Luận văn:Tách và xác định β-Lactam trong đối tượng sinh học bằng phương pháp điện di mao quản

TRƯỜNG…………………. KHOA………………………

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Tách và xác định β-Lactam trong đối tượng sinh học bằng phương pháp điện di mao quản

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU………………………………………………………………... 4

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN…………………………………………...5

1.1. Giới thiệu về chất kháng sinh β-lactam…………………………………………5

1.2. Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay ……... 9

1.3. Các phương pháp phân tích định lượng β-lactam…………………………….11

1.3.1. Phương pháp quang học ………………………………………………...11

1.3.2. Phương pháp điện hóa …………………………………………………..12

1.3.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ……………………………………..12

1.3.4.Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis-CE) ……..14

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………17

2.1. Đối tượng và nội dung nghiên cứu …………………………………………….17

2.1.1. Đối tượng ………………………………………………………………..17

2.1.2. Nội dung nghiên cứu ……………………………………………………17

2.2. Giới thiệu chung về phương pháp Điện di mao quản ………………………. 17

2.2.1. Nguyên tắc của phương pháp điện di mao quản……………………… 17

2.2.2. Thiết bị của phương pháp điện di mao quản………………………….. 18

2.2.3 . Các quá trình xẩy ra trong mao quản………………………………… 19

2.2.4. Sự phân loại hay các kiểu (mode) của phương pháp điện di mao

quản……………………………………………………………………………...29

2.2.5. Phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC).. 20

2.2.6. Phân tích định lượng trong phương pháp điện di mao quản………….26

2.3. Thực nghiệm…………………………………………………………………… .27

2.3.1. Máy móc và dụng cụ …………………………………………………….27

2.3.2. Hóa chất ………………………………………………………………….27

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ………………………….29

3.1. Nghiên cứu khảo sát tối ưu điều kiện tách β - Lactam ……………………..29

3.1.1. Chọn bước sóng phát hiện chất …………………………………………29

3.1.2. Mao quản và xử lý mao quản trước khi tách………………………… 30

3.1.3. Chọn phương pháp bơm mẫu …………………………………………..31

3.1.4. Độ điện di và độ điện di hiệu dụng ……………………………………..32

3.1.5. Ảnh hưởng pH của dung dịch đệm điện di …………………………….33

3.1.6. Ảnh hưởng của thành phần dung dịch đệm …………………………...36

3.1.7. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất tạo mixen SDS ……………….37

3.1.8. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đệm…………………………………40

3.1.9. Khảo sát ảnh hưởng thời gian bơm mẫu ………………………………43

3.1.10. Khảo sát ảnh hưởng thế điện di ……………………………………….45

3.1.11. Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ của mao quản …………………………47

3.1.12.Tổng kết điều kiện tối ưu ……………………………………………….50

3.2. Đánh giá phương pháp phân tích ……………………………………………...51

3.2.1. Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn ……………………..51

3.2.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng của đường chuẩn

(LOQ)…………………………………………………………………………... 54

3.2.5. Độ chính xác của phép đo ………………………………………………55

3.2.6. Độ lặp lại của phép đo …………………………………………………..57

3.3. Phân tích mẫu thực ……………………………………………………………..59

3.3.1. Phân tích mẫu thuốc …………………………………………………….59

3.3.2 Phân tích mẫu máu …………………………………………………….. .63

3.4. Ưu nhược điểm của phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu

Mixen (MEKC) ……………………………………………………………………...64

3.5. Hướng phát triển của đề tài. …………………………………………………...65

PHỤ LỤC ………………………………………………………………..71

MỞ ĐẦU

Ngày nay, khi xã hội ngày càng phát triển thì vấn đề sức khỏe của con người

β-Lactam là thuốc kháng sinh tổng hợp quan trọng chữa bệnh cho con người,

ngày càng được chú trọng đặc biệt là các sản phẩm liên quan trực tiếp đến sức khỏe

thú y từ khi chúng được giới thiệu trên thị trường vào năm 1938 và là loại kháng sinh

được dùng nhiều nhất hiện nay. Liều lượng và cách dùng kháng sinh không đúng sẽ dễ

bị vi khuẩn nhờn thuốc, kháng thuốc, từ đó việc chữa trị bệnh càng khó khăn. Ngoài ra

còn gây lãng phí cho người bệnh vì có các bệnh do virut không chữa được bằng kháng

sinh nhưng vẫn dùng kháng sinh, gây khó khăn cho việc chuẩn đoán các bệnh và ảnh

hưởng sức khỏe của người bệnh. Hàm lượng lớn kháng sinh trong máu gây ra các bệnh

về thận, đặc biệt ở người cao tuổi. Vì vậy kiểm soát và phân tích thuốc kháng sinh đối

với người bệnh là biện pháp cần thiết để nâng cao hiệu quả sử dụng chúng.

Ở Việt Nam đã có rất nhiều công trình nghiên cứu tách và xác định đồng thời

các kháng sinh β-Lactam trong các mẫu dược phẩm, sinh học, thực phẩm và môi

trường chủ yếu là các công trình phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC.

Phương pháp HPLC là phương pháp tách chọn lọc, độ nhạy cao, lượng mẫu bơm ít thời

gian phân tích ngắn. Tuy nhiên phương pháp cũng có một số nhược điểm là phải sử

dụng một lượng lớn dung môi để rửa cột, giá thành phân tích cao. Ngược lại, phương

pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) lại sử dụng một lượng hóa

chất không đáng kể, tiết kiệm chi phí từ 3 – 4 lần, lượng mẫu bơm nhỏ hơn trong

HPLC hàng trăm lần, cỡ nl, cho độ tin cậy cao.

Tách và xác định đồng thời kháng sinh β-Lactam bằng phương pháp điện di

mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) trong mẫu dược phẩm và sinh học là

một hướng nghiên cứu mới, song với ưu điểm của nó thì phương pháp sẽ ngày càng

thông dụng được áp dụng nhiều trong phòng thí nghiệm và phân tích mẫu dịch vụ. Vì

vậy chúng tôi quyết định chọn đề tài là “ Tách và xác định β-Lactam trong đối

tượng sinh học bằng phương pháp điện di mao quản”

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu về chất kháng sinh β-lactam [1,2,10,25]

Là các kháng sinh mà phân tử chứa vòng β-Lactam. Gồm các nhóm: penicillin,

cephalosporin, monobactam, cacbapenem trong đó hai nhóm sử dụng phổ biến và lớn

nhất là penicillin và cephalosporin.

Các penicillin thu được từ môi trường nuôi cấy nấm Penicilium notatum và

Penicillium chryrogenum, bán tổng hợp từ axit 6-amino penicillanic (6APA).

Các cephalosporin tự nhiên được phân lập từ môi trường nuôi cấy nấm

Cephalosporium acremonium và bán tổng hợp từ axit 7-amino cephalosporinic

(7ACA) xuất phát từ các kháng sinh thiên nhiên.

Cấu trúc và phân loại:

* Các penicillin

Các penicillin đều có cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng: vòng thiazolidin, vòng β-

S 4

C O

C H 3

N H

C H 3

C O O M

Lactam

Hình 1.1. Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin

Tên gọi chung công thức của các penicillin khi chưa có gốc R là: (2S,5R,6R 3,3-

dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid

Khi thay thế R bằng các gốc khác nhau, những cacbon bất đối có cấu hình 2S,

5R, 6R ta có các penicilin có độ bền, dược động học và phổ kháng khuẩn khác nhau.

Với M là gốc cation thường là: K, Na, H.

Nhóm kháng sinh penicillin được chia thành 3 nhóm chính với hoạt tính khác

nhau.

Bảng 1.1. Phân loại và cấu trúc một số penicillin

CH2-

Tên kháng sinh R Hoạt tính

Gồm các Penicillin tự Penicillin

nhiên và dẫn chất.Phổ G

Benzyl hẹp: vi khuẩn gram(+). (PENG)

n ê i h n ự t

Không kháng β- Benzathin

n i l l i c i n e p m ó h N

CH3

C-

lactamase

Oxacillin Là các Penicillin bán

(OXA) 6-[(5-methyl-3-phenyl- tổng hợp. Phổ hẹp như

1,2-oxazole-4-carbonyl)amino] nhóm I. Kháng

Cl N

C-

penicilliiase, không tác

CH3

động vào vòng β – Cloxacillin Lactam được. (CLO) 6-{[3-(2-chlorophenyl )-

e s a i i l l i c i n e p g n á h k n i l l i c i n e p m ó h N

NH2NH2

CH-

5-methyl-oxazole-4-carbonyl]amino}

Ampicillin

g n ộ r

Phổ rộng, tác dụng cả (AMP) 6-([(2R)-2-amino-2-

khuẩn gram (+) và (-).

ổ h p n

phenylacetyl]amino)

NH2NH2

Không kháng β- Amoxicilli

i l l i c i

CH-

và lactamase

n e p

n (AMO) penicilliiase 6-{[(2R)-2-amino-2-(4-

m ó h N

hydroxyphenyl)-acetyl]amino}

* Các cephalosporin

Các cephalosporin cấu trúc chung gồm 2 vòng: vòng β-Lactam 4 cạnh gắn với 1

R 2

S 1

R 1

C O

N H

R 3

C O O M

dị vòng 6 cạnh, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R. Khác nhau bởi các gốc R

Hình 1.2. Công thức cấu tạo các kháng sinh cephalosporin

Tên gọi chung của các cephalosporin khi chưa có gốc R là: (6R,7R) 8-oxo-5-

thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid

Khi thay đổi các gốc R, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R được các

cephalosporin có độ bền, tính kháng khuẩn và dược động học khác nhau.

Dựa vào khổ kháng khuẩn, chia các cephalosporin thành 4 thế hệ. Các

cephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn gram dương mạnh hơn, nhưng trên

gram âm yếu hơn thế hệ sau. Trong bản luận văn này, chúng tôi chỉ trình bày thế hệ I

(CEP) và thế hệ III (CEF)

Bảng 1.2. Phân loại và cấu trúc một số cephalosporin

Thế hệ Kháng sinh R1 R2 R3

I: Phổ tác dụng trung bình, tác dụng Cephalexin H -CH3

CH- NH2

mạnh nhất trên vi khuẩn gram (+), (CEP)

yếu nhất trên gram (-). Không bền

và dễ bị β-lactamase phá hủy

NH2

III: Tác dụng tốt trên vi khuẩn gram Cefixim H -CH=CH2

(-), trên vi khuẩn gram (+) thì tác (CEF)

dụng kém penicillin và

N S HOOCCH2O

cephalosporin thế hệ I. Bền với β-

lactamase

Tính chất:

Các β-lactam thường ở dạng bột kết tinh màu trắng, dạng axit ít tan trong nước,

dạng muối natri và kali dễ tan; tan được trong metanol và một số dung môi hữu cơ

phân cực vừa phải. Tan trong dung dịch axit và kiềm loãng do đa phần chứa đồng thời

nhóm –COOH và –NH2.

Cực đại hấp phụ chủ yếu do nhân phenyl, tùy vào cấu trúc khác làm dạng phổ

thay đổi (đỉnh phụ, vai, sự dịch chuyển sang bước sóng ngắn hoặc dài, giảm độ hấp

thụ).

Các β-lactam là các axit với nhóm –COOH có pKa= 2.5-2.8 tùy vào cấu trúc

phân tử. Trong môi trường axit, kiềm, β-lactamase có tác dụng phân cắt khung phân tử,

mở vòng β-lactam làm kháng sinh mất tác dụng.

Bảng 1.3. Hằng số axit của các kháng sinh nghiên cứu

Tên kháng sinh pKa1 Tên kháng sinh pKa1 Tên kháng sinh pKa1

2.74 AMO 2.8 CLO 2.7 PEN

2.7 CEP 2.6 CEF 2.75 AMP

2.72 OXA

Tác dụng:

Cơ chế:

Các penicillin có khả năng acyl hóa các D- alanin tranpeptidase, làm cho quá

trình tổng hợp peptidoglycan không được thực hiện. Sinh tổng hợp vách tế bào bị

ngừng lại. Ít tác dụng trên vi khuẩn gram (-). Mặc khác, các penicillin còn hoạt hóa

enzym tự phân giải murein hydroxylase làm tăng phân hủy vách tế bào, kết quả là vi

khuẩn bị tiêu diệt.

Ngăn cản xây dựng và giảm độ bền của mang tế bào vi khuẩn nên chủ yếu kìm

hãm sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn. Các kháng sinh β-lactam có hoạt phổ rộng.

Kháng thuốc:

Vi khuẩn sinh ra các β-lactamase, là enzim có tác dụng mở vòng β-lactam, theo

phản ứng ái nhân vào nhóm C=O, làm kháng sinh mất tác dụng. Tất cả các cách kháng

không sinh ra β-lactamase để thực hiện gọi là kháng gián tiếp (được gọi là kháng

methicillin).

Độc tính:

Các kháng sinh β-lactam độc tính thấp, nhưng cũng dễ gây dị ứng thuốc: dị ứng,

mày đay, vàng da, gây độc với thận, rối loạn tiêu hóa…nguy hiểm nhất là sốc phản vệ..

Thuốc không dùng cho trẻ sơ sinh và trong thời kỳ cho con bú. Chống chỉ định

dị ứng với thành phần của thuốc.

1.2. Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay

Như trên cho thấy, có nhiều loại kháng sinh khác nhau, tác động bằng các cơ

chế khác nhau đối với các vi trùng khác nhau. Kháng sinh chỉ có tác dụng với các bệnh

do vi trùng (bacteria), không có tác dụng với các bệnh do siêu vi (virus). Để điều trị

bệnh nhiễm trùng cần biết loại vi trùng gây bệnh để chọn kháng sinh thích hợp. Vì

thiếu hiểu biết và vì tin tưởng sai lầm, nên ở khắp nơi trên thế giới, nhất là ở các nước

đang phát triển, người ta đã dùng kháng sinh quá nhiều, cả khi không cần thiết, không

đúng chỉ định và không đúng cách.

Năm 2000, các bác sĩ Hoa kỳ viết 160 triệu toa thuốc kháng sinh cho 275 triệu

người dân, một nửa đến 2/3 số toa đó được coi là không cần thiết.Theo R. Gonzales

[6,26], 3/4 số kháng sinh dùng ở ngoại chẩn là cho viêm đường hô hấp trên trong khi

60% các trường hợp viêm đường hô hấp trên là do siêu vi, không cần và không điều trị

được bằng kháng sinh. Dùng cephalosporins bừa bãi khiến enterococus trở nên đề

kháng và cũng đã xuất hiện các vi trùng enterococus kháng vancomycin. Theo báo cáo

của A.W. McCormick [13] năm 2003, tỉ lệ pneumococus kháng penicillin tăng nhanh ở

Hoa kỳ, tác giả dự tính đến năm 2004, 41% pneumococcus sẽ đề kháng penicillin. Tỉ lệ

vi trùng lao kháng thuốc tăng cao khiến phải dùng 4 thứ thuốc kết hợp để điều trị bệnh

lao.

Các vi trùng kháng thuốc không khu trú ở một địa phương nào vì với phương

tiện giao thông mau lẹ, vi trùng có thể di chuyển đến khắp nơi trên thế giới trong vòng

24 giờ. D.P. Raymond [17] mỗi năm ở Hoa kỳ có 2 triệu người bị nhiễm trùng vì lây

lan trong bệnh viện, hơn một nửa số này là do vi trùng kháng thuốc, gây tử vong cho

70 ngàn người và làm tốn của ngân sách từ 5 đến 10 tỉ đô-la

Tại Việt Nam, theo báo cáo của Nguyễn Kim Phượng và J. Chalker [4], năm

1997 tại 23 trạm y tế ở Hải phòng, 69% bệnh nhân được cho kháng sinh, 71% bệnh

nhân không dùng kháng sinh đúng liều lượng và đúng thời gian (dưới 5 ngày).

Theo [4] Qua thống kê tại khoa Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng Bệnh viện Bạch

Mai cho thấy, hơn 70% bệnh nhân dị ứng do dùng kháng sinh, trong đó có không ít trẻ

em. Sốc phản vệ do dùng kháng sinh là tai biến nghiêm trọng nhất, dễ gây tử vong.

Nhiều trường hợp dị ứng thuốc gây giảm hồng cầu, bạch cầu, thiếu máu huyết tán, xuất

huyết giảm tiểu cầu, tổn thương tế bào gan... Phó giám đốc Bệnh viện Nhi Trung ương

Nguyễn Văn Lộc thừa nhận, tiền mua kháng sinh đang chiếm tới 60% tổng kinh phí

mua thuốc của bệnh viện. Nhiều loại kháng sinh gần như đã bị kháng hoàn toàn. Đối

với vi khuẩn E.coli (gây bệnh tiêu chảy, viêm phổi, nhiễm trùng huyết), tỉ lệ kháng

thuốc ở Ampiciline là 88%, Amoxiciline là 38,9%. Đối với vi khuẩn Klebsiella (gây

bệnh nhiễm trùng huyết và viêm phổi), tỉ lệ kháng thuốc của Ampiciline gần 97% và

Amoxiciline là 42%

Các nhà chuyên môn đã báo động về hậu quả nguy hiểm của sự lạm dụng kháng

sinh từ nhiều chục năm nay. Năm 1981, sau hội nghị ở Santa Domingo, các nhà chuyên

môn đã thành lập “Liên Hiệp vì sự Sử Dụng Kháng Sinh Hợp Lý” (Alliance for the

Prudent use of Antibiotics) có thành viên thuộc 93 quốc gia nhằm chống lại sự lan tràn

của các bệnh do vi trùng kháng thuốc tại các nước đang phát triển.

Năm 2001, Tổ Chức Y Tế Thế Giới đã đề ra “Kế Hoạch Toàn Cầu để Kiểm

Soát Sự Đề Kháng Kháng Sinh”. Kế hoạch đề cập đến mọi hoạt động y tế của tất cả

các quốc gia đã phát triển cũng như đang phát triển: Phòng thí nghiệm phải tăng cường

khả năng chẩn đoán các bệnh nhiễm trùng, giúp chẩn đoán nhanh chóng và chính xác,

đo lường độ nhạy của kháng sinh, đo nồng độ kháng sinh trong máu. Ngành dược cần

cung cấp đầy đủ thuốc thiết yếu, ngăn ngứa sự lưu hành của các thuốc giả, 5% lượng

thuốc lưu hành tại các nước đang phát triển là thuốc giả mạo, không đúng phẩm chất,

hàm lượng hoặc không có hoạt chất……

Nếu ngăn ngừa được sự phát triển của các vi trùng kháng thuốc chúng ta sẽ bảo

vệ được môi trường sống, duy trì được sự hữu hiêu của kháng sinh, hạn chế được chi

phí về y tế và cứu đươc nhiều sinh mạng.

1.3. Các phương pháp phân tích định lượng β-lactam

1.3.1. Phương pháp quang học

Phương pháp đo quang là phương pháp phân tích dựa trên tính chất quang học

của chất cần phân tích như tính hấp thụ quang, tính phát quang… Các phương pháp

này đơn giản, dễ tiến hành, thông dụng, được ứng dụng nhiều khi xác định β-lactam,

đặc biệt trong dược phẩm.

Các β-lactam hấp thụ UV nhưng không nhiều cực đại hấp thụ, chúng cũng tạo

phức với một số ion kim loại giúp nâng cao độ nhạy của phép đo. Trong nhiều trường

hợp, các β-lactam được thủy phân thành các chất đơn giản hơn để phân tích.

Các phương pháp phát quang có thể dùng xác định các β-lactam với độ nhạy

khá cao dựa trên đặc tính tạo phức với ion kim loại hay phản ứng quang hóa của các β-

lactam.

A. Fernández-González và cộng sự [11] dùng Cu2+ thủy phân và tạo phức với

AMP, với bước sóng kích thích 343nm, phát xạ 420nm có giới hạn phát hiện thu được

4.10-7M (0.16 mg/l). Phương pháp này kết hợp phương pháp dòng chảy cho hiệu quả

và tốc độ phân tích cao, sử dụng để phân tích AMP trong thuốc uống, huyết thanh…

Theo [18], F. Belal và cộng sự xác định AMO và AMP trong thuốc uống bằng

phương pháp phổ hấp thụ phân tử. Phương pháp cải tiến sự thủy phân của kháng sinh

với HCl 1M, NaOH 1M sau đó thêm PdCl2, KCl 2M. Kết quả tạo ra phức màu vàng

được đo tại bước sóng 335 nm. Khoảng tuyến tính từ 8- 40 mg/l và giới hạn phát hiện

của AMP là 0.73 mg/l, AMP 0.76 mg/l

Wei Liu và cộng sự [28], sử dụng phản ứng quang hóa của β-lactam với hệ

luminol-K3Fe(CN)6 kết hợp phương pháp chiết pha rắn mắc trực tiếp đã phân tích một

số β-lactam (penicillin, cefradine, cefadroxil, CEP ) trong sữa đạt độ nhạy cao: PEN là

0.5 mg/l, cefradine 0.04 mg/l, cefadroxil là 0.08 mg/l, 0.1 mg/l CEP. Kết quả được

kiểm chứng lại bằng phương pháp HPLC, detector UV-VIS, nồng độ CEP trong mẫu là

0.1 mg/l.

Tuy nhiên, nếu không kết hợp với phương pháp chiết pha rắn mắc nối tiếp, các

phương pháp quang học chủ yếu chỉ dùng xác định riêng rẽ từng chất kháng sinh và

trong các đối tượng có nhiều yếu tố ảnh hưởng hay chất tương tự chất phân tích, việc

xác định sẽ kém chính xác. Ngoài ra, trong nhiều trường hợp chất phân tích cần thủy

phân mới phát hiện được cũng là sự hạn chế của phương pháp này.

1.3.2. Phương pháp điện hóa

Một số phương pháp điện hóa đã được ứng dụng để phân tích các β-lactam

nhưng không phổ biến nhiều. Theo [7], Daniela P. Santos và cộng sự sử dụng sensor

điện thế phân tích AMO, đạt giới hạn phát hiện 0.92 μM (0.39 mg/l) trong môi trường

đệm axetat 0.1M pH=5.2.

1.3.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùng

quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất là

trong việc tách và phân tích lượng vết các chất. Phương pháp HPLC với cột tách pha

đảo được sử dụng rất rộng rãi để xác định các kháng sinh β-lactam trong các loại mẫu

khác nhau do có nhiều ưu thế so với các phương pháp khác vì có độ chính xác, độ

nhạy, độ lặp lại cao, khoảng tuyến tính rộng…

Detector ghép nối trong máy HPLC cho phép phát hiện sự xuất hiện chất sau khi

rửa giải. Hiện nay có rất nhiều loại detector được sử dụng cho mục đích này đã mở

rộng khả năng phân tích được rất nhiều loại chất bằng phương pháp HPLC. Đối với

phân tích dư lượng, detector khối phổ (MS) là một sự lựa chọn ưu tiên do có thể phát

hiện và phân tích chất trong các đối tượng phức tạp.

Theo [29], Blanchflower WJ và cộng sự dùng HPLC – MS phân tích penicillin

V, PENG, OXA, CLO, dicloxacillin trong thịt, thận và sữa. Điều kiện chạy sắc ký: cột

Inertsil ODS2 (4,6 mm×150 mm, 5 μm); pha động: ACN – (C2H5)3N 0,5% (45/55),

dùng nafcillin làm nội chuẩn đạt giới hạn phát hiện trong sữa 2-10 μg/kg, trong thịt 25-

100 μg/kg.

J.M. Cha và cộng sự [19] dùng phương pháp HPLC – MS để phân tích β-lactam

trong nước sông và nước thải. Điều kiện chạy sắc ký: cột Xterra MS C18 (2.1 mm×50

mm, 2.5 μm); pha động: A = axit focmic 0,1%, B = Metanol (MeOH), C = Acetonitril

(ACN); chạy gradient: bắt đầu A/B/C=90:5:5(v/v/v), 8 phút A/B/C=50:40:10, 20 phút A/B/C=90:5:5; tốc độ pha động 0.25 ml/phút; nhiệt độ cột 450C; thời gian 20 phút. Áp

dụng phân tích AMO, AMP, oxacillin, CLO, cephapirin có giới hạn phát hiện của

phương pháp là 8 – 10 ng/l với nước bề mặt, 13 – 18 ng/l với nước thải trước xử lý, 8 –

15 ng/l với nước thải sau xử lý.

Một detector quan trọng trong phương pháp HPLC là detector huỳnh quang, với

ưu điểm tăng độ nhạy, độ chọn lọc cao. Như trong [16] C.Y.W Yang và cộng sự dùng

cột Spherisorb ODS2 (250 mm x 4,6 mm, 5 μm) phân tích AMO trong sữa bò (pha

động: ACN/đệm photphat 10mM pH 5.6 – 24/76; detector huỳnh quang: 346 nm – 422

nm) đạt giới hạn phát hiện lần lượt 0.5 μg/kg và 0.3 μg/kg. Tuy vậy, do các β-lactam ít

tạo phức phát huỳnh quang và cơ chế phát quang dựa trên phản ứng quang hóa [24, 16]

nên chỉ áp dụng với số ít chất hoặc phân tích riêng từng chất chứ không áp dụng phân

tích đồng thời nhiều kháng sinh cùng lúc được.

Tác giả Ngô Quang Trung [5] đã xây dựng quy trình phân tích đồng thời 6

kháng sinh β_Lactam gồm: AMO, CEP, AMP, CLO, CEF, PENG trong nước thải bệnh

viện tại khu vực Hà Nội. Tác giả sử dụng cột tách Supelcosil ODS 250 mm x 4.6 mm,

5 µm, pha động gồm đệm axetat 12 mM pH 4, 70%; ACN 20%, MeOH 10%. Detector

UV-VIS đo ở bước sóng 212 nm. Xây dựng đường chuẩn các kháng sinh trong khoảng

0.1 – 1 mg/l, hệ số tương quan R > 99.8%. Giới hạn phát hiện LOD và LOQ là 0.4 và

0.1 mg/l

Ngoài ra, còn dùng các detector khác như detector điện hóa, detector độ dẫn…

để phân tích các β-lactam.

Nói chung, khi phân tích kháng sinh trong các đối tượng mẫu phức tạp như thực

phẩm, mẫu sinh học, mẫu nước thải, việc xử lý mẫu đối với các phương pháp đều đòi

hỏi qui trình xử lý phức tạp do các kháng sinh liên kết chặt chẽ với nền mẫu và có

nhiều chất nhiễu cần loại trừ.

1.3.4. Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE)

Gần đây, phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệu

quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít. Phương pháp đã được ứng

dụng để tách và xác định các kháng sinh β-lactam trong nhiều đối tượng mẫu khác

nhau.

L. Nozal, L. Arce1,A.R´ıos, M. Valcárcel [21] sử dụng phương pháp điện di

mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) với thành phần dung dịch đệm điện di

gồm 40 mM đệm Borat, 100 mM SDS pH 8.5. Tiến hành phân tích tại thế điện di 10 kV, nhiệt độ 200C, thời gian bơm mẫu 10s. Phương pháp cho phép tách 6 kháng sinh

gồm: AMO, AMP, PENG, OXA, penicillin V và CLO ứng dụng phân tích trong mẫu

nước thải của trang trại chăn nuôi. Giới hạn phát hiện từ 0.14 đến 0.27 mg/l, độ lệch

chuẩn tương đối thời gian lưu từ 0.25 đến 0.86%, diện tích pic 1.3 đến 4.15%. Độ thu

hồi trên 96%.

Biyang Deng và cộng sự [15] đã sử dụng phương pháp điện di với detector điện

quang hóa xác định AMO trong nước tiểu người với giới hạn phát hiện thấp 0.31 μg/l,

khoảng tuyến tính rộng 1 μg/l – 8 mg/l cùng độ thu hồi cao 95.77%, độ lệch chuẩn

tương đối không lớn hơn 2.2% và thời gian phân tích ngắn 6 phút/ mẫu.

Attila Gaspar và cộng sự [14] đã tách và xác định thành công 14 kháng sinh họ

cephalosporin bằng phương pháp điện di mao quản vùng (capillary zone

electrophoresis – CZE). Quá trình tách dùng đệm photphat 25 mM có pH = 6.8.

Phương pháp này tách được 14 kháng sinh trong vòng 20 phút, giới hạn phát hiện 14

kháng sinh cefalosporin C, cefoxitin, cefazolin, cefadroxil, cefoperazon, cefamandol,

cefaclor, CEP, CEF, ceftibuten, cefuroxim, ceftazidim, cefotaxim, ceftriaxon với giới

hạn phát hiện 0.42 – 1.62 mg/l. Trong đó CEP và CEF có giới hạn phát hiện tương ứng

1.62 và 0.89 mg/l; khoảng tuyến tính 5 – 200 mg/l. Mục đích của phương pháp được

ứng dụng để nghiên cứu độ bền của kháng sinh họ Cephalosporins trong nước tại nhiệt độ khác nhau (+25, +4 và -180C). Kết quả cho thấy các kháng sinh giảm nồng độ

không lớn hơn 20% tại nhiệt độ phòng sau khi pha loãng.

M.I.Bailon-Perez và cộng sự [22] sử dụng phương pháp CZE và detector UV –

DAD, pha động dùng hệ đệm tris 175 mM pH 8 và 20% (v/v) ethanol, dùng kĩ thuật

chiết pha rắn làm sạch và làm giàu mẫu ứng dụng phân tích đồng thời AMP, AMO,

dicloxacillin, CLO, OXA, PEN, nafcillin trong nền mẫu nước ( nước sông, nước

thải…). Giới hạn phát hiện tương ứng 0.8; 0.8; 0.25; 0.30; 0.30; 0.9; 0.08 μg/l cùng độ

thu hồi đạt 94 – 99 % với độ lệch chuẩn tương đối thấp hơn 10%.

Phương pháp MEKC cũng được M.I. Bail´on P´erez, L. Cuadros Rodr´ ıguez,

C. Cruces-Blanco [23] xác định 9 loại kháng sinh β_Lactam gồm CLO, dicloxacillin,

OXA, PENG, penicillinV, AMP, nafcillin, piperacillin, AMO trong mẫu dược phẩm.

Các điều kiện tối ưu được chọn là 26 mM đệm Borat, 100 mM SDS pH = 8.5 làm chất

nền điện di và thế điện di 25 kV. Giới hạn phát hiện LOD 0.35 đến 1.42 mg/l, giới hạn

định lượng 2.73 đến 5.74 mg/l, độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu từ 1.5 đến 1.7%.

Độ thu hồi từ 91 – 95.6%.

.Nhìn chung, phương pháp quang học và phương pháp điện hóa rất dễ tiến hành,

đơn giản nhưng chỉ xác định từng chất riêng rẽ, điều này rất khó cho việc phân tích các

mẫu có đa thành phần. Với phương pháp HPLC kết quả tách tốt, độ chính xác, độ nhạy

cao nhưng giá thành chi phí phân tích một mẫu lớn. Vì vậy phương pháp MEKC sẽ là

bước phát triển mới khắc phục những nhược điểm của phương pháp quang, điện,

HPLC mà kết quả đáng tin cậy. Trong bản luận văn này, chúng tôi nghiên cứu theo

hướng của tác giả L. Nozal, L. Arce1,A.R´ıos, M. Valcárcel [21], M.I. Bail ´on P´erez,

L. Cuadros Rodr´ ıguez, C. Cruces-Blanco [23] trong mẫu dược phẩm và sinh học.

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng và nội dung nghiên cứu

2.1.1. Đối tượng

Xác định hàm lượng kháng sinh trong mẫu thuốc và mẫu máu là một mảng đề

tài rất thực tế và quan trọng. Như đã chúng tôi đã đề cập trong bản luận văn này, vấn

đề lạm dụng không đúng hàm lượng kháng sinh đem lại rất nhiều tác hại và ảnh hưởng

đến sức khoẻ con người

Trong đề tài này, đối tượng phân tích mà chúng tôi chọn để nghiên cứu là

penicillin (PENG), cloxacillin (CLO), oxacilin (OXA) ampicillin (AMP), amoxicillin

(AMO), cephalexin (CEP), cefixim (CEF) là các kháng sinh β-lactam được sử dụng

phổ biến hiện nay.

2.1.2. Nội dung nghiên cứu

Nội dung đề tài cần giải quyết là:

- Lựa chọn phương pháp nghiên cứu là phương pháp điện di mao quản điện

động học kiểu Mixen (MEKC) với detector DAD

- Nghiên cứu chọn điều kiện tối ưu tách các kháng sinh -lactam có thể tách

và xác định đồng thời các kháng sinh -lactam như: pH, nồng độ chất điện ly, điện thế,

nhiệt độ….

- Đánh gía thống kê phương pháp phân tích

- Áp dụng phân tích một số mẫu thuốc và mẫu máu - Đánh giá ưu khuyết điểm của phương pháp 250C

2.2. Giới thiệu chung về phương pháp Điện di mao quản [7,8,20]

Để thực hiện được nhiệm vụ của luận văn, kỹ thuật tách được chọn là phương

pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC)

2.2.1. Nguyên tắc của phương pháp điện di mao quản

- Nguyên tắc của sự tách: là dựa trên cơ sở tính chất điện di (sự di chuyển -

Mobility) của các phần tử chất tan (các ion chất tan, chất phân tích) trong mao quản

(đường kính 25 - 100 m ID) trên nền của dung dịch chất điện giải và có chất đệm pH

thích hợp, dưới tác dụng của một từ trường điện E nhất định được cung cấp bởi một

nguồn thế cao một chiều (V: 15 - 40 kV) đặt vào hai đầu mao quản. Nghĩa là CEC là

kỹ thuật tách được thực hiện trong mao quản nhờ lực từ trường điện E điều khiển sự

tách của các chất. Việc dùng cột mao quản có nhiều ưu việt, như tốn ít mẫu và các hoá

chất khác phục vụ cho sự tách, nhưng số đĩa hiệu dụng Nef lớn, sự tách các chất xẩy ra

nhanh và hiệu quả cao.

- Cơ chế điện di: Sự điện di của các phần tử chất tan (các ion) trong ống mao

quản là cơ chế di chuyển khác nhau của chất tan ( chất phân tích ), dưới tác dụng của

lực điện trường E nhất định (Electric Field Force: EFF) và tính chất (đặc trưng) của

dòng điện di thẩm thấu (Electro-Osmotic Flow: EOF), trong sự phụ thuộc vào điện tích

và kích thước của chúng. (Trong đó dòng EOF gọi là dòng điện di thẩm thấu, hay dòng

điện thẩm).

2.2.2. Thiết bị của phương pháp điện di mao quản

- Trang thiết bị của hệ: Theo nguyên tắc, để thực hiện điện di, hệ thống máy

phải có các bộ phận chính như sau:

1. Buồng điện cực, bình điện di và các điện cực trơ (Au hay Pt),

2. Cột tách sắc ký (cột mao quản hay gọi tắt là mao quản),

3. Nguồn cấp thế cao một chiều (15-40 kV), tạo lực điện trường E, để điều khiển quá

trình điện di (sắc ký) của các chất,

4. Bộ phận nạp mẫu vào mao quản (cột tách),

5. Bộ phận phát hiện các chất sau khi tách (detector),

6. Bộ phận điều nhiệt cho mao quản,

7. Bộ phận ghi nhận sắc đồ tách của các chất trong hỗn hợp mẫu.

Các bộ phận này có thể xem trong sơ đồ nguyên lý mô tả ở hình 1.

Hình 2.1. Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của hệ điện di mao quản

2.2.3 . Các quá trình xẩy ra trong mao quản

Trong quá trình điện di, dưới tác dụng của lực điện trường E, do điện thế V đặt vào

hai đầu mao quản tạo ra, trong mao quản có các quá trình là:

1. Sự xuất hiện lớp điện kép sát thành mao quản,

2. Trong mao quản có dòng điện i (5 – 200 A),

3. Xuất hiện dòng điện di thẩm thấu, EOF,

4. Sự tương tác của các chất mẫu và pha động (MP) với thành mao quản,

5. Sự khuếch tán, hay hội tụ của vùng mẫu các chất, khi di chuyển,

6. Sự phân bố của các chất giữa 2 pha (động và tĩnh), khi mao quản có pha tĩnh thật

hay pha tĩnh giả (Mixen, trong hệ MEKC),

7. Hiệu ứng nhiệt Jun, làm mao quản nóng lên,

8. Sự phân tán, gradient và truyền nhiệt từ tâm mao quản ra xung quanh.

9. Sự di chuyển (sự điện di) của các chất (như các ion âm, ion dương, và phần tử

trung tính) trong mao quản. Đây là quá trình chính tạo ra sự sắc ký của các chất.

Nhưng các quá trình trên (1-8) lại có tương tác và ảnh hưởng đến quá trình 9, nó có thể

làm tốt và cũng có thể làm xấu quá trình điện di chuyển này của chất.

Đó là các quá trình luôn xẩy ra trong mao quản của HPCEC. Trong 9 quá

trình xẩy ra đó, chỉ có quá trình 9 là dẫn đến sự tách của các chất, nhưng các quá trình

khác (1-8) lại ảnh hưởng đến quá trình 9, hoặc trực tiếp, hoặc gián tiếp. Vì thế, muốn

có kết quả điện di tốt, nhất thiết chúng ta phải luôn xem xét tất cả các quá trình đó

và các yếu tố liên quan đến các quá trình đó trong mao quản. Tức là phải tối ứu hoá

các điều kiện điện di cho một loại đối tượng mẫu và các chất cần xác định, để có

được hiệu quả tách cao.

2.2.4. Sự phân loại hay các kiểu (mode) của phương pháp điện di mao quản

Sắc ký điện di mao quản rất đa dạng, nhiều kiểu, từ đơn giản đến hoàn chỉnh và

phức tạp, nhưng tuỳ theo cơ chế, bản chất, và đặc điểm của sự tách (sự điện di) xẩy ra

trong ống mao quản mà người ta thường phân chia thành các loại hay các kiểu (Mode)

khác nhau, và gán cho mỗi kiểu một tên riêng, để dễ hiểu, hay phân biệt và sử dụng

chúng cho thích hợp. Cụ thể các kiểu đó là:

1. Điện di mao quản cổ điển (Capillary Electrophoresis: CE)

2. Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis: CZE)

3. Điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (Micell), (Micellary Capillary Electro-

Kenetic:MEK hay MCEK).

4. Điện di mao quản Gel-Filter (sàng lọc hay rây phân tử), (Capillary Gel

Electrophoresis: Gel-CE),

5. Điện di mao quản hội tụ đẳng điện (Capillary Iso-electric Focusing : CIEF).

6. Điện di mao quản đẳng tốc độ (Capillary Iso-Tacho-Phoresis: CITP).

2.2.5. Phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC)

Phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen ( MCEK, hay viết

ngắn gọn là MEKC) là một kiểu của kỹ thuật tách theo bản chất của sự điện di có sử

dụng kết hợp cả tính chất của kỹ thuật điện di mao quản ( Capillary Electrophoresis) và

sắc ký lỏng (LC) có pha tĩnh. Nó là một trong các kiểu tách sắc ký (separation mode)

của kỹ thuật CE được ứng dụng rộng rãi trong sinh học, y học và dược. Nó là một kiểu

kỹ thuật điện di mao quản có sức mạnh, tiện lợi và được ứng dụng cho việc tách cả các

chất phân tử trung hoà và các chất mang điện tích (hợp chất liên kết ion). Vì thế nó bổ

sung và làm phong phú về chủng loại của kỹ thuật điện di.

Bản chất và trung tâm của sự tách ở đây là sự hình thành các phần tử Mixen

(tiểu phân Mixen - pha tĩnh giả) trong ống mao quản và các tiểu phân này sẽ dẫn

dắt và đóng góp khả năng của quá trình tách sắc ký điện di các chất trên nền của

dung dịch chất đệm và chất điện ly trong ống mao quản. Sự tách sắc kí của các phân

tử chất tan trung hoà bằng kỹ thuật MEKC được điều chỉnh bởi các chất hoạt động bề

mặt nằm trong dung dịch MP điện di. Khi chất hoạt động bề mặt ở nồng độ cao hơn

nồng độ ngưỡng của Mixen (giới hạn hình thành Mixen, CMC: Critial Micellary

Concentration), ví dụ chất hoạt động bề mặt SDS (Sodium Dodecyl Sulfat), có CMC=9

mM, thì một tổ hợp của các phần tử tiểu phân của chất hoạt động bề mặt được tích tụ

lại và chúng hình thành (hay tạo ra) trong ống mao quản các tổ hợp của các tiểu phân

SDS. Nó chính là các Mixen (pha tĩnh giả). Các Mixen này là các tiểu phân có đầu kị

nước của chất hoạt động bề mặt, định hướng vào trung tâm của Mixen và để cho đầu

ưa nước của nó ra ngoài và sẽ tương tác với ion chất đệm, hay ion chất tan. Nghĩa là

đầu mang điện tích của chất hoạt động bề mặt sẽ hướng ra chất đệm. Cấu trúc tiêu biểu

của Mixen được mô tả trong hình 2.2. Các Mixen ở đây hoạt động như một pha tĩnh.

Các phân tử của chất mẫu (chất phân tích) được phân bố vào trong cả Mixen và cả ở

ngoài Mixen (trong pha động) theo một cân bằng động học, có hằng số phân bố Ki xác

định, trong những điều kiện nhất định đã được chọn để chạy điện di và mỗi chất tan Xi

sẽ có một hằng số phân bố Ki nhất định trong điều kiện đó. Nếu các Ki của các chất tan

là khác nhau rõ rệt thì sẽ có được kết quả sắc kí điện di tốt.

Phương pháp MEKC dùng để tách các chất phân tích có điện tích và không có

điện tích. Đối với các chất có điện tích, các Mixen loại này chuyển động hoặc là cùng

chiều hoặc là ngược chiều với dòng EOF, là tuỳ thuộc vào điện tích của chất hoạt động

bề mặt và cấu trúc của Mixen . Các chất hoạt động bề mặt Aniônic, ví dụ như SDS, sẽ

di chuyển về Anốt (cực dương), nghĩa là ngược chiều với hướng của dòng EOF. Trong

dung dịch đệm điện di có pH trung tính và kiềm, khi dòng EOF di chuyển nhanh hơn

tốc độ của Mixen , thì sự điện di thực (net movement) của Mixen là theo hướng của

dòng EOF. Trong khi di chuyển như thế, các Mixen có thể tương tác với các phần tử

chất tan (chất phân tích) như kiểu phân bố của sắc ký cột lỏng rắn (R-LC) theo cả

tương tác ưa nước, tương tác kị nước và tương tác tĩnh điện, để tạo ra quá trình sắc ký

của các chất mẫu, khi chạy qua cột mao quản trong quá trình điện di.

Hình 2.2. Cấu trúc của các Mixen và dòng EOF trong MEKC

: dòng EOF. O: Chất hoạt động bề mặt. : Chất tan (chất PT). : Dòng điện di của

chất

Đối với các phần tử chất tan trung tính, nó chỉ là sự phân bố của chất tan vào

trong Mixen và ở ngoài Mixen (pha động điện di) theo một cân bằng động học có hằng

số phân bố Ki nhất định trong điều kiện đã chọn. Chính sự phân bố theo kiểu cân bằng

động học này gây ra (tạo ra) sự lưu giữ khác nhau của các chất tan, và tạo ra sự tách

sắc ký các chất phân tích theo kiểu Mixen. Vì thế các Mixen trong ống mao quản của

kỹ thuật tách này được gọi là pha tĩnh giả. Nhiều chất tan tương tác với Mixen khá

bền, nó tồn tại trong Mixen dài hơn (lâu hơn) sự di chuyển của nó, khi các Mixen mang

nó (các chất tan trung tính) một phần đi ngược chiều của dòng EOF.

Khi mà các chất tan lại không tương tác với các Mixen, thì nó được dòng EOF

mang một cách đơn thuần cùng với dòng EOF. Nhiều hợp chất kị nước tương tác rất

mạnh với các Mixen, và nó bị lưu lại khá lâu trong mao quản, nên làm tăng thời gian

lưu giữ của chất tan

Cơ chế của sự tách các phần tử trung tính trong MEKC về cơ bản vẫn là kiểu

tương tác phân bố của chất tan, tương tự như trong sắc ký cột lỏng-rắn (LC) hấp phụ,

nhưng lại được điều khiển bới lực điện trường E của thế cao V giữa hai đầu mao quản

tạo ra, mà không phải bằng áp suất đẩy pha động như trong HPLC. Trong kỹ thuật

phân tích MEKC, các tính toán về hệ số dung tích ki’, số đĩa N của cột mao quản, độ

phân giải R,... cũng dựa trên cơ sở tương tự với các tính toán của hệ sắc kí cột LC, và

tất nhiên có bổ sung thêm một số yếu tố cho thích hợp và đúng đắn hơn cho hệ pha

MEKC. Chính tỷ số giữa tổng số mol của chất tan (total moles of solute) ở trong

Mixen (pha tĩnh giả), và tổng số mol của chất tan ở trong pha động (dung dịch đệm

điện di), cũng được xem như là dung lượng của cột mao quản, và nó được biểu diễn

theo công thức sau.

ki’ = ( ti – t0 )/[t0.(1- ti/tmc)] = Ki.(VMC/VMP) (1)

Trong đó:

ti : Thời gian lưu của chất tan.

t0 : Thời gian không lưu giữ của chất.

tMC : Thời gian không lưu giữ của Mixen.

Ki : Hệ số phân bố nhiệt động của chất tan giữa hai pha (VMC và VMP).

Với VMC : Thể tích của pha Mixen , và VMP : Thể tích của pha động.

Và tỷ số q = (VMC/VMP) cũng được gọi là tỷ số pha của hệ MEKC. Đồng thời từ

biểu thức (1) chúng ta cũng rút ra được thời gian lưu của chất tan tR như sau.

ti = [ t0.tMC.( 1+ ki’) ] / [ tMC + t0.ki’ ) ] (2)

Nếu như mà ( tMC << t0.k’ ) thì chúng ta lại có:

(3) ti = [ tMC.( 1 + ki’) ] / ki’ ]

Nghĩa là thời gian lưu tR có quan hệ chặt chẽ với hệ số dung tích ki’. Khi hệ số ki’

lớn, thì thời gian lưu ti cũng lớn. Mặt khác, trong MEKC, tỷ số pha q là phụ thuộc vào

nồng độ của chất hoạt động bề mặt trong mao quản, và quan hệ này được biểu diễn bởi

công thức sau đây.

q = [V.( CSP- CMC )] / [ 1 – vmc.(CSP – CMC )] (4)

Trong đó:

V : Điện thế sử dụng để tạo ra điện trường E của sự điện di.

CSP : Nồng độ của Mixen (mol/l.)

CMC : Nồng độ giới hạn chuẩn của Mixen (mol/l.)

Vmc : Tốc độ trung bình của Mixen .

Ki : Hệ số phân bố của chất thứ i ở trong và ngoài Mixen .

Và khi nồng độ Mixen không lớn, thì hệ số dung tích ki’, và tốc độ của dòng EOF,

được tính như sau.

ki’ = Ki.vmc .( CSP - CMC ) (5)

vEOF = ( e + MC ).E (6)

Cùng với các tham số tR, ki’ , Rij đã nói ở trên, hệ số phân bố nhiệt động Ki

của chất tan trong hệ MEKC, cũng là một đại lượng quan trọng có liên quan đến các

quá trình xẩy ra trong mao quản và được xác định theo biểu thức sau.

lnKi = (H0/R.T) + ( S0/R ) (7)

Trong đó: H0, S0 là Entanpi và Entropi tiêu chuẩn của chất tan. R là hằng số khí, và T là nhiệt độ (oK) của cột mao quản. Biểu thức này cho chúng ta thấy hằng số

phân bố Ki luôn luôn phụ thuộc vào nhiệt độ. Nó cũng là một hằng số nhiệt động.

Nhìn chung, chúng ta thấy khi nhiệt độ tăng thì hệ số phân bố Ki đều giảm dần

ở tất cả các chất. Với các chất khác nhau, thì hệ số Ki này cũng thay đổi rất khác nhau.

Đó chính cũng là yếu tố thuận lợi cho sự tách trong kỹ thuật điện di. Đồng thời với các

chất hoạt động bề mặt khác nhau thì cũng gây ảnh hưởng đến hệ số Ki khác nhau.

Ngoài các đại lượng trên, độ phân giải R cũng là một thông số quan trọng của

kỹ thuật MEKC. Độ phân giải Rij của hai chất , ví dụ như I và J trong hệ MEKC cũng

được biểu thị bằng công thức sau đây theo ba thành phần cơ bản.

(8)

Rij = A.z.ti

Trong đó: ________

(9) Hiệu lực tách A: A =  (N/4) .

Độ chọn lọc z : z = [(  - 1 )/] với  = k2’/k1’ (10)

Thời gian lưu tR :

ti = [k2’/(k2’+ 1)].{[(1 – t0/tmc )] / [1 + k1.( t0/tmc)]} (11)

i : hệ số dung tích

Trong đó: k’

ti : Thời gian lưu của chất tan.

t0 : Thời gian không lưu giữ của chất

tmc: Thời gian không lưu giữ của Mixen.

Công thức (8) và (9) này cho chúng ta thấy rằng, độ phân giải Rij có thể được

nâng cao (làm tốt), khi tối ưu hoá được số đĩa N lớn nhất, khi chọn được điều kiện để

có độ chọn lọc  và hệ số dung tích ki’ của các chất tan là phù hợp nhất. Để có được hệ

số dung tích ki’ tốt, trong MEKC, có thể đạt được bằng cách thay đổi pH, thay đổi

nồng độ của chất hoạt động bề mặt, thêm dung môi hữu cơ vào pha động (dung dịch

đệm điện di). Nói chung, hệ số dung tích ki’ của chất tan là tăng tuyến tính cùng với sự

tăng nồng độ của chất hoạt động bề mặt trong một vùng nhất định. Song khi tăng nồng

độ chất hoạt động bề mặt nhiều, thì một vấn đề xuất hiện ở đây là, nhất là khi dùng các

chất hoạt động bề mặt loại ionic với nồng độ cao thường gây ra sự tăng cường độ dòng

điện trong mao quản và hiệu ứng nhiệt Jun xuất hiện rõ rệt. Công suất điện trong vùng

từ 5 - 7 W/m mao quản trong môi trường lực ion trung bình, thì cũng đã làm nhiệt độ mao quản đã tăng rõ rệt (có thể đến 10oC). Lúc này hiệu suất sắc ký bị giảm. Mặt khác

với các ống mao quản có đường kính nhỏ (từ 25 - 100 m), việc sử dụng từ trường

điện thế V càng cao, thì đương nhiên sẽ càng làm nóng mao quản nhiều. Vì thế nên

tránh dùng thế quá cao và cột mao quản đường kính (ID) lớn hơn 100 m và cần phải

điều nhiệt mao quản.

Các chất hoạt động bề mặt được dùng trong MEKC cũng có thể tương tác với

thành ống mao quản và cũng có thể ảnh hưởng nhất định đến dòng EOF, làm thay đổi

sự tương tác hấp phụ giữa chất tan và thành ống mao quản. Hướng di chuyển của chất

tan và của các Mixen, là cũng bị thay đổi trong sự phụ thuộc vào điện tích của Mixen

và tốc độ của dòng EOF. Nói chung, các hệ đệm điện di có pH tương đối cao, thường

được sử dụng để duy trì dòng EOF có tốc độ đủ lớn và đảm bảo hướng di chuyển ổn

định của các Mixen.

Bảng 2.1. Các chất hoạt động bề mặt dùng trong MEKC

CMC (mM) Số phần tử kết tụ (Mixen) Ví dụ Loại chất

SDS Anionic 14 62

DTAB Cationic 14 50

1,3 78

Non-Ionic Octylglucoside - -

0,16 - (không ionic) n-Dodecyl--D-maltoside

Triton-X 0,24 140

CHAPS Ionic kép 8 10

(Zwitterionic) CHAPSO 8 11

Bile Salts Axít Chlolic 14 2-4

2.2.6. Phân tích định lượng trong phương pháp điện di mao quản

Theo lý thuyết sắc ký, trong một điều kiện sắc ký xác định đã chọn, thì thời gian

lưu của chất là đại lượng đặc trưng để định tính (phát hiện) các chất. Còn chiều cao H

của pic sắc ký hay diện tích S của pic là có liên quan chặt chẽ đến nồng độ Cx của chất.

Trong một vùng nồng độ nhất định và không lớn, thì chúng ta luôn có biểu thức xác

định mối quan hệ đó là:

Hi = k1.Ci (12) và Si = k2.Ci (13)

Trong đó: Hi và Si là chiều cao và diện tích của pic sắc ký của chất i.

Ci là nồng độ của chất ứng với thời gian lưu tRi .

k1, k2 là hằng số điều kiện thực nghiệm.

Để phân tích định lượng các chất theo kỹ thuật CE, chúng ta dựa theo phương

trình cơ bản trên và có thể dùng một trong hai phương pháp chuẩn hoá là phương pháp

đường chuẩn và phương pháp thêm tiêu chuẩn để xác định nồng độ chất phân tích

trong mẫu.

2.3. Thực nghiệm

2.3.1. Máy móc và dụng cụ

- Máy điện di model 1602A của hãng HP3D (Đức) với detector DAD, kết nối

với phần mềm HP chemstation

- Mao quản silica trần – loại bubble cell, đường kính 50 µm, chiều dài 64.5 cm,

chiều dài hiệu dụng 58 cm của hãng HP (Đức)

- Mắc trắc quang UV – 1601PC của hãng Shimadzu

- Máy đo pH TITROLINE của hãng SCHOTT – Đức

- Bể siêu âm, máy ly tâm, hệ thống bơm chân không, cân phân tích, giấy lọc

0.45 μm; 0.2 μm của hãng Millipore (USA)

- Các dụng cụ thí nghiệm thông dụng khác của Phòng thí nghiệm phân tích

2.3.2. Hóa chất

- Các chất chuẩn PENG (Na), AMP.3H2O, AMO.3H2O, CLO (Na), CEP.H2O,

CEF, OXA do Viện kiểm nghiệm Bộ Y tế ( 48 Hai Bà Trưng – Hà Nội) cung cấp

- Nước deion được lọc qua giấy lọc 0.45µm của hãng Millipore (USA)

- Axít Boric H3BO3, muối natri tetraborat Na2B4O7.10H2O, chất hoạt động bề

mặt Natri dodecyl sunfat SDS, NaOH, NaH2PO4.2H2O, Na2HPO4… của hãng Merk (

Đức).

- Đệm Borat được pha tetraborat từ axit boric H3BO3, muối natri

Na2B4O7.10H2O với nước deion. Dung dịch được siêu âm 10 phút, lọc qua giấy lọc

kích thước lỗ 0.2 μm và định mức tới thể tích mong muốn. Điều chỉnh pH bằng dung

dịch NaOH và H3BO3, giá trị pH thay đổi cho phép ± 0.05 và được đo sau khi thêm

SDS. Dung dịch được bảo quản ở nhiệt độ thường

- Dung dịch chuẩn được pha trong nước deion từ các chất chuẩn sau đó đem

siêu âm 15 phút được dung dịch nồng độ 1000 mg/l. Dung dịch 1000 mg/l được pha

loãng 10 lần thành 100 mg/l.( 1000 mg/l bảo quản trong 2 tháng và 100 mg/l bảo quản

1 tháng). Các dung dịch nồng độ thấp được pha từ dung dịch 100 mg/l và sử dụng trong ngày. Dung dịch được bảo quản trong tủ lạnh 40C, tránh ánh sáng trực tiếp.

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Nghiên cứu khảo sát tối ưu điều kiện tách β-Lactam

3.1.1. Chọn bước sóng phát hiện chất

Để khảo sát phổ β-Lactam, detector được chọn là UV-Vis. Do các β-Lactam

đều là những hợp chất không có mầu, hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại nên chúng

tôi sử dụng máy quang phổ UV – 1601PC với khoảng quét phổ là 190 – 400 nm dùng

cuvet thạch anh để xác định các bước sóng hấp thụ tối ưu của các chất này. Các chất

được pha với nồng độ 10 mg/l trong 25 mM đệm Borat, 100 mM SDS, pH=9. Phổ thu

được thể hiện hình 3.1

Hình 3.1 Phổ hấp thụ của các β-Lactam (nồng độ 10 mg/l )

Các hệ đệm đa axit hay đa bazơ có nhược điểm là có hấp thụ quang trong vùng

UV hay UV-VIS gây khó khăn phát hiện chất.Vì thế phải quét phổ các chất đệm, xem

xét sóng đo thích hợp để hạn chế ảnh hưởng

Kết quả quét phổ cho ta thấy: các β-Lactam có phổ hấp thụ quang cao nhất ở

198 nm. Chúng tôi chọn bước sóng làm việc là 198 nm cho pic cao và đẹp nhất.

Detector sử dụng của máy điện di là detector DAD của hãng HP

3.1.2. Mao quản và xử lý mao quản trước khi tách

Trong kỹ thuật điện di việc sử dụng mao quản silica đường kính trong nhỏ hơn

100 µm sẽ làm mất ảnh hưởng của nhiệt jun sinh ra trong ống mao quản và do vậy mới

cho phép áp vào hai đầu mao quản điện thế cao tới 20 – 30kV. Hơn nữa kích thước

mao quản sẽ rất thuận lợi khi phân tích những mẫu có hàm lượng nhỏ như mẫu huyết

thanh. Tuy nhiên, nếu mao quản có đường kính quá nhỏ thì thể tích mẫu nạp cũng bị

giới hạn, điều này lại ảnh hưởng đến độ nhạy phát hiện. Khoảng đường kính trong của

mao quản thường là 25 – 150 µm. Tốt nhất nên dùng mao quản có đường kính trong từ

25- 75 µm. Vì mao quản có ID lớn hơn 75 µm thường cho hiệu ứng nhiệt Iun lớn và

khó khống chế nhiệt độ mao quản khi điện di. Để phù hợp với điều kiện của phòng thí

nghiệm loại mao quản chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này có đường kính trong là

50 µm

Chiều dài mao quản cũng là yếu tố quan trọng, vì muốn áp thế cao vào hai đầu

mao quản thì chiều dài mao quản phải đủ lớn. Về mặt lý thuyết, thế áp vào mao quản

thông thường đảm bảo từ 200 – 600 V/cm là thích hợp. Việc chọn chiều dài mao quản

chỉ có tính chất định tính phụ thuộc vào khoảng cách từ lọ mẫu đến detector và từ

detector đến lọ đệm và tùy thuộc vào hỗn hợp chất mẫu cần tách. Mao quản của chúng

tôi sử dụng là loại mao quản trần, có tổng chiều dài là 64.5cm, chiều dài hiệu lực là

58cm, loại bubble cell (có độ nhạy cao gấp 3 -5 lần so với cell thông thường) của hãng

HP. Để tạo flowcell trên mao quản, tại chiều dài 58cm tính từ đầu mao quản loại bỏ

lớp poliamit bằng cách đốt nóng một đoạn mao quản dài 2mm. Sau đó dùng giấy mềm

tẩm axeton hoặc etanol lau sạch và lắp vào hệ điện di.

Mao quản lần đầu tiên sử dụng được rửa lần lượt với NaOH 1M 10 phút, nước

deion 10 phút và rửa với đệm chạy 30 phút. Sau khi chạy từ 3-4 lần thì hoạt hóa lại cột,

rửa với NaOH 0.1M 3 phút, nước deion 3 phút và đệm chạy 10 phút.

3.1.3. Chọn phương pháp bơm mẫu

Trong kỹ thuật điện di mao quản có thể đưa vào mao quản bằng ba phương pháp

là phương pháp điện động học (electrokinetic), phương pháp thủy động học

(hydrodynamic) và phương pháp Xiphong (siphon). Trong đó phương pháp điện động

học và thủy động học được dùng rộng rãi Nguyên tắc của phương pháp điện là đặt một

thế nhất định trong một thời gian nhất định vào đầu của hai điện cực, một điện cực

nhúng trong lọ mẫu và một điện cực kia nhúng trong lọ đệm. Trong khi đó hai đầu của

mao quản cũng được nhúng vào hai lọ mẫu và đệm nói trên. Như thế những ion mẫu sẽ

di chuyển vào mao quản tạo thành vùng mẫu đầu mao quản. Ion nào có kích thước nhỏ,

điện tích lớn sẽ được dẫn vào mao quản nhiều hơn. Trong mẫu nếu có hai chất phân

tích có cùng nồng độ nhưng điện tích khác nhau thì lượng ion của những chất này được

dẫn vào mao quản khác nhau. Do vậy nồng độ chất phân tích được nạp vào mao quản

sẽ khác so với nồng độ mẫu thực. Sự sai khác này sẽ lớn nếu thời gian bơm mẫu dài.

Trong thực tế điều này không đáng ngại vì người ta có thể loại trừ bằng cách bơm mẫu

trong thời gian ngắn và ở những điều kiện như nhau trong mọi thí nghiệm nghiên cứu,

thời gian bơm mẫu ngắn ảnh hưởng đến độ nhạy. Ngoài ra lượng mẫu bơm còn phụ

thuộc vào độ dẫn của dung dịch mẫu, đặc biệt ở những mẫu có nồng độ muối cao mà ta

không thể biết trước được như những mẫu nước tiểu.

Trong phương pháp bơm mẫu thứ hai là bơm mẫu theo kiểu thủy động lực học

bao gồm trong kiểu bơm mẫu này là bơm bằng áp suất hoặc xiphong. Nguyên tắc của

phương pháp xiphong dựa trên sự chênh lệch độ cao của hai đầu ống mao quản được

đặt cao thấp khác nhau một khoảng H, một đầu nhúng vào lọ chứa mẫu và đầu kia

nhúng vào lọ chứa đệm để mẫu tự xiphong vào ống mao quản trong thời gian nhất

định. Như thế mẫu nạp vào được đặt ở đầu mao quản cao. Phương pháp này đơn giản

nhưng khi nạp một lượng mẫu nhỏ cỡ vài nl thì khó chính xác và áp dụng cho những

hệ điện di tự tạo đơn giản, độ lặp lại kém. Vì vậy ít được dùng.

Phương pháp bơm mẫu bằng áp suất là dùng một áp suất thích hợp để nén vào

lọ chứa mẫu và tạo chân không phía đầu kia mao quản trong một thời gian nhất định.

Do lực áp suất đẩy và hút mà một lượng mẫu sẽ được bơm vào đầu mao quản. Áp suất

hay được dùng từ 50 – 300 mbar. Mẫu được bơm vào sẽ có nồng độ đều và giống với

nồng độ của chất tan trong mẫu phân tích. Trong phương pháp này chúng tôi chọn bơm

mẫu theo phương pháp thủy động lực học với áp suất là 50 mbar và cách bơm mẫu này

sẽ được dùng trong suốt quá trình thí nghiệm

3.1.4. Độ điện di và độ điện di hiệu dụng

Trong kỹ thuật MEKC chất tạo Mixen có vai trò rất quan trọng, nó quyết định

đến độ phân giải của quá trình tách. Các hạt Mixen hình thành trong dung dịch điện di

đóng vai trò như pha tĩnh giả. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dung loại Natri

dodecyl sunphat (SDS), tức là Mixen được hình thành bởi các phân tử SDS.

Theo lý thuyết, độ điện di [7,8]

tot(i) = ( ef + EOF) = l/(ti .E) = (L.l)/(ti .V) (14)

Thời gian lưu của chất tan i là:

(15) ti = (L.l)/(tot(i) .V)

Trong đó:

tot(i) = (ef + EOF ): Độ điện di tổng cộng (toàn phần) của chất tan.

V: Điện thế được dùng đặt vào hai đầu ống mao quản, kV.

l: Chiều dài hiệu dụng (56cm) và L là chiều dài tổng cộng của mao quản

(64.5cm).

E: Điện trường trong mao quản do thế V tạo ra. Điện trường E này do thế V

(kV) đặt vào hai đầu ống mao quản và nó là lực chính điều khiển quá trình điện di

của các chất và cả dòng EOF trong ống mao quản.

Độ điện di hiệu dụng riêng µef của chất tan được tính theo công thức sau:

µef = tot - EOF

µtot = (L. l)/ ti .V = 64.5 . 56/ ti .V

EOF = (L.l)/ t0 . V = 64.5 . 56/ t0 . V

Thời gian t0 được đo bằng cách dùng chất tan trung tính đánh dấu, chính chất

tan này trong từng điều kiện nó nằm trong dòng EOF và sẽ di chuyển bằng tốc độ di

chuyển của dòng EOF. Thời gian t0 được xác định bằng cách điện di metanol tinh

khiết. Thực tế trong mỗi thí nghiệm chúng tôi quan sát thấy t0 trùng với tín hiệu nhiễu

trên đường nền gây ra bởi dung địch đệm điện di. Vì thế trong các thí nghiệm chúng tôi

đã sử dụng thời gian xuất hiện của tín hiệu này như thời gian t0

3.1.5. Ảnh hưởng pH của dung dịch đệm điện di

Ảnh hưởng pH trong dung dịch đệm điện di được khảo sát với dung dịch điện di

chứa:

- 7 chất kháng sinh β-Lactam cùng nồng độ 5 mg/l, 25 mM đệm Borat + 100 mM SDS

- Thế điện di 20kV, bơm mẫu áp suất 50mbar, thời gian bơm mẫu 8s, nhiệt độ mao quản 280C

Gía trị pH thay đổi tại pH = 8.25; 8.0; 7.75; 7.5.

Hình 3.2 Sắc đồ điện di của β-Lactam ở pH 8.25; 8.0; 7.75; 7.5

Bảng 3.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến thời gian di chuyển của β-Lactam

Thời gian di chuyển của β-Lactam (phút) pH CEP AMP PENG OXA CEF CLO t0 AMO

8.38 9.37 9.48 10.83 11.78 12.404 13.44 8.25 5.47

5.58 8.35 9.95 10.12 11.11 12.09 12.74 13.08 8.0

8.34 10.62 10.88 11.41 12.37 12.84 13.32 7.75 5.67

5.83 8.41 11.43 11.87 12.36 13.05 14.11 14.43 7.5

Hình 3.3. Ảnh hưởng pH dung dịch đệm điện di đến độ điện di hiệu dụng của β-Lactam

3.5

AMO

CEP

2.5

AMP

PENG

OXA

1.5

CEF

CLO

7.5

7.75

8.25

pH

Vì mao quản được sử dụng là mao quản thủy tinh silic. Khi cho mao quản silic

không phủ tiếp xúc với dung dịch đệm có pH từ 7.5 đến 8.25 (>4), bề mặt mao quản

tích điện âm nguyên nhân là do các nhóm silanol trên bề mặt mao quản phân ly proton,

làm bề mặt mao quản mang tính âm điện (anionic), thì dòng EOF thường hướng theo

phương từ anốt (cực dương) về phía catốt (cực âm). Khi có thêm chất hoạt động bề mặt

SDS – dạng anionic, hình thành các Mixen. Các Mixen sẽ di chuyển về phía anốt (cực

dương) nghĩa là ngược chiều với hướng của dòng EOF. Do từng tính chất riêng của các

β-Lactam chúng phân bố vào Mixen khác nhau với hệ số phân bố khác nhau. Khi chất

phân tích bám vào Mixen, chúng di chuyển cùng tốc độ Mixen, khi không bám vào

Mixen, chúng di chuyển cùng tốc độ dòng điện di thẩm thấu. Kết quả là trong dòng

EOF về phía cực âm là các phân tử trung hòa và các ion mang điện tích âm. Mixen và

dòng EOF di chuyển khác tốc độ. Do hệ số phân bố vào Mixen khác nhau dẫn tới di

chuyển tới cực âm với tốc độ khác nhau, tách khỏi nhau.

Khi điện di ở pH từ 7.5 đến 8.25 làm cho dòng EOF và độ điện di µef của chất

tan bị thay đổi theo. Trong dung dịch với gía trị pH cao hơn hay thấp hơn giá trị pI ( độ

ion hóa) sẽ làm thay đổi điện tích của các chất tan. Nghĩa là khi thay đổi pH sẽ làm

thay đổi chất tan bị dương điện hơn hay âm điện hơn hoặc ngược lại. Kết quả sẽ làm

cho dòng EOF và độ điện di µef của chất tan cũng bị thay đổi theo. Điện di ở pH cao

hơn giá trị pI (pI = -log I và I: độ ion hóa) làm cho chất tan có điện tích âm và nó sẽ di

chuyển về phía anốt (đầu cực dương) chậm hơn dòng EOF. Như vậy cùng với tác dụng

làm thay đổi điện tích của chất tan, sự thay đổi pH của dung dịch đệm điện di cũng làm

thay đổi cả tốc độ của dòng EOF.

Hơn nữa khi pH thay đổi nó cũng sẽ làm thay đổi sự tích điện của thành mao

quản. Vì khi pH của pha động điện di thay đổi, sẽ làm thay đổi quá trình de-hydro, tách

ion H trong nhóm –OH trên thành mao quản. Tức là làm thay đối lớp điện kép và thế

Zêta. Qua đó mà tác động hay làm ảnh hưởng đến sự điện di của chất.

Từ hình 3.3, ở pH =7.5 đến 8.25 độ điện di của PENG, OXA, CEF hầu như

không bị ảnh hưởng. Đối với CLO độ điện di ko đổi pH 7.5 đến 8, đến pH 8.25 độ điện

di cao hơn.

Với CEP, AMP độ điện di thấp dần khi tăng dần gía trị pH, tại pH = 8.25 và 8.0

chân pic của CEP và AMP chưa tách ra được khỏi nhau.

Nhận thấy càng tăng pH thì khả năng tách càng kém, thời gian di chuyển ngắn

hơn và pic nhọn hơn. Ảnh hưởng này thể hiện rõ nhất ở AMP và CEP. Từ nghiên cứu,

chũng tôi chọn pH =7.75 tốt nhất để tách các β-Lactam trong những nghiên cứu tiếp

theo.

3.1.6. Ảnh hưởng của thành phần dung dịch đệm

Cùng với pH của dung dịch đệm, chất điện ly trong pha động cũng có vai trò rất

quan trọng và nó phải có nồng độ phù hợp. Trong thực tế người ta chọn chất đệm pH

cũng chính là chất điện giải của sắc ký điện di.Tác động của chất điện giải thể hiện qua

việc ổn định, duy trì dòng điện I và dòng điện thẩm EOF trong mao quản. Qua đó sẽ

làm ảnh hưởng đến độ điện di hiệu dụng µef của chất phân tích.

Trong hệ đệm, thì các hệ đệm đa axit, đa ba bazơ thường có hiệu lực tốt hơn các

hệ đệm đơn axit, đơn bazơ. Vì các đa axit, đa bazơ có nhiều nấc phân ly, nên có khả

năng đệm trong vùng pH rộng và tính linh hoạt cao. Các đệm dùng với nồng độ cao mà

không gây hiệu ứng nhiệt lớn cho ống mao quản.

Tiến hành chạy điện di thành phần đệm: 25 mM đệm Photphat

- 7 chất kháng sinh β-Lactam cùng nồng độ 5 mg/l, 100 mM SDS, pH =7.75

- Thế điện di 20kV, bơm mẫu áp suất 50 mbar, thời gian bơm mẫu 8s, nhiệt độ mao quản 280C

Thực nghiệm nhận thấy, khi chạy điện di trong hệ đệm photphat thì chưa xuất

hiện pic trước thời gian 15 phút. Vì vậy chũng tôi quyết định chọn đệm Borat cho các

khảo sát tiếp theo.

3.1.7. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất tạo mixen SDS

Chất hoạt động bề mặt SDS được xem như pha tĩnh giả của sự tách vì thực chất

nó vẫn chuyển động cùng với dòng điện di. Nồng độ SDS trong dung dịch đệm điện di

có ảnh hưởng mạnh tới độ điện li hiệu dụng của các β-Lactam bởi nó liên quan đến sự

hình thành hạt Mixen cũng như nồng độ Mixen trong dung dịch đệm điện di. Để khảo

sát ảnh hưởng của SDS đến quá trình điện di, nồng độ SDS đã bị thay đổi tại ba giá trị

là 75 mM; 100 mM và 125 mM. Các điều kiện khảo sát:

- 7 chất kháng sinh β-Lactam cùng nồng độ 5 mg/l, 25 mM đệm Borat, pH = 7.75

- Thế điện di 20kV, bơm mẫu áp suất 50 mbar, thời gian bơm mẫu 8s, nhiệt độ mao quản 280C

Hình 3.4 Sắc đồ điện di của β-Lactam tại nồng độ SDS = 75 mM;100 mM và 125 mM

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ SDS đến thời gian lưu của β-Lactam

Thời gian di chuyển của β-Lactam (phút) Nồng độ SDS(mM) t0 AMO CEP AMP PENG OXA CEF CLO

5.8 8.552 10.437 10.662 11.235 12.708 12.951 13.298 75

5.9 8.74 11.32 11.68 12.31 13.17 13.4 14.12 100

Hình 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ SDS trong dung dịch đệm điện di đến độ điện di hiệu dụng của β-Lactam

3.5

AMO

CEP

2.5

AMP

PENG

OXA

1.5

CEF

CLO

125

6.1 9.397 12.45 12.802 14.085 14.414 15.011 17.372 125

100 SDS (mM)

Thay đổi nồng độ chất hoạt động bề mặt SDS, gây ra sự thay đổi hấp thụ lên

thành mao quản qua tương tác ionic hay hiệu ứng kị nước. Các chất hoạt động bề mặt

được dùng trong MEKC cũng có thể tương tác với thành ống mao quản và cũng có thể

ảnh hưởng nhất định đến dòng EOF, làm thay đổi sự tương tác hấp phụ giữa chất tan

và thành ống mao quản. Hướng di chuyển của chất tan và của các Mixen cũng bị thay

đổi trong sự phụ thuộc vào điện tích của Mixen và tốc độ của dòng EOF Chất hoạt

động bề mặt là SDS là dạng anionic làm tăng dòng EOF, sẽ di chuyển về anot ( cực

dương) nghĩa là ngược chiều với hướng của dòng EOF.

Theo lý thuyết [7,8]

Độ phân giải R cũng là một thông số quan trọng của kỹ thuật MEKC. Độ phân

giải Rij của hai chất , ví dụ như I và J trong hệ MEKC cũng được biểu thị bằng công

thức sau đây theo ba thành phần cơ bản.

Rij = A.z.ti

Trong đó: ________

Hiệu lực tách A: A =  (N/4) .

Độ chọn lọc z : z = [(  - 1 )/] với  = k2’/k1’

Thời gian lưu tr :

ti = [k2’/(k2’+ 1)].{[(1 – t0/tm )] / [1 + k1.( t0/tm)]}

i : hệ số dung tích

Trong đó: k’

ti : Thời gian lưu của chất tan.

t0 : Thời gian không lưu giữ của chất

Theo công thức, độ phân giải R có thể được nâng cao (làm tốt) khi tối ưu hóa

i của chất tan là phù hợp. Hệ số dung tích k’

i nói chung là tăng tuyến tính cùng với sự

được số đĩa N lớn nhất, khi chọn được điều kiện để có độ chọn lọc α và hệ số dung tích k’

tăng nồng độ của chất hoạt động bề mặt trong một vùng pH nhất định. Càng tăng nồng

độ thì thời gian lưu các chất β-Lactam càng tăng do ảnh hưởng của nồng độ các ion

trong dung dịch càng lớn, tương tác với Mixen bền và lâu hơn sự di chuyển của nó, dẫn

đến tốc độ di chuyển của các chất tan sẽ chậm hơn vì vậy thời gian lưu tăng, cường độ

dòng cũng tăng, chiều cao pic bị thay đổi. Thời gian càng tăng thì pic sẽ càng bị kéo

dãn và tù hơn.

Độ điện di hiệu dụng của AMO và ClO tăng khi tăng nồng độ SDS, các chất còn

lại độ điện di hiệu dụng hầu như không thay đổi, khả năng tách thay đổi nhiều, các pic

tách hết chân.

Song khi tăng nồng độ chất hoạt động bề mặt lên đáng kể, nhất là với loại ionic

với nồng độ cao thường gây ra sự tăng cường độ dòng điện trong mao quản và hiệu

ứng nhiệt Jun xuất hiện rõ rệt làm mao quản nóng lên. Tại nồng độ 125 mM nhận thấy

tín hiệu nền xấu hơn so với nồng độ 75 mM và 100 mM, pic dãn rộng hơn. Nồng độ

SDS 75mM hiệu quả tách cũng rất tốt nhưng chiều cao pic không bằng 100 mM, sẽ

gây ảnh hưởng độ nhạy. Vì vậy chúng tôi chọn nồng độ SDS = 100 mM tối ưu để khảo

sát các thí nghiệm tiếp theo.

3.1.8. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đệm

Cùng với pH của dung dịch đệm, chất điện giải (chất điện ly) trong pha động

cũng có vai trò quan trọng và nó phải có nồng độ phù hợp. Trong thực tế, người ta cố

gắng chọn chất đệm pH cũng đồng thời chính là chất điện giải của sắc ký điện di. Như

vậy, pha động sẽ không phức tạp, không gây khó khăn ảnh hưởng đến hiệu quả tách

sắc ký. Ở đây tôi chọn Natri tetraborat vừa là chất đệm pH vừa là chất điện giải

Chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ đệm tại bốn gía trị là 20 mM; 25 mM; 30

mM; 35 mM với điều kiện khảo sát như sau:

- 7 chất kháng sinh β-Lactam cùng nồng độ 5 mg/l, 100 mM SDS, pH = 7.75

- Thế điện di 20kV, bơm mẫu áp suất 50 mbar, thời gian bơm mẫu 8s, nhiệt độ mao quản 280C

HÌnh 3.6 Sắc đồ điện di của β-Lactam tại nồng độ đệm 20 mM, 25 mM, 30 mM và 35

Bảng 3.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đệm tới thời gian lưu ( phút)

Thời gian di chuyển của β-Lactam (phút) Nồng độ đệm (mM) t0 AMO CEP AMP PENG OXA CEF CLO

5.42 7.94 9.90 10.12 10.49 11.51 11.80 11.91 20

5.67 8.34 10.62 10.88 11.41 12.37 12.84 13.32 25

6.08 9.3 12.03 12.37 13.53 14.22 14.86 16.0 30

Hình 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ đệm đến độ điện di hiệu dụng của β-Lactam

AMO

CEP

AMP

PENG

OXA

CEF

CLO

4 3.5 3 2.5 2 1.5 1

6.31 10.95 14.16 14.58 17.54 17.8 19.70 22.42 35

Đệm Borat (mM)

Khảo sát nồng độ đệm tại bốn giá trị, càng tăng nồng độ đệm thì độ điện di hiệu

dụng của 7 kháng sinh β-Lactam càng tăng, thời gian lưu của chất tan tăng nhưng hiệu

quả tách cũng không tốt.

Trong ống mao quản, khi nồng độ đệm tăng, nghĩa là nồng độ các ion tăng,

thường làm thay đổi, giảm độ lớn của lớp điện kép, ảnh hưởng đến sự tương tác tĩnh

điện Culông của chất tan với thành mao quản. Lớp điện kép là một hiện tượng sinh ra

rất tự nhiện trong mao quản. Lớp điện kép này thường làm cho vùng mẫu di chuyển

không phẳng qua đó tạo ra sự doãng chân pic và cuối cùng làm giảm hiệu quả tách, cụ

thể nhất ở nồng độ 35 mM.

Lực ion của dung dịch cũng là yếu tố ảnh hưởng đến dòng EOF và quá trình sắc

ký điện di các chất. Nồng độ đệm tăng, lực ion cũng tăng theo, lớp điện kép bị thu hẹp

lại kết quả làm giảm thế Zeta và giảm luôn tốc độ của dòng EOF. Lực ion lớn, taọ ra

dòng điện cao và có hiệu ứng nhiệt Jun lớn làm mao quản nóng lên, độ nét của pic

cũng bị ảnh hưởng, làm giảm hiệu quả tách. Tại nồng độ đệm 30 mM và 35 mM nồng

độ đệm cao nên pic đã bị dãn và tín hiệu nền xấu đi nhiều, hiệu quả tách cũng kém, pic

của PENG và OXA bị dính chân vào nhau tại nồng độ 35 mM.

Nồng độ đệm 20 mM, lực ion thấp hơn, giảm được cường độ dòng điện I, tăng

sự hấp phụ của mẫu lên thành mao quản, tốc độ di chuyển của các chất tan nhanh hơn

vì vậy hiệu quả tách kém, hai pic của CEF và CLO dính chân vào nhau.

Do đó chúng tôi chọn nồng độ 25 mM đệm Borat là điều kiện tối ưu.

3.1.9. Khảo sát ảnh hưởng thời gian bơm mẫu

Chúng tôi tiến hành khảo sát thời gian bơm mẫu tại ba gía trị là 8s, 10s và 12s

với điều kiện khảo sát như sau:

- 7 chất kháng sinh β-Lactam cùng nồng độ 5 mg/l, 25 mM đệm Borat, 100 mM SDS,

pH = 7.75 - Thế điện di 20kV, bơm mẫu áp suất 50 mbar, nhiệt độ mao quản 280C

HÌnh 3.8 Sắc đồ điện di tại thời gian bơm mẫu 8s, 10s và 12s

Bảng 3.4 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu tới thời gian lưu ( phút)

Thời gian di chuyển của β-Lactam (phút) Thời gian bơm mẫu (s) t0 AMO CEP AMP PENG OXA CEF CLO

5.74 8.48 10.76 11.03 11.63 12.63 1298 13.42 8

5.74 8.49 10.76 11.02 11.66 12.61 13.0 13.43 10

Hình 3.9 Ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu đến chiều cao pic β-Lactam

5.75 8.46 10.76 11.01 11.62 12.57 12.93 13.39 12

c i

)

U A m

(

p o a c u ề i

h C

10 8 6 4 2 0

AMO CEP AMP PENG OXA CEF CLO

10 Thời gian (s)

Khi nạp mẫu vào mao quản, lượng mẫu hay vùng mẫu nạp phải nhỏ hơn giới

hạn cho phép (2% ≤ chiều dài l). Nếu vùng mẫu nạp vào quá lớn thì sự phân tán (mở

rộng của vùng mẫu sẽ xuất hiện mạnh, do hiện tượng khuếch tán. Vùng mẫu càng lớn

thì sự phân tán càng lớn. Lúc này độ phân giải và hiệu suất tách (Nef ) sẽ bị khử (bị

giảm mạnh) theo sự phân tán mở rộng của vũng mẫu của chất phân tích trong mao

quản.

Ta có công thức [8]:

()2 = (Winj)2/12

Với σ : Độ biến động hay độ lệch chuẩn của sự tách trong CE

Winj : Độ rộng của mẫu được nạp vào đầu ống mao quản

Từ công thức trên cho thấy, khi vùng mẫu Winj lớn, thì độ lệch chuẩn σ cũng lớn

theo. Nghĩa là số đĩa lý thuyết của cột tách sẽ giảm.

Hình 3.9 thể hiện mối quan hệ giữa chiều cao pic và thời gian bơm mẫu, khi

tăng thời gian bơm mẫu, chiều cao pic tăng lên nhưng không đáng kể. Trong cùng một

điều kiện, khi tăng thời gian bơm mẫu, thời gian lưu các chất hầu như không thay đổi

chỉ có chiều cao các pic thay đổi. Bơm mẫu càng lâu thì chiều cao pic càng tăng,

nhưng pic bị doãng chân thể hiện ở pic của CLO cụ thể nhất. Vì vậy chũng tôi chọn

thời gian bơm mẫu 10s là điều kiện tối ưu.

3.1.10. Khảo sát ảnh hưởng thế điện di

Khảo sát thế điện di tại ba gía trị 15 kV, 20 kV và 25 kV với điều kiện khảo sát

như sau:

- 7 chất kháng sinh cùng nồng độ 5 mg/l, 25 mM đệm Borat, 100 mM SDS, pH = 7.75 - Bơm mẫu 10s áp suất 50 mbar, nhiệt độ mao quản 280C

HÌnh 3.10 Sắc đồ điện di thế điện di 15kV, 20kV và 25kV

Bảng 3.5 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu tới thời gian lưu ( phút)

Thời gian di chuyển của β-Lactam (phút) Thế điện di (kV) t0 AMO CEP AMP PENG OXA CEF CLO

7.98 11.85 15.29 15.68 16.38 17.69 18.16 18.94 15

5.91 8.55 10.77 11.02 11.72 12.68 13.15 13.51 20

4.30 6.43 7.92 8.09 8.73 9.48 9.89 10.03 25

Hình 3.11 Ảnh hưởng của thế điện di đến độ điện di hiệu dụng của β-Lactam

3.5

AMO

CEP

2.5

AMP

PEN G OXA

1.5

CEF

CLO

20 Thế (kV)

Quá trình điện di trong mao quản chỉ xảy ra khi có nguồn thế V một chiều nhất

định đặt vào hai đầu của mao quản. Thế V này tạo ra lực điện trường E và dòng điện I

trong mao quản, nó điều khiển và duy trì sự điện di của các chất. Thế V được dùng sao

cho không cho dòng điện I quá lớn trong mao quản, dòng này chỉ nên nằm trong

khoảng vùng từ 10-75 μA.

Khi tăng thế điện từ 15kV đến 25kV, thời gian di chuyển của các β-Lactam

càng giảm. Tại thế 15kV và 20kV đạt hiệu quả tách tốt, nhưng thời gian di chuyển của

β-Lactam ở 15kV khá lớn tại 18.9 phút mới xuất hiện pic của CLO.

Với thế 25kV, thời gian di chuyển ngắn hơn, độ điện di hiệu dụng lớn hơn so

với 15kV, 20kV nhưng kết quả tách kém, pic CEF và CLO dính chân vào nhau. Vì khi

tăng thế V, dòng điện I lớn sẽ gây ra hiệu ứng nhiệt Jun lớn, làm nóng mao quản gây ra

sự doãng pic. Tức là làm giảm hiệu quả tách.. Vì vậy chúng tôi chọn thế tại 20kV là

phù hợp.

3.1.11. Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ của mao quản

Tiến hành khảo sát nhiệt độ của mao quản ba giá trị là 250C, 280C và 300C, với

điều kiện khảo sát như sau:

- 7 chất kháng sinh β-Lactam cùng nồng độ 5 mg/l, 25 mM đệm Borat, 100 mM SDS,

pH = 7.75

- Thế điện di 20 kV, bơm mẫu 10s, áp suất 50 mbar.

HÌnh 3.12. Sắc đồ điện di ảnh hưởng của nhiệt độ tại 250C, 280C và 300C

Bảng 3.6 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ tới thời gian di chuyển β-Lactam

Thời gian di chuyển của β-Lactam (phút) Nhiệt độ (0C) CEF CLO t0 AMO CEP AMP PENG OXA

5.97 8.81 11.54 11.86 12.23 13.18 13.40 14.13 25

5.91 8.55 10.77 11.02 11.72 12.68 13.15 13.51 28

Hình 3.13 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới độ điện di hiệu dụng của β-Lactam

3.5

2.5

1.5

AMO CEP AMP PENG OXA CEF CLO

5.52 8.18 10.27 10.51 11.17 12.1 12.47 12.84 30

28 Nhiệt độ oC

Theo [7,8] lnKi = (H0/R.T) + ( S0/R ) Trong đó: H0, S0 là Entanpi và Entropi tiêu chuẩn của chất tan. R là hằng số

khí, và T là nhiệt độ (oK) của cột mao quản

Biểu thức này cho ta thấy hằng số phân bố Ki luôn phụ thuộc vào nhiệt độ. Khi

nhiệt độ tăng thì hệ số phân bố Ki đều giảm dần, tùy thuộc vào từng chất mà hệ số này

thay đổi khác nhau.

Cũng giống như khi tăng điện thế V làm ảnh hưởng tới hiệu ứng nhiệt Jun làm

nóng thành mao quản. Nhiệt độ là yếu tố quan trọng. Sự tăng nhiệt độ ít ảnh hưởng đến

số đĩa hiệu dụng Nef, song có trường hợp khi tăng nhiệt độ lại làm hỏng chất mẫu hay

chất đệm nhất là làm thay đổi độ nhớt dung dịch , tạo ra gradient nhiệt độ và nồng độ

chất, qua đó làm ảnh hưởng đến sự điện di.

Song trong CE, sự gradient nhiệt độ luôn xảy ra nó chỉ khác nhau ở mức độ. Sự

tiêu hao công suất điện từ trường sinh ra nhiệt càng nhiều, thì càng không có lợi. Đồng

thời sự phân tán nhiệt độ qua thành mao quản ra ngoài, lại làm cho vùng tâm của cột

mao quản có nhiệt độ cao hơn vùng sát thành. Sự khác nhau về nhiệt độ sẽ tạo ra sự

khác nhau về độ nhớt dung dịch, chỗ nào có nhiệt độ cao hơn thì sẽ có độ nhớt thấp

hơn và như thế cũng dẫn đến làm tăng tính không đồng nhất của dung dịch trong các

vùng của cột mao quản.

Khi nhiệt độ thay đổi 1 độ, thì dẫn đến sự thay đổi độ nhớt từ 2-3% và qua đó

ảnh hưởng đến giá trị độ điện di μef của chất tan ( chất phân tích), chúng sẽ gây ra sự

mở rộng pic. Tức là giảm hiệu quả tách, vì khi độ nhớt giảm sẽ làm giảm số đĩa hiệu

dụng Nef của cột tách giảm theo.

Hình 3.12, tại nhiệt độ 250C pic của OXA và CEF chưa tách hẳn, 300C pic các

β-Lactam có tách rõ rệt nhưng pic lạ lại trùng với pic của CEP làm chiều cao CEP tăng lên. Chúng tôi chọn nhiệt độ tại 280C là điều kiện tối ưu.

3.1.12.Tổng kết điều kiện tối ưu

Bảng 3.7 Tổng kết các điều kiện tối ưu

Các yếu tố Điều kiện

Detector DAD

Số đo bước sóng chung 198 nm

Kích thước mao quản Mao quản silica trần, tổng chiều dài 64.5cm, chiều dài hiệu

dụng 56 cm, đường kính trong 50µm, loại bubble cell.

Chất tạo mixen SDS

Phương pháp bơm mẫu Thủy động hoc : 10s; 50 mbar

Thế điện di 20 kV

Dung dịch điện ly

Nhiệt độ 25 mM đệm Borat + 100 mM SDS, pH = 7.75 280C

Hình 3.14. Sắc đồ điện di của β-Lactam tại điều kiện tối ưu.

3.2. Đánh giá phương pháp phân tích

3.2.1. Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn

Từ phương trình Hi = k1.Ci khi tăng nồng độ chất phân tích thì chiều cao pic sắc

ký cũng tăng lên, song lý thuyết chỉ ra rằng tỉ lê đó chỉ đúng trong một khoảng nhất

định. Vì vậy chúng tôi phải khảo sát khoảng tuyến tính của chất phân tích.

Chúng tôi tiến hành khảo sát khoảng tuyến tính trong điều kiện tối ưu mục

3.1.12 của các β-Lactam trong khoảng nồng độ từ 1 đến 20 mg/l, mỗi nồng độ được đo

lặp lại 3 lần Chúng tôi thu được kết quả như sau.

Bảng 3.8 Chiều cao pic β-Lactam tại các nồng độ khác nhau.

Nồng độ AMO CEP AMP PENG OXA CEF CLO (mg/l)

0.97 0.61 1.22 1.1 1 1.37 1.1 1.3

2.1 2.1 1.1 2.1 2 3 1.9 2.4

3.4 3.2 2 3.7 3 4.9 2.8 3.9

6.1 5.7 3.6 6.5 5 8.9 5.2 7.1

9.6 8.7 5.7 9.9 7 13.8 7.9 10.8

8.9 15.7 15.1 14.6 10 20.2 16.9 11.9

18.56 16.78 25.53 12.57 22.6 12 27.9 18.76

- *

.- *

23.61 21.69* 36* 16.4 27.5 15 32.9 22.47

27.35 18.06 30.69 20 37.43 26.33

* Pic bị dính chân vào nhau.

Khi tăng dần nồng độ lên, chúng tôi nhận thấy từ nồng độ 15 và 20 mg/l pic của

PENG và OXA càng dính vào nhau, chân pic bị doãng rộng, pic không tách hết chân.

Hiện tượng này được giải thích tương tự như mục 3.1.8.

Hình 3.15. Sắc đồ điện di của β-Lactam tại nồng độ 15ppm

Do lượng mẫu thực có hàm lượng thấp nên chúng tôi chọn khoảng nồng độ từ 1

đến 10mg/l nằm trong khoảng tuyến tính và khảo sát lập đường chuẩn.

Dựa vào số liệu bảng 3.8 chúng tôi sử dụng phần mềm Origin Version 7.5 để

)

U A m

Y = A + B * X

Value Error

U A m c i p o a c u e i h C

( c i p o a c u e i h C

Parameter ------------------------------------------------------------ -1.12558 0.37924 A B 1.57227 0.06775 ------------------------------------------------------------

Parameter ------------------------------------------------------------ -1.21163 0.28315 A B 2.12285 0.05058 ------------------------------------------------------------

N P

R ------------------------------------------------------------ <0.0001 0.99631

0.51299

R ------------------------------------------------------------ 0.99887 0.38302 6 <0.0001

Nong do AMO (mg/l)

Nong do CEP (mg/l)

xây dựng đường chuẩn. kết quả thu được như sau.

)

U A m

Y = A + B * X

( c i p o a c

Value Error

U A m o a c u e i h C

u e i h C

-0.62558 0.24335 1.34477 0.04347

Parameter ------------------------------------------------------------ -0.55349 0.25435 A 1.2186 0.04544 B ------------------------------------------------------------

Parameter Value Error ------------------------------------------------------------ A B ------------------------------------------------------------

N P

R ------------------------------------------------------------ 0.99723 0.34405 6

<0.0001

R N ------------------------------------------------------------ 0.99792 0.32918 6 ------------------------------------------------------------

Nong do PENG (mg/l)

Nong do AMP (mg/l)

)

U A m

Y = A + B * X

Value Error

U A m o a c u e i h C

( c i p o a c u e i h C

Parameter ------------------------------------------------------------ -0.7 0.22771 A B 0.9325 0.04068 ------------------------------------------------------------

Parameter ------------------------------------------------------------ -1.07558 0.39784 A B 1.74477 0.07107 ------------------------------------------------------------

N P

R ------------------------------------------------------------ 0.99622 0.30803

<0.0001

R ------------------------------------------------------------ 0.9967 0.53815

6 <0.0001

Nong do CEF (mg/l)

Nong do OXA(mg/l)

1 6

1 4

1 2

)

1 0

U A m

Y = A + B * X

V alu e

E rro r

Hình 3.16 Đường chuẩn của 7 loại β-Lactam

( c i p o a c u e i h C

-1 .0 3 9 5 3 1 .6 19 1 9

0 .4 0 0 4 8 0 .0 7 1 5 5

P a ra m e te r ------------------------------------------------------------ A B ------------------------------------------------------------

S D

R ------------------------------------------------------------ 0 .99 6 1 2 0 .5 4 1 73

< 0 .0 00 1

N o n g d o C L O (m g /l)

nồng độ 1 -10 mg/l

3.2.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng của đường chuẩn (LOQ)

- Giới hạn phát hiện (LOD) được định nghĩa là nồng độ chất phân tích nhỏ nhất

tạo thành tín hiệu phân tích có diện tích gấp 3 lần tín hiệu đường nền. Như vậy pic sắc

ký của chất phân tích phải có chiều cao thoả mãn hệ thức sau:

H ≥ 3σn (*)

Trong đó: H là chiều cao pic sắc ký của chất phân tích

σn là dao động của tín hiệu đường nền

Giới hạn phát hiện là thông số đặc trưng cho độ nhạy của phương pháp phân

tích. Để xác định LOD của các β-lactam chúng tôi tiến hành xác định LOD dựa vào

đường chuẩn

Theo (*) giới hạn phát hiện được tính theo công thức sau:

LOD = 3×Sy/b

Trong đó: Sy : là độ lệch chuẩn của phương trình đường chuẩn

b : là hệ số góc của phương trình hồi qui

- Giới hạn định lượng của phương pháp (LOQ) được định nghĩa là nồng độ chất

phân tích nhỏ nhất mà phép phân tích vẫn định lượng được chính xác với độ tin cậy

95%. Theo lý thuyết thống kê thì giới hạn định lượng là nồng độ chất phân tích có tín

hiệu phân tích gấp 10 lần tín hiệu nhiễu của đường nền.

LOQ = 10×Sy/b

Bảng 3.9 Giới hạn phát hiện của phương pháp

Chất phân tích Phương trình y = a + bx Hệ số góc (b) LOD (mg/l) LOQ (mg/l) Độ lệch chuẩn (Sy)

AMO CEP AMP PENG OXA y = 2.1228x - 1.2116 y = 1.5723x - 1.1256 y = 1.3448x - 0.6256 y = 1.2186x - 0.5535 y = 1.7448x - 1.0756 2.1228 1.5723 1.3448 1.2186 1.7448 0.383 0.513 0.3292 0.3441 0.5382 0.54 0.98 0.73 0.85 0.93 1.8 3.26 2.45 2.82 3.08

CEF CLO y = 0.9325x - 0.7 y = 1.6192x - 1.0395 0.9325 1.6192 0.308 0.5417 0.99 1.00 3.3 3.34

3.2.5. Độ chính xác của phép đo

Để đánh giá sai số của phương pháp phân tích, chúng tôi tiến hành chọn ba mẫu

tương ứng với khu vực: điểm đầu, điểm giữa và điểm cuối của khoảng tuyến tính đã

được chọn ở trên. Các mẫu được chọn có nồng độ lần lượt là 1mg/l; 5mg/l và 10 mg/l.

Tiến hành đo các mẫu trên với điều kiện tương tự như các điều kiện khi khảo sát

 H H i

khoảng tuyến tính. Mỗi mẫu tiến hành đo 8 lần. Sai số được tính theo công thức sau:





100

Trong đó: Hi là chiều cao pic tính từ đường chuẩn

Ht là chiều cao pic đo được trên sắc đồ

Kết quả phân tích được trình bày trong bảng sau

Bảng 3.10 Khảo sát độ chính xác của phương pháp phân tích (1mg/l)

STT

4 1.3 2 1.3

AMO

1 1

CEP

AMP

PENG

0.97 0.99 0.98 0.99 0.99 0.99 0.99 0.99 0 1.06 1.1 3.77 1 1.1 10 1.23 1.31 1.3 1.3 OXA

1 1.1 1.1 0 1 1.1 10 1.3 1.3 0

CEF 1.02 1 2.06 1 1.15 1.1 1.1 1.1 1.1 10 4.35 0 1.17 1.2 1 1.1 1.1 1.1 5.98 8.33 10 1.4 1.2 1.3 1.3 8.33 5.69 0.76 7.14 0.64 0.65 0.61 0.62 0.64 0.63 0.63 0.63 0.63 0.63 6 1.4 1.37 2.14 0.97 0.99 2.06 1.2 1.1 8.33 1.02 1.1 7.84 1.25 1.3 4 0.63 0.63 TB 8 7 1.36 1.3 1.3 1.37 1.37 1.37 5.38 5.38 0.55 0.96 0.98 0.98 0.99 0.99 0.99 3.13 1.02 0.89 1.08 1.11 1.2 1.1 1.1 1.1 8.33 1.85 1.01 1.05 1 0.97 1.1 1.1 1.1 10 13.4 5.26 1.27 1.28 1.3 1.3 1.3 1.3 2.36 1.36 0 0.65 0.63 0.63 0.63 0.63 0.63 5 3 1 1.5 1.4 1.4 Ht 1.37 1.37 1.37 1.37 1.37 Hi X% 2.14 5.38 2.14 5.38 8.67 Ht Hi X% Ht Hi X% Ht Hi X% Ht Hi X% Ht Hi

1.3

CLO

5.38 1.6 0.32 1.1 1.23 11.82 2.63 0.47 0.49 1.31 1.17 1.22 1.23 1.23 1.23 6.11 5.13 0.92 X% 1.56 3.08 3.28 2.11 1.56 1.2 1.25 1.22 1.2 Ht 1.23 1.23 1.23 1.23 1.23 Hi 0.82 2.5 2.5 X%

Bảng 3.11 Khảo sát độ chính xác của phương pháp phân tích (5mg/l)

STT

AMO

CEP

AMP

PENG

OXA

CEF

CLO

5 9.1 8.9 2.2 6.11 6.1 0.16 5.67 5.7 0.53 5.23 5.2 0.57 7.12 7.1 0.28 3.4 3.6 5.88 6.61 6.5 1.66 1 8.8 8.9 1.14 6.2 6.1 1.61 5.7 5.7 0 5.1 5.2 1.96 6.9 7.1 2.9 3.4 3.6 5.88 6.42 6.5 1.25 6 9.13 8.9 2.52 5.98 6.1 2.01 5.81 5.7 1.89 5.17 5.2 0.58 7.2 7.1 1.39 3.43 3.6 4.96 6.57 6.5 1.07 4 8.86 8.9 0.45 5.97 6.1 2.18 5.62 5.7 1.42 5.12 5.2 1.56 7.07 7.1 0.42 3.32 3.6 8.43 6.63 6.5 1.96 3 8.7 8.9 2.3 6.03 6.1 1.16 5.5 5.7 3.64 5 5.2 4 7.05 7.1 0.71 3.3 3.6 9.09 6.6 6.5 1.52 2 8.8 8.9 1.14 6.14 6.1 0.65 5.6 5.7 1.79 5 5 0 6.9 7.1 2.9 3.5 3.6 2.86 6.51 6.5 0.15 8 8.86 8.9 0.45 6.22 6.1 1.93 5.8 5.7 1.72 5.21 5.2 0.19 7.15 7.1 0.7 3.63 3.6 0.83 6.48 6.5 0.31 TB 8.9 8.9 0.04 6.1 6.1 0.06 5.69 5.7 0.24 5.23 5.2 0.57 7.07 7.1 0.5 3.44 3.6 4.54 6.54 6.5 0.63 Ht Hi X% Ht Hi X% Ht Hi X% Ht Hi X% Ht Hi X% Ht Hi X% Ht Hi X%

7 8.92 8.9 0.22 6.12 6.1 0.33 5.79 5.7 1.55 5.1 5.2 1.96 7.13 7.1 0.42 3.57 3.6 0.84 6.51 6.5 0.15 Bảng 3.12 Khảo sát độ chính xác của phương pháp phân tích (10mg/l)

STT

1 20.1 20.2 0.5 15.1 2 19.8 20.2 2.02 14.2 3 20.3 20.2 0.49 14.7 4 21.1 20.2 4.27 14.9 5 21.8 20.2 7.34 15.3 6 21 20.2 3.81 15.5 7 21.6 20.2 6.48 14.9 8 20.8 20.2 2.88 14.6 TB 20.8 20.2 2.94 14.9 Ht Hi X% Ht AMO CEP

AMP

PENG

OXA

CEF

15.2 7.04 14.9 14.6 2.01 11.7 11.9 1.71 17.2 16.9 1.74 9.4 9.1 3.19 16.3 16.1 1.23 15.2 3.4 14.7 14.6 0.68 12.1 11.9 1.65 17 16.9 0.59 9.2 9.1 1.09 15.9 16.1 1.26 15.2 2.01 14.3 14.6 2.1 11.5 11.9 3.48 16.7 16.9 1.2 8.92 9.1 2.02 16.2 16.1 0.62 15.2 0.65 13.9 14.6 5.04 11.8 11.9 0.85 16.7 16.9 1.08 8.97 9.1 1.45 16.4 16.1 1.83 15.2 1.94 14.1 14.6 3.55 11.9 11.9 0 17 16.9 0.59 9.23 9.1 1.41 16 16.1 0.63 15.2 2.01 14.5 14.6 0.69 12.3 11.9 3.25 17.1 16.9 1.29 9.15 9.1 0.55 15.7 16.1 2.55 15.2 4.11 15.1 14.6 3.31 12.4 11.9 4.03 16.8 16.9 0.6 9.21 9.1 1.19 16.2 16.1 0.62 15.2 2.01 14.5 14.6 0.43 12 11.9 0.73 17 16.9 0.32 9.17 9.1 0.79 16.1 16.1 0.08 15.2 Hi X% 0.66 14.8 Ht 14.6 Hi X% 1.35 12.2 Ht 11.9 Hi X% 2.46 17.1 Ht 16.9 Hi X% 1.17 9.3 Ht 9.1 Hi X% 2.15 16.2 Ht 16.1 Hi X% 0.62 CLO

Nhận xét: Từ kết quả tính toán ở trên, chúng tôi nhận thấy đều nằm trong giới

hạn cho phép (<15%).

3.2.6. Độ lặp lại của phép đo

Một phương pháp phân tích tốt ngoài việc có sai số nhỏ còn yêu cầu có độ lặp

lại cao. Để đánh giá độ lặp lại của phương pháp, chúng tôi tiến hành khảo sát độ lặp lại

ở 3 nồng độ trên (1; 5; 10 mg/l). Dựa vào kết quả thực nghiệm của phần trước, tiến





hành tính độ lặp lại theo công thức sau:





 H H i 

100

(%)



Độ lệch chuẩn:

 H

Hệ số biến động:

Trong đó:

Hi là giá trị chiều cao pic của tín hiệu phân tích đo ở lần thứ i

Htb là giá trị chiều cao pic của n lần đo (n = 8)

S là độ lệch chuẩn của phép đo

V là hệ số biến động của phép đo

Gía trị độ lệch chuẩn S được tính toán trong phần mềm OriginVersion 7.5. Các

kết quả tính toán được biểu diễn ở bảng sau:

Bảng 3.13: Đánh giá độ lặp lại của phương pháp phân tích

AMO CEP

Nồng độ

Giá trị TB (STB) Giá trị TB (STB) Độ lệch chuẩn (S) Hệ số biến động (V%) Độ lệch chuẩn (S) Hệ số biến động (V%)

1 mg/l 0.0744 5.46 0.0146 0.9813 1.49 1.3625

5 mg/l 0.1495 1.68 0.0946 6.0963 1.55 8.89625

10 mg/l 0.708 3.4 0.4106 14.9 2.76 20.8125

PENG AMP

Nồng độ

Giá trị TB (STB) Giá trị TB (STB) Độ lệch chuẩn (S) Hệ số biến động (V%) Độ lệch chuẩn (S) Hệ số biến động (V%)

1 mg/l 0.0692 6.22 0.0878 1.045 8.4 1.11125

5 mg/l 0.1108 1.95 0.0863 5.1163 1.69 5.68625

10 mg/l 0.4138 2.85 0.3137 11.988 2.62 14.5375

CEF OXA

Nồng độ

Giá trị TB (STB) Giá trị TB (STB) Độ lệch chuẩn (S) Hệ số biến động (V%) Độ lệch chuẩn (S) Hệ số biến động (V%)

1 mg/l 0.0609 4.75 0.0141 0.6331 2.23 1.2825

5 mg/l 0.1117 1.58 0.1158 3.4438 3.36 7.065

10 mg/l 0.1915 1.13 0.1598 9.1725 1.74 16.955

CLO

Nồng độ

Giá trị TB (STB) Độ lệch chuẩn (S) Hệ số biến động (V%)

1 mg/l 0.0688 1.21875 5.64

5 mg/l 0.073 6.54125 1.12

10 mg/l 0.2295 16.1125 1.42

Qua bảng 3.13 đánh giá độ lặp lại của phép đo chúng tôi nhận thấy độ lệch

chuẩn và hệ số biến động của chất phân tích tương đối nhỏ, mặc dù với nồng độ 1mg/l

thì hệ số biến động lớn hơn so với nồng độ 5mg/l và 10mg/l xong các giá trị này vẫn

nằm trong giới hạn. Như vậy phương pháp có độ lặp lại tốt.

3.3. Phân tích mẫu thực

3.3.1. Phân tích mẫu thuốc

Bảng 3.14 Thông tin và đặc điểm từng loại thuốc

Tên thuốc Đặc điểm Xuât xứ Hàm lượng

Viên con Mỗi viên thuốc chứa nhộng, đóng Công ty cổ phần dược Ampicillin 500mg AMP, còn lại là vỉ, 10 viên/ phẩm VIDIPHA tá dược vỉ

Viên con Công ty cổ phần dược Mỗi viên thuốc chứa nhộng, đóng Cephalexin phẩm Trung ương 2 - 500mg CEP, còn lại là vỉ, 10 viên/ DOPHARMA tá dược vỉ

Công ty cổ phần dược Mỗi viên thuốc chứa Viên con phẩm Overseas Laboteries - 250mg AMO và Br- Zaxin nhộng, đóng Ấn độ 250mg CLO, còn lại là vỉ, 10 viên/vỉ VN-5254-08 tá dược

Lọ chứa 1.000.000 IU Công ty cổ phần hóa – dược Penicillin G Dạng bột phẩm MEKOPHAR PENG (600mg)

Bristopen Dạng viên Nhập khẩu bởi Công ty CP Mỗi viên chứa 500mg

con nhộng, Dược phẩm TBYT Hà Nội OXA

10 viên/ vỉ HAPHARCO

Dạng viên Công ty Saga Laboratories, Mỗi viên chứa 200mg Cefixim con nhộng, India CEF 10 viên/vỉ

Các mẫu được chuẩn bị bằng cách trộn đều 4 viên thuốc nén, lấy mẫu đại diện,

mang đi cân một lượng chính xác m1 = 0.02g. Mẫu được hòa tan bằng nước deion, đem

siêu âm 10 phút sau đó lọc qua giấy lọc cỡ 0.45μm và định mức bằng nước deion trong

bình 20ml, ta được dung dịch A có nồng độ a mg/l. Hút 2.5ml dung dịch pha loãng 10

lần với nước deion thành dung dịch B trong bình 25 ml có nồng độ b mg/l. Từ dung

dịch B pha thành các dung dịch có nồng độ thấp hơn có nồng độ Cx, được dùng trong

ngày, tiến hành đo bằng phương pháp thêm chuẩn. Các dung dịch được bảo quản trong tủ lạnh 40C, tránh ánh sáng.

Hút 100 μl vào 4 bình 2ml, sau đó thêm dần 20 μl, 40 μl, 80 μl từ dung dịch

chuẩn 100 mg/l vào 3 bình còn lại. Định mức bằng dung dịch điện ly chứa 25 mM

đệm Borat + 100 mM SDS, pH = 7.75. Tiến hành chạy lặp lai .mỗi mẫu phân tích 3 lần

với các điều kiện tối ưu như chạy đường chuẩn, lấy kết quả trung bình. Kết quả được

xử lý bằng phần mềm thống kê origin 7.5 và excel.

* Sau khi tính được nồng độ Cx theo phương pháp thêm chuẩn thì khối lượng

của các β-Lactam tính trong khối lượng cân m1 được lấy theo các thể tích ban đầu được

tính theo công thức sau

m = V. Cx. F. 10-6 (g)

Trong đó: m là khối lượng chất phân tích có trong m1 gam mẫu

V: thể tích dung dịch được pha từ m1 (g)

F: hệ số pha loãng 10-6: hệ số chuyển đổi từ μg sang g

Công thức cuối cùng là

m = 20. Cx. 200.10-6 (g)

* Hàm lượng β-Lactam trong một viên thuốc được tính theo công thức sau

% β-Lactam = (m / mthuoc) . 100%

Với mthuốc =  4 viên thuốc

| % _

b lactam



.100%

b lactam sx % _

 % _ b lactam sx

Sự khai khác về hàm lượng so với kết quả in trên nhãn là:

* Đánh giá độ thu hồi theo phương pháp thêm chuẩn

Ta có Cx là nồng độ ban đầu khi chưa thêm chất chuẩn β-Lactam

Cs: nồng độ được thêm vào lượng dung dịch chuẩn C

Hx và Hs là chiều cao trung bình của các dung dịch tương ứng

Theo đó Cs = Hs. Cx/ Hx

Khi đó tính được lượng β-Lactam thêm vào là: C’ = Cs – Cx (mg/l)

Công thức thu hồi là : %H = (C’/C).100%

Bảng 3.15. Kết quả độ thu hồi xác định β-Lactam theo phương pháp thêm chuẩn trong

mẫu thuốc

STT C Cx + C Cs %H Tên hoạt chất Chiều cao (mAU) Thời gian lưu (phút) Hiệu suất trung bình %H/3

97.3 1 AMO

96 2 CLO

0 1 2 4 0 1 2 4 2.1 3.1 3.02 92.4 4.1 4.12100.8 6.1 6.05 98.7 2.43 3.43 3.42 99 4.43 4.23 90 6.43 6.39 99 2.5 3.6 4.9 7.2 2.7 3.8 4.7 7.1 8.35 8.30 8.28 8.26 13.78 13.71 13.67 13.65

99.94 3 CEP

98.68 4 AMP

104.2 5 PENG

104.3 6 OXA

99.17 7 CEF

0 1 2 4 0 1 2 4 0 1 2 4 0 1 2 4 0 1 2 4 4.2 5.3 5.8 8.1 3.6 4.4 5.5 7.1 4.1 5.1 5.7 7.6 5.4 6.6 7.7 9.9 1.8 2.3 2.9 3.9 10.71 10.77 10.77 10.75 11.23 11.27 11.31 11.30 11.67 11.63 11.63 11.59 12.69 12.66 12.64 12.63 13.27 13.24 13.21 13.50 4.38 5.38 5.53114.7 6.38 6.0583.43 8.38 8.45101.7 4.06 5.06 4.9690.22 6.06 6.2 107.1 8.06 8.0198.68 4.79 5.79 5.96116.8 6.79 6.6693.46 8.79 8.88102.2 4.86 5.86 5.94 108 6.86 6.93103.5 8.86 8.91101.3 3.4 4.4 4.3494.44 5.4 5.48103.9 8.4 7.3799.17

Bảng 3.16. Kết quả tính nồng độ Cx và sự sai khác hàm lượng so với kết quả in trên

nhãn thuốc

STT %β-actamsx mthuốc (g) Nồng độ Cx (mg/l) Khối lượng thuốc tính theo Cx (g) %β- Lactam đo Tên hợp chất và hàm lượng ghi trên nhãn Sai số S so với hàm lượng in trên nhãn

2.43 1 AMO 2.1 CLO 2.43 AMO 81.97 CLO 81.97 AMO 84 CLO 97.2 AMO 0.025 CLO 0.186 AMO 250mg và CLO 250 mg AMO 0.0084 CLO 0.00972

4.38 0.018 87 87.6 0.007 2 CEP 500mg 2.3

4.06 0.016 82.3 81.2 0.013 3 AMP 500mg 2.43

0.65 4.79 0.019 92.3 95.8 0.038 4 PENG 600mg

4.86 3.4 0.024 0.014 81.6 67.5 97.2 68 0.191 0.007 5 OXA 500mg 2.45 6 CEF 200mg 1.185

Trong 6 loại thuốc phân tích thì thuốc chứa hoạt chất OXA có nhiều hàm lượng

thuốc nhất, sau đó đến thuốc chứa CLO, PENG, AMO và cuối cùng là CEF và CEP.

Hiệu suất thu hồi cao > 97.3%, đạt yêu cầu cho phép > 95%

3.3.2 Phân tích mẫu máu [3]

Mẫu máu được lấy từ 2 người tình nguyện độ tuổi từ 20 đến 25, cách 2 tuần

trước khi uống thuốc không dùng bất kỳ loại thuốc nào khác. Mỗi người tình nguyện

uống 3 viên/ngày vào các buổi sáng, trưa, tối và uống liên tiếp trong 3 ngày. Viên cuối

cùng của ngày thứ 3, sau khi uống 4 giờ thì lấy mẫu máu..

Lấy từ 1.5 đến 2ml lượng mẫu vào các ống ependorf. Ly tâm 15 phút ở 10.000 rpm để tách riêng phần hồng cầu, phần huyết thanh được bảo quản trong tủ lạnh -150C.

Trước khi phân tích lẫy mẫu ra khỏi ngăn đá và để ở nhiệt độ phòng cho mẫu

tan đá. Hút 50 μl huyết thanh vào ống ependorf thể tích 10 ml. Lọai bỏ protein bằng

cách kết tủa nó với etanol tuyệt đối khoảng 200-300 μl, thêm 500 μl n-hexan và ly tâm

15 phút ở 10.00 rpm tách riêng biệt 2 lớp. Dịch chiết thu được lọc qua giấy lọc 0.45

μm. Hút 200 μl dịch lọc làm bay hơi bằng khí N2 sạch đến hết dung môi. Cặn được hòa

tan bằng hỗn hợp 25 mM đêm Borat+100 mM SDS, pH= 7.75. Trộn đều bằng cách đặt

vào bể siêu âm trong 2 phút. Dung dịch được đem đi đo bằng phương pháp thêm

chuẩn. Mỗi mẫu đo được bơm lặp lại 3 lần. Kết quả mẫu được xử lý bằng phần mềm

thống kê origin 7.5 và excel.

Bảng 3.17 Kết quả phân tích hàm lượng kháng sinh β-Lactam trong mẫu máu.

Khối Hàm Thời Chiều lượng lượng gian Hiệu cao ST Tên loại ghi trên thêm lưu suất pic Cx Cs %H T thuốc uống nhãn vào (phút trung (mAU (mg/viên (mg/l ) bình ) ) )

9.21 0 2.3

1.9 3 1.9 2.9 9.17 3.5 1 3 4 100.6 9 500 mg Amoxicilli 1 9.13 1.9 4.0 104.8 AMO n 4.8 2 102.0 9 3 3 9

9.11 1.9 5.9 7.1 100.7 3 3 6

14.6 0 2.7

14.31 1 3.5 72.89 500 mg 2 Cloxacillin 92.63 CLO 14.23 2 5.1 109.3

14.15 3 6.9 95.67 2.4 6 2.4 6 2.4 6 2.4 6 3.1 9 4.6 5 6.2 9

Thời gian lưu của AMO và CLO thay đổi so với mẫu chuẩn và mẫu thuốc là do

khi xử lý mẫu máu chưa đuổi hết được dung môi hữu cơ là n-hexan bằng khí N2 nên

thời gian lưu tăng lên.

3.4. Ưu nhược điểm của phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu

Mixen (MEKC)

Phương pháp MEKC là một phương pháp phân tích hiện đại cho độ tin cậy và

hiệu quả tách cao. Phương pháp có thể xác định được trên nhiều đối tượng khác nhau

bao gồm cả chất mang điện tích và chất trung tính. Phương pháp có một số đặc điểm

cơ bản sau:

- Lượng mẫu phân tích nhỏ, tốc độ phân tích nhanh, thao tác đơn giản hơn nhiều

so với kỹ thuật phân tích HPLC. Chạy một mẫu sắc ký 7 chất chỉ trong vòng 14 phút.

- Dung dịch pha động cũng như mẫu phân tích thường được pha trong nước

deion và sử dụng rất ít.

- Cột tách là ống mao quản nhỏ, rẻ, cho hiệu suất tách cao, dễ tái sinh hơn nhiều

so với phương pháp HPLC.

Tuy nhiên phương pháp cũng có một số nhược điểm sau:

- Do flowcell nằm ngay trên mao quản nên độ nhạy của phương pháp thấp hơn

nhiều so với phương pháp khác. Giới hạn của nó khoảng cỡ mg/l đối với detector UV-

VIS, DAD. Trong khi đó các phương pháp khác như: HPLC có giới hạn nhỏ hơn

nhiều.

- Máy làm việc ở vùng điện áp rất cao nên phải cẩn trọng khi làm việc.

- Lượng mẫu sử dụng nhỏ là một ưu điểm của phương pháp, đồng thời cũng là

nhược điểm của nó. Khi lượng mẫu nhỏ dẫn đến sai số lớn khi phân tích hàm lượng lớn

do hệ số pha loãng cao. Đối với mẫu có hàm lượng nhỏ, khi tăng thời gian bơm mẫu

thì gây ra hiện tượng doãng pic, hiệu suất tách không cao.

- Thời gian lưu của của dung dịch phụ thuộc rất nhiều vào thành phần đệm,

dung dịch điện ly vì vậy đòi hỏi phải cẩn thận và tỉ mỉ.

3.5. Hướng phát triển của đề tài.

Trong bản luận văn này, do điều kiện còn hạn chế nên chúng tôi chỉ xác định

được hàm lượng của β_Lactam bằng phương pháp MEKC trong mẫu dược phẩm và

mẫu máu. Phương pháp còn có thể được mở rộng phân tích trong những dạng nền mẫu

khác nhau ví dụ như: mẫu nước tiểu, mẫu sữa,… hay các mẫu môi trường như: nước

thải bệnh viện, nước thải trại chăn nuôi gia súc...Vì vậy rất cần có những nghiên cứu

tiếp theo để phát triển phương pháp áp dụng vào thực tiễn hơn.

KẾT LUẬN

Qua cơ sở nghiên cứu các điều kiện thực nghiệm, với mục đích ứng dụng

phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) để tách và xác định

các kháng sinh AMO, AMP, CEP, PENG, OXA, CEF, CLO trong mẫu sinh học và

dược phẩm, chúng tôi thu được kết quả như sau:

1. Khảo sát và chọn được thông số tối ưu cho quá trình chạy sắc ký:

- Detector DAD – 198 nm

- Chất tạo Mixen: SDS. Dung dịch điện ly : 25 mM đệm Borat + 100 mM SDS,

pH = 7.75

- Thế điện di 20 kV

- Sử dụng mao quản silica trần, tổng chiều dài 64.5cm, chiều dài hiệu dụng 56

cm, đường kính trong 50µm, loại bubble cell.

- Nhiệt độ mao quản 280C

2. Đánh giá phương pháp phân tích:

- Xây dựng đường chuẩn các kháng sinh trong khoảng 1 – 10 mg/l, hệ số tương

quan các đường chuẩn R2 > 0,99

- Giới hạn phát hiện LOD của các kháng sinh từ 0,54 mg/l đến 1 mg/l. Giới hạn

định lượng LOQ từ 1,8 mg/l đến3,34 mg/l

- Độ chính xác ở các nồng độ 1mg/l; 5mg/l; 10mg/l nằm trong khoảng 0 – 13.4

- Hệ số biến động ở các nồng độ 1mg/l; 5mg/; 10mg/l nằm trong khoảng 1.12 –

8.4%

3. Phân tích hàm lượng kháng sinh trong mẫu thuốc và mẫu máu.

- Với mẫu thuốc: hiệu suất thu hồi đạt được từ 83.43%. đến 116.8%.

- Với mẫu máu: hiệu suất thu hồi từ 72,89% tới 109.3%.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT

1. Bộ Y Tế (2007), Hóa dược, tập 2, NXB Y học, Hà Nội

2. Bộ Y Tế (2002), Dược điển Việt Nam, xuất bản lần thứ 3, Nhà xuất bản

Y học, Hà Nội

3. Lê Thị Huyền Dương (2000), Tách và phân tích đồng thời một số chất

quan trọng trong nhóm vitamin A bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu

năng cao và điện di mao quản, Luận án tiến sĩ, ĐH Quốc Gia Hà Nội

4. Ngọc Phương ( 2006), "Thảm họa lạm dụng kháng sinh cho trẻ", Báo

laodong.com.vn, 10-10-2006.

5. Ngô Quang Trung (2008), Xây dựng qui trình phân tích đồng thời một

số kháng sinh học b_lactam và nghiên cứu sự tồn dư tại một số khu vực

bệnh viện Hà Nội, Luận văn thạc sĩ khoa học,ĐHQGHN

6. Nguyễn Văn Đích (2005), "Không nên lạm dụng kháng sinh", Báo y học

và đời sống, số 27

7. Nguyễn Văn Ri (2007), Các phương pháp tách sắc ký, chuyên đề cao

học trường ĐH KHTN - ĐHQG Hà Nội

8. Phạm Luận (2004), Cơ sở lý thuyết điện di mao quản hiệu năng cao,

Sách chuyên đề cho sinh viên chuyên ngành hóa phân tích, ĐH Quốc Gia

Hà Nội

9. Tạ Thị Thảo (2005), Bài giảng chuyên đề thống kê trong hóa phân tích,

ĐH Quốc gia Hà Nội

10. Trường ĐH Dược Hà Nội (1999), Hóa Dược, Tài liệu lưu hành nội bộ

cho sinh viên trường ĐH Dược Hà Nội, NXB ĐH Dược Hà Nội

TIẾNG ANH

11. A. Fernández-González, R. Badía and M. E. Díaz-Gar (2003), "Micelle-

mediated spectrofluorimetric determination of ampicillin based on metal ion-

catalysed hydrolysis", Analytica Chimica Acta, 484(2), pp 223-231

12. Amber R. Solangi (2007), ”Development of new analytical methods for 4-

quniolone antibacterials and cephalosporin antibiotics”, National Centre of

Excellence in Analytical Chemistry/ University of Sindh

13. Althea W. McCormick (2003), " Geographic diversity and temporal trends of

antimicrobial resistance in Streptococcus pneumoniae in the United States",

Journal Nature medicine, 9: 424 - 430

14. Attila Gaspar, Melinda Andrasi, Szilvia Kardos (2002), "Application of

capillary zone electrophoresis to the analysis and to a stability study of

cephalosporins", Journal of Chromatography B, 775(2), pp 239–246

15. Biyang Deng, Aihong Shia, Linqiu Lia and Yanhui Kang (2008),

"Pharmacokinetics of amoxicillin in human urine using online coupled

capillary electrophoresis with electrogenerated chemiluminescence

detection", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 48(4), 1249-

1253

16. C. Y. W Ang, W.H. Luo, E.B. Hansen, j.p. Freeman, H,C. Thompson (1996),

"Rapid determination of ampicillin in bovine milk by liquid chromatography

with fluorescence detection", Journal of AOAC International, 80(1),. 107-190

17. D.P. Raymond (2001), " Impact of a rotating empiric antibiotic schedule on

infectious mortality in an intensive care unit", Journal of Critical Care

Medicin, 29(6):1101-1108

18. F. Belal, M. M. El-Kerdawy, S. M. El-Ashry and D. R. El-Wasseef (2000),

"Kinetic spectrophotometric determination of ampicillin and amoxicillin in

dosage forms", Il Farmaco, 55(11-12), pp 680-686

19. J.M. Cha, S. Yang, K.H. Carlson (2006), ,"Trace determination of β-lactam

antibiotics in surface water and urban wastewater using liquid

chromatography combined with electrospray tandem mass spectrometry",

Journal of Chromatography A, 1115(1-2), 46-57

20. James W.Jorgenson (1992), High performance capillary electrophoresis,

Agilent Technoligies

21. L.Nozal,L.Arce1,A.R´ıos2,M.Valcárcel(2004),"Development of ascreening

method for analytical control of antibiotic

Residues by micellar electrokinetic capillary chromatography", Journal of

AnalyticaChimicaActa, 523(2004)21–28

22. M.I Bailon-Perez, A.M.Garcia-Campana, C. Cruces-Blanco, M. del Olmo

Iruela (2008), "Trace determination of β-lactam antibiotics in environmental

aqueous samples using off-line and on-line preconcentration in capillary

electrophoresis", Journal of Chromatography A, 185(2), pp 273-280

23 M.I Bailon-Perez,L.CuadrosRodr´ ıguez,C.Cruces-Blanco (2006), " Analysis

of different -lactams antibiotics in pharmaceutical preparations

Using micellar electrokinetic capillary chromatography", Journal of

Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 43(2007) pp 746–752

24 Masaaki Kai, Hiromi Kinoshita, Mikio Morizono(2003),“Chromatographic

determinations of a β-lactam antibiotic, cefaclor by means off luorescence,

chemiluminescence and massspectrometry”, Journal of Mass

Spectrometry,39(3), 329 – 340

25 Merk (1996), The Merck Index, 12th edition

26 R. Gonzales (2001), "linical infectious diseases", University of Chicago.

Press, 23:757-762

27 Richard P. Wenzel, M.D Michael B. Edmond, M.D., M.P.H (2000), "

Managing Antibiotic Resistance", New England Journal of Medicine,

343:1961-1963

28 Wei Liu, Zhujun Zhang, Zuoqin Liu(2007), "Determination of -lactam

antibiotics in milk using micro-ﬂow chemiluminescence system with on-line

solid phase extraction", Analytica Chimica Acta,592(2), 187–192

29 WJ Blanchflower, Hewitt SA, Kennedy DG (1994), "Confirmatory assay for

the simultaneous detection of five penicillins in muscle, kidney and milk

using liquid chromatography - electrospray mass spectrometry", Analyst,

119(12), 2595-2601

PHỤ LỤC

SẮC ĐỒ ĐIỆN DI VÀ ĐƯỜNG THÊM CHUẨN CỦA β-LACTAM

TRONG MẪU THỰC

* Mẫu thuốc:

Hình 3.17. Sắc đồ điện di của β-Lactam trong mẫu thuốc

)

U A m

( c i p

U A m c i p

o a c

y = 1.1829x + 2.48 R2 = 0.9994

o a c u ề i h C

y = 1.0943x + 2.66 R2 = 0.9972

u ề i h C

-2.5

1.5

3.5

5.5

0 -0.5 -1

-2.5

1.5

3.5

5.5

0 -0.5

Nồng độ CLO (mg/l )

Nồng độ AMO (mg/l)

)

9 y = 0.9543x + 4.18 8 R2 = 0.985

)

U A m

y = 0.8857x + 3.6 R2 = 0.9963

U A m

( c i p

o a c u ề i h C

-5

-4

-3

-2

-1

-4.5 -3.5 -2.5 -1.5 -0.5 0.5

1.5

2.5

3.5

4.5

-1

Nồng độ CEP (mg/l)

Nồng độ AMP (mg/l)

)

U A m

y = 1.12x + 5.44 R2 = 0.9996

( c i p

( c i p o a c u ề i

y = 0.86x + 4.12 R2 = 0.9945

h C

o a c u ề i h C

-6

-4

-2

-6

-4

-2

Nồng độ PENG (mg/l )

Nồng độ OXA (mg/l)

Hình 3.18. Đường thêm chuẩn mẫu

thuốc của β-Lactam phụ thuộc vào

)

U A m

chiều cao pic.

( c i p o a c u ề i h C

y = 0.5286x + 1.8 R2 = 0.9988

4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 -0.8

-4.8

-2.8

1.2

3.2

5.2

Nồng độ CEF (mg/l)

* Mẫu máu

Hình 3.19 Sắc đồ điện di của β-Lactam trong mẫu máu.

)

U A m

( c i p o a c u ề i h C

y = 1.2029x + 2.32 R2 = 0.9994

y = 1.08x + 2.66 R2 = 0.9861

-2.5

1.5

3.5

5.5

8 7 6 5 4 3 2 1 0 -0.5

-2.5

-0.5

1.5

3.5

5.5

Nồng độ AMO (mg/l)

Nồng độ CLO (mg/l)

HÌnh 3.20 Đường thêm chuẩn của AMO và CLO trong mẫu máu phụ thuộc vào chiều

cao pic