. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 11 (6): 530–532.

282. Xi X., Mo X., Xiao Y., Yin B., Lv C., Wang Y., Sun Z., Yang Q., Yao Y., Xuan Y., Li X., Yuan A.Y. and Tian K., 2016. Production of Escherichia coli- based virus-like particle vaccine against porcine circovirus type 2 challenge in piglets: Structure characterization and protective efficacy validation. Journal of Biotechnology 223: 8–12.

283. Xiao C.T., Halbur P.G. and Opriessnig T., 2012. Complete genome sequence of a novel porcine circovirus type 2b variant present in cases of vaccine failures in the United States. Journal of Virology 86: 12469–12473.

284. Xiao C.T., Halbur P.G. and Opriessnig T., 2015. Global molecular genetic analysis of porcine circovirus type 2 (PCV2) sequences confirms the presence of four main PCV2 genotypes and reveals a rapid increase of PCV2d. Journal of General Virology 96: 1830-1841.

285. Xiao C., Harmon K.M., Halbur P.G., Opriessnig T., 2016. PCV2d-2 is the predominant type of PCV2 DNA in pig samples collected in the U.S. during 2014 – 2016. Veterinary Microbiology 197:72–77.

286. Xujie L., Xiaobo W., Yi S., Jing F., Song G. and Xiufan L., 2011. A candidate inactivated chimeric vaccine PCV1-2 constructed based on PCV1 and PCV2 isolates originating in China and its evaluation in conventional pigs in regard to protective efficacy against PCV2 infection. Microbiology and Immunology 55 (4): 254-266.

287. Yang K., Li W., Niu H., Yan W., Liu X., Wang Y., Cheng S., Ku X. and He Q., 2012. Efficacy of single dose of an inactivated porcine circovirus type 2

154

(PCV2) whole-virus vaccine with oil adjuvant in piglets. Acta Veterinaria Scandinavica 54: 67.

288. Yu S., Opriessnig T., Kitikoon P., Nilubol D., Halbur P.G. and Thacker E., 2007a. Porcine circovirus type 2 (PCV2) distribution and replication in tissues and immune cells in early infected pigs. Veterinary Immunology and Immunopathology 115 (3–4): 261–272.

289. Yu S., Vincent A., Opriessnig T., Carpenter S., Kitikoon P., Halbur P.G. and Thacker E., 2007b. Quantification of PCV2 capsid transcript in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in vitro. Veterinary Microbiology 123: 34-42.

290. Zhai S.L., Chen S.N., Xu Z.H., Tang M.H, Wang F.G, Li X.J., Sun B.B., Deng S.F., Hu J., Lv D.H., Wen X.H., Yuan J., Luo M.L and Wei W.K., 2014. Porcine circovirus type 2 in China: an update on and insights to its prevalence and control. Veterinary Journal 11:88.

291. Zhu S., Zhang C., Wang J., Wei L., Quan R., Yang J., Yan X., Li Z., She R., Hu F., Liu J., 2016. Immunity elicited by an experimental vaccine based on recombinant flagellin-porcine circovirus type 2 cap fusion protein in piglets. PLoS ONE 11(2): e0147432

292. Zuhara B., Joanne M., Dinh N. T. K., Dung N. V., Huong N. T. L., Phuc K. V., Hung V., Spradbrow P., 2004. Antigenic relatedness of duck plague viruses isolated in Vietnam. Aciar proceeding 117: 71 - 76.

155

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Các mẫu PCV2 tham khảo từ Nguyễn Thị Thu Hồng và ctv (2008)

STT Ký hiệu mẫu

Nhóm heo

vietnam1/2002

Nơi lấy mẫu Long An

Năm thu thập mẫu 2002

2 NAVET-

Bình Dương

2004

vietnam3/2004

Không có dữ liệu Không có dữ liệu

Triệu chứng lâm sàng Không có dữ liệu Không có dữ liệu

2006

vietnam2/2006

Vũng Tàu

Sau cai sữa

Còi, viêm da

vietnam5/2007

2007

Sau cai sữa

Bình thường

Tp. Hồ Chí Minh

Phụ lục 2. Các chủng PCV2 tham khảo từ GenBank

STT

Chủng

Tham khảo

EU340257/isolate 17639/Canada/2006

1 AF055392/strain 1010 Stoon/Canada/1998 2 AF264042/isolate 40895/USA/1998 3 AF465211/strain SC/Taiwan/2002 4 AY256455/strain 212/Hungary/2003 5 HM038034/strain LG/China/2008 6 KM042397/strain 748-NA/Vietnam/2008 7 AF055394/strain 48285/France/1998 8 DQ629115/isolate n32eu/USA/2005 9 10 EU340258/isolate 16845/USA/2007 11 EU886637/isolate Aust3959/Australia/2007 12 FJ598044/strain WuHan/China/2008 13 JQ181591/isolate HB1-1/Vietnam/2011 14 KF871068/strain SNUVR000463/Korea 15 EU148503/isolate DK1980PMWSfree/

Genotype 2a 2a 2a 2a 2a 2a 2b 2b 2b 2b 2b 2b 2b 2b 2c

Meehan và ctv, 1998 Fenaux và ctv, 2000 Không công bố Dan và ctv, 2003 Guo và ctv, 2010 Không công bố Meehan và ctv, 1998 Cheung và ctv, 2007 Opriessnig và ctv, 2008 Opriessnig và ctv, 2008 O'Dea và ctv, 2011 Không công bố Huynh và ctv, 2012 Seo và ctv, 2014 Dupont và ctv, 2008

Danmark/1980

16 KJ094599/strain PM163/Brazil/2010 17 AY181946/strain TJ/China/2002 18 AY686763/strain SH/China/2004 19 KP698404/isolate DE143-14/Germany/2014 20 LC004742/isolate ML-7/India/2013

2c Franzo và ctv, 2015 2d-1 Wang và ctv, 2009 2d-1 2d-1 2d-1

JQ181600/isolate Han8/Vietnam/2011 JX535296/isolate 22625-33/USA/2012

21 HM038017/strain BDH/China/2008 22 23 24 KJ133547/strain

Không công bố Eddicks và ctv, 2015 Bhattacharjee và ctv, 2015 Guo và ctv, 2010 Huynh và ctv, 2012 Xiao và ctv, 2012 Seo và ctv, 2014

2d-2 2d-2 2d-2 2d-2

SNUVR130689/Korea/2013

25 KJ187306/strain PCV2-UFV1/Brazil/2013 26 KX828231/isolate KU-1604/Korea/2016 27 KT795287/strain MEX/41238/2014

2d-2 2d-2 2e

Salgado và ctv, 2014 Kwon và ctv, 2017 Harmon và ctv, 2015

156

Chủng

Tham khảo

STT 28 KT795290/strain USA/45358/2015 29 KT867795/isolate PCV2/USA/IA-084/2013 30 KT867799/isolate PCV2/USA/MN-

Genotype 2e 2e 2e

Harmon và ctv, 2015 Không công bố Không công bố

088/2006

31 KT867801/isolate PCV2/MEX/YU-

Không công bố

002/2012

2e 2f 2f

Xiao và ctv, 2016 Không công bố Không công bố

32 KX510062/isolate 19792-IA-2016-APRIL 33 LC004750/isolate MZ-5/India/2013 34 KT369067/strain Papuan 04.1/Indonesia/2013

JX099786/isolate P2425NT/Vietnam/2008

35 MF139076/isolate SC5/China/1999 36 37 FJ998185/strain SCNB/CHA/05/

2f 2g* 2g*

Bao và ctv, 2018 Huynh và ctv, 2012 Không công bố

2g*

Turcitu và ctv, 2011

China/2005 JN006443/isolate WB/ROM3/Romania/2008

JQ181599/isolate Han6-13/Vietnam/2011 JX099781/isolate P477LG/Vietnam/2009

39 HM776443/isolate HUN-11/China/2009 40 HQ395058/strain 10QH/China/2010 41 42 43 KJ729072/isolate PCV2Izn-89-

Re (2h)** Zhao và ctv, 2010 Re (2h)** Cai và ctv, 2012 Re (2h)** Huynh và ctv, 2012 Re (2h)** Huynh và ctv, 2012 Re (2h)** Anoopraj và ctv, 2015

13/India/2013

Re (2h)** Không công bố

44 MH465473/strain GXYL1208/China/2012 Re (2h) Yao và ctv, 2019 45 MH465453/ strain GXLZ1208a/China/2012 Re (2h) Yao và ctv, 2019 46 KM042398/strain 549-QNa/Vietnam/2009 * 2g: theo phân loại mới của Franzo và Segalés (2018) ** Re: recombinant (nhóm tái tổ hợp), 2h: theo phân loại mới của Franzo và Segalés (2018)

Phụ lục 3. Phương pháp miễn dịch peroxidase trên tế bào một lớp (IPMA) định lượng

kháng thể

+ Mẫu dùng để làm phản ứng: mẫu huyết thanh

+ Các bước thực hiện: thực hiện theo quy trình của AAHL

(a) Chuẩn bị đĩa phản ứng

- Nhiễm PCV2 trên tế bào PK15A trong vĩ nhựa 96 giếng.

- Đem ủ ở 370C, 5% CO2 trong 4 ngày.

- Rút bỏ môi trường duy trì và rửa tế bào 1 lần bằng dung dịch PBS.

- Cho vào 200 µl/giếng dung dịch cố định tế bào formaldehyde 10% chứa 0,1% NP40.

- Để 20 phút ở nhiệt độ phòng.

- Rửa 4 lần với dung dịch PBST.

157

- Đĩa có thể dùng để thực hiện phản ứng ngay hoặc trữ ở 40C đến khi thực hiện

phản ứng nhuộm IPMA.

(b) Phương pháp nhuộm miễn dịch peroxidase (IPX)

- Cho 100 µl/giếng dung dịch ngăn cản (block) tế bào chứa 1% BSA trong

ELISA Buffer - EB).

- Đem ủ ở 370C trong 30 phút.

- Rửa 4 lần với dung dịch PBST.

- Cho vào 50 µl/giếng huyết thanh kháng PCV1 và PCV2 chuẩn dùng làm đối

chứng (PCV1 và PCV2 chuẩn được pha loãng 1/100) và huyết thanh kiểm tra

(được pha loãng 1/20, sau đó pha loãng bậc 2). Tất cả được pha loãng trong

dung dịch đệm EB.

- Đem ủ ở 370C trong 1 giờ.

- Rửa 4 lần với dung dịch PBST.

- Cho vào 50 µl/giếng cơ chất protein A, được pha loãng 1/25000 trong dung

dịch đệm EB.

- Đem ủ ở 370C trong 1 giờ.

- Rửa 4 lần với dung dịch PBST.

- Cho 200 µl/giếng dung dịch substrate.

+ 0,002 g AEC (amino ethyl carbozole)

+ 0,5 ml N,N-dimethyl formamide

+ 9,5 ml acetate buffer 0,05M

+ 5 µl H2O2 30%

- Để ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, cho đến khi xuất hiện màu đỏ gạch ở giếng

đối chứng dương.

- Cho 200 µl/giếng nước cất để làm ngừng phản ứng.

- Đọc kết quả dưới kính hiển vi đảo pha.

- Hiệu giá kháng thể là số đảo của độ pha loãng cao nhất mà tế bào có nhuộm

màu. Hiệu giá kháng thể của mẫu kiểm tra  5,32log2 (1/40) được đánh giá là

dương tính với kháng thể chống PCV2.

158

Phụ lục 4. Phương pháp ELISA phát hiện kháng thể IgG chống PCV2

Quy trình phản ứng ELISA phát hiện IgG chống PCV2 trong huyết thanh theo

hướng dẫn của nhà sản xuất kít Ingezim CIRCO IgG (Ingenasa, Madrid, Tây Ban Nha):

Nguyên tắc phản ứng: bộ kít Ingezim CIRCO IgG sử dụng kỹ thuật ELISA

gián tiếp với kháng nguyên là protein tái tổ hợp PCV được cố định vào đáy giếng (đĩa

polystyrene). Xác định kháng thể IgG chống PCV2 trong huyết thanh heo.

Các bước thực hiện phản ứng:

Bước 1: Cho 100 µl đối chứng dương vào 2 giếng (giếng A1 và B1), đối chứng

âm vào 2 giếng (giếng A2 và B2). Cho 100 µl mẫu huyết thanh kiểm tra (đã được pha

loãng 1/200) vào các giếng còn lại theo sơ đồ bố trí mẫu. Ủ đĩa phản ứng ở nhiệt độ

phòng trong vòng 1 giờ. Nếu trong mẫu có kháng thể chống PCV2, sẽ có sự kết hợp

với kháng nguyên có sẵn.

Bước 2: rửa đĩa phản ứng 4 lần với dung dịch rửa. Cho 100 µl conjugate (kháng

thể đơn dòng đặc hiệu chống immunoglobulins của heo gắn với peroxidase) vào tất

cả các giếng. Ủ đĩa phản ứng ở nhiệt độ phòng trong vòng 30 phút. Nếu trong mẫu

huyết thanh kiểm tra có kháng thể đặc hiệu, conjugate sẽ kết hợp với kháng thể đặc

hiệu. Nếu trong mẫu kiểm tra không có kháng thể đặc hiệu, conjugate sẽ bị rửa trôi ở

bước kế tiếp.

Bước 3: rửa đĩa phản ứng 6 lần với dung dịch rửa. Cho 100 µl cơ chất vào tất

cả các giếng. Ủ đĩa phản ứng ở nhiệt độ phòng trong vòng 10 phút.

Bước 4: cho 100 µl dung dịch dừng phản ứng vào tất cả các giếng.

Bước 5: đo mật độ quang OD (optical density) ở bước song 450 nm. Dựa vào

giá trị OD để xác định sự hiện diện của kháng thể.

Đánh giá kết quả:

Phản ứng được xem là hợp lý khi giá trị OD của đối chứng âm < 0,35, OD đối

chứng dương > 0,7.

Giá trị ngưỡng:

Ngưỡng âm tính = OD đối chứng âm + 0,2

Ngưỡng dương tính = OD đối chứng âm + 0,25

159

- Mẫu kiểm tra được đánh giá là dương tính khi có giá trị OD cao hơn

ngưỡng dương tính.

- Mẫu kiểm tra được đánh giá là âm tính khi có giá trị OD thấp hơn ngưỡng

âm tính.

- Mẫu có giá trị OD nằm giữa 2 giá trị ngưỡng âm tính và dương tính được

xem là nghi ngờ.

Phụ lục 5. Ví dụ minh họa cách tính %VNT50

Ví dụ minh họa cách tính VNT50. (A) chọn ngẫu nhiên 3 vùng ở mỗi giếng

phản ứng (ở độ phóng đại 100 lần). (B) Giếng có độ pha loãng 1:8 có số tế bào nhiễm

< 50% so với giếng đối chứng, suy ra hiệu giá 50%VN là 1:8 (Lyoo, 2009).

160

Phụ lục 6. Cách tính hiệu giá vi- rút chuẩn độ bằng công thức Reed và Muench (1938)

Số liệu quan sát Giá trị tích lũy1

Tỷ lệ nhiễm2 % nhiễm3 Số giếng âm tính Độ pha loãng vi-rút Số giếng dương tính Tổng số giếng dương tính cộng dồn Tổng số giếng âm tính cộng dồn Số giếng dương tính/ tổng số giếng gây nhiễm ở mỗi độ pha loãng

4 4 4 3 1 0 4/4 4/4 4/4 3/4 1/4 0/4 16 12 8 4 1 0 16/16 12/12 8/8 4/5 1/5 0/8 0 0 0 1 4 8 0 0 0 1 3 4 100 100 100 80 20 0

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 1 Giá trị tích lũy là giá trị cộng dồn của các số liệu quan sát theo hướng mũi tên 2 Tỷ lệ nhiễm là tổng số giếng có tế bào nhuộm màu trên tổng số các giá trị tích lũy 3 Tỉ lệ % nhiễm là tỷ lệ nhiễm được chuyển đổi sang tỉ lệ % Như vậy, độ pha loãng vi-rút chứa 1 TCID50 sẽ nằm giữa 10−4 và 10−5, vì vậy

điểm cuối của nó được tính là: 10−(4+x) và x chính là giá trị phải tính bởi công thức

% nhiễm tại độ pha loãng cận trên 50% − 50

như sau:

log10 thừa số pha loãng

)

(

% nhiễm tại độ pha loãng cận trên 50% − % nhiễm tại độ pha loãng cận dưới 50%

80 − 50

)

= 0,5

(

= 1 80 − 20

Điểm cuối = 10− (4 + 0,5) = 10– 4,5

Như trình bày ở mục 2.5.5, mỗi giếng cho 0,1ml dịch vi-rút pha loãng nên

0,1ml của độ pha loãng 10− 4,5 chứa 1 TCID50 vi-rút. Hiệu giá của dung dịch vi-rút đó

là 104,5 TCID50/0,1ml, hay 105,5 TCID50/1ml. Hoặc trình bày dạng log10 TCID50/ml là

5,5log10 TCID50/ml

161

Hiệu giá (log10 TCID50/ml) của các chủng vi-rút phân lập được

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

STT Ký hiệu mẫu Số giếng dương tính/ tổng số giếng gây nhiễm ở mỗi độ pha loãng Kết quả phân lập

Độ pha loãng

TpHCM6/2010

1/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 4/4 4/4 1/4 0/4 0/4 0/4 1/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 4/4 4/4 1/4 0/4 0/4 0/4 4/4 4/4 4/4 0/4 0/4 0/4 1/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 4/4 4/4 2/4 0/4 0/4 0/4 4/4 4/4 4/4 4/4 0/4 0/4 1/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 4/4 4/4 4/4 4/4 0/4 0/4 4/4 4/4 4/4 2/4 0/4 0/4 4/4 4/4 4/4 2/4 0/4 0/4

1 CaMau/2007 2 KhanhHoa/2007 3 BinhDuong1/2009 4 NAVET-BinhDuong2/2009 5 BinhDuong3/2009 6 BinhDuong4/2009 7 NAVET-DongNai2/2009 8 9 BinhDinh5/2013 10 BinhDinh6/2013 11 NAVET-TpHCM8/2016 12 NAVET-LongAn2/2012 13 BinhDinh1/2013 14 LamDong1/2013 15 NAVET-NgheAn1/2015 16 NAVET-NgheAn2/2015 17 NAVET-BenTre/2014 18 CanTho/2008 19 TpHCM4/2010 20 BinhDuong6/2012 21 BinhDinh3/2013 - * - * + + + + + + + + + + + + + + + - * + + + Hiệu giá (P3) log10 TCID50/ml - - 1,67 3,67 1,67 3,67 4,50 1,67 1,67 1,67 4,00 5,50 1,67 1,67 5,50 5,00 5,00 - 4,33 1,67 1,67 4/4 4/4 3/4 0/4 0/4 0/4 1/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 1/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4

(- *): âm tính, không chuẩn độ

162

Phụ lục 7. Kiểm tra tạp nhiễm vi-rút và Mycoplasma

Kiểm tra tạp nhiễm vi-rút và Mycoplasma trên heo trước khi đưa vào thí nghiệm và

kiểm tra tính thuần khiết của các chủng PCV2 được chọn làm giống để nghiên cứu chế tạo

vắc-xin 1. Tách chiết ARN/ADN vi-rút: sử dụng bộ kit Viral Gene-spinTMViral DNA/RNA

Extraction Kit (iNtRON, code: 17151). Quy trình thực hiện theo hướng dẫn của nhà

sản xuất.

2. Trình tự mồi dùng để phát hiện vi-rút

Mồi Trình tự mồi (5’ - 3’)

Vi-rút

Ký hiệu mồi

Tài liệu tham khảo

Kích thước (bp)

CSFV

671

Paton và ctv, 2000

E2 OF E2 OR

AGRCCAGACTGGTGGCCNTAYGA TTYACCACTTCTGTTCTCA

PRRSV

800

O5F O5R

CATGAGGTGGGCAACTGTTT GTCATGTACCCGAAGGTGAA

Li và ctv, 2012

PEDV

651

P1 P2

TTCTGAGTCACGAACAGCCA CATATGCAGCCTGCTCTGAA

Song và ctv, 2006

TGEV

859

T1 T2

GTGGTTTTGGTYRTAAATGC CACTAACCAACGTGGARCTA

PPA

265

PPV-F PPV-R

AGTTAGAATAGGATGCGAGGAA AGAGTCTGTGGTGTATTTATTGG

Xu và ctv, 2012

PRV

198

PRV-F PRV-R

GGGGTTGGACAGGAAGGACACCA AACCAGCTGCACGCGCTCAA

PCV1

349

Larochelle và ctv, 1999

PF1 PF2

TTGCTGAGCCTAGCGACACC TCCACTGCTTCAAATCGGCC

3. Quy trình PCR và RT-PCR

3.1. Quy trình RT-PCR phát hiện ARN vi-rút

Sử dụng bộ kít QIAGEN® OneStep RT-PCR (QIAGEN, code: 210212)

Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng cho 1 mẫu: 25 μl/mẫu

Thành phần H2O (nuclease-free water) QIAGEN buffer (5x) dNTP mix (10 mM) Mồi xuôi (10 M) Mồi ngược (10 M) Enzyme RT/ HotStarTaq DNA polymerase ARN khuôn mẫu Thể tích (µl) 13,5 5 1 1 1 1 2,5

163

Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR

Giai đoạn Nhiệt độ

48oC 95oC Thời gian 30 phút 15 phút Chu kỳ 1 1

Phiên mã ngược (RT) tạo cDNA Hoạt hoá PCR ban đầu: - Biến tính cDNA - Bất hoạt enzyme RT -Hoạt hóa Hot Start Taq DNA polymerase Biến tính Bắt cặp* Tổng hợp Kết thúc 1

* Nhiệt độ mồi bắt cặp như sau: 53 oC (P1/P2 và T1/T2), 55oC (EOF/EOR), 58oC (O5F/O5F)

94oC 53 oC, 55oC, 58oC 72 oC 72 oC 4 oC 30 giây 1 phút 1 phút 5 phút ∞

3.2. Quy trình PCR phát hiện ADN vi-rút

Hóa chất dùng trong phản ứng PCR: Taq DNA polymerase (Promega, Mỹ),

dNTPs (Promega, Mỹ).

Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng cho 1 mẫu: 25 μl/mẫu

Thể tích (µl)

Thành phần H2O (nuclease-free water) PCR buffer green (5X) MgCl2 (25 mM) dNTPs (10 mM) Primer F (10 uM) Primer R (10 uM) Taq DNA polymerase (5 UI/ul) ADN khuôn mẫu 12,8 5 2 0,5 1 1 0,2 2,5

Chu trình nhiệt phản ứng PCR

Chu kỳ 1

* Nhiệt độ mồi bắt cặp như sau: 56 oC (PPVF/PPVR và PRVF/PRVR), 62oC (P1F/P1R

Giai đoạn Tiền biến tính Biến tính Bắt cặp* Tổng hợp Kết thúc 1 Nhiệt độ 94oC 94oC 56 oC, 62oC 72 oC 72 oC 4 oC Thời gian 5 phút 30 giây 1 phút 1 phút 5 phút ∞

164

4. Quy trình phát hiện Mycoplasma

ADN được tách chiết bằng bộ kít “HigherPurityTM Bacterial Genomic DNA

Isolation Kit” (iNtRON, code: AN0067). Quy trình thực hiện theo hướng dẫn của nhà

sản xuất.

Sử dụng bộ kit e-MycoTM Plus Mycoplasma PCR Detection (iNtRON, code:

25237) để phát hiện Mycoplasma trong huyễn dịch mô, huyễn dịch tế bào nuôi cấy,

phân lập vi rút từ các mẫu thực địa nghi ngờ bị nhiễm Mycoplasma. Quy trình thực

hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Quy trình nhiệt PCR phát hiện Mycoplasma

Giai đoạn Tiền biến tính Biến tính Bắt cặp Tổng hợp Kết thúc 1 Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ 94 oC 94oC 58 oC 72 oC 72 oC 4 oC 1 phút 30 giây 20 giây 60 giây 5 phút ∞

5. Điện di sản phẩm RT-PCR và PCR bằng agarose 2% trong dung dịch TAE

1X có chứa chất nhuộm màu SYBR® Safe, ở 90V, 130mA, trong 30 phút. Mẫu dược

đánh giá là dương tính khi mẫu có băng ADN tương đương với băng ADN của đối

chứng dương và thang chuẩn.

165

Phụ lục 8. Phân nhóm di truyền các mẫu PCV2 thu thập từ năm 2007 đến năm

2016 được giải trình tự ORF2 (sắp xếp theo năm lấy mẫu)

Nhóm heo

Ký hiệu mẫu

Geno type

Nơi lấy mẫu

Triệu chứng lâm sàng*

S T T

CaMau/2007

Cà Mau

Năm thu mẫu 2007 Sau cai sữa Mắc bệnh tai xanh

2 KhanhHoa/2007

Khánh Hòa 2007 Sau cai sữa Còi

Re (2h)** Cần Thơ

2008 Sau cai sữa Không có dữ liệu

CanTho/2008 BinhDuong1/2009a 2b

2009 Sau cai sữa Còi

Bình Dương

5 NAVET-

2009 Sau cai sữa Còi

Bình Dương

BinhDuong2/2009a BinhDuong3/2009a 2b

2009 Sau cai sữa Còi

Bình Dương

BinhDuong4/2009a 2b

2009 Sau cai sữa Còi

Bình Dương

BinhDuong5/2009 2b

2009 Sau cai sữa Không có dữ liệu

Bình Dương

9 DongNai1/2009

Đồng Nai

2009 12 tuần

Mắc bệnh tai xanh, bệnh dịch tả heo

10 NAVET-

Đồng Nai

2009 16 tuần

DongNai2/2009

Còi, khó thở, viêm da, da nhợt nhạt

11 TpHCM1/2010

Tp. Hồ Chí Minh

2010 Sau cai sữa Mắc bệnh tai xanh, viêm da

12 TpHCM2/2010

Re (2h)** Tp. Hồ Chí

Minh

2010 Sau cai sữa Mắc bệnh tai xanh, viêm da

13 TpHCM3/2010

Tp. Hồ Chí Minh

2010 Sau cai sữa Mắc bệnh tai xanh, viêm da

14 TpHCM4/2010

Re (2h)** Tp. Hồ Chí

2010 Sau cai sữa Mắc bệnh tai xanh, viêm da

Minh

15 TpHCM5/2010

Re (2h)** Tp. Hồ Chí

2010 Sau cai sữa Mắc bệnh tai

Minh

xanh, bệnh dịch tả heo

16 TpHCM6/2010

2010 Sau cai sữa Triệu chứng hô

hấp

Tp. Hồ Chí Minh

166

Nhóm heo

Ký hiệu mẫu

Geno type

Nơi lấy mẫu

Triệu chứng lâm sàng*

S T T

Năm thu mẫu

17 TpHCM7/2010

2010 Sau cai sữa Mắc bệnh tai

Tp. Hồ Chí Minh

xanh, bệnh dịch tả heo

Đồng Nai

2012 Sau cai sữa Mắc bệnh tai xanh

18 DongNai3/2012 19 BinhDuong6/2012b Re (2h)** Bình

Dương

2012 1 tuần tuổi Gầy trơ xương, tiêu chảy nặng

20 LongAn1/2012

2d-2

Long An

2012 Sau cai sữa Mắc bệnh tai xanh, viêm da

21 NAVET-

2d-2

Long An

LongAn2/2012

2012 Sau cai sữa Mắc bệnh tai xanh, viêm da

22 LongAn3/2012

2d-2

Long An

2012 Sau cai sữa Mắc bệnh tai xanh, viêm da

23 BinhDinh1/2013

2d-2

Bình Định

2013 Thai

Thai sẩy

24 BinhDinh2/2013

Re (2h)** Bình Định

2013 Sau cai sữa Không có dữ liệu

25 BinhDinh3/2013

Re (2h)** Bình Định

2013 Sau cai sữa Không có dữ liệu

26 BinhDinh4/2013

Re (2h)** Bình Định

2013 Sau cai sữa Không có dữ liệu

27 BinhDinh5/2013

Bình Định

2013 Nái

Mắc bệnh tai xanh, sinh ra heo con chết

28 BinhDinh6/2013

Bình Định

2013 Nái

Mắc bệnh tai xanh, sẩy thai

29 LamDong1/2013

2d-2

Lâm Đồng

2013 12 tuần

Mắc bệnh tai xanh, viêm da

30 LamDong2/2013

Lâm Đồng

2013 12 tuần

Mắc bệnh tai xanh, viêm da

31 LamDong3/2013

2d-2

Lâm Đồng

2013 12 tuần

Mắc bệnh tai xanh, viêm da

32 DongNai4/2013

Đồng Nai

2013 3 tuần

Mắc bệnh tai xanh, bệnh dịch tả heo

33 BinhDuong7/2013b 2b

2013 12 tuần

Còi

Bình Dương

34 BinhDuong8/2013 2d-2

2013 Sau cai sữa Không có dữ liệu

Bình Dương

PhuYen/2014

Phú Yên

2014 Đực giống Bình thường,

trại có heo con đang bị còi

167

Nhóm heo

Ký hiệu mẫu

Geno type

Nơi lấy mẫu

Triệu chứng lâm sàng*

S T T

Năm thu mẫu

36 DongNai5/2014

Đồng Nai

2014 Cai sữa

Không có dữ liệu

37 DongNai6/2014

Đồng Nai

2014 Cai sữa

Không có dữ liệu

38 BinhDuong9/2014 2d-2

2014 Cai sữa

Không có dữ liệu

Bình Dương

2014 10 tuần

Không có dữ liệu

39 BinhDuong10/2014 2d-2

Bình Dương

40 TayNinh/2014

2d-2

Tây Ninh

2014 5 tháng

Viêm da

41 NAVET-

2d-1

Bến Tre

2014 Cai sữa

Không có dữ liệu

BenTre/2014

2015 Thai

Thai sẩy

42 BinhDuong11/2015 2b

Bình Dương

43 NAVET-

2d-2

Nghệ An

2015 Sau cai sữa Còi

NgheAn1/2015

44 NAVET-

2d-2

Nghệ An

2015 Sau cai sữa Còi

NgheAn2/2015

2016 14 tuần

Không có dữ liệu

45 BinhDuong12/2016 2d-2

Bình Dương

46 DongNai7/2016

2d-2

Đồng Nai

2016 18 tuần

Viêm da

47 DongNai8/2016

2d-2

Đồng Nai

2016 Sau cai sữa Không có dữ liệu

2016 Thai

48 NAVET-

Thai khô

TpHCM8/2016

Tp. Hồ Chí Minh * Các heo được xác định mắc bệnh tai xanh, bệnh dịch tả heo thông qua triệu chứng lâm sàng, bệnh tích và xác định có sự hiện diện của vi-rút PRRS, CSF trong mẫu bệnh phẩm bằng phương pháp RT-PCR. ** Re: recombinant (nhóm tái tổ hợp), 2h: theo phân loại mới của Franzo và Segalés (2018) a Mẫu được thu thập cùng trại và cùng thời điểm b Mẫu được thu thập cùng trại với chủng NAVET-vietnam3/2004

168

Phụ lục 9. So sánh trình tự chuỗi a-xít a-min của protein capsid PCV2

169

170

171

172

So sánh trình tự chuỗi a-xít a-min (suy ra từ trình tự chuỗi nucleotide) của protein capsid giữa các mẫu PCV2 trong nghiên cứu này với các chủng PCV2 tham khảo

173

Phụ lục 10. Khối lượng (kg) heo ở thí nghiệm 2

Lô Sau tiêm vắc-xin lần hai 28 ngày

TN2 (tiêm vắc- xin)

41,5 40,5 40,0 40,7 0,8 41,0 40,0 Trước tiêm vắc-xin 14,6 15,5 15,7 15,3 0,6 15,2 15,7 Sau tiêm vắc-xin lần một 21 ngày 21,4 22,8 20,6 21,6 1,1 21,9 21,5

ĐC2 (đối chứng) 40,5 0,7 KH heo 5TN2 9TN2 11TN2 𝐱̅ SD 14ĐC2 15ĐC2 𝐱̅ SD 15,5 0,4 21,7 0,3

Phụ lục 11. Hiệu giá kháng thể IPMA (log2) heo thí nghiệm 2

Tuổi heo

Lô KH heo 3 tuần 5 tuần 7 tuần (tiêm vắc-xin lần đầu)

5TN2 9TN2 11TN2 TN2 (tiêm vắc- xin)

𝐱̅ SD

14ĐC2 15ĐC2

ĐC2 (đối chứng) 6,64 6,64 6,64 6,64 0,00 9,64 9,64 9,64 0,00 7,64 7,64 8,64 7,98 0,58 9,64 10,64 10,14 0,71 8,64 8,64 9,64 8,98 0,58 10,64 11,64 11,14 0,71

𝐱̅ SD

174

Phụ lục 12. Xử lý thống kê Xử lý thống kê các MOI khác nhau Two-way ANOVA: TITER versus MOI, TIME Source DF SS MS F P MOI 4 18.5222 4.63056 69.42 0.000 TIME 2 0.3419 0.17095 2.56 0.088 Interaction 8 0.9400 0.11750 1.76 0.110 Error 45 3.0016 0.06670 Total 59 22.8057 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev MOI Mean ---+---------+---------+---------+------ 1 4.49917 (--*--) 2 4.66750 (--*--) 3 5.45833 (--*--) 4 5.72250 (--*--) 5 5.86167 (--*--) ---+---------+---------+---------+------ 4.50 5.00 5.50 6.00 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev TIME Mean -+---------+---------+---------+-------- 1 5.2590 (--------*---------) 2 5.3245 (---------*--------) 3 5.1420 (---------*--------) -+---------+---------+---------+-------- 5.04 5.16 5.28 5.40 Xử lý thống kê đường cong phát triển giữa các chủng PCV2 Two-way ANOVA: TITRATION versus ISOLATION, TIME Source DF SS MS F P ISOLATION 2 6.4981 3.24906 24.37 0.000 TIME 7 8.2520 1.17886 8.84 0.000 Interaction 14 3.4310 0.24507 1.84 0.092 Error 24 3.2003 0.13334 Total 47 21.3814 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev ISOLATION Mean ---+---------+---------+---------+------ 1 4.29688 (-----*----) 2 4.75063 (-----*----) 3 5.19813 (-----*----) ---+---------+---------+---------+------ 4.20 4.55 4.90 5.25 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev TIME Mean -+---------+---------+---------+-------- 1 3.73833 (-----*-----) 2 4.55667 (-----*-----) 3 4.80500 (-----*-----) 4 4.88833 (-----*-----) 5 5.00000 (-----*-----) 6 5.05500 (-----*-----) 7 5.11000 (-----*-----) 8 4.83500 (-----*-----) -+---------+---------+---------+-------- 3.50 4.00 4.50 5.00

175

So sánh hiệu giá giữa các chủng qua các lần tiếp đời One-way ANOVA: TITER versus STRAIN Source DF SS MS F P STRAIN 2 1.203 0.601 2.75 0.077 Error 36 7.864 0.218 Total 38 9.066 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev --+---------+---------+---------+------- 1 13 5.2300 0.4432 (---------*----------) 2 13 5.5900 0.4343 (----------*---------) 3 13 5.2062 0.5199 (---------*----------) --+---------+---------+---------+------- 5.00 5.25 5.50 5.75 Xử lý thống kê thí nghiệm 3 One-way ANOVA: TL 0DPV versus LO Source DF SS MS F P LO 1 0.228 0.228 0.57 0.470 Error 8 3.176 0.397 Total 9 3.404 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev --+---------+---------+---------+------- 1 6 8.0167 0.4792 (-----------*-----------) 2 4 8.3250 0.8221 (-------------*--------------) --+---------+---------+---------+------- 7.50 8.00 8.50 9.00

One-way ANOVA: TL 28DPV versus LO Source DF SS MS F P LO 1 0.60 0.60 0.14 0.723 Error 8 35.50 4.44 Total 9 36.10 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -------+---------+---------+---------+-- 1 6 20.500 1.761 (-------------------------) 2 4 21.000 2.582 (------------------------------) -------+---------+---------+---------+-- 19.5 21.0 22.5 24.0

One-way ANOVA: TL 28DPC versus LO Source DF SS MS F P LO 1 33.8 33.8 0.58 0.468 Error 8 464.3 58.0 Total 9 498.0 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ----+---------+---------+---------+----- 1 6 40.500 5.612 (--------------------------) 2 4 36.750 10.112 (---------------------------------) ----+---------+---------+---------+----- 30.0 35.0 40.0 45.0 One-way ANOVA: ADG 28DPV versus LO Source DF SS MS F P LO 1 112 112 0.03 0.867 Error 8 30071 3759 Total 9 30184

Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -----+---------+---------+---------+---- 1 6 445.83 49.87 (-------------*--------------) 2 4 452.68 76.67 (-----------------*-----------------) -----+---------+---------+---------+---- 400 440 480 520

176

One-way ANOVA: ADG 28DPC versus LO Source DF SS MS F P LO 1 55293 55293 1.18 0.308 Error 8 373406 46676 Total 9 428699 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev +---------+---------+---------+--------- 1 6 714.3 162.9 (-----------------------) 2 4 562.5 283.3 (-----------------------------) +---------+---------+---------+--------- 320 480 640 800 One-way ANOVA: IPMA 0DPV versus LO Source DF SS MS F P LO 1 0.067 0.067 0.64 0.447 Error 8 0.833 0.104 Total 9 0.900 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ---+---------+---------+---------+------ 1 6 6.4772 0.4082 (----------------------) 2 4 6.6439 0.0000 (----------------------------) ---+---------+---------+---------+------ 6.25 6.50 6.75 7.00 One-way ANOVA: IPMA 7DPV versus LO Source DF SS MS F P LO 1 0.017 0.017 0.08 0.779 Error 8 1.583 0.198 Total 9 1.600 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ----+---------+---------+---------+----- 1 6 6.4772 0.4082 (--------------------------) 2 4 6.3939 0.5000 (--------------------------------) ----+---------+---------+---------+----- 6.00 6.30 6.60 6.90 One-way ANOVA: IPMA 14DPV versus LO Source DF SS MS F P LO 1 22.817 22.817 44.70 0.000 Error 8 4.083 0.510 Total 9 26.900 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev --------+---------+---------+---------+- 1 6 8.9772 0.8165 (---------) 2 4 5.8939 0.5000 (------------) --------+---------+---------+---------+- 6.0 7.2 8.4 9.6 One-way ANOVA: IPMA 21DPV versus LO Source DF SS MS F P LO 1 36.82 36.82 36.44 0.000 Error 8 8.08 1.01 Total 9 44.90

177

Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ----+---------+---------+---------+----- 1 6 9.311 1.033 (----------) 2 4 5.394 0.957 (-------------) ----+---------+---------+---------+----- 4.8 6.4 8.0 9.6 One-way ANOVA: IPMA 28DPV versus LO Source DF SS MS F P LO 1 64.067 64.067 219.66 0.000 Error 8 2.333 0.292 Total 9 66.400 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev --+---------+---------+---------+------- 1 6 10.311 0.516 (-----) 2 4 5.144 0.577 (------) --+---------+---------+---------+------- 4.8 6.4 8.0 9.6 One-way ANOVA: IPMA 7DPC versus LO Source DF SS MS F P LO 1 141.067 141.067 193.46 0.000 Error 8 5.833 0.729 Total 9 146.900 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ---+---------+---------+---------+------ 1 6 12.811 0.983 (----) 2 4 5.144 0.577 (------) ---+---------+---------+---------+------ 5.0 7.5 10.0 12.5 One-way ANOVA: IPMA 14DPC versus LO Source DF SS MS F P LO 1 93.75 93.75 58.82 0.000 Error 8 12.75 1.59 Total 9 106.50 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev --+---------+---------+---------+------- 1 6 14.644 1.095 (-------) 2 4 8.394 1.500 (---------) --+---------+---------+---------+------- 7.5 10.0 12.5 15.0

One-way ANOVA: IPMA 21DPC versus LO Source DF SS MS F P LO 1 74.82 74.82 42.50 0.000 Error 8 14.08 1.76 Total 9 88.90 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ---------+---------+---------+---------+ 1 6 14.977 1.211 (--------) 2 4 9.394 1.500 (-----------) ---------+---------+---------+---------+ 10.0 12.5 15.0 17.5 One-way ANOVA: IPMA 28DPC versus LO Source DF SS MS F P LO 1 50.42 50.42 42.09 0.000 Error 8 9.58 1.20 Total 9 60.00

178

Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev --+---------+---------+---------+------- 1 6 15.477 0.408 (---------) 2 4 10.894 1.708 (-----------) --+---------+---------+---------+------- 10.0 12.0 14.0 16.0 One-way ANOVA: OD 0DPV versus LO Source DF SS MS F P LO 1 0.00434 0.00434 0.63 0.451 Error 8 0.05526 0.00691 Total 9 0.05959 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ----+---------+---------+---------+----- 1 6 0.35369 0.06505 (------------------------) 2 4 0.31118 0.10662 (------------------------------) ----+---------+---------+---------+----- 0.240 0.300 0.360 0.420

One-way ANOVA: OD 7DPV versus LO Source DF SS MS F P LO 1 0.3527 0.3527 5.08 0.054 Error 8 0.5549 0.0694 Total 9 0.9076 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ---+---------+---------+---------+------ 1 6 0.6241 0.3305 (------------------) 2 4 0.2407 0.0544 (-----------------------) ---+---------+---------+---------+------ 0.00 0.25 0.50 0.75 One-way ANOVA: OD 14DPV versus LO Source DF SS MS F P LO 1 2.300 2.300 14.15 0.006 Error 8 1.300 0.162 Total 9 3.599 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -----+---------+---------+---------+---- 1 6 1.1775 0.5081 (-------------) 2 4 0.1987 0.0539 (----------------) -----+---------+---------+---------+---- 0.00 0.50 1.00 1.50 One-way ANOVA: OD 21DPV versus LO Source DF SS MS F P LO 1 2.449 2.449 17.56 0.003 Error 8 1.116 0.139 Total 9 3.564 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -----+---------+---------+---------+---- 1 6 1.2053 0.4705 (------------) 2 4 0.1952 0.0549 (----------------) -----+---------+---------+---------+---- 0.00 0.50 1.00 1.50 One-way ANOVA: OD 28DPV versus LO Source DF SS MS F P LO 1 2.288 2.288 20.12 0.002 Error 8 0.910 0.114 Total 9 3.198

Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ----+---------+---------+---------+----- 1 6 1.1412 0.4255 (------*-----) 2 4 0.1649 0.0394 (------*-------) ----+---------+---------+---------+----- 0.00 0.50 1.00 1.50

179

One-way ANOVA: OD 7DPC versus LO Source DF SS MS F P LO 1 7.881 7.881 66.26 0.000 Error 8 0.952 0.119 Total 9 8.833 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ---+---------+---------+---------+------ 1 6 1.9962 0.4351 (-------) 2 4 0.1841 0.0401 (---------) ---+---------+---------+---------+------ 0.00 0.70 1.40 2.10 One-way ANOVA: OD 14DPC versus LO Source DF SS MS F P LO 1 4.2157 4.2157 57.53 0.000 Error 8 0.5862 0.0733 Total 9 4.8019 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ---+---------+---------+---------+------ 1 6 1.9876 0.2835 (--------) 2 4 0.6623 0.2479 (----------) ---+---------+---------+---------+------ 0.50 1.00 1.50 2.00 One-way ANOVA: OD 21DPC versus LO Source DF SS MS F P LO 1 2.582 2.582 23.88 0.001 Error 8 0.865 0.108 Total 9 3.447 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev +---------+---------+---------+--------- 1 6 1.8992 0.3377 (----------) 2 4 0.8620 0.3134 (-------------) +---------+---------+---------+--------- 0.50 1.00 1.50 2.00

One-way ANOVA: OD 28DPC versus LO Source DF SS MS F P LO 1 0.906 0.906 9.00 0.017 Error 8 0.805 0.101 Total 9 1.712 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ----+---------+---------+---------+----- 1 6 1.8894 0.3159 (--------*--------) 2 4 1.2748 0.3196 (---------*----------) ----+---------+---------+---------+----- 1.05 1.40 1.75 2.10

One-way ANOVA: VNT 0DPV versus LO Source DF SS MS F P LO 1 2.82 2.82 1.95 0.201 Error 8 11.58 1.45 Total 9 14.40

180

Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ------+---------+---------+---------+--- 1 6 3.833 0.408 (---------------------) 2 4 2.750 1.893 (-------------------------) ------+---------+---------+---------+--- 2.0 3.0 4.0 5.0 One-way ANOVA: VNT 7DPV versus LO Source DF SS MS F P LO 1 6.017 6.017 6.35 0.036 Error 8 7.583 0.948 Total 9 13.600 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ---------+---------+---------+---------+ 1 6 3.8333 0.4082 (----------------) 2 4 2.2500 1.5000 (---------------------) ---------+---------+---------+---------+ 2.0 3.0 4.0 5.0 One-way ANOVA: VNT 14DPV versus LO Source DF SS MS F P LO 1 21.600 21.600 28.80 0.001 Error 8 6.000 0.750 Total 9 27.600 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev +---------+---------+---------+--------- 1 6 4.0000 0.6325 (---------) 2 4 1.0000 1.1547 (-----------) +---------+---------+---------+--------- 0.0 1.5 3.0 4.5 One-way ANOVA: VNT 21DPV versus LO Source DF SS MS F P LO 1 72.600 72.600 387.20 0.000 Error 8 1.500 0.187 Total 9 74.100 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev --+---------+---------+---------+------- 1 6 5.5000 0.5477 (---) 2 4 0.0000 0.0000 (--) --+---------+---------+---------+------- 0.0 2.0 4.0 6.0 One-way ANOVA: VNT 28DPV versus LO Source DF SS MS F P LO 1 117.600 117.600 235.20 0.000 Error 8 4.000 0.500 Total 9 121.600 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ---+---------+---------+---------+------ 1 6 7.0000 0.8944 (----) 2 4 0.0000 0.0000 (----) ---+---------+---------+---------+------ 0.0 2.5 5.0 7.5 One-way ANOVA: VNT 7DPC versus LO Source DF SS MS F P LO 1 180.267 180.267 270.40 0.000 Error 8 5.333 0.667 Total 9 185.600

181

Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ---+---------+---------+---------+------ 1 6 8.6667 1.0328 (---) 2 4 0.0000 0.0000 (----) ---+---------+---------+---------+------ 0.0 3.0 6.0 9.0 One-way ANOVA: VNT 14DPC versus LO Source DF SS MS F P LO 1 66.15 66.15 18.73 0.003 Error 8 28.25 3.53 Total 9 94.40 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev --+---------+---------+---------+------- 1 6 9.500 0.837 (------------) 2 4 4.250 2.872 (----------------) --+---------+---------+---------+------- 2.5 5.0 7.5 10.0 One-way ANOVA: VNT 21DPC versus LO Source DF SS MS F P LO 1 40.02 40.02 10.14 0.013 Error 8 31.58 3.95 Total 9 71.60 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ------+---------+---------+---------+--- 1 6 9.833 1.169 (-------------) 2 4 5.750 2.872 (----------------) ------+---------+---------+---------+--- 5.0 7.5 10.0 12.5 One-way ANOVA: VNT 28DPC versus LO Source DF SS MS F P LO 1 18.15 18.15 3.44 0.101 Error 8 42.25 5.28 Total 9 60.40 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ----+---------+---------+---------+----- 1 6 10.500 1.225 (-------------------) 2 4 7.750 3.403 (------------------------) ----+---------+---------+---------+----- 6.0 8.0 10.0 12.0

One-way ANOVA: BC-0 dpc versus LO Source DF SS MS F P LO 1 3626042 3626042 0.20 0.667 Error 8 145580208 18197526 Total 9 149206250 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -------+---------+---------+---------+-- 1 6 19167 3763 (------------------------) 2 4 17938 4993 (-------------------------------) -------+---------+---------+---------+-- 15000 18000 21000 24000

182

One-way ANOVA: BC-7 dpc versus LO Source DF SS MS F P LO 1 2128167 2128167 0.20 0.666 Error 8 84915833 10614479 Total 9 87044000 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ---------+---------+---------+---------+ 1 6 16867 1652 (-----------------------------) 2 4 15925 4874 (-----------------------------------) ---------+---------+---------+---------+ 14000 16000 18000 20000 One-way ANOVA: BC-14 dpc versus LO Source DF SS MS F P LO 1 33450667 33450667 1.22 0.301 Error 8 219079583 27384948 Total 9 252530250 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -+---------+---------+---------+-------- 1 6 17358 5249 (-----------------------) 2 4 13625 5207 (----------------------------) -+---------+---------+---------+-------- 8000 12000 16000 20000 One-way ANOVA: BC-21 dpc versus LO Source DF SS MS F P LO 1 140454000 140454000 21.96 0.002 Error 8 51171250 6396406 Total 9 191625250 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -------+---------+---------+---------+-- 1 6 18775 2689 (-----------) 2 4 11125 2238 (---------------) -------+---------+---------+---------+-- 10500 14000 17500 21000 One-way ANOVA: BC-28 dpc versus LO Source DF SS MS F P LO 1 147894000 147894000 13.49 0.006 Error 8 87695000 10961875 Total 9 235589000 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev --+---------+---------+---------+------- 1 6 19000 3319 (-------------) 2 4 11150 3298 (-----------------) --+---------+---------+---------+------- 8000 12000 16000 20000