Luận văn Thạc sĩ Sinh học thực nghiệm: Xác định đa hình nucleotide đơn (SNP) có khả năng liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở cá tra Pangasianodon hypophthalmus

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:85

Thêm vào BST

Báo xấu

25
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu nhằm xác định chính xác các chỉ thị SNP tiềm năng liên quan đến tính trạng tăng trưởng đã được sàng lọc và dự đoán bằng phương pháp tin sinh học trên quần thể cá tra. Kết quả của đề tài đóng góp về mặt khoa học cho hướng nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử trên đối tượng cá tra nuôi Việt Nam.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học thực nghiệm: Xác định đa hình nucleotide đơn (SNP) có khả năng liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở cá tra Pangasianodon hypophthalmus

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT *************** NGUYỄN THỊ HOA XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH NUCLEOTIDE ĐƠN (SNP) CÓ KHẢ NĂNG LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH TRẠNG TĂNG TRƯỞNG Ở CÁ TRA PANGASIANODON HYPOPHTHALMUS. LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM Hà Nội – 2018
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT *************** NGUYỄN THỊ HOA XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH NUCLEOTIDE ĐƠN (SNP) CÓ KHẢ NĂNG LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH TRẠNG TĂNG TRƯỞNG Ở CÁ TRA PANGASIANODON HYPOPHTHALMUS. Chuyên ngành: SINH HỌC THỰC NGHIỆM Mã số: 8 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. KIM THỊ PHƯƠNG OANH Hà Nội – 2018
i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn phòng Đào tạo Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật đã tạo điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành luận văn. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình đến TS. Kim Thị Phương Oanh, trưởng phòng Hệ gen học môi trường, Viện Nghiên cứu hệ Gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, người đã dành nhiều thời gian, tâm huyết, tận tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ nhiệt tình của tập thể cán bộ Phòng Hệ gen học môi trường – Viện Nghiên cứu hệ Gen tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và tập thể lớp Cao học K20 đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập. Hà Nội, ngày ..... tháng ...... năm 2018 Học viên Nguyễn Thị Hoa
ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn này hoàn toàn được trình bày dựa trên kết quả nghiên cứu khoa học của bản thân dưới sự hướng dẫn chuyên môn của TS. Kim Thị Phương Oanh, trưởng phòng Hệ gen học môi trường, Viện Nghiên cứu hệ Gen, cùng với sự giúp đỡ kỹ thuật của các cán bộ trong phòng Hệ gen học môi trường. Các số liệu hình ảnh, kết quả được trình bày, trong luận văn này là trung thực, không sao chép bất cứ tài liệu, công trình nghiên cứu của người khác mà không chỉ rõ nguồn tham khảo. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan của mình trước hội đồng. Hà Nội, ngày… tháng… năm 2018 Học viên Nguyễn Thị Hoa
iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................................................... i LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................................................ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT................................................................................ v MỞ ĐẦU ................................................................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................................. 3 1.1. Đặc điểm sinh học và giá trị kinh tế của cá tra...............................................................................3 1.1.1. Đặc điểm sinh học ..................................................................................................................3 1.1.2. Giá trị kinh tế của cá tra .........................................................................................................4 1.2. Tình hình nghiên cứu về SNP marker trong thủy sản trên thế giới ................................................5 1.3. Tình hình nghiên cứu về cá tra ở Việt Nam ...................................................................................7 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................................. 10 2.1. Nguyên vật liệu .................................................................................................................................10 2.1.1. Thu thập mẫu cá tra ....................................................................................................................10 2.1.2. Các cặp mồi nhân các vùng trình tự có chứa SNP marker .........................................................10 2.1.3. Hóa chất thí nghiệm ...................................................................................................................11 2.1.4. Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm ......................................................................................................12 2.2. Phương pháp......................................................................................................................................12 2.2.1. Tách chiết DNA tổng số .............................................................................................................12 2.2.2. Khuếch đại các vùng trình tự bằng phương pháp PCR ..............................................................13 2.2.3. Xác định SNP bằng phương pháp Single Base Extension (SNapShot Multiplex Kit). ..............14 2.2.4. Thiết kế mồi SBE (Single Base Extension)................................................................................16 2.2.5. Thu thập dữ liệu và đánh giá ......................................................................................................22 2.2.6. Phân tích số liệu trên quần thể....................................................................................................23 3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số........................................................................................................25 3.2. Kết quả khuếch đại các đoạn trình tự chứa SNP ...............................................................................26 3.3. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR ......................................................................................................26 3.4. Kết quả điện di mao quản bộ mẫu chuẩn ..........................................................................................27 3.5. Thiết lập 11 Binset cho 11 nhóm mẫu ...............................................................................................29 3.6. Kết quả chạy Binset cho các sản phẩm SNapShot của 11 nhóm.......................................................33 3.7. Kết quả thống kê và tính xác suất theo thành phần kiểu gen và tần số alen tại các vị trí SNP cần kiểm nghiệm trên hai nhóm cá tra sinh trưởng nhanh và sinh trưởng chậm ............................................35
iv CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 41 4.1. Kết luận .............................................................................................................................................41 4.2. Kiến nghị ...........................................................................................................................................41 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................................. 42 PHỤ LỤC 1: Danh sách 96 mẫu cá tra (gồm 48 mẫu STN và 48 mẫu STC) ................................... 1 PHỤ LỤC 2: Danh sách các cặp mồi nhân đoạn trình tự DNA chứa SNP. ..................................... 3 PHỤ LỤC 3: Kết quả tách chiết DNA tổng số của 96 mẫu cá tra (gồm 48 mẫu sinh trưởng nhanh và 48 mẫu sinh trưởng chậm ..................................................................................................................... 9 PHỤ LỤC 4: Kết quả đo nồng độ DNA tổng số 96 mẫu cá tra sinh trưởng nhanh và chậm ....... 10 PHỤ LỤC 5: Kết quả PCR khuếch đại các vùng trình tự có chứa SNP ........................................ 12 PHỤ LỤC 6: Danh sách 11 nhóm mồi SBE ...................................................................................... 14 PHỤ LỤC 7: Kết quả chạy điện di mao quản của 11 nhóm .......................................................... 100 PHỤ LỤC 8: Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR của 11 nhóm mẫu .............................................. 107 PHỤ LỤC 9 ........................................................................................................................................ 100 Các chỉ số về thành phần kiểu gen và tần số alen của 84 SNP (thuộc 11 nhóm) của nhóm cá tra sinh trưởng nhanh và nhóm cá tra sinh trưởng chậm (NN:kí hiệu cho kiểu gen chưa được xác định rõ do kỹ thuật) ............................................................................................................................................. 100 phụ ...................................................................................................................................................... 103
v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Từ đầy đủ AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism BLAST Basic Local Alignment Search Tool cDNA Complementary DNA DNA Deoxy Ribonucleic Acid EBV Estimates of breeding value – Giá trị chọn giống của tính trạng FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations – Tổ chức lương thực và nông nghiệp Liên Hợp Quốc FET Fisher Exact Test NGS Next Generation Sequencing PCR Polymer Chain Reaction RAPD Random – Amplified Polymorphic DNA SAP Shrimp Alkaline Phosphatase SBE Single Base Extension SNP Single Nucleotide Polymorphism UTR Unified Genotyper
vi DANH MỤC HÌNH Hình 1: Sơ đồ tổng quát các bước tiến hành thí nghiệm ............................................................... 12 Hình 2: Sơ đồ minh họa chu trình nhiệt ........................................................................................ 14 Hình 3: Hình ảnh minh họa quá trình thực hiện thí nghiệm SBE sử dụng SNapShot [38] ........... 16 Hình 4: Sơ đồ quy trình xử lý thiết kế mồi SBE ........................................................................... 17 Hình 5: Sơ đồ minh họa chu trình nhiệt trong phản ứng SNapShot .............................................. 20 Hình 6: Kết quả điện di mẫu DNA tổng số trên gel agarose 0,8% một số mẫu đại diện .............. 25 Hình 7: Kết quả điện di sản phẩm PCR của một mồi đại diện trên gel agarose 0.8% .................. 26 Hình 8: Kết quả điện di tinh sạch của đại diện một nhóm mẫu trên gel Agarose 0.8% ................ 27 Hình 9: Kết quả điện di mao quản bộ mẫu chuẩn 6 sản phẩm trên hệ thống phân tích ABI 3500 28 Hình 10: Kết quả điện di mao quản của một nhóm mẫu đại diện G1 ........................................... 34 Hình 11: Kết quả điện di mao quản nhóm sản phẩm SNapShot G2 của 9 mồi SBE (S024, S089, SV14, S037, S125, S013, S105, S079 và S006) từ một mẫu cá tra sinh trưởng nhanh: kích thước sản phẩm thực tế lần lượt là 75, 70, 65, 53, 48, 42, 36, 30 và 24 nucleotide .............................. 100 Hình 12: Kết quả điện di mao quản nhóm sản phẩm SNapShot G3 của 9 mồi SBE (SV12, S004, S067, S127, S097, S082, S017, S030, S038) từ một mẫu cá tra sinh trưởng nhanh: kích thước sản phẩm thực tế lần lượt là 78,72, 61, 55, 50, 44, 38, 31 và 24 nucleotide...................................... 101 Hình 13: Binset G4 gồm 10 mồi SBE (S048, S122, S113, S056, S077, S039, S012, S047, S076 và S046) từ một mẫu cá tra sinh trưởng chậm: kích thước sản phẩm thực tế lần lượt là 76, 71, 66, 61, 55, 49, 43, 37, 31 và 24 nucleotide. ....................................................................................... 101 Hình 14: Kết quả điện di mao quản nhóm sản phẩm SNapShot G5 của 10 mồi SBE (S005, S034, SV06, SV03, S114, S109, SV08, SV04, S078 và S098) từ một mẫu cá tra sinh trưởng chậm: kích thước sản phẩm thực tế lần lượt là 77,71, 65, 59, 53, 47, 41, 36, 30 và 24 ................................. 102 Hình 15: Kết quả điện di mao quản nhóm sản phẩm SNapShot G6 của 8 mồi SBE (S081, S008, SV15, S058, SV13, S011, S063 và S124) từ một mẫu cá tra sinh trưởng chậm: kích thước sản phẩm thực tế lần lượt là 64, 58, 53, 47, 42, 37, 30 và 24 nucleotide. .......................................... 103 Hình 16: Kết quả điện di mao quản nhóm sản phẩm SNapShot G7 của 6 mồi SBE (S100, S095, S020, S086, S001 và S042) từ một mẫu cá tra sinh trưởng chậm: kích thước sản phẩm thực tế lần lượt là 53, 47, 42, 237, 31 và 24 nucleotide ................................................................................ 103
vii Hình 17: Kết quả điện di mao quản nhóm sản phẩm SNapShot G8 của 7 mồi SBE (S090_4109, S033_1077, S090_3990, S060, S033_992, S044 và S036) từ một mẫu cá tra sinh trưởng chậm: kích thước sản phẩm thực tế lần lượt là 59, 54, 48, 42, 36, 30 và 24 nucleotide ........................ 104 Hình 18: Kết quả điện di mao quản nhóm sản phẩm SNapShot G9 của 7 mồi SBE (S085, SV07, S126, S053, S118, S019 và S071) từ một mẫu cá tra sinh trưởng chậm: kích thước sản phẩm thực tế lần lượt là 58, 52, 47, 42, 37, 31 và 24 nucleotide................................................................... 105 Hình 19: Kết quả điện di mao quản nhóm sản phẩm SNapShot G10 của 7 mồi SBE (SV02, S066, SV05, S121, S066, SV10 và SV16) từ một mẫu cá tra sinh trưởng nhanh: kích thước sản phẩm thực tế lần lượt là 69, 62, 55, 48, 41, 33 và 25 nucleotide .......................................................... 105 Hình 20: Kết quả điện di mao quản nhóm sản phẩm SNapShot G11 của 6 mồi SBE (S029, S028, S070, S080, S099 và S096) từ một mẫu cá tra sinh trưởng chậm: kích thước sản phẩm thực tế lần lượt là 54, 48, 43, 38, 31 và 24 nucleotide .................................................................................. 106 DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Thông số kỹ thuật cài đặt mặc định cho kỹ thuật SNapShot trên hệ thống ABI 3500 ... 21 Bảng 2: Danh sách 6 mồi SBE trong bộ mồi chuẩn ...................................................................... 22 Bảng 3: Bảng kết quả đo nồng độ DNA tổng số của một số mẫu đại diện ................................... 25 Bảng 4: Kết quả điện di mao quản đối với bộ sản phẩm chuẩn trên hệ thống phân tích ABI 3500 ....................................................................................................................................................... 28 Bảng 5: Danh sách 11 bộ Binset cho 11 nhóm sản phẩm SNapShot ............................................ 29 Bảng 6: Các SNP được lựa chọn với điều kiện xác suất (FET
1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Cá tra nuôi (Pangasianodon hypophthalmus), thuộc họ cá tra (Pangasiidae), bộ cá da trơn hay cá nheo (Siluriformes). Cá tra nuôi là một trong những loài cá đặc hữu của vùng lưu vực sông Mê Kông (Việt Nam, Thái Lan, Lào, Campuchia), có giá trị kinh tế lớn và được nuôi phổ biến ở vùng này và một số nước khác thuộc khu vực miền nam châu Á. Theo thống kê của FAO, Việt Nam là nước có sản lượng cá tra nuôi Pangasianodon hypophthalmus lớn nhất thế giới và xuất khẩu sang hơn 140 nước trên thế giới. Mặc dù xuất khẩu ra hàng trăm thị trường nhưng sản phẩm cá tra Việt Nam vẫn chưa có chỗ đứng bền vững. Một phần do chất lượng cá giống đầu vào chưa cao, tình hình dịch bệnh, thời tiết thất thường… dẫn đến hiệu quả sản xuất thấp, giá cả không ổn định, mặt khác, ngành hàng cá tra Việt Nam còn chịu sự cạnh tranh gay gắt khi mà một số nước khác đã và đang đẩy mạnh sản xuất loại thủy sản này. Do đó việc tìm ra giải pháp đột phá để nâng cao giá trị ngành hàng cá tra là yêu cầu cấp bách hiện nay. Việc phát triển và ứng dụng rộng rãi Công nghệ sinh học trong lĩnh vực thủy sản đang là hướng đi mà chính phủ, lãnh đạo các cấp các ngành liên quan cũng như các doanh nghiệp thủy sản đặc biệt quan tâm. Một trong những vấn đề cấp thiết và có ý nghĩa cực kỳ quan trọng đối với công tác giống là thông tin về đặc điểm cấu trúc phân tử của bộ gen (genome) của cá tra. Nghiên cứu genome sẽ cung cấp những thông tin chính xác nhất cho việc xác định các tính trạng quan trọng như tính kháng bệnh, tính chống chịu đối với điều kiện môi trường, các tính trạng liên quan đến năng suất, chất lượng sản phẩm cá tra. Để tạo tiền đề cho các nghiên cứu về hệ gen cá tra, góp phần cho công tác nghiên cứu và ứng dụng Công nghệ sinh học trong thủy sản, Viện Nghiên cứu hệ gen đã xây dựng và thực hiện đề tài nghiên cứu cấp nhà nước: “Phân tích hệ gen biểu hiện (exome + transcriptome) của cá tra nhằm phát triển chỉ thị phân tử phục vụ chọn giống cá tra theo hướng tăng trưởng” thuộc Chương trình phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong thủy sản của Bộ nông nghiệp và Phát triển nông thôn, do TS. Kim Thị Phương Oanh làm chủ nhiệm (thời gian thực hiện đề tài 8/2014 đến 4/2018). Dựa trên dữ liệu toàn bộ hệ gen (genome) và hệ gen biểu hiện
2 (transcriptome) cá tra, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Xác định đa hình nucleotide đơn (SNP) có khả năng liên quan đến tính trạng tăng trưởng ở cá tra Pangasianodon hypophthalmus” nhằm xác định chính xác các chỉ thị SNP tiềm năng liên quan đến tính trạng tăng trưởng đã được sàng lọc và dự đoán bằng phương pháp tin sinh học trên quần thể cá tra. Kết quả của đề tài đóng góp về mặt khoa học cho hướng nghiên cứu phát triển chỉ thị phân tử trên đối tượng cá tra nuôi Việt Nam. 2. Mục tiêu của đề tài Kiểm nghiệm lại các chỉ thị SNP tiềm năng đã được sàng lọc dựa trên dữ liệu hệ gen biểu hiện (transcriptome) trong quần thể cá tra. 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Mẫu vây cá tra (100 cá thể) được lấy từ Trung tâm Quốc gia Giống thủy sản nước ngọt Nam Bộ, Viện Nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản II, được chia thành hai nhóm: - Nhóm mẫu sinh trưởng nhanh: Phân tích và kiểm nghiệm trên 50 cá thể thuộc gia đình có EBV cao nhất. - Nhóm mẫu sinh trưởng chậm: Phân tích và kiểm nghiệm trên 50 cá thể thuộc gia đình có EBV thấp nhất. 4. Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Tách chiết DNA tổng số từ mẫu mô vây của các cá thể cá tra thuộc quần thể kiểm nghiệm. Nội dung 2: Thiết kế mồi dựa trên dữ liệu transcriptome đã phân tích và sàng lọc SNP bằng phương pháp tin sinh. Nội dung 3: Thực hiện phản ứng PCR phân lập đoạn trình tự DNA có chứa SNP. Nội dung 4: Xác định các SNP bằng phương pháp Single-Base Extension/ SNaPshot Multiplex System Nội dung 5: Phân tích dữ liệu SNP
3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đặc điểm sinh học và giá trị kinh tế của cá tra 1.1.1. Đặc điểm sinh học Cá tra có tên khoa học là Pangasianodon hypophthalmus được Rainboth sử dụng lần đầu vào năm 1996 để chỉ định cho loài cá Tra và sau đó được nhiều tác giả khác sử dụng phổ biến cho đến nay. Cá tra nuôi là một trong những loại cá đặc hữu của vùng lưu vực sông Mê Kông (Việt Nam, Thái Lan, Lào, Campuchia), thuộc họ cá tra (Pagasiidae), bộ cá da trơn hay cá nheo (Siluriformes), có giá trị kinh tế lớn và được nuôi phổ biến ở vùng này và một số nước khác thuộc khu vực miền Nam Châu Á. Về đặc điểm sinh học, cá tra là cá da trơn (không vẩy), thân dài, lưng xám đen, bụng hơi bạc, miệng rộng, đầu nhỏ vừa phải, mắt tương đối to. Vây lưng cao, có một gai cứng có răng cưa. Vây ngực có ngạch, bụng có 8 tia phân nhánh [10]. Cá tra dễ nuôi, có thể sống tốt trong điều kiện ao tù nước đọng, nhiều chất hữu cơ, có hàm lượng oxy hòa tan và độ pH thấp. Người ta có thể nuôi loại cá này với mật độ rất cao và có thể sống được ở vùng nước lợ (nồng độ muối 7-10‰). Một ao nuôi có thể chứa 50 con/ m2, còn nuôi bè thì khoảng 90 – 120 con/ m2. Cá tra là loài cá ăn tạp. Chúng có thể ăn thịt lẫn nhau ngay trong bể ấp và chúng vẫn tiếp tục ăn nhau nếu cá ương không được cho ăn đầy đủ. Trong quá trình ương thành cá giống trong ao, chúng ăn các loại động vật phù du có kích thước nhỏ và thức ăn nhân tạo. Khi cá lớn thể hiện tính ăn rộng, ăn đáy và ăn tạp thiên về động vật. Trong điều kiện thiếu thức ăn, cá có thể sử dụng các loại thức ăn bắt buộc khác như mùn bã hữu cơ, rễ cây thủy sinh, rau quả và thức ăn có nguồn gốc động vật như tôm tép, cua, côn trùng, ốc và cá. Trong ao nuôi cá tra có khả năng thích nghi với nhiều loại loại thức ăn khác nhau như: thức ăn tự chế, thức ăn công nghiệp, cám, tấm, rau muống… Thức ăn có nguồn gốc động vật giúp cá lớn nhanh hơn [7]. Cá tra có tốc độ tăng trưởng tương đối nhanh, lúc còn nhỏ cá tăng nhanh về chiều dài. Cá ương trong ao sau 2 tháng đạt chiều dài từ 10-12 cm (14 – 15 gam). Từ khoảng 2,5 kg trở đi, mức tăng trọng lượng nhanh hơn so với chiều dài cơ thể. Cá nuôi trong ao 1 năm đạt 1 đến 1,5 kg/con (năm đầu), những năm về sau cá tăng
4 trọng nhanh hơn, có khi đạt tới 5 đến 6 kg/năm tuỳ thuộc môi trường sống và sự cung cấp thức ăn cũng như loại thức ăn có hàm lượng đạm nhiều hay ít. Cá tra không sinh sản trong ao nuôi, cá có tập tính di cư sinh sản trên những khúc sông có điều kiện sinh thái phù hợp. Trong tự nhiên chỉ gặp cá thành thục trên sông ở địa phận của Campuchia và Thái Lan. Ở Việt Nam cá tra cũng không có bãi sinh sản tự nhiên. Cá sinh sản ở Campuchia, cá bột theo dòng nước về Việt Nam [7]. Tuổi thành thục của cá tra trên sông Mekong 3 – 4 năm tuổi. Cá tra có tập tính di cư ngược dòng. Mùa vụ sinh sản của cá trong tự nhiên bắt đầu từ tháng 5 đến tháng 7 âm lịch hàng năm. Trọng lượng cá thành thục lần đầu từ 2,5 đến 3 kg [7]. Cá tra không có cơ quan sinh dục phụ, nếu chỉ nhìn hình dáng bên ngoài thì khó phân biệt được cá đực và cá cái. Bắt đầu phân biệt được cá đực cái từ giai đoạn II, các giai đoạn sau, buồng trứng tăng về kích thước, hạt trứng màu vàng, tinh sào có hình dạng phân nhánh, màu hồng chuyển dần sang màu trắng sữa. Hệ số thành thục của cá tra khảo sát được trong tự nhiên từ 1,76 đến 12,94 (cá cái) và từ 0,83 đến 2,1 (cá đực) cỡ cá từ 8 đến 11 kg. Trong ao nuôi vỗ, hệ số thành thục cá tra cái có thể đạt 19,5%. Số lượng trứng đếm được trong buồng trứng của cá gọi là sức sinh sản tuyệt đối, sức sinh sản tuyệt đối của cá tra từ 200.000 đến vài triệu trứng. Sức sinh sản tương đối có thể là 135.000 trứng/kg cá cái. Kích thước của trứng cá tra tương đối nhỏ và có tính dính. Trứng sắp đẻ có đường kính trung bình 1mm, khi đẻ ra trứng trương nước thì đường kính trứng có thể là 1,5 – 1,6 mm. Trong sinh sản nhân tạo, ta có thể nuôi thành thục sớm và cho đẻ sớm hơn trong tự nhiên (từ tháng 3 dương lịch hàng năm), cá tra có thể tái phát dục 1 – 3 lần trong một năm [3]. 1.1.2. Giá trị kinh tế của cá tra Ở Việt Nam, đồng bằng Nam Bộ đã có truyền thống nuôi cá tra trong ao và bè. Năng suất nuôi cá tra rất cao, trung bình khoảng 300 tấn/ha. Cá tra đã và đang trở thành một đối tượng nuôi có giá trị xuất khẩu lớn. Tính đến hết năm 2017, diện tích nuôi cá tra cả nước là 5.230 ha (tăng 3,5% so cùng kỳ). Trong đó, vùng đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) với 5 tỉnh: An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Vĩnh Long và Bến Tre chiếm đến 95% diện tích. Kim ngạch xuất khẩu cá tra năm 2017 đạt khoảng 1,78 tỷ USD, tăng 4,3% so với năm 2016, đạt 1,79 tỉ USD, đóng góp 21,45% vào giá trị xuất khẩu của ngành thủy sản [4]. Song song với việc sản lượng
5 thủy sản xuất khẩu tăng là sự cạnh tranh gay gắt ở cả thị trường trong nước cũng như thị trường nước ngoài. Rất nhiều doanh nghiệp cạnh tranh không lành mạnh, lạm dụng kháng sinh, chất tăng trọng làm mất uy tín chất lượng cá tra xuất khẩu Việt Nam. Bên cạnh đó, giá cá tra nguyên liệu tăng dẫn đến tình trạng các hộ dân ồ ạt mở rộng diện tích nuôi trồng mà không có sự kiểm soát làm nguồn cung vượt cầu, rủi ro cao. Một khó khăn gây trở ngại cho việc xuất khẩu cá tra nữa là hiện nay các nước khác cũng gia tăng sản lượng nuôi và xuất khẩu cá tra, chẳng hạn như Ấn Độ có sản lượng hơn 650.000 tấn, Bangladesh gần 500.000 tấn, indonesia 110.000 tấn … Riêng thị trường Trung Quốc, vốn là nhà nhập khẩu cá tra lớn nhất, các doanh nghiệp nội địa cũng đang tích cực nuôi với sản lượng khoảng 10.000 tấn [5]. Không chỉ bị cạnh tranh về thị trường với các đối thủ mới, cá tra Việt Nam cũng đang gặp nhiều trở ngại tại thị trường nước ngoài từ chính các thay đổi về chính sách. Chính vì vậy, ngành thủy sản cần phải đổi mới phương pháp nuôi trồng để nâng cao năng suất, cải tiến cách thức quản lý để kiểm soát và nâng cao chất lượng sản phẩm cá tra để đáp ứng được yêu cầu thị trường và bảo vệ thương hiệu cá tra Việt Nam trên thị trường quốc tế. Nền tảng cho chiến lược phát triển này là công tác chọn giống, tập trung ứng dụng khoa học kỹ thuật nhằm nâng cao chất lượng di truyền của loài cá có giá trị kinh tế cao này. 1.2. Tình hình nghiên cứu về SNP marker trong thủy sản trên thế giới Với sự phát triển của khoa học công nghệ trong những năm gần đây, việc áp dụng nghiên cứu genome trong nuôi trồng thủy sản và bảo vệ nguồn đa dạng sinh học đã trở nên dễ dàng tiếp cận hơn [33], [11], [32]. Giải mã gen hay đọc trình tự DNA bằng phương pháp Sanger [42] cùng với các thế hệ máy giải trình tự tự động đã tạo nên một cuộc cách mạng trong lĩnh vực nghiên cứu hệ gen (genomics) [24]. Với công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới (Next Generation Sequencing - NGS) hiện nay đã và đang phát hiện được thêm nhiều đa hình nucleotide đơn (Single Nucleotide Polymorphism – SNP) cho nhiều đối tượng khác nhau. Đã có nhiều các nghiên cứu và bài báo được công bố liên quan đến chỉ thị phân tử DNA và phạm vi ứng dụng của chúng, bao gồm trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản. Phân tích đa hình nucleotide đã nổi lên như công nghệ genotyping với các ứng dụng rộng rãi trong nuôi trồng thủy sản như xây dựng bản đồ liên kết di truyền, tìm kiếm các gen quy
6 định tính trạng hữu ích trong nuôi trồng thủy sản [35], [55] như tính kháng bệnh, tính chống chịu với điều kiện môi trường, các tính trạng liên quan đến năng suất, chất lượng sản phẩm, màu sắc thịt, độ tuổi thành thục. Các SNP liên kết với các tính trạng mong muốn có thể được xác định bằng cách sử dụng công nghệ NGS như RNA-seq, Genotyping by sequencing (GBS) [18], multiplexed shotgun genotyping [14] và Restriction-site associated DNA sequencing (RAD-seq), tạo ra một khối lượng dữ liệu khổng lồ với giá thành rẻ hơn rất nhiều. Sử dụng GBS đã giúp xác định được 4275 loci SNP của cá nheo lục Ictalurus furcatus, trong đó 64 SNP multiplex đã được sử dụng cho genotyping [29]. Nhờ kĩ thuật NGS, đã xác định được tổng cộng 5243 SNP marker chất lượng cao ở loài ngọc trai môi đen Pinctada margaritifera từ quần đảo Fiji [28]. Một bản đồ liên kết di truyền mật độ cao được tích hợp cùng bản đồ vật lý được tạo ra ở cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) với hơn 50000 SNP, độ bao phủ 90% Mb của hệ gen cá da trơn, kích thước di truyền ước tính 3505,4 cM [31]; [30]. Bản đồ tích hợp tạo điều kiện cho việc lắp ráp bộ gen cá da trơn, lập bản đồ QTL và phân lập các gen mang các đặc điểm hữu ích về mặt kinh tế. Một bản đồ di truyền cho cá chép (Cyprinus carpio) cũng được xây dựng dựa trên 8487 SNP marker với 50 nhóm liên kết với tổng khoảng cách 3762,88 cM [27]; [54]. Ngoài ra, bản đồ liên kết di truyền còn được xây dựng ở một số loài khác quan trọng đối với nuôi trồng thủy sản như cá tráp đầu vàng (Sparus aurata) [50]; cá chẽm Châu Á (Lates calcarifer) [52]; cá quế mõm hếch (Siniperca chuatsi) [45]; cá bơn Nhật (Paralichthys oilivaceus) [15]; [43]... Tăng trưởng là đặc điểm kinh tế quan trọng nhất trong nhiều chương trình chọn giống trong nuôi trồng thủy sản, do đó đã có nhiều nghiên cứu về chủ đề này. Sự liên quan giữa tính trạng sinh trưởng và đa hình ở các gen thích hợp đã được nghiên cứu ở một số loài cá. Ở cá hồi chấm hồng Bắc cực (Salvelinus alalpinus), nghiên cứu đa hình nucleotide đơn (SNP) của các gen liên quan đến sinh trưởng cho thấy trên gen GHRH/PACAP2 có SNP liên quan rõ ràng tỷ lệ sinh trưởng và được coi như một marker tiềm năng có thể ứng dụng cho chọn giống dòng sinh trưởng nhanh [47]. Gần đây, công nghệ RNA-seq cũng đã được sử dụng để xác định SNP marker cho tính trạng tăng trưởng ở cá hồi cầu vồng. Nghiên cứu này đã xác định được 22 SNP có liên kết với tính trạng tăng trưởng ở 778 cá thể đại diện
7 cho 40 gia đình [40]. Ở cá hồi Đại tây dương (Salmo salar L.), nghiên cứu SNP trên gen IGF1 cho thấy, có hai vị trí (ở vùng promoter g.5763G>T và ở intron 3 g.4671A>C) có liên quan chặt chẽ với trọng lượng cơ thể và đây cũng là những marker tiềm năng có thể ứng dụng cho chọn giống [49]. Ở cá chép (Cyprinus carpio), SNP nằm trên intron 2 của gen IGF-1 (g.7627T>A) có liên quan chặt chẽ với trọng lượng và chiều dài cơ thể. Cá chép có kiểu gen AA có trọng lượng trung bình cao hơn cá có kiểu gen TT 5,9%. Cá có kiểu gen TT tương ứng có trọng lượng trung bình thấp nhất. Đây cũng là marker tiềm năng có thể ứng dụng cho chọn giống [20]. Ở cá rô phi (Oreochromis niloticus), nghiên cứu SNP trên các gen liên quan đến sinh trưởng (bao gồm: GH, IGF-1 và MyoG) đã tìm ra các SNP mới trên gen GH và MyoG có tiềm năng ứng dụng làm marker chọn giống [16]. Như vậy, nghiên cứu đa dạng di truyền của các gen liên quan đến tính trạng sinh trưởng là một phương pháp khá hiệu quả nhằm tìm ra marker phân tử để chọn lọc tính trạng này. 1.3. Tình hình nghiên cứu về cá tra ở Việt Nam Trong những năm gần đây, ở nước ta đã bước đầu chú ý đến các nghiên cứu nhằm nâng cao chất lượng di truyền và kiểm soát dịch bệnh ở một số giống thủy sản. Các nghiên cứu đã và đang tiến hành trên cá tra đã đặt cơ sở khoa học cho công tác chọn giống và nghiên cứu đa dạng sinh học của giống thủy sản có giá trị kinh tế cao này. Các tác giả Phạm Anh Tuấn và Nguyễn Hữu Ninh đã sử dụng 4 microsatellite tìm kiếm mối tương quan giữa marker phân tử với màu sắc thịt của cá tra [9]. Một số nghiên cứu đa dạng di truyền sử dụng các marker phân tử như RAPD và AFLP đã được nghiên cứu trên trên cá tra [2]; [6]. Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II đã thực hiện chương trình chọn giống cá tra thông qua tính trạng tốc độ tăng trưởng bằng phương pháp chọn lọc cá thể (quần đàn 2001-2002) và tỷ lệ phi lê bằng phương pháp chọn lọc kết hợp (quần đàn 2003) dưới sự hỗ trợ kinh phí của SUFA (2001-2005). Quần đàn 2001, 2002 và 2003 được thành lập trên cơ sở chọn lọc đàn con của 75, 79 và 101 gia đình được sản xuất từ cá bố mẹ thuộc 3- 4 trại sản xuất giống khác nhau và có nguồn gốc từ tự nhiên ở đồng bằng sông Cửu Long. Chương trình chọn giống được tiếp tục bằng đề tài cấp Bộ “Chọn giống cá tra nhằm tăng tỷ lệ philê bằng chọn lọc gia đình, 2006-2008” trên quần đàn G1-
8 2001, G1-2002 và G1-2003 và đề tài trong giai đoạn “Đánh giá hiệu quả chọn giống cá tra nâng cao tốc độ tăng trưởng và tỷ lệ philê, 2010-2012” trên quần đàn G2-2001, G2-2002 và G2-2003. Kết quả đề tài 03 giai đoạn này cho thấy hệ số di truyền ước tính của tính trạng tỷ lệ phi lê thấp (h2=0,05-0,12), trọng lượng cơ thể cao (h2=0,22-0,54) và kháng bệnh gan thận mủ thấp (h2=0,04-0,20). Hiệu quả chọn lọc tương ứng được mong đợi cho những tính trạng này. Nguyễn Văn Sáng và ctv (2009) đã tìm thấy tương quan di truyền thuận thấp giữa tỷ lệ philê và trọng lượng cơ thể (r=0,35). Kết quả này cho phép kết luận rằng chọn lọc tính trạng trọng lượng cơ thể có thể mang lại hiệu quả cho tỷ lệ philê nhưng không cao. Hiệu quả chọn lọc thực tế tính trạng tăng trưởng tương đối khả quan ở mức trung bình và cao 5,4-18,2% mỗi thế hệ và cho tính trạng tỷ lệ philê ở mức 0,51-1,2%. Hệ số di truyền thực tế cho tính trạng tăng trưởng cũng ở mức trung bình và cao như hệ số ước tính, 0,24-0,38 và cho tính trạng tỷ lệ phi lê tương đối cao, 0,27 (trong khi hệ số di truyền ước tính tương đối thấp). Quần đàn chọn giống thế hệ thứ 3 được hình thành trong các năm 2010-2012 cho chọn giống tiếp theo bao gồm 1800 con chọn lọc có giá trị chọn giống EBV cao và 250 con đối chứng (chọn ngẫu nhiên). Kết quả đánh giá đa dạng các quần đàn chọn giống bằng chỉ thị microsatellite cho thấy không có sự khác biệt về cấu trúc alen giữa các đàn cá thiết lập vật liệu chọn giống có nguồn gốc từ các trại giống khác nhau, 2001, 2002 và 2003 và giữa chúng với đàn con G1-2001, G1-2002 và G1-2003 trên 6 chỉ thị khảo sát [8]; [1]. Kết quả nghiên cứu chuyên đề trong đề tài giai đoạn 2010- 2012 cho thấy, các quần đàn bố mẹ G1-2001, G1-2002, G1-2003 và đàn tự nhiên có số lượng alen, độ phong phú alen, chỉ số thông tin đa hình, giá trị dị hợp tử mong đợi và thực tế gần tương đương nhau bằng phân tích trên 10 cặp microsatellite. Trong đó, quần đàn G1-2001 có khác biệt di truyền so với các đàn còn lại và đàn G1-2002 có chỉ số cận huyết thấp hơn các đàn còn lại. Như vậy, cho đến nay chúng ta chưa tìm ra chỉ thị phân tử nào có thể ứng dụng cho chọn giống cá tra. Do việc nghiên cứu xác định các chỉ thị phân tử DNA có độ tin cậy cao, có ý nghĩa thực tế lớn, ứng dụng trong chọn giống và kiểm soát sạch bệnh nên ngày càng được các nhà khoa học và các nhà quản lý quan tâm, xác định đó là nền tảng cho các nghiên cứu ứng dụng sau này. Ở nước ta, với giá trị kinh tế cao của cá tra và yêu cầu cấp thiết nâng cao chất
9 lượng di truyền, kiểm soát dịch bệnh và quản lý nghề nuôi cá này, phân tích hệ gen cá tra là một trong những vấn đề rất cần nghiên cứu và có ý nghĩa quan trọng. Để tạo tiền đề cho các nghiên cứu về hệ gen cá tra, góp phần cho công tác nghiên cứu và ứng dụng công nghệ sinh học trong thủy sản, từ năm 2014 – 2018 viện Nghiên cứu hệ gen đã thực hiện đề tài cấp nhà nước: “Phân tích hệ gen biểu hiện (exome + transcriptome) của cá tra nhằm phát triển chỉ thị phân tử phục vụ chọn giống cá tra theo hướng tăng trưởng”, do TS. Kim Thị Phương Oanh làm chủ nhiệm. Đề tài đã sử dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) giải mã được toàn bộ hệ gen (genome) của một cá thể cá tra đực độ bao phủ khoảng 127X. Kích thước bộ gen cá tra ước tính 700 Mb, lắp ráp thành 568 scaffolds, với giá trị N50 đạt 14,29 Mbp. Toàn bộ hệ gen của cá tra đã được chú giải và ước tính có khoảng 28.600 gen mã hoá protein. Đây là phác thảo bộ gen cá tra đầu tiên có thể được sử dụng làm hệ gen tham chiếu cho cá tra [26]. Đề tài cũng đã giải mã hệ gen biểu hiện (transcriptome) của mô cơ từ hai nhóm mẫu: cá tra sinh trưởng nhanh (10 cá thể) và cá tra sinh trưởng chậm (10 cá thể). Bằng cách sử dụng các công cụ và phần mềm tin sinh học, nhóm nghiên cứu đã tiến hành phân tích hai bộ dữ liệu transcriptome của hai nhóm cá tra sinh trưởng nhanh và sinh trưởng chậm; sàng lọc được 369 đa hình nucleotide đơn (SNP) có sự khác biệt giữa hai nhóm mẫu. Dựa trên những phân tích dự đoán bằng phương pháp tin sinh học, 99 chỉ thị SNP tiềm năng có sự khác biệt giữa các nhóm sinh trưởng nhanh và sinh trưởng chậm, có khả năng liên quan đến tính trạng tăng trưởng được sàng lọc. Tuy nhiên, những phân tích dựa trên phương pháp tin sinh học này cần được kiểm nghiệm lại bằng thực nghiệm trên quần thể lớn hơn.
10 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Nguyên vật liệu 2.1.1. Thu thập mẫu cá tra a. Địa điểm thu thập mẫu Cá tra thuộc nhóm sinh trưởng nhanh và nhóm sinh trưởng chậm được thu thập từ Trung tâm Quốc gia giống thủy sản nước ngọt Nam Bộ, Viện nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản II, ấp 2, xã An Thái Trung, huyện Cái Bè, tỉnh Tiền Giang. b. Quá trình thu mẫu Tất cả mẫu cá tra đã được phân loại thành hai nhóm sinh trưởng nhanh và sinh trưởng chậm theo kết quả đề tài trước đó của Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II. Để phân loại nhóm sinh trưởng nhanh và sinh trưởng chậm người ta căn cứ vào chỉ số giá trị giống ước tính (Estimated Breeding Value – EBV) được tính toán cho từng cá thể. Dựa vào bảng xếp hạng EBV của toàn bộ quần đàn cá tra nuôi mẫu, chúng tôi tiến hành thu mẫu vây của 50 cá thể có EBV cao nhất (nhóm sinh trưởng nhanh) và 50 cá thể có EBV thấp nhất (nhóm sinh trưởng chậm). Mẫu vây được thu cắt từ vây bụng của cá, sau khi cắt rời khỏi cơ thể cá được bảo quản ngay trong cồn tuyệt đối. Mẫu vây sau đó được bảo quản ở nhiệt độ -20oC. Trong quá trình thao tác cắt mẫu vây dụng cụ cắt được rửa sạch bằng cồn trước khi thực hiện cắt mẫu tiếp theo. Trong quá trình bảo quản mẫu vây thường xuyên thay cồn trong ống đảm bảo mẫu không bị biến đổi. Trong quá trình làm thí nghiệm, chúng tôi chỉ tiến hành trên 96 mẫu cá tra gồm 48 mẫu sinh trưởng nhanh và 48 mẫu sinh trưởng chậm để phù hợp với việc sử dụng khay 96 giếng. Danh sách 96 mẫu cá tra được liệt kê ở PHỤ LỤC 1. 2.1.2. Các cặp mồi nhân các vùng trình tự có chứa SNP marker Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng 90 cặp mồi nhân vùng trình tự có chứa chỉ thị SNP được thiết kế dựa vào danh sách 99 SNP tiềm năng có sự khác biệt giữa hai nhóm cá tra sinh trưởng nhanh và sinh trưởng chậm đã qua sàng lọc bằng các phần mềm tin sinh học, dựa trên kết quả nghiên cứu trước đó (kết quả của nhóm nghiên cứu đề tài “Phân tích hệ gen biểu hiện (exome + transcriptome) của cá tra nhằm phát triển chỉ thị phân tử phục vụ chọn giống cá tra theo hướng sinh trưởng”. Từ 99
11 SNP tiềm năng chỉ thiết kế 90 cặp mồi là do có một số trường hợp có 2 SNP trở lên ở cùng một transcript, do vậy sẽ có những cặp mồi nhân lên được đoạn trình tự có chứa nhiều SNP. Danh sách 90 cặp mồi nhân đoạn trình tự genome chứa SNP cùng kích thước sản phẩm PCR dự tính được liệt kê ở PHỤ LỤC 2 2.1.3. Hóa chất thí nghiệm STT Thí nghiệm Tên hóa chất Hỗn hợp dung dịch solution 1: Tris HCl 10 mM, EDTA 100 mM, SDS 2% Tách chiết và Dung dịch amonium axetat 7,5M (solution 1 tinh sạch DNA 2) tổng số Proteinase K (20 mg/ml) Ethanol 100% Ethanol 70% Agarose TAE 2 Điện di Bromophenol blue 0,25% Ethidium bromide 0,1 µg/ ml Taq 2X Master Mix 3 PCR Primer H2O ABI PRISMSNaPshotTM Multiplex Kit gồm: SNP SNaPshot Multiplex Ready Reaction Mix 4 Genotyping SNaPshot Multiplex Control Primer Mix SNaPshot Multiplex Control template 5 Tinh sạch DNA Shrimp Alkaline phosphatase (SAP)