Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân lập gen defensin liên quan đến khả năng kháng mọt ở cây đậu xanh

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:63

Thêm vào BST

Báo xấu

20
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài “Phân lập gen defensin liên quan đến khả năng kháng mọt ở cây đậu xanh” nhằm xác định khả năng kháng mọt của các giống đậu xanh góp phần tuyển giống đậu xanh kháng mọt tốt và nghiên cứu đặc điểm của gen defensin1 qua đó bước đầu tìm hiểu cơ sở phân tử của tính kháng mọt ở đậu xanh. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Phân lập gen defensin liên quan đến khả năng kháng mọt ở cây đậu xanh

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM LƢƠNG THỊ TRANG PHÂN LẬP GEN DEFENSIN LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT Ở CÂY ĐẬU XANH LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2015 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM LƢƠNG THỊ TRANG PHÂN LẬP GEN DEFENSIN LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT Ở CÂY ĐẬU XANH Chuyên ngành: SINH HỌC THỰC NGHIỆM Mã số: 60.42.01.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN THỊ NGỌC LAN THÁI NGUYÊN - 2015 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Thái Nguyên, tháng 5 năm 2015 Tác giả luận văn Lƣơng Thị Trang Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN i http://www.lrc.tnu.edu.vn
LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Ngọc Lan đã định hướng khoa học, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình tôi tiến hành nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn GS.TS. Chu Hoàng Mậu, TS. Hoàng Phú Hiệp và c c thầy cô Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Th i Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi, tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Cuối cùng, tôi bày tỏ lời cảm ơn đến bạn bè cùng toàn thể gia đình đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian học tập. Thái Nguyên, tháng 5 năm 2015 Tác giả luận văn Lƣơng Thị Trang Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTNii http://www.lrc.tnu.edu.vn
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN..............................................................................................................i LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................. ii MỤC LỤC ....................................................................................................................... iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT .......................................................... iv DANH MỤC CÁC BẢNG..............................................................................................v DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................................. vi MỞ ĐẦU ..........................................................................................................................1 1. Lý do chọn đề tài ............................................................................................. 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................ 2 3. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................3 1.1. Đặc điểm chung của cây đậu xanh ............................................................... 3 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây đậu xanh ................................................... 3 1.1.2. Đặc điểm nông sinh và vai trò của cây đậu xanh .................................. 3 1.1.3. Đặc điểm hóa sinh của hạt đậu xanh ..................................................... 7 1.2. Mọt hại đậu xanh .......................................................................................... 8 1.2.1. Đặc điểm của mọt hại hạt đậu xanh ...................................................... 8 1.2.2. T c hại do mọt đậu xanh ..................................................................... 13 1.2.3. Biện ph p phòng trừ mọt đậu C. chinensis gây hại ............................. 13 1.3. Đặc điểm của defensin và gen defensin...................................................... 19 1.3.1. Đặc điểm chung của defensin ở thực vật............................................. 19 1.3.2. C c nghiên cứu về defensin ở đậu xanh .............................................. 22 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 26 2.1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu .................................... 26 2.1.1. Vật liệu ................................................................................................ 26 2.1.2. Hóa chất, thiết bị .................................................................................. 26 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTNiii http://www.lrc.tnu.edu.vn
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu............................................................................ 27 2.2. Phương ph p nghiên cứu ............................................................................ 27 2.2.1. Đ nh gi khả năng kh ng mọt của c c giống đậu xanh ...................... 27 2.2.2. Phương ph p sinh học phân tử ............................................................ 27 2.2.3. Phương ph p x c định trình tự nucleotide........................................... 33 2.2.4. Phương ph p xử lý số liệu ................................................................... 34 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................. 35 3.1. Đặc điểm của c c giống đậu xanh nghiên cứu ........................................... 35 3.2. Khả năng kh ng mọt của c c giống đậu xanh nghiên cứu ......................... 36 3.2.1. X c định khả năng kh ng mọt dựa trên tỷ lệ số lượng hạt bị hại ........ 36 3.2.2. X c định khả năng kh ng mọt dựa trên tỷ lệ khối lượng hạt bị hại .... 38 3.3. Kết quả phân lập gen defensin1 từ đậu xanh .............................................. 41 3.3.1. Kết quả nhân bản gen defensin1 từ đậu xanh ...................................... 41 3.3.2. Kết quả biến nạp vector t i tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli ............ 43 3.3.3. Kết quả giải trình tự cDNA DEF1 ....................................................... 44 3.4. Phân tích sự đa dạng về trình tự nucleotode và trình tự amino acid suy diễn của gen defensin1 ....................................................................................... 47 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................................ 50 1. Kết luận .......................................................................................................... 50 2. Đề nghị........................................................................................................... 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 51 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTNiv http://www.lrc.tnu.edu.vn
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT ABA Abscisic acid bp Cặp base cDNA Complementary DNA (Sợi DNA bổ sung được tổng hợp từ RNA thông tin nhờ enzym phiên mã ngược) cs Cộng sự DEF1 Defensin 1 DEPC diethyl pyrocarbonate DNA deoxyribosenucleic acid dNTP deoxynucleoside triphosphate E. coli Escherichia coli EDTA Ethylen Diamin Tetraacetic Acid IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside kb Kilo base kGy Kilogray mRNA messenger ribonucleic acid PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) RNA Ribonucleic Acid TAE Tris acetat Ethylen Diamin Tetraacetic Acid Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTNiv http://www.lrc.tnu.edu.vn
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Danh sách các giống đậu xanh nghiên cứu ....................................... 26 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA ............................................. 28 Bảng 2.3. Trình tự cặp mồi nhân gen DEF1 ..................................................... 29 Bảng 2.4. Thành phần phản ứng nhân gen DEF1 ............................................. 29 Bảng 2.5. Chu trình nhiệt cho phản ứng nhân gen DEF1 ................................. 30 Bảng 2.6. Thành phần phản ứng ghép nối gen vào vector pBT ........................ 31 Bảng 3.1. Một số đặc điểm hình thái của 10 giống đậu xanh nghiên cứu ........ 35 Bảng 3.2. Tỷ lệ số hạt đậu xanh nghiên cứu bị hại .......................................... 37 Bảng 3.3. Tỷ lệ khối lượng hạt bị hại ............................................................... 39 Bảng 3.4. Sự sai khác về trình tự nucleotide của cDNA DEF1 của giống đậu xanh DX16 và trình tự có mã số AY437639 .............................. 45 Bảng 3.5. Sự sai khác về trình tự amino acid suy diễn của protein DEF1 ở giống đậu xanh DX16 và trình tự mang mã số AY437639............... 47 Bảng 3.6. Hệ số tương đồng và sai khác di truyền giữa các trình tự cDNA DEF1 của 3 giống đậu xanh .............................................................. 47 Bảng 3.7. Hệ số tương đồng và hệ số sai khác giữa 3 giống đậu xanh dựa trên trình tự amino acid suy diễn từ trình tự gen DEF1 ................... 48 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTNv http://www.lrc.tnu.edu.vn
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cặp mọt trưởng thành (C. chinensis)................................................. 11 Hình 1.2. Cấu trúc defensin thực vật ................................................................. 20 Hình 1.3. Mô hình cấu trúc defensin đậu xanh (VrD1) ..................................... 22 Hình 2.1. Sơ đồ vector pBT ............................................................................... 31 Hình 3.1. Hình ảnh các giống đậu xanh nghiên cứu ......................................... 35 Hình 3.2. Đồ thị mô tả tỷ lệ thiệt hại về số lượng hạt 10 giống đậu xanh ........ 37 Hình 3.3. Tỷ lệ khối lượng hạt bị hại của 10 giống đậu xanh nghiên cứu ........ 39 Hình 3.4. Ảnh điện di sản phẩm PCR nhân cDNA DEF1 từ giống đậu xanh DX123 và DX16 ....................................................................... 42 Hình 3.5. So sánh trình tự nucleotide của cDNA DEF1 ở giống đậu xanh DX16 với trình tự gen trên Ngân hàng gen Quốc tế ......................... 45 Hình 3.6. So s nh trình tự amino acid suy diễn của protein DEF1 của giống đậu xanh DX16 với trình tự mang mã số AY437639 ............. 46 Hình 3.7. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ giữa 3 giống đậu xanh dựa trên trình tự nucleotide của gen DEF1 ..................................................... 48 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTNvi http://www.lrc.tnu.edu.vn
MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Đậu xanh [Vigna radiata (L.) Wilczek] là cây trồng có giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế cao. Đậu xanh có thời gian sinh trưởng ngắn so với nhiều loại cây ăn hạt khác, chế độ chăm sóc đơn giản. Đậu xanh còn được xem như là một thứ dược liệu quí có tác dụng giải độc, thanh nhiệt, bớt sưng phù, điều hoà ngũ tạng, chữa bệnh cho con người. Hạt đậu xanh còn là một mặt hàng nông sản xuất khẩu có giá trị. Ngoài ra, sản phẩm phụ của cây đậu xanh được dùng làm thức ăn cho gia súc. Trồng đậu xanh còn có tác dụng chống xói mòn, cải tạo đất. Hệ rễ của cây đậu xanh có nốt sần chứa vi khuẩn cố định đạm. Trồng đậu xanh không những mang hiệu quả về mặt kinh tế và dinh dưỡng mà còn có tác dụng cải tạo đất. Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới, đặc điểm khí hậu thường nóng ẩm, đây là điều kiện tốt để phát triển sản xuất nông nghiệp. Tuy nhiên, cũng là yếu tố thuận lợi cho sâu hại phát sinh phát triển gây tổn thất nghiêm trọng tới năng suất và phẩm chất của nông sản. Đối với nhóm nông sản là hạt, một trong những nguyên nhân chính gây tổn thất đến số lượng và chất lượng hạt là côn trùng, chủ yếu là Bộ cánh cứng (thường gọi là mọt). Mọt có thể gây thành dịch từ một số lượng nhỏ cá thể, do khả năng sinh sản lớn và thời gian phát triển cá thể ngắn. Sự tổn hại do mọt gây ra là rất lớn, do đó công t c phòng trừ mọt đậu nói chung và mọt đậu xanh nói riêng đang là một vấn đề cần được quan tâm nghiên cứu. Vì vậy, trong công tác chọn tạo giống thì bên cạnh yếu tố năng suất cao và chất lượng tốt thì khả năng chống chịu với điều kiện ngoại cảnh trong đó có khả năng kh ng mọt ở hạt là vấn đề cần thiết trong lĩnh vực chọn giống đậu đỗ nói chung và chọn giống đậu xanh nói riêng. Hiện nay, đã có c c công trình nghiên cứu về cây đậu xanh trên phương diện hình thái, năng suất, đ nh gi sự đa dạng về kiểu gen, kiểu hình và đa hình protein… của các giống đậu xanh địa phương. Một số nghiên cứu bước đầu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN1 http://www.lrc.tnu.edu.vn
đ nh gi về khả năng kh ng côn trùng, kh ng nấm, kh ng virus … trên một số loại cây trồng trong đó có cây đậu xanh. Tuy nhiên, ở Việt Nam, những nghiên cứu trên cây đậu xanh mới tập trung đ nh gi về mức độ thiệt hại mà còn ít nghiên cứu x c định về cơ chế phân tử của tính chống chịu sinh vật hại nói chung và tính kháng mọt nói riêng. Theo các nghiên cứu đã công bố, đặc tính kháng mọt hại hạt của cây trồng rất phức tạp và có liên quan đến gen defensin1. Defensin1 thực vật hoạt động mạnh sẽ tổng hợp protein ức chế, ảnh hưởng đến chức năng kênh ion, t c động đến hoạt động của α-amylase côn trùng… Cơ chế gây độc của defensin đối với mọt ở hạt đậu xanh là khi mọt phá huỷ những hạt đậu xanh thì defensin1 đã ngăn chặn sự tiêu hoá tinh bột của mọt và ức chế sự sinh trưởng phát triển của chúng. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập gen defensin liên quan đến khả năng kháng mọt ở cây đậu xanh” nhằm x c định khả năng kh ng mọt của các giống đậu xanh góp phần tuyển giống đậu xanh kháng mọt tốt và nghiên cứu đặc điểm của gen defensin1 qua đó bước đầu tìm hiểu cơ sở phân tử của tính kháng mọt ở đậu xanh. 2. Mục tiêu nghiên cứu Đ nh gi đặc điểm hạt và khả năng kh ng mọt của một số giống đậu xanh nghiên cứu, đồng thời phân lập và nghiên cứu đặc điểm của gen defensin1 liên quan đến tính kháng mọt của cây đậu xanh. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Nghiên cứu đặc điểm hạt của các giống đậu xanh nghiên cứu bao gồm: màu sắc hạt, hình thái hạt, khối lượng 1000 hạt. 3.2. Đánh giá khả năng kh ng mọt của các giống đậu xanh nghiên cứu. 3.3. Phân lập, giải trình tự và so sánh gen defensin1 từ hệ gen của các giống đậu xanh nghiên cứu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN2 http://www.lrc.tnu.edu.vn
Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đặc điểm chung của cây đậu xanh 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây đậu xanh Cây đậu xanh [Vigna radiata (L.) Wilczek], có bộ NST 2n = 22, là loại cây trồng cạn thu quả và hạt. Theo Vavilov, đậu xanh có nguồn gốc từ Ấn Độ, được phân bố rộng rãi ở c c nước Đông và Nam Á, khu vực Đông Dương. Dạng dại của V. radiata cũng được tìm thấy ở Madagasca, bên bờ Ấn độ Dương, đông Phi [10]. Đậu xanh phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới, là cây trồng khá quen thuộc và phổ biến ở nước ta. Phân loại khoa học của đậu xanh: Giới (regnum): Plantae Ngành (division): Magnolyophita Lớp (class): Magnolyopsida Bộ (order): Fabales Họ (Familia): Fabaceae Chi (genus): Vigna Loài (species): V.radiata Chi Vigna là một trong những chi lớn trong họ Đậu, bao gồm 7 chi phụ Vigna, Haydonia, Plactropic, Macrhincha, Cerachotopic, Lasiospron, Sigmaidotrotopis [2], [10]. 1.1.2. Đặc điểm nông sinh và vai trò của cây đậu xanh Cây đậu xanh thuộc loại cây thân thảo, bao gồm các bộ phận rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt. Rễ đậu xanh thuộc loại rễ cọc bao gồm rễ chính và các rễ phụ. Rễ chính thường ăn sâu khoảng 20 - 30 cm, trong điều kiện thuận lợi có thể ăn sâu 70 - 100 cm, rễ phụ thường từ 30 - 40 cái, dài khoảng 20 - 25 cm [10]. Trên rễ phụ có nhiều lông hút do lớp tế bào biểu bì rễ biến đổi thành, có vai trò giúp cây hút Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN3 http://www.lrc.tnu.edu.vn
nước và các chất dinh dưỡng cần thiết đi nuôi cơ thể. Trên rễ các cây họ đậu có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn cố định đạm Zhirubium. Nốt sần xuất hiện rất sớm (sau gieo 10 - 15 ngày). Trên mỗi cây có khoảng 10 đến 20 nốt sần, kích thước nốt sần không giống nhau tập trung chủ yếu ở phần cổ rễ. Trung bình mỗi vụ, 1 ha đậu xanh có thể bù lại cho đất tương ứng 85 - 108 kg nitơ làm cho đất tơi xốp hơn [7], [8]. Thân cây đậu xanh thuộc loại thân thảo, có màu xanh hoặc tím. Thân có 3 dạng: thân đứng, thân nghiêng và thân bò lan trên mặt đất. Dạng bò lan thường gặp ở vùng đồi núi của Ấn Độ và Mianma. Đường kính thân trung bình 5 - 8 mm. Chiều cao cây có nhiều biến động tùy thuộc vào giống, mùa vụ và khả năng thâm canh. Chiều cao cây có thể thay đổi từ 25 - 125 cm. Toàn bộ chiều dài thân được chia thành 7 - 12 đốt. Ở các đốt gần mặt đất thường hình thành cành cấp 1. C c đốt phía trên là vị trí để hình thành chùm hoa, quả. Số cành trên thân thường 2 - 3 cành nhưng cũng có một số trường hợp cây có đến 9 - 10 cành [10]. Lá mầm xuất hiện khi hạt đậu hút đủ nước sau đó được tồn tại và phát triển cho đến khi toàn bộ chất dinh dưỡng trong l được huy động để cung cấp cho sự phát triển của cây con ở thời kì đầu. Thời kì này thường kéo dài 15 - 20 ngày sau khi hạt nảy mầm. Sau khi lá mầm xuất hiện từ 3 - 5 ngày thì 2 l đơn bắt đầu hình thành và mọc đối diện nhau trên mặt đất. Sau khi l đơn xuất hiện khoảng một tuần bắt đầu hình thành lá kép. Lá kép có 2 lá chét. Tốc độ hình thành lá kép phụ thuộc vào thời vụ, giống và kỹ thuật chăm sóc cho cây. Trung bình 6 - 8 ngày thì hình thành một lá kép. Vị trí của lá kép trên thân hoặc cành thường mọc sole tại các phần giữa của c c đốt thân và cành. Kích thước của phiến l và độ dài của cuống l thay đổi tùy thuộc vào vị trí của tầng l . Thông thường c c kích thước này thường tăng dần từ tầng l dưới lên tầng lá giữa và sau đó lại giảm dần ở các tầng l phía trên. Điều này biểu hiện sự sinh trưởng và phát triển bình Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN4 http://www.lrc.tnu.edu.vn
thường của cây đậu xanh. Khi gặp điều kiện thuận lợi và cây đậu xanh sinh trưởng, phát triển tốt thì lá chét giữa của l kép thường lớn hơn 2 l chét ở 2 bên. Vì vậy, căn cứ vào độ lớn của phiến lá có thể đ nh gi được tình hình sinh trưởng và phát triển của cây đậu xanh. Lá chét giữa của cây đậu xanh có nhiều hình dạng kh c nhau thường có 1 số hình dạng phổ biến như: hình ovan, hình tim, hình l chẻ thùy, hình nhọn, hình lưỡi dao, hình b n ovan… L kép của cây đậu xanh phần mọc trên thân, thường có 7 - 8 lá. Ngoài ra lá còn mọc nhiều trên các cành cấp 1 [2], [10]. Lá non và ngọn của cây đậu xanh có thể được dùng để làm rau, muối dưa. Thân, l xanh có thể dùng làm thức ăn cho vật nuôi [1], [2]. Hoa đậu xanh được hình thành trên các trục hoa. Mỗi trục hoa có thể phát triển thành một hàng hoa mọc đối nhau. Các hoa trên cùng một hàng xếp liên tục và đối nhau. Trung bình mỗi hoa có từ 3 - 20 hoa, do đó mỗi trục hoa có thể có từ 6 - 40 hoa. Vị trí bắt đầu của mỗi trục hoa phía dưới thường nằm giữa thân, giữa cành hoặc ở nách lá. Những trục hoa phía trên mọc sole từ các đốt thân. Ở phía trên của thân cây độ dài của lóng ngắn lại cho nên số lượng trục hoa nhiều hơn. Số lượng trục hoa trên mỗi cây thường biến động lớn. Số lượng này thay đổi tùy thuộc vào giống và điều kiện trồng trọt. Thông thường trên mỗi cây trung bình có từ 5 - 7 trục hoa, tương ứng với 30 - 280 hoa mỗi cây. Hoa đậu xanh có màu vàng, cuống hoa kém phát triển. Hoa gồm 5 bộ phận: lá bắc, đài hoa, tràng hoa, nhị đực, nhị cái. Lá bắc có màu xanh nhưng không phát triển mà thường tiêu biến rất sớm. Đài hoa chia thành 5 l đài trong đó có 2 l ngắn dính nhau tạo thành môi trên ôm lấy phía sau cánh cờ, 3 lá còn lại có dạng hình dài bằng nhau bọc xung quanh 2 cánh bên và cánh thìa. Phía dưới đài hoa c c l đan kết thành hình phễu tiếp xúc với trục hoa. Tràng hoa hình c nh bướm gồm 4 cánh: cánh cờ, 2 cánh bên và cánh thìa. Cánh cờ to nhất màu vàng có gân màu đỏ nâu, số lượng vân khác nhau tùy thuộc vào giống đậu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN5 http://www.lrc.tnu.edu.vn
xanh khác nhau. Hai cánh bên màu vàng có độ cong như c nh cờ nhưng diện tích nhỏ hơn chỉ bằng ¼ cánh cờ. Cánh thìa có màu vàng nhạt, không có gân, phía trên co lại hình thành mỏ chim bao kín phần nhị đực và nhị cái. Nhị đực gồm 10 c i có độ dài không giống nhau một cái dài nhất tương ứng với độ dài vòi nhụy, 2 cái tiếp theo dài bằng nhau nhưng ngắn hơn đầu vòi nhụy khoảng 0,2 mm. Tiếp theo có 3 c i có độ dài như nhau nhưng lại ngắn hơn đầu vòi nhụy khoảng 0,3 mm. Cuối cùng có 4 cái cùng chiều dài và ngắn hơn đầu vòi nhụy 0,5 mm. Mỗi nhị đực có 2 bao phấn, phía dưới các cuống nhị đực kết thành hình ống bao quanh chân nhụy cái. Vòi nhụy cái có phần đầu uốn cong thành hình mỏ chim, có dạng hơi nhọn. Phía trong phần nhọn này được phủ kín một lớp lông tơ rất mềm, màu trắng ngà. Đây chính là bộ phận tiếp nhận phấn hoa từ nhị đực trong quá trình thụ phấn. Trong quần thể tự nhiên, hoa đậu xanh thường nở rải rác thành từng đợt khác nhau [1]. Sau khi hoa thụ phấn từ 2 - 3 ngày, bầu hoa phát triển thành quả non. Thời gian từ lúc thụ phấn đến khi quả chín tùy thuộc chủ yếu vào đặc điểm của giống, vào điều kiện chăm sóc và vào nhiệt độ. Thời gian vào vụ xuân trung bình khoảng 20 - 25 ngày, ở vụ hè 15 - 20 ngày, ở vụ thu đông 25 - 30 ngày. Quả đậu xanh khi chín có độ dài trung bình 8 - 10 cm, quả dài nhất là 15 cm. Cắt ngang quả có hình bầu dục hoặc hình tròn, với đường kính 4 - 6 mm. Quả đậu xanh có màu sắc thay đổi: màu vàng rơm, màu nâu, màu đen hoặc có một số màu đặc biệt, nhưng phổ biến hơn cả là màu đen và màu nâu. Vỏ quả thường được phủ một lớp lông dài 0,3 - 0,4 mm. Mật độ lông phụ thuộc vào đặc điểm của giống và khả năng chống chịu của cây. Những giống chống chịu bệnh khảm vàng virus và bệnh sâu đục quả có mật độ lông dày hơn. Vào thời kì chín hoàn toàn lông trên quả thường rụng đi hoặc tự tiêu biến [1], [2]. Độ dày của vỏ quả đậu xanh thường 0,1 - 0,3 mm. Bên trong vỏ quả chia thành nhiều ngăn, có v ch màu trắng. Vào thời kỳ quả chín c c v ch ngăn này co lại nhưng dấu vết vẫn còn khá rõ. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN6 http://www.lrc.tnu.edu.vn
Hạt không nội nhũ, phôi cong, hai l mầm dày, lớn và chứa nhiều chất dinh dưỡng. Hạt gồm vỏ hạt, rốn hat hai lá mầm và mầm non. Mầm non là nơi thu nhỏ của mầm rễ, 2 l đơn, thân chính và l kép đầu tiên. Hạt có hình tròn, hình trụ, hình ovan, hình thoi… và có nhiều màu sắc kh c nhau như: màu xanh mốc, xanh bóng, xanh nâu, vàng mốc, vàng bóng nằm ngăn c ch nhau bằng các vách xốp của quả. Ruột hạt màu vàng, xanh, xanh nhạt. Hình dạng hạt kết hợp với màu sắc và độ lớn của hạt là chỉ tiêu quan trọng để đ nh gi chất lượng của hạt. Mỗi quả có từ 8 - 15 hạt. Hạt của những quả trên thân thường to, mẩy hơn hạt của các quả trên cành. Hạt của các quả lứa đầu cũng to và mẩy hơn c c quả lứa sau. Số lượng hạt trung bình trong một quả là một trong những yếu tố chủ yếu tạo thành năng suất của đậu xanh. Khối lượng hạt của mỗi cây biến động lớn từ 20 - 90 gam tùy giống, thời vụ và chế độ canh tác. Khối lượng 1000 hạt đậu xanh từ 50 - 70 gam [1]. 1.1.3. Đặc điểm hóa sinh của hạt đậu xanh Hạt đậu xanh chứa 23 - 28% protein, 1,3% lipid, 56 - 60% gluxid, 12% nước, các vitamin B1, B2, C… C c muối kho ng như: Ca, Na, Fe, K… [10]. Đối với cây trồng nói chung và cây đậu xanh nói riêng, đ nh gi chất lượng hạt được thực hiện bằng những phân tích thành phần hóa sinh trong hạt như: hàm lượng protein, lipid, đường, thành phần amino acid, hàm lượng và hoạt độ của các enzyme trong hạt ở giai đoạn nảy mầm… Trong đó, hai thành phần quan trọng có ảnh hưởng lớn đến sự nảy mầm của hạt và sự phát triển của cây là protein và lipid. Protein thực vật nói chung và protein đậu xanh nói riêng là nguồn cung cấp đạm dễ tiên hóa cho người và một số vật nuôi. Trong hạt đậu xanh, các phân tử protein chiếm khoảng 23 - 28% và được chia thành hai nhóm là protein đơn giản và protein phức tạp. Trong đó nhóm protein đơn giản chủ yếu là globulin, chiếm tử 60 - 80%, còn lại là albumin và một số loại khác. Chức năng chính của protein dự trữ là cung cấp amino acid và nitơ cho qu trình nảy mầm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN7 http://www.lrc.tnu.edu.vn
của hạt. Protein đậu xanh có chứa đầy đủ các tính chất chung nhất của protein [10]. Ngoài ra, protein đậu xanh còn có một số tính chất kh c như khả năng hút nước và dầu tạo nhũ tương, khả năng hòa tan trong nước. Đó là một trong những yếu tố quan trọng trong nghiên cứu và công nghệ sản xuất các sản phẩm từ đậu xanh. Protein đậu xanh được đ nh gi là có chất lượng tốt do có chứa đầy đủ các amino acid không thay thế và hàm lượng của chúng tương đối trùng với tiêu chuẩn dinh dưỡng dành cho trẻ em do Tổ chức Nông lương Thế giới (FAO) và Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đưa ra [13]. Lipid là những hợp chất hữu cơ có trong tế bào sống, không hòa tan trong nước nhưng hòa tan trong c c dung môi hữu cơ không phân cực như ether, petroleum ether, benzene… Lipid cũng là thành phần cấu tạo quan trọng của màng sinh học, là nguồn dự trữ nhiên liệu cung cấp năng lượng cho cơ thể. Lipid cùng với protein và polysaccarid cung cấp năng lượng cho sự nảy mầm của hạt. Tuy hàm lượng lipid trong hạt đậu xanh chiếm tỷ lệ thấp trung bình khoảng 1,3% [10], nhưng đó lại là một chỉ tiêu quan trọng để đ nh gi phẩm chất và khả năng bảo quản hạt. 1.2. Mọt hại đậu xanh 1.2.1. Đặc điểm của mọt hại hạt đậu xanh Các loài côn trùng hại kho thuộc họ Bruchid có rất nhiều loài khác nhau trong đó có mọt đậu xanh là loài mọt nhỏ với chiều dài khoảng 2 - 3 mm. Chúng được tìm thấy chủ yếu trên hạt đậu xanh trong kho [34]. Mọt đậu xanh có tên khoa học là Callosobruchus chinensis Linnes thuộc họ Bruchidae, bộ Coleoptera [33]. Phạm vi ký chủ C. chinensis là dịch hại chủ yếu trên cây đậu xanh (Cicer arietinum), đậu tương (Glycine max), đậu Hà lan (Cajanus cajan), đậu lăng (Lens culinaris ssp), đậu adzuki (Vigna angularis), đậu đen (Vigna mungo), đậu đũa (Vigna Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN8 http://www.lrc.tnu.edu.vn
unguiculata) ở khu vực nhiệt đới. Giai đoạn cây bị xâm nhiễm: Giai đoạn quả và sau thu hoạch. Bộ phận của cây bị ảnh hưởng là hạt [15]. Phân bố địa lý Phân bố rộng khắp nhất của họ Bruchidae là C. chinensis loài này phân bố rộng khắp khu vực nhiệt đới và bán nhiệt đới. C. chinensis có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới của châu Á và hiện nay nó vẫn là loài phổ biến nhất. Ở châu Á, loài này đã xuất hiện ở Việt Nam và một số nước như Bru-nây, Trung Quốc, Inđônêxia, Nhật Bản, Th i Lan, Myanma. Ngoài ra, loài này cũng xuất hiện ở một số châu lục kh c như châu Phi (Egypt, Ethiopia, Kenya, Malawi, Sierra Leone,...), châu Đại Dương (Australia) [15]. Đặc điểm hình thái Mọt C. chinensis thuộc nhóm biến thái hoàn toàn, chu kỳ phát triển của chúng trải qua bốn giai đoạn: Trứng, sâu non, nhộng và trưởng thành. Mọt đậu xanh C. chinensis đẻ trứng dính trên vỏ hạt đậu. Trứng có hình trái xoan, một đầu to, một đầu nhỏ. Kích thước quả trứng với chiều dài khoảng 0,4 - 0,61 mm, chiều rộng khoảng 0,28 - 0,4 mm [3]. Trứng mới đẻ có màu trắng trong hoặc vàng nhạt, sau khoảng 3 đến 4 ngày trứng xuất hiện rõ hình sâu non với đầu màu đen ở phần đầu to của trứng, cơ thể màu vàng nhạt, màu trứng lúc này rất mỏng và trong, sau một thời gian trứng có màu trắng sữa, nếu nhìn bằng mắt thường không thể thấy sâu non nữa, khi soi lên kính thấy bên trong trứng có các hạt tinh bột màu trắng bao phủ lấy sâu non đây là lúc sâu non đang đục vào hạt [3]. Sâu non của mọt đậu xanh có bốn tuổi trải qua 3 lần lột x c. Kích thước và màu sắc của sâu non thay đổi theo tuổi. Sâu non của chúng khi nở ra hầu hết là đục ngay vào trong hạt, cơ thể căng tròn màu vàng nhạt, đầu phát triển hàm và mảnh mai đầu màu nâu đen. Kích thước của sâu non tuổi 1 có chiều dài khoảng 0,42 - 0,73 mm, chiều rộng khoảng 0,19 - 0,39 mm. Sâu non tuổi 2 có chiều dài dao động từ 0,53 - 1,38 mm, chiều rộng khoảng 0,42 - 1,05 mm, cơ thể có màu vàng đậm cong hình chữ C, hàm và mảnh đầu có màu nâu vàng, không chân. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN9 http://www.lrc.tnu.edu.vn
Sâu non tuổi 3 có chiều dài dao động từ 1,03 - 1,93 mm, chiều rộng 0,71 - 1,43 mm, lúc này chỉ nhìn rõ đôi hàm màu nâu vàng, còn mảnh mai đầu có màu rất giống màu cơ thể, các lỗ thở dọc hai bên lưng cũng dần xuất hiện rõ [12]. Sâu non tuổi 4 kích thước cơ thể tăng rất mạnh, chiều dài dao động từ 2,0 - 3,67mm, chiều rộng 1,27 - 2,34 mm, kích thước đạt tối đa ở giai đoạn cuối tuổi 4 chiều dài khoảng 2,82 - 4 mm, chiều rộng khoảng 1,27 - 2,34 mm. Cơ thể có c c đốt bụng phình to, da căng tròn, có thể nhìn thấy rõ nhịp đập của chuỗi tim chạy dọc lưng cơ thể sâu non. Mặt lưng hình b n nguyệt, mặt bụng hơi cong. Sâu non tuổi cuối cơ thể biến đổi rất rõ, phần lưng ngực trước bắt đầu thon nhỏ lại phía mặt bụng hình thành mầm chân, trên mầm chân có u lông, cơ thể lúc này rõ c c đốt, khi sắp vũ ho thành nhộng cơ thể sâu duỗi thẳng ra [12]. Sâu non đẫy sức tuổi cuối sau khi hoàn thành về sinh trưởng, chúng tạo cho mình một vỏ bọc màu vàng nhạt bao quanh cơ thể, vỏ bọc này giống như một c i kén đây là đặc điểm rất khác biệt của mọt đậu xanh so với các loại mọt kh c, sau đó chúng lột xác hoá nhộng ngay trong vỏ bọc này. Nhộng của C.chinensis L. thuộc dạng nhộng trần, có hình bầu dục, cơ thể nhìn rõ mầm cánh, mầm chân và mầm râu. Kích thước nhộng: chiều dài 3,1 - 4 mm, chiều rộng 1,64 - 2,6 mm. Khi sâu non mới hoá nhộng, cơ thể có màu vàng, sau một thời gian mắt nhộng có màu nâu đỏ. Khi sắp vũ ho trưởng thành cơ thể dần dần chuyển từ màu vàng sang màu vàng nâu rồi đến màu nâu đỏ. C c đốt bụng cử động linh hoạt. Cấu tạo phần bụng của nhộng có hai gai thịt màu nâu, hai gai thịt mọc trên một mấu lồi ở c c đốt cuối bụng, khoảng cách từ gai thịt so với mầm chân, mầm cánh và hình dạng mấu lồi là đặc điểm quan trọng để phân biệt nhộng đực và nhộng cái. Nhộng đực mấu lồi quanh gai thịt có nếp nhăn tạo thành hình chữ V ngược, mầm chân và mầm cánh vừa chạm đến vị trí của mấu lồi. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN10 http://www.lrc.tnu.edu.vn
Nhộng cái mấu lồi tạo thành hình tròn khoảng cách từ mầu lồi đến mầm chân, mầm cánh cách nhau 1 hoặc 2 đốt bụng [12]. Trưởng thành mọt đực dài 1,96 - 3 mm, rộng 1,44 - 1,8 mm, mọt cái dài 2,7 - 3,5 mm, rộng 1,55 - 1,9 mm. Thân hình bầu dục, ngắn, toàn thân có màu đen nâu, màu nâu đỏ hay trà nâu. Trên cơ thể mọt trưởng thành có nhiều lông nhỏ màu đen nâu, màu vàng nâu hay màu trắng xám xen kẽ tạo thành đường zíc zắc. Cổ nhỏ dần từ phía sau ra phía trước, tạo hình chuông. Đầu mà nâu tối đến nâu đen phủ đầy chấm lõm và lông nhung màu vàng kim thưa thớt, đầu luôn quặp về phía trước. Râu đầu mọc ở ngay miệng mép lõm của mắt, râu đầu có 11 đốt, râu con c i hình răng cưa có màu nâu đen. Mép sau ngực trước ở giữa có hai khóm lông hình bầu dục màu trắng hoặc màu xám. Mắt cao và lồi, đoạn trước lõm vào rất sâu, hình chữ U, ngực trước có hình chóp cụt bằng đầu, mặt lưng lồi tròn. Ở cuối đốt bụng được phủ một lớp lông mịn màu trắng. Đôi c nh màng rất phát triển được xếp gọn gàng dưới cánh cứng do vậy mọt bay rất nhanh. Đốt đùi to khoẻ chân có màu nâu đỏ mặt trong của chân có một đôi gai, ngoài ra chân còn có cựa sắc nhọn. a b Hình 1.1. Cặp mọt trưởng thành (C. chinensis) (a. con cái; b. con đực) [12] Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN11 http://www.lrc.tnu.edu.vn