Luận án Tiến sĩ Khoa học vật liệu: Nghiên cứu chế tạo, đặc trưng và khảo sát tiềm năng ứng dụng của hệ dẫn thuốc nano đa chức năng nền copolyme PLA-PEG có và không có hạt từ (Fe3O4)

VIỆN HÀN LÂM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -------------------------- PHAN QUỐC THÔNG

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO, ĐẶC TRƯNG VÀ KHẢO SÁT TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG CỦA HỆ DẪN THUỐC NANO ĐA CHỨC NĂNG NỀN COPOLYME PLA-PEG CÓ VÀ KHÔNG CÓ HẠT TỪ (Fe3O4)

Chuyên ngành: Vật liệu điện tử

Mã số: 9.44.01.23

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU

Hà Nội - 2019

VIỆN HÀN LÂM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -------------------------- PHAN QUỐC THÔNG

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO, ĐẶC TRƯNG VÀ KHẢO

SÁT TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG CỦA HỆ DẪN THUỐC

NANO ĐA CHỨC NĂNG NỀN COPOLYME PLA-PEG

CÓ VÀ KHÔNG CÓ HẠT TỪ (Fe3O4)

Chuyên ngành: Vật liệu điện tử

Mã số: 9.44.01.23

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

GS.TSKH. NGUYỄN XUÂN PHÚC

TS. HÀ PHƯƠNG THƯ

Hà Nội - 2019

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất của mình tới

GS.TSKH. Nguyễn Xuân Phúc và TS. Hà Phương Thư – những người Thầy hướng dẫn

đã ân cần chỉ bảo, cũng như tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt thời gian

thực hiện luận án.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn trân trọng nhất tới PGS.TS. Đỗ Hùng Mạnh,

PGS.TS. Phạm Thanh Phong, TS. Lê Trọng Lư vì sự quan tâm sâu sắc, sự giúp đỡ tận

tình trước và trong quá trình thực hiện luận án.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn trân trọng nhất tới PGS.TS. Lê Thị Mai Hương, TS.

Trần Thị Hồng Hà thuộc Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam, PGS.TS. Hoàng Thị Mỹ Nhung, ThS. Nguyễn Đắc Tú

của Bộ môn sinh học tế bào thuộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

– Đại học Quốc gia Hà Nội vì những hợp tác nghiên cứu trong các ứng dụng y sinh.

Bản luận án này sẽ không thể hoàn thành nếu không có sự giúp đỡ của các đồng

nghiệp. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn của mình tới tất cả các thành viên làm việc tại Phòng

Vật liệu nano y sinh và Phòng vật lý vật liệu từ và siêu dẫn của Viện Khoa học vật liệu.

Đặc biệt, tôi xin được gửi tới TS. Phạm Hồng Nam, NCS. Đỗ Khánh Tùng, NCS. Lưu

Hữu Nguyên, NCS. Mai Thị Thu Trang, NCS. Nguyễn Hoài Nam, NCS. Lê Thị Hồng

Phong và ThS. Tạ Ngọc Bách, TS. Vương Thị Kim Oanh lời cảm ơn chân thành vì sự

giúp đỡ thực hiện các phép đo và sự quan tâm động viên hết sức quý báu với tôi trong

quá trình thực hiện luận án.

Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới GS. Phan Mạnh Hưởng ở Đại học Nam Florida

và GS. Sri Sridhah thuộc Trường Đại học Đông Bắc, Hoa Kỳ về những phép đo trên

các máy chuyên dụng thực hiện tại đó. Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới GS.

Nguyễn Thị Kim Thanh và Cộng sự tại Đại học London – Vương quốc Anh về những

hợp tác nghiên cứu và giúp đỡ tôi thực hiện những phép đo quý báu.

Luận án được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài nghiên cứu cơ bản định

hướng ứng dụng mã số DT.NCCB-DHUD.2012-G/08 và dự án AOARD award FA

2386 14-1-0025 giữa nhóm nghiên cứu của GS. Nguyễn Xuân Phúc, Viện Khoa học

vật liệu với các nhóm của GS. Nguyễn Thị Kim Thanh, Trường đại học London và GS.

Sri Sridhah, Trường đại học Đông Bắc – Hoa Kỳ; đề tài “Nghiên cứu quy trình chế tạo

và thử nghiệm hệ dẫn thuốc hướng đích cấu trúc nano đa chức năng (polyme-drug-

folate)”, Mã số 106.99-2012.43, Nafosted (7/2013-7/2016) và đề tài “Nghiên cứu chế

tạo hệ dẫn thuốc nano Paclitaxel phối hợp Curcumin và đánh giá tác động của chúng

lên các tế bào ung thư”, mã số:VAST03.04/16-17, Viện Hàn lâm Khoa học và Công

nghệ Việt Nam, (1/2016-12/2017) do TS. Hà Phương Thư làm chủ nhiệm.

Tôi cũng xin được cảm ơn tới Ban lãnh đạo, Bộ phận quản lý đào tạo và các cán

bộ Phòng thí nghiệm trọng điểm của Viện Khoa học vật liệu, vì đã luôn tạo điều kiện

thuận lợi nhất cho tôi trong quá trình thực hiện bản luận án.

Sau cùng, tôi muốn gửi tình cảm yêu thương nhất và sự biết ơn tới bố, mẹ, vợ và

các con cũng như tất cả những người thân trong gia đình và bạn bè đã luôn cổ vũ, động

viên để tôi vượt qua khó khăn hoàn thành tốt nội dung nghiên cứu trong bản luận án

này.

Hà Nội, ngày tháng năm

Tác giả luận án

Phan Quốc Thông

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, dưới sự hướng dẫn

của GS.TSKH. Nguyễn Xuân Phúc và TS. Hà Phương Thư. Các số liệu, kết quả sử

dụng trong luận án được trích dẫn từ các bài báo và báo cáo đề tài đã được sự đồng ý

của các đồng tác giả. Các số liệu, kết quả này là trung thực và chưa từng được ai công

bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả luận án

Phan Quốc Thông

iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

I. Danh mục các ký hiệu

: Từ trường cố định B0

Bcl-2 : Protein gây chết rụng tế bào

BT-474 : Dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến vú người

: Nhiệt dung riêng của hệ mẫu C

: Một loại protein trong hệ thống miễn dịch C3

: Khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của chất thử tính theo % so với đối chứng

: Pha trống 2 G2

: Cường độ từ trường H

HepG2 : Dòng tế bào ung thư gan ở người

: Nồng độ ức chế (Inhibited Concentration) IC50

: Chỉ số xác định liều cận trên và cận dưới LD50

: Khối lượng hạt từ

: Pha nguyên phân M

: Khối lượng tổng cộng của hệ mẫu

: Từ độ bão hòa Ms

: Độ hồi phục dọc và ngang, tương ứng 1 và 2 r1, r2

: Tốc độ hồi phục dọc và ngang, tương ứng 1 và 2 R1, R2

: Tần số radio RF

: Tốc độ hồi phục dọc và ngang khi không có chất tương phản Ro1,2

Sarcoma180 : Dòng tế bào ung thư mô liên kết chuột

: Thời gian hồi phục dọc và ngang, tương ứng 1 và 2 T1, T2

: Mômen từ của chân không

: Tần số của từ trường

: Tốc độ tăng nhiệt ban đầu

: Độ lệch tiêu chuẩn 

: Hằng số pha φ

: Tần số Larmor ω0

II. Danh mục các chữ viết tắt

: Huyết thanh Bò (Bovine Calf Serum) BCS

: Chất lỏng từ CLT

: Kỹ thuật chụp cắt lớp với sự hỗ trợ của máy tính (Computed Tomography)

Cur : Curcumin

Cur/Fe3O4@PLA-PEG: Hạt nano Fe3O4 bọc copolyme PLA-PEG mang Curcumin

Cur/PLA-PEG: Polylactic axit- Polyethylene glycol mang Curcumin

Cur/PLA-PEG-Fol: Polylactic axit- Polyethylene glycol mang Curcumin và gắn yếu tố

hướng đích Folat

: Dung môi (Dichlomethan) DCM

: Giản đồ tán xạ ánh sáng động (Dynamic Light Scattering) DLS

DMEM : Môi trường nuôi cấy tế bào (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)

DMSO : Dung môi (Dimethyl Sulfoside)

: Làm lạnh có từ trường (Field Cool) FC

FDA

: Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Thuốc Hoa Kỳ (Food and Drug Administration)

Fe3O4@PLA-PEG: Hạt nano Fe3O4 bọc copolyme PLA-PEG

FE-SEM

: Kính hiển vi điện tử quét- phát xạ trường (Field Emission Scanning Electron Microscope)

FT-IR : Phổ hấp thụ hồng ngoại Fourier

HDT : Hệ dẫn thuốc

HDTNN : Hệ dẫn thuốc kích thước nano

: Công suất tổn hao nội tại (Intrinsic Loss Power) ILP

: Ôxit sắt (Iron oxide) IO

: Nhiệt trị ung thư dùng chất lỏng từ (Magnetic Fluid Hyperthermia) MFH

: Đốt nóng cảm ứng từ (Magnetic Inductive Heating) MIH

MNPs : Các hạt nano từ tính (Magnetic Nanoparticles)

MPEG-PLA : Methôxy poly(ethylene glycol)-poly(lactic axit)

MRI : Ảnh cộng hưởng từ (Magnetic Resonance Imaging)

NAA : Axit amin không thiết yếu (Non-Essential Amino Acids)

PBS : Đệm sinh lý (Phosphate Buffered Saline)

PEG : Polyethylene glycol

PET : Kỹ thuật ghi hình bằng bức xạ positron (Positron Emission Tomography)

PLA : Polylactic axit

PLA-PEG : Polylactic axit- Polyethylene glycol

PLA-TPGS : Poly(lactic axit)-vitamin E

PLGA : Poly (lactic-co-glycolic)

PLGA-PEG : Poly(lactic-co-glycolic)-polyethylene glycol

: Hợp chất kháng sinh (Penixillin- Streptomycin sulfate- Fungizone) PSF

: Tốc độ hấp thụ riêng (Specific Absorption Rate) SAR

: Sn(II) 2-ethylhexanoate (Tin (II) 2-ethylhexanoate) Sn(Oct)2

: Thuốc nhuộm (Sulfo Rhodamine B) SRB

: Axit hữu cơ Tricloacetic (Trichloro Acetic acid) TCA

: Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron Microscope) TEM

: Phân tích nhiệt vi lượng (Thermal Gravimetric Analysis) TGA

UV-Vis : Phổ tử ngoại-khả kiến (Ultraviolet-Visible)

: Từ kế mẫu rung (Vibrating Sample Magnetometer) VSM

: Nhiễu xạ tia X (X-Ray Diffraction) XRD

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1. Sơ đồ hình thành hạt nano đa chức năng .................................................. 9

Hình 1.2. Các loại hạt nano nền polyme cấu trúc lõi-vỏ đặc trưng cho phân phối thuốc .............................................................................................................. 11

Hình 1.3. Sơ đồ hệ dẫn thuốc nano đa chức năng ................................................. 12

Hình 1.4. Cấu trúc hệ dẫn thuốc đa chức năng với: A) Các hạt nano đa chức năng đơn giản với thuốc và/hoặc các liệu pháp được mang vào bên trong; B) Các hạt nano đa chức năng phức tạp bao gồm hạt nano ôxit sắt, hạt nano lõi silica – vỏ hạt vàng, hạt nano Gadolinium biến tính bề mặt gắn các phối tử hướng đích và đóng gói thuốc ........................................................... 14

Hình 1.5. Cấu trúc Curcumin ............................................................................... 16

Hình 1.6. Sơ đồ tổng hợp copolyme PLA-PEG bằng phương pháp trùng ngưng mở vòng polyme ......................................................................................... 25

Hình 1.7. Cấu trúc tinh thể của Fe3O4 ................................................................... 26

Hình 1.8. Nguyên lý của chụp ảnh cộng hưởng từ: a) spin của các proton của phân tử nước quay tròn dưới sự tác dụng của từ trường ngoài B0 với tần số Larmor (ω0); b) sau khi áp dụng từ trường xoay chiều tần số radio (RF) có hướng vuông góc với B0 spin proton sẽ bị kích thích và lệch khỏi hướng ban đầu; c) thời gian phục hồi dọc T1; d) thời gian phục hồi ngang T2 .. 29

Hình 1.9. Mô hình hệ nanovector lõi hạt từ tính ................................................... 38

Hình 2.1. Ảnh thiết bị kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường Hitachi S-4800 ... 43

Hình 2.2. Ảnh thiết bị kính hiển vi điện tử truyền qua TEM ................................. 44

Hình 2.3. (a) Hệ thí nghiệm đốt nóng cảm ứng từ, (b) Minh họa bố trí thí nghiệm đốt nóng cảm ứng từ ............................................................................. 48

Hình 3.1. Mô tả quy trình chế tạo hệ dẫn thuốc nano Cur/PLA-PEG, Cur/PLA-PEG- Fol ........................................................................................................ 62

Hình 3.2. Ảnh FE-SEM của hạt nano copolyme PLA-PEG với các hợp phần PLA:PEG 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3 tương ứng với các hình 1A, 1B, 1C, 1D, 1E ......................................................................................................... 63

Hình 3.3. Phân bố kích thước thủy động (DLS) của các hệ nano PLA-PEG với tỷ lệ thành phần PLA:PEG 3:1, 2:1, 1:1, 1:2 và 1:3 tương ứng các hình A, B, C, D và E. .................................................................................................. 64

Hình 3.4. Thế Zeta của copolyme PLA-PEG ........................................................ 65

vii

Hình 3.5. Ảnh FE-SEM của hệ hạt nano Cur/PLA-PEG với các hợp phần PLA:PEG 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, tương ứng với các hình 2A, 2B, 2C, 2D, 2E ....... 67

Hình 3.6. Phân bố kích thước thủy đông (DLS) của các hệ nano Cur/PLA-PEG với tỷ lệ thành phần PLA:PEG 3:1, 2:1, 1:1, 1:2 và 1:3, tương ứng các hình A, B, C, D và E .......................................................................................... 68

Hình 3.7. Thế Zeta của hạt nano Cur/PLA-PEG ................................................... 69

Hình 3.8. Ảnh FE-SEM của hạt nano Cur/PLA-PEG-Fol với các hợp phần PLA:PEG 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, tương ứng với các hình 3A, 3B, 3C, 3D, 3E ....... 70

Hình 3.9. Đường phân bố kích thước (DLS) của các hệ nano Cur/PLA-PEG-Fol với tỷ lệ thành phần PLA:PEG 3:1, 2:1, 1:1, 1:2 và 1:3, tương ứng các hình A, B, C, D và E ......................................................................................... 71

Hình 3.10. Thế Zeta của hạt nano Cur/PLA-PEG-Fol ............................................. 72

Hình 3.11. Phân bố kích thước các hệ nano PLA-PEG, Cur/PLA-PEG và Cur/PLA- PEG-Fol ............................................................................................... 72

Hình 3.12. Phổ UV-Vis (B) và phương trình đường chuẩn Curcumin (A) .............. 74

Hình 3.13. Phổ UV-Vis của các hệ nano Cur/PLA-PEG với các tỷ lệ thành phần PLA:PEG 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3 ............................................................ 74

Hình 3.14. Ảnh hưởng của tỷ lệ PLA:PEG đến hiệu quả mang thuốc của hệ nano Cur/PLA-PEG ...................................................................................... 75

Hình 3.15. Phổ UV-Vis của Curcumin, Cur/PLA-PEG (A) và của Curcumin, axit folic và Cur/PLA-PEG-Fol (B) ..................................................................... 76

Hình 3.16. Phổ FT-IR của PLA, PEG và PLA-PEG với tỷ lệ thành phần PLA:PEG khác nhau ............................................................................................. 77

Hình 3.17. Phổ FT-IR của PLA, PLA-PEG, Curcumin, Cur/PLA-PEG .................. 78

Hình 3.18. Phổ FT-IR của axit folic, PLA-PEG, Cur/PLA-PEG và PLA-PEG-Fol .. 78

Hình 3.19. Phổ FT-IR của Cur/PLA-PEG với các tỷ lệ thành phần PLA:PEG khác nhau ...................................................................................................... 79

Hình 3.20. Phổ FT-IR của Cur/PLA-PEG-Fol với các tỷ lệ thành phần PLA:PEG khác nhau ...................................................................................................... 79

Hình 3.21. Tỷ lệ % giải phóng chậm Cur từ hệ nano Cur/PLA-PEG (A) và Cur/PLA- PEG-Fol (B) tại 37oC ............................................................................ 80

Hình 3.22. Giá trị IC50 của Cur/H2O, Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol ........... 84

Hình 3.23. Giá trị IC50 của Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol ........................... 85

viii

Hình 3.24. Sự thay đổi hình dạng tế bào HepG2 dưới tác dụng của Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol ................................................................................ 86

Hình 4.1. Sơ đồ tổng hợp hạt nano Fe3O4 bằng phương pháp đồng kết tủa ........... 89

Hình 4.2. Mô tả quy trình chế tạo hệ dẫn thuốc nano Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur ......................................................................... 90

Hình 4.3. Giản đồ XRD của Fe3O4, Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur 91

Hình 4.4. Phổ FT-IR của các hệ mẫu hạt nano Fe3O4, Fe3O4@PLA-PEG, Fe3O4@PLA-PEG/Cur ......................................................................... 92

Hình 4.5. Ảnh SEM, TEM và phân bố kích thước của các hạt nano Fe3O4, Fe3O4@PLA-PEG, Fe3O4@PLA-PEG/Cur tương ứng hình 1A, 1B, 1C; 2A, 2B, 2C và 3A, 3B, 3C .................................................................... 93

Hình 4.6. Kích thước thủy động (DLS) các hạt nano Fe3O4, Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur tương ứng các hình (A), (B) và (C) .................. 94

Hình 4.7. Thế Zeta của hệ hạt nano Fe3O4 (A), 3Fe3O4@0,3PLA-PEG (C) và của một vài hệ hạt nano Fe3O4@PLA-PEG khác (B) ......................................... 96

Hình 4.8. Kết quả phân tích TGA cho mẫu hạt nano Fe3O4@PLA-PEG (A) và Fe3O4@PLA-PEG/Cur (B) ................................................................... 99

Hình 4.9. Từ độ phụ thuộc từ trường của Fe3O4, Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA- PEG/Cur tính trên khối lượng tổng vỏ-lõi (A) và sau khi trừ đóng góp lượng vỏ hữu cơ (B) ........................................................................... 100

Hình 4.10. So sánh độ tương phản ảnh cộng hưởng từ hạt nhân theo chế độ trọng T2 của các hạt nano Fe3O4@PLA-PEG (A) và Fe3O4@PLA-PEG/Cur (B) ............................................................................................................ 102

Hình 4.11. Đường tốc độ hồi phục phụ thuộc nồng độ pha loãng mẫu: R1 vs C (A) và R2 vs C (B) của các các chất lỏng từ Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA- PEG/Cur ............................................................................................. 103

Hình 4.12. Tốc độ hồi phục dọc R1 (A) và gang R2 (B) phụ thuộc nồng độ mẫu Fe3O4@PLA-PEG S1 (C) và Fe3O4@PLA-PEG/Cur S2 (D) ................ 104

Hình 4.13. Đường gia nhiệt của hệ chất lỏng từ nồng độ 1 mg/mL của Fe3O4@PLA- PEG (A) và Fe3O4@PLA-PEG/Cur (B), đo với các từ trường khác nhau, và kết quả tính SAR cho các nồng độ 1 mg/mL của hệ nano Fe3O4@PLA- PEG (C) và Fe3O4@PLA-PEG/Cur (D) .............................................. 107

Hình 4.14. Đường gia nhiệt MIH của các hệ mẫu Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA- PEG/Cur ............................................................................................. 108

Hình 4.15. Phổ UV-Vis (A) và lượng Curcumin giải phóng theo thời gian (B) từ hệ nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur ủ tại nhiệt độ 37oC ................................. 109 Hình 4.16. Đốt nóng cảm ứng từ hệ Fe3O4@PLA-PEG/Cur với các khoảng thời gian 5 – 10 – 15 – 20 – 25 phút tương đương hình A – B – C – D – E ........ 110

Hình 4.17. Phổ UV-Vis (A) và phần trăm giải phóng Curcumin (B) từ hệ nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur theo phương pháp đốt nóng cảm ứng từ tại các khoảng thời gian khác nhau ................................................................ 111

Hình 4.18. Kết quả thí nghiệm MIH giải phóng chậm Curcumin trong hệ nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur ngắt tại 370C với thời gian chiếu khác nhau: đường gia nhiệt với các từ trường khác nhau (A), phổ UV-Vis của mẫu khi ngắt (B), và phần trăm giải phóng Curcumin (C) ........................................ 112

Hình 4.19. Kết quả giải phóng chậm Curcumin từ hệ nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur tại nhiệt độ dừng chiếu từ 45oC: đường gia nhiệt với các từ trường khác nhau (A), phổ UV-Vis của mẫu mới ngắt (B) và phần trăm giải phóng Curcumin (C) ...................................................................................................... 113

Hình 5.1. Tỉ lệ tăng sinh của tế bào Sarcoma 180 (A) và BT-474 (B) so với đối chứng sinh học khi được thử nghiệm độc tính với hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG theo dải nồng độ 0,01-100 µg/mL. Tỉ lệ tăng sinh của tế bào ở nồng độ thử nghệm cao nhất vẫn đạt 85 % so với DCSH, ở 3 nồng độ tiếp theo đạt 90-95 % và ở nồng độ thấp nhất không có sự khác biệt so với ĐCSH ........................................................................................... 116

Hình 5.2. Đường cong đáp ứng liều của hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG dựa trên phương pháp Litchfield - Wilcoxon: (A) Thí nghiệm lần 1, (B) Thí nghiệm lần 2 ....................................................................................... 117

Hình 5.3. Ảnh MRI của hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA- PEG/Cur chụp theo chế độ T2W, TE 80ms, TR 3,0s ở điều kiện: (A) Fe3O4@PLA-PEG trong môi trường Agar 1,5 % chứa 2.106 tế bào Sarcoma 180; (B) Fe3O4@PLA-PEG trong môi trường Agar 1,5 %, (C) Fe3O4@PLA-PEG/Cur trong môi trường Agar 1,5 % chứa 2.106 tế bào sarcoma 180; (D) Fe3O4@PLA-PEG/Cur trong môi trường Agar 1,5 %. Nồng độ sắt từ trong mỗi giếng là: (1) 0,000 mg/mL; (2) 0,01 mg/mL; (3) 0,05 mg/mL; (4) 0,1 mg/mL; (5) 0,2 mg/mL; (6) 0,5 mg/mL ............. 118

Hình 5.4. Khả năng tăng tương phản MRI của hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA- PEG ở chế độ T2W, TE 80ms, TR 3,0s, góc chụp 180o (cắt lớp theo trục đầu – đuôi chuột). (A) Ảnh trước khi tiêm hệ chất lỏng nano từ; (B) Ảnh sau khi tiêm hệ chất lỏng nano từ: (1) chuột không được tiêm, (2) chuột tiêm 50 µg hạt từ trực tiếp vào khối u, (3) chuột tiêm 250 µg hạt từ trực tiếp vào khối u .................................................................................... 119

Hình 5.5. Ảnh chụp MRI theo chế độ T2W, TE 80ms, TR 3,0s, góc chụp 90o cho thấy tốc độ lan truyền của hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG trong khối u rắn dưới da chuột theo thời gian ở hai nồng độ vật liệu thử nghiệm là 25 µg/0,5 cm3 và 250 µg/0,5 cm3 .................................................... 120

Hình 5.6. Tế bào Sarcoma 180 sau khi đốt từ 30 phút với hệ chất lỏng nano từ nồng độ 2 mg/mL ở từ trường 70 Oe, 178 kHz. Mẫu thí nghiệm (A), Đối chứng (ĐC) nhiệt trị - có hạt từ, không chiếu từ trường (B), và Đối chứng sinh học -ĐCSH (C) ................................................................................... 121

Hình 5.7. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ hạt nano từ đến tỉ lệ chết của tế bào Sarcoma 180 ................................................................................ 122

Hình 5.8. Tế bào Sarcoma 180 tại thời điểm 0 phút (A) và 60 phút (B) .............. 123

Hình 5.9. Tỷ lệ tế bào Sarcoma 180 chết theo thời gian sau khi đốt nhiệt 60 phút với nồng độ 1 mg/ml và 2 mg/ml chất lỏng hệ chất lỏng nano từ ở từ trường 70 Oe, 178 kHz ................................................................................... 124

Hình 5.10. Ảnh khối u rắn dưới da sau 5 ngày (A), 10 ngày (B) và 15 ngày (C) cấy truyền ................................................................................................. 125

Hình 5.11. Ảnh khối u trước và sau khi điều trị trên khối u 5 ngày tuổi ................ 127

Hình 5.12. Ảnh về tăng khối u chuột đối chứng trong 12 ngày theo dõi ................ 128

Hình 5.13. Theo dõi sự thay đổi thể tích khối u được nhiệt trị trên khối u 5 ngày tuổi, Lô 1 – tiêm 30 µL hạt nano, lô 2 – tiêm 20 µL hạt nano ..................... 128

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm nhiệt từ trị trên chuột mang khối u rắn dưới da .......... 57

Bảng 3.1. Phân bố kích thước hạt và thế Zeta của các hạt nano PLA-PEG ............ 65

Bảng 3.2. Phân bố kích thước hạt và thế Zeta của các hạt nano Cur/PLA-PEG ..... 69

Bảng 3.3. Phân bố kích thước hạt và thế Zeta của các hạt nano Cur/PLA-PEG-Fol .............................................................................................................. 73

Bảng 3.4. Kích thước hạt, lượng Curcumin và hiệu quả mang Curcumin của các hệ copolyme PLA-PEG, Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol ................. 75 Bảng 3.5. Tỷ lệ % Curcumin giải phóng chậm từ hệ nano Cur/PLA-PEG tại 37oC .............................................................................................................. 81 Bảng 3.6. Tỷ lệ % Curcumin giải phóng chậm từ hệ nano Cur/PLA-PEG-Fol tại 37oC .............................................................................................................. 81

Bảng 3.7. Giá trị IC50 của hệ nano Cur/PLA-PEG, Cur/PLA-PEG-Fol và Cur/H2O .............................................................................................................. 84

Bảng 3.8. Giá trị IC50, hiệu quả mang Cur và hiệu quả nhập bào của hệ nano Cur/PLA-PEG ...................................................................................... 85

Bảng 3.9. Giá trị IC50, hiệu quả mang Cur và hiệu quả nhập bào của hệ nano Cur/PLA-PEG-Fol ................................................................................ 85

Bảng 4.1. Ảnh hưởng của nồng độ PLA-PEG đến độ bền phân tán hạt nano Fe3O4@PLA-PEG trong nước .............................................................. 95

cal) và bởi khối lượng vỏ thí nghiệm TGA (Mc

Bảng 4.2. Ảnh hưởng của nồng độ Fe3O4 đến độ bền phân tán hạt nano Fe3O4@PLA- PEG trong nước .................................................................................... 97

Bảng 4.3. Từ độ bão hòa: đo trực tiếp cho mẫu lõi+vỏ (Mcs); hiệu đính bởi khối lượng ex) của các vỏ danh định (Mc mẫu hạt nano Fe3O4, Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur .... 100

Bảng 4.4. Kết quả tính toán độ hồi phục r1, r2 và tỷ số r1/r2 cho 2 mẫu Fe3O4@PLA-PEG (S1), Fe3O4@PLA-PEG/Cur (S2) và chất thương phẩm Resovist, Ferumoxytol ......................................................................... 105

Bảng 4.5. Kết quả tính SAR của hệ nano Fe3O4@PLA-PEG và Cur/Fe3O4@PLA- PEG ở các từ trường khác nhau .......................................................... 107

Bảng 4.6. Phần trăm Curcumin giải phóng từ hệ nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur khi được ủ tại 37oC ................................................................................... 109

Bảng 4.7. Số liệu đo giải phóng Curcumin của hệ nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur đạt được ở 37oC và 45oC bằng phương pháp đốt nóng cảm ứng từ ........... 113

xii

Bảng 5.1. Nhiệt độ bão hòa đạt được (oC) khi kích thích hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG bằng những từ trường có cường độ khác nhau ...... 121

Bảng 5.2. Tỷ lệ tế bào chết (%) sau khi được trộn với hệ chất lỏng nano từ và chiếu từ trường 30 phút ................................................................................ 122

Bảng 5.3. Tỷ lệ tế bào chết tại các thời điểm sau khi chiếu từ trường với nồng độ chất lỏng nano từ 2 mg/mL ........................................................................ 123

Bảng 5.4. Tỷ lệ tế bào chết tại các thời điểm sau khi chiếu từ trường với nồng độ chất lỏng nano từ 1 mg/mL ........................................................................ 123

xiii

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn i

Lời cam đoan iii

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt iv

Danh mục các hình vẽ vii

Danh mục các bảng xii

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1

Chương 1 TỔNG QUAN MỘT SỐ HỆ DẪN THUỐC ....................................... 7

1.1. Hệ dẫn thuốc ................................................................................................... 7

1.1.1. Hệ dẫn thuốc kích thước thông thường ..................................................... 7

1.1.2. Hệ dẫn thuốc kích thước nano (HDTNN) .................................................. 8

1.1.3. Các loại polyme nghiên cứu ứng dụng ..................................................... 21

1.1.4. Copolyme phân hủy sinh học PLA-PEG .................................................. 22

1.2. Hệ dẫn thuốc nano từ tính ........................................................................... 26

1.2.1. Hạt nano từ ............................................................................................... 26

1.2.2. Các phương pháp chế tạo hạt nano từ ..................................................... 33

1.2.3. Bọc bảo vệ và chức năng hệ nano từ tính ................................................ 37

Tóm lược chương 1 ............................................................................................... 399

Chương 2 CÁC KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM ................................................ 40

2.1. Phương pháp tổng hợp PLA-PEG ............................................................... 40

2.1.1. Hóa chất và thiết bị ................................................................................... 40

2.1.2. Tổng hợp PLA-PEG ................................................................................. 40

2.2. Phương pháp chế tạo các hạt nano .............................................................. 40

2.2.1. Chế tạo hệ nano PLA-PEG, Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol ........ 40

2.2.2. Chế tạo hạt nano Fe3O4@PLA-PEG, Fe3O4@PLA-PEG/Cur .................. 41

2.3. Các phương pháp đặc trưng ........................................................................ 42

xiv

2.3.1. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ copolyme và hạt nano Fe3O4 đến độ bền

phân tán của hệ nano Fe3O4@PLA-PEG ................................................. 42

2.3.2. Hiển vi điện tử .......................................................................................... 42

2.3.3. Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) ............................................... 44

2.3.4. Giản đồ tán xạ ánh sáng động (Dynamic Light Scattering - DLS) .......... 45

2.3.5. Phổ tử ngoại khả kiến UV-Vis (Ultraviolet-Visible) ................................. 45

2.3.6. Nhiễu xạ tia X (XRD) ............................................................................... 45

2.3.7. Phân tích nhiệt vi lượng (Thermal Gravimetric Analysis-TGA) .............. 46

2.3.8. Từ kế mẫu rung (Vitrating Sample Magetometer – VSM) ....................... 47

2.3.9. Đốt nóng cảm ứng từ (Magnetic Inductive Heating - MIH) .................... 47

2.3.10. Cộng hưởng từ hạt nhân ........................................................................ 49

2.3.11. Chụp ảnh cộng hưởng từ hạt nhân cho mẫu động vật .......................... 50

2.4. Phương pháp nghiên cứu giải phóng chậm thuốc ...................................... 51

2.4.1. Giải phóng chậm Curcumin bằng ủ nhiệt ................................................ 51

2.4.2. Giải phóng chậm Curcumin bằng MIH ................................................... 51

2.5. Thực nghiệm sinh học .................................................................................. 52

2.5.1. Thử nghiệm độc tính in vitro trên dòng tế bào HepG2 ............................ 52

2.5.2. Thử nghiệm sinh học trên tế bào ung thư và chuột mang khối u ............ 53

2.5.3. Phương pháp nhiệt từ trị tiêm trực tiếp vào khối u .................................. 56

Tóm lược chương 2 ............................................................................................... 588

Chương 3 NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VÀ ĐẶC TÍNH CỦA HỆ NANO

COPOLYME PLA-PEG ĐA CHỨC NĂNG ...................... 59

3.1. Chế tạo các hệ nano copolyme PLA-PEG, Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-

PEG-Fol ........................................................................................................ 60

3.1.1. Chế tạo hạt nano copolyme PLA-PEG ..................................................... 60

3.1.2. Chế tạo hạt nano copolyme PLA-PEG mang Curcumin (Cur/PLA-PEG) .. ................................................................................................................ 60

3.1.3. Chế tạo hạt nano copolyme PLA-PEG mang Curcumin và gắn yếu tố

hướng đích Folat (Cur/PLA-PEG-Fol) .................................................... 61

3.2. Cấu trúc, hình thái học và đặc trưng tính chất của các hạt nano PLA-

PEG, Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol ............................................... 62

3.2.1. Hình dạng, kích thước và sự phân bố kích thước hạt nano PLA-PEG ... 62

3.2.2. Hình dạng, kích thước và sự phân bố kích thước hạt nano Cur/PLA-PEG ................................................................................................................ 66

3.2.3. Hình dạng, kích thước và sự phân bố kích thước hệ nano Cur/PLA-PEG- Fol ............................................................................................................. 69

3.2.4. Khả năng mang thuốc của các hạt nano PLA-PEG ................................ 73

3.2.5. Kết quả đo phổ UV-Vis ............................................................................. 76

3.2.6. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại FT-IR ................................................ 77

3.3. Nghiên cứu giải phóng chậm Curcumin ..................................................... 80

3.4. Nghiên cứu khả năng gây độc trên tế bào ung thư của các hệ nano

Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol ......................................................... 83

Kết luận chương 3 ................................................................................................... 87

Chương 4 NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VÀ ĐẶC TÍNH CỦA HỆ CHẤT LỎNG

NANO TỪ ĐA CHỨC NĂNG LÕI HẠT Fe3O4 ................. 88

4.1. Chế tạo hệ nano Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur ................. 89

4.1.1. Tổng hợp hạt nano Fe3O4 ......................................................................... 89

4.1.2. Chế tạo hệ nano Fe3O4@PLA-PEG.......................................................... 90

4.1.3. Chế tạo hệ nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur .................................................. 90

4.2. Cấu trúc, hình thái học và đặc trưng tính chất các mẫu hạt nano Fe3O4,

Fe3O4@PLA-PEG, Fe3O4@PLA-PEG/Cur ................................................. 91

4.2.1. Phân tích XRD .......................................................................................... 91

4.2.2. Phân tích FT-IR ....................................................................................... 91

4.2.3. Hình dạng, kích thước và sự phân bố kích thước các hạt nano Fe3O4,

Fe3O4@PLA-PEG, Fe3O4@PLA-PEG/Cur .............................................. 92

4.2.4. Ảnh hưởng của nồng độ copolyme PLA-PEG và hạt nano Fe3O4 đến độ

bền phân tán của hệ nano Fe3O4@PLA-PEG .......................................... 95

4.3. Đặc trưng đóng góp khối lượng và từ tính của các mẫu Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur ............................................................................ 98

4.4. Ảnh cộng hưởng từ hạt nhân hệ nano Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-

PEG/Cur ..................................................................................................... 101

4.5. Kết quả đốt nóng cảm ứng từ của hệ nano Fe3O4@PLA-PEG và

Fe3O4@PLA-PEG/Cur ............................................................................... 106

xvi

4.6. Đốt nóng cảm ứng từ giải phóng Curcumin của hệ nano Fe3O4@PLA-

PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur ................................................................. 108

4.6.1. Đốt nóng cảm ứng từ bởi từ trường cường độ yếu................................. 108

4.6.2. Giải phóng Curcumin của hệ nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur bằng phương

pháp ủ nhiệt ............................................................................................ 109

4.6.3. Giải phóng Curcumin của hệ nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur kích bởi đốt

nóng cảm ứng từ ..................................................................................... 109

4.6.4. Kết quả đốt từ giải phóng chậm Curcumin hệ nano Fe3O4@PLA-

PEG/Cur khi ngắt tại cùng nhiệt độ ....................................................... 111

Kết luận chương 4 ................................................................................................. 114

Chương 5 THỰC NGHIỆM SINH HỌC HỆ CHẤT LỎNG NANO TỪ

ĐA CHỨ NĂNG LÕI HẠT Fe3O4 ............................. 115

5.1. Kết quả thử nghiệm độc tính ..................................................................... 115

5.1.1. Độc tính tế bào ........................................................................................ 115

5.1.2. Độc tính cấp ............................................................................................ 116

5.2. Khả năng tăng tương phản ảnh cộng hưởng từ hạt nhân ........................ 117

5.2.1. Khả năng tăng tương phản ảnh cộng hưởng từ dịch tế bào .................. 117

5.2.2. Khả năng tăng tương phản ảnh chụp cộng hưởng từ khối u rắn .......... 118

5.3. Khả năng điều trị ung thư bằng nhiệt từ trị ............................................. 121

5.3.1. Khả năng tiêu diệt tế bào ung thư bằng nhiệt từ trị ............................... 121

5.3.2. Tiêu diệt khối u bằng nhiệt từ trị sử dụng Fe3O4@PLA-PEG ............... 125

Kết luận chương 5 ................................................................................................. 129

KẾT LUẬN CHUNG ............................................................................................ 131

A. CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ SỬ DỤNG TRONG LUẬN ÁN ....................... 133

B. CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN HƯỚNG NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN .. 134

xvii

MỞ ĐẦU

Trong thế kỉ XXI, ngành khoa học vật liệu đã có bước phát triển đột phá nhờ khả

năng can thiệp của con người tại kích thước nanomet (10-9 m). Công nghệ nano đang

làm thay đổi cuộc sống của chúng ta từng ngày nhờ các ứng dụng đa dạng trên tất cả

các phương diện về kinh tế và xã hội. Các kết quả nghiên cứu trong trên hai thập kỉ qua

cho thấy công nghệ nano có nhiều tiềm năng ứng dụng trong y học (công nghệ nano Y

học – Nanomedicine) và chuyên sâu hơn là trong điều trị ung thư (Công nghệ nano Ung

thư – Cancer nanotechnology) [1, 2].

Trong vài thập niên trở lại đây, các hệ vật liệu kích thước nano phân phối thuốc

đã được quan tâm phát triển mạnh, hệ phân phối thuốc kích thước nano được chứng

minh là có nhiều ưu điểm vượt trội so với các hệ dẫn thuốc thông thường. Với kích

thước nanomet, khả năng đóng gói thuốc tốt, có thể chức năng hóa bề mặt để tăng lưu

thông trong máu, tăng tính tương thích sinh học, dễ dàng nhập bào theo cơ chế thụ động

do có kích thước nanomet hoặc gắn yếu tố hướng đích làm tăng khả năng nhập bào và

bám đích theo cơ chế chủ động và chọn lọc. Trong tất cả các hệ vật liệu phân phối thuốc

kích thước nanomet, hệ polyme, hệ hạt vàng, hệ hạt từ được quan tâm hơn cả. Đặc biệt,

hệ phân phối thuốc nanomet trên nền hạt nano sắt từ (Fe3O4) được quan tâm phát triển

mạnh trong những năm gần đây với nhiều ưu điểm vượt trội như dễ dàng phát triển

thành hệ nano phân phối thuốc đa chức năng ứng dụng cho cả mục đích chẩn đoán và

điều trị bệnh.

Polyme phân hủy sinh học được sử dụng để thiết kế các hệ phân phối thuốc kích

thước nano với những đặc tính ưu việt hơn so với các hệ phân phối thuốc truyền thống

như: kiểm soát giải phóng thuốc, tự phân hủy và không gây độc sau khi sử dụng, giảm

liều dùng và sự phụ thuộc của bệnh nhân vào thuốc được cải thiện. Trong số các polyme

phân hủy sinh học phải kể đến polylactic axit (PLA), poly(lactic-co-glycolic) (PLGA),

… đã được cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ (FDA) cho phép ứng dụng trong

dược phẩm và lưu hành trên thị trường [3].

Tuy nhiên, ngoài những đặc tính ưu việt trên các hệ nano polyme phân phối thuốc

vẫn có những hạn chế như dễ bị đào thải bởi các thực bào (đơn nhân và đa nhân), các

tế bào của hệ lưới nội mô, sự lắng đọng các protein trên bề mặt hạt nano như

apolipoproteins (các protein kết hợp với lipid để tạo lipoprotein tham gia vào quá trình

vận chuyển lipid) và protein C3 (một loại protein trong hệ thống miễn dịch), qua đó

làm giảm đáng kể thời gian lưu thông máu của các hạt nano.

Do đó, việc chức năng hóa bề mặt polyme phân hủy sinh học như PLA bởi PEG

(polyethylene glycol) để cải thiện những hạn chế của polyme phân hủy sinh học là rất

quan trọng. PEG là một polyme ưa nước, độc tính thấp, không kích thích miễn dịch và

đã được FDA cho phép lưu hành. PEG làm giảm đáng kể sự tương tác không đặc hiệu

với protein, tránh sự đào thải bởi các thực bào và các tế bào của hệ lưới nội mô, đồng

thời tăng khả năng phân tán trong nước, qua đó tăng đáng kể khả năng lưu thông trong

máu. Vì vậy, vật liệu copolyme PLA-PEG được nghiên cứu tổng hợp và chế tạo hệ

nano copolyme PLA-PEG mang thuốc hướng đích nhằm cải thiện các hạn chế của

polyme phân hủy sinh học PLA.

Copolyme PLA-PEG sau khi tổng hợp được sử dụng như một hệ dẫn thuốc ứng

dụng cho mục đích chẩn đoán và điều trị bệnh. Trong nội dung của luận án, copolyme

PLA-PEG được sử dụng để mang Curcumin (một dược chất có tính chất chống ôxy hóa

và tiêu diệt được nhiều loại tế bào ung thư) và gắn yếu tố hướng đích Folat tạo thành

hệ dẫn thuốc hướng đích Cur/PLA-PEG-Fol kích thước nano được sử dụng để tiêu diệt

tế bào ung thư HepG2 (dòng tế bào ung thư gan ở người). Hơn nữa, copolyme PLA-

PEG còn được sử dụng để bọc hạt nano sắt từ Fe3O4 tạo thành hệ dẫn thuốc

Fe3O4@PLA-PEG kích thước nano với phần lõi là hạt nano sắt từ Fe3O4 và bọc cùng

lúc hạt nano sắt từ Fe3O4 và Curcumin tạo thành hệ dẫn thuốc đa chức năng

Cur/Fe3O4@PLA-PEG. Hệ thuốc nano này được sử dụng cho mục đích chẩn đoán hình

ảnh cộng hưởng từ MRI, cũng như cho khả năng tăng nhiệt tại chỗ khi chiếu từ trường

ngoài, có thể ứng dụng trong nhiệt trị ung thư và giải phóng thuốc Curcumin.

Tên luận án: “Nghiên cứu chế tạo, đặc trưng và khảo sát tiềm năng ứng

dụng của hệ dẫn thuốc nano đa chức năng nền copolyme PLA-PEG có và không

có hạt từ (Fe3O4)”

Mục tiêu của luận án:

1) Tổng hợp được copolyme PLA-PEG với các tỷ lệ thành phần PLA:PEG khác

nhau trong vùng 3:1-1:3. Chế tạo hệ nano copolyme PLA-PEG mang Curcumin có và

không gắn yếu tố hướng đích Folat. Nghiên cứu khả năng giải phóng Curcumin đối với

các hệ nano copolyme không và có gắn Folat. Nghiên cứu độc tính tế bào in vitro của

hệ nano copolyme PLA-PEG mang Curcumin không và có gắn Folat trên dòng tế bào

ung thư gan người HepG2.

2) Tổng hợp hạt nano Fe3O4 và chế tạo được chất lỏng từ (CLT) có độ bền cao

trên nền hạt Fe3O4 bọc copolyme PLA-PEG tạo thành hệ nano Fe3O4@PLA-PEG. Chế

tạo được hệ CLT đa chức năng Fe3O4@PLA-PEG/Cur trên nền hạt nano Fe3O4 bọc

copolyme PLA-PEG mang Curcumin.

3) Thử nghiệm sinh học các hệ nano Fe3O4 bọc copolyme mang thuốc (Cur).

Nghiên cứu khả năng ứng dụng làm tác nhân tăng tương phản ảnh cộng hưởng từ hạt

nhân, nghiên cứu hiệu ứng đốt nóng cảm ứng từ và khả năng giải phóng thuốc (Cur).

Thử nghiệm độc tính, và khả năng nhiệt từ trị tiêu diệt tế bào ung thư, tiêu diệt khối u

trên chuột thử nghiệm dựa trên hiệu ứng đốt nóng cảm ứng từ ứng dụng trong nhiệt trị

ung thư (hyperthermia).

Nội dung luận án:

Chương 1 trình bày tổng quan giới thiệu về các hệ dẫn thuốc, các polyme phân

hủy sinh học được sử dụng cho mục đích tổng hợp các hệ dẫn thuốc kích thước nano,

lợi thế của các hệ dẫn thuốc khi được chức năng hóa bề mặt, vai trò của các chất chức

năng hóa bề mặt như poly(ethylene glycol), tinh bột, polysaccarit, … lợi thế của hệ dẫn

thuốc kích thước nano, hệ nano copolyme mang thuốc hướng đích. Tiềm năng và tính

ưu việt của hệ nano copolyme PLA-PEG mang thuốc và gắn yếu tố hướng đích. Hệ 3

CLT trên nền hạt nano Fe3O4 chức năng hóa bề mặt bởi copolyme PLA-PEG có và

không mang Curcumin cũng được trình bày tổng quát.

Trong chương 2, quy trình tổng hợp copolyme PLA-PEG và các quy trình chế

tạo các hệ mẫu, quy trình thử nghiệm sinh học trên các dòng tế bào ung thư và trên

chuột mang khối u, và nguyên lý của các phép đo nhằm phân tích và biện luận các kết

quả trong luận án được trình bày chi tiết.

Chương 3, chương 4 và chương 5 trình bày các kết quả nghiên cứu thu nhận được

của luận án và các thảo luận liên quan. Chương 3 trình bày kết quả nghiên cứu tổng hợp

copolyme PLA-PEG, chế tạo hệ nano dẫn thuốc PLA-PEG mang Curcumin có và

không gắn yếu tố hướng đích Folat với các đặc trưng về kích thước, hình dạng, cấu trúc,

khả năng phân tán và độ bền phân tán được trình bày, phân tích và biện luận chi tiết,

thử nghiệm trên dòng tế bào ung thư gan HepG2. Các kết quả nghiên cứu trong chương

4 liên quan đến vật liệu nano Fe3O4 được tổng hợp bằng phương pháp đồng kết tủa, bọc

copolyme PLA-PEG có mang và không mang Curcumin tạo thành hệ CLT kích thước

nano đa chức năng. Các đặc trưng về hình dạng, kích thước, cấu trúc, tính chất từ, hiệu

ứng tăng cường độ tương phản cộng hưởng từ và hiệu ứng đốt nóng từ định hướng ứng

dụng trong y sinh được trình bày, phân tích và biện luận chi tiết. Chương 5 trình bày

các kết quả thử nghiệm sinh học của hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG trên tế bào

ung thư và chuột mang khối u, thử độc tính tế bào, độc tính cấp, chụp ảnh cộng hưởng

từ trên tế bào và khối u chuột.

Ý nghĩa nghiên cứu của luận án

Hạt nano copolyme PLA-PEG được tổng hợp với tỷ lệ thành phần PLA:PEG

khác nhau sẽ ảnh hưởng đến khả năng mang thuốc (Curcumin, hạt nano sắt từ Fe3O4),

khả năng thâm nhập tế bào ung thư (HepG2) cũng như khả năng giải phóng thuốc.

Hạt nano copolyme PLA-PEG được sử dụng để chế tạo hệ nano copolyme mang

thuốc hướng đích và hệ nano mang thuốc đa chức năng với những ưu điểm vượt trội so

với các hệ phân phối thuốc truyền thống và các hệ phân phối thuốc polyme. Cụ thể:

Tăng cường khả năng nhập bào, tăng hiệu quả điều trị của thuốc (Cur) khi được

mang và hạt nano copolymer PLA-PEG.

Hạt nano copolyme PLA-PEG được sử dụng để mang Curcumin và gắn yếu tố

hướng đích Folat tạo thành hệ dẫn thuốc nano mang thuốc hướng đích, bọc hạt nano từ

Fe3O4 tạo thành các hệ dẫn thuốc nano và mang Curcumin tạo thành hệ dẫn thuốc đa

chức năng ứng dụng trong chẩn đoán hình ảnh cộng hưởng từ MRI, khả năng tăng nhiệt

tại chỗ dưới tác dụng của từ trường ngoài sử dụng cho mục đích nhiệt trị tại chỗ tiêu

diệt tế bào ung thư, nhiệt từ trị (magnetic hyperthermia) tiêu diệt khối u trên chuột thử

nghiệm, tăng cường giải phóng Curcumin.

Đóng góp mới của luận án

Đã tổng hợp được copolyme PLA-PEG bằng phương pháp trùng ngưng với các

tỷ lệ thành phần PLA-PEG khác nhau.

Đã chế tạo được hạt nano copolyme PLA-PEG bằng phương pháp bay hơi dung

môi dạng mixen với cấu trúc lõi-vỏ, mang Cucurmin tạo thành hệ nano mang thuốc

Cur/PLA-PEG và gắn yếu tố hướng đích Folat tạo thành hệ nano mang thuốc hướng

đích Cur/PLA-PEG-Fol.

Đã tổng hợp thành công hạt nano sắt từ Fe3O4 bằng phương pháp đồng kết tủa

với từ độ đạt khoảng 65 emu/g, bọc copolyme PLA-PEG có và không có mang

Curcumin tạo thành hệ chất lỏng nano từ đa chức năng cấu trúc lõi-vỏ Fe3O4@PLA-

PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur với giá trị độ phục hồi r2 cao hơn các chất thương phẩm

Resovist và Ferumoxytol ứng dụng trong chẩn đoán hình ảnh MRI.

Đốt nóng cảm ứng từ hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG/Cur làm tăng nhiệt

tại chỗ và tăng hiệu quả giải phóng thuốc (Curumin).

Sử dụng hệ chất lỏng nano từ đa chức năng Fe3O4@PLA-PEG trong ứng dụng

nhiệt trị giúp tiêu diệt hiệu quả tế bào và khối u trên chuột.

Bố cục luận án: Luận án có 132 trang (chưa bao gồm tài liệu tham khảo), bao

gồm phần mở đầu, 5 chương nội dung và kết luận. Cụ thể như sau:

MỞ ĐẦU

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN MỘT SỐ HỆ DẪN THUỐC

CHƯƠNG 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

CHƯƠNG 3: NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VÀ ĐẶC TÍNH CỦA HỆ NANO COPOLYME PLA-PEG ĐA CHỨC NĂNG

CHƯƠNG 4: NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VÀ ĐẶC TÍNH CỦA HỆ CHẤT LỎNG NANO ĐA CHỨC NĂNG LÕI HẠT TỪ Fe3O4

CHƯƠNG 5: THỰC NGHIỆM SINH HỌC HỆ CHẤT LỎNG NANO ĐA CHỨC NĂNG LÕI HẠT TỪ Fe3O4

KẾT LUẬN CHUNG

Các kết quả chính của luân án được công bố trong 05 bài báo trên các tạp chí

quốc tế và trong nước (02 bài báo thuộc danh sách SCI, 01 bài báo trong hệ thống

Scopus, 01 bài báo trên các tạp chí quốc gia và 01 bài báo đăng trong các kỷ yếu hội

thảo khoa học quốc gia) và 05 bài báo khác có liên quan đến hướng nghiên cứu của

luận án. Luận án được hoàn thành tại Phòng Vật liệu nano y sinh – Viện Khoa học vật

liệu, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam với sự hỗ trợ của các đề tài

nghiên cứu: Đề tài nghiên cứu cơ bản định hướng ứng dụng mã số DT.NCCB-

DHUD.2012-G/08, Dự án AOARD award FA 2386 14-1-0025 hợp tác giữa Viện Khoa

học vật liệu với Trường đại học London (Anh) và Trường đại học Đông Bắc (Hoa Kỳ);

Đề tài “Nghiên cứu quy trình chế tạo và thử nghiệm hệ dẫn thuốc hướng đích cấu trúc

nano đa chức năng (polyme-drug-folate)”, Mã số 106.99-2012.43, Nafosted (7/2013-

7/2016); Đề tài “Nghiên cứu chế tạo hệ dẫn thuốc nano Paclitaxel phối hợp Curcumin

và đánh giá tác động của chúng lên các tế bào ung thư”, mã số:VAST03.04/16-17 do

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam tài trợ (TS. Hà Phương Thư làm chủ

nhiệm).

Chương 1 TỔNG QUAN MỘT SỐ HỆ DẪN THUỐC

1.1. Hệ dẫn thuốc

Hệ dẫn thuốc hay hệ phân phối thuốc được định nghĩa như “là một công thức

hoặc thiết bị cho phép đưa một dược chất (thuốc) vào trong cơ thể, nâng cao hiệu quả

và sự an toàn bằng cách kiểm soát tỷ lệ, thời gian và vị trí giải phóng thuốc trong cơ

thể, quá trình này bao gồm cả sự quản lý thuốc, sự giải phóng các thành phần của thuốc

và sự vận chuyển các thành phần của thuốc qua các lớp màng sinh học để đến vị trí mà

thuốc tác động” [4].

Hệ dẫn thuốc có thể là một công thức với mục đích trị liệu hoặc một thiết bị được

sử dụng để dẫn thuốc. Có nhiều cách để đưa thuốc vào cơ thể: bằng đường uống, đường

tiêm, qua da, đường thở (mũi), ngoài ra còn có một số hình thức phân phối thuốc khác.

1.1.1. Hệ dẫn thuốc kích thước thông thường

- Các thiết bị phân phối thuốc

Một trong những cách phổ biến nhất để phân phối thuốc bằng các thiết bị là đặt

thuốc vào trong các thiết bị phân phối thuốc và cấy vào mô bên trong cơ thể. Ngày nay

với công nghệ hiện đại, việc chế tạo các thiết bị phân phối thuốc thích hợp và cấy vào

mô bên trong cơ thể đã được ứng dụng rộng rãi và cũng đã mang lại những hiệu quả

đáng khích lệ. Một số thiết bị được sử dụng để phân phối thuốc như: Cảm biến sinh học

phân phối thuốc; Thiết bị phân phối thuốc dựa trên nền các vi dòng; Vi chip kiểm soát

giải phóng thuốc; Các bơm và ống dẫn phân phối thuốc.

- Các hệ phân phối thuốc hướng đích

Đối với hệ phân phối thuốc hướng đích và được kiểm soát, một loạt các hệ chất

mang được phát triển như: Các chất nền liên kết, kháng thể đơn dòng, các vi hạt hình

cầu và liposome. Ngoài ra, có nhiều hệ thống tinh vi dựa trên cơ chế phân tử, công nghệ

nano, và liệu pháp phân phối gen cũng được phát triển.

- Các hệ phân phối thuốc chuyên biệt

Khái niệm sử dụng các hạt phân phối thuốc đến các vị trí trong cơ thể đã được

chọn lọc, từ đó sử dụng chúng như những tác nhân chẩn đoán trong y học để nghiên

cứu hệ thống các tế bào khác nhau (gan, lá lách, xương, lympho), các hạt có kích thước

từ 20 – 30 μm được sử dụng để phân phối thuốc hướng đích. Do kích thước nhỏ, chúng

có thể được tiêm trực tiếp vào cơ thể, các hệ thống phân phối thuốc chuyên biệt có thể

bao gồm thuốc và vật liệu lõi hoặc thuốc có thể được phân tán như chất nhũ tương bên

trong vật liệu mang hoặc thuốc có thể được gói gọn bởi vật liệu mang.

1.1.2. Hệ dẫn thuốc kích thước nano (HDTNN)

- Tính ưu việt và tiềm năng của HDTNN

+ Tính ưu việt của HDTNN

Việc chế tạo hệ thống nano chẩn đoán hoặc điều trị đòi hỏi phải kiểm soát nhiều

thông số khác nhau để tối ưu hóa. Những yếu tố này có thể bao gồm thành phần của

các hợp phần, tính kỵ nước trên bề mặt hạt, điện tích bề mặt, kích thước hạt, mật độ của

các phối tử nhắm đích, và nhiều kết hợp của chúng.

Hiện nay, sự phối hợp một số chức năng vào một chất nền của hệ mang đang

được quan tâm, ví dụ phương pháp tự lắp ráp cho việc chuẩn bị của các chất mang đa

chức năng, theo đó các chất kỵ nước và các cấu trúc nano vô cơ được đồng thời gói gọn

trong một chất mang phân phối thuốc [5]. Ngược lại với các hướng tạo phức hóa học,

phương pháp tự lắp ráp cho phép tích hợp các vật liệu của thuộc tính khác nhau dựa

trên nhiệt động lực không đặc hiệu [6]. Với mục đích này, các hạt nano polyme, hình

thành từ sự tự lắp ráp của copolyme khối kỵ nước trong các dung môi chọn lọc là đặc

biệt hữu ích. Hạt nano được tổng hợp bằng phương pháp tự lắp ráp có thể được thiết kế

để chứng minh đồng thời: i) kéo dài sự lưu thông trong máu; ii) đóng gói và bảo vệ của

một loạt các tác nhân điều trị với tải trọng cao; iii) tối ưu hóa tổ hợp các tính chất vật

lý của chất mang để tận dụng cả hai cơ chế nhắm đích chủ động và thụ động; iv) đáp

ứng với các kích thích tại chỗ cho giải phóng thuốc kiểm soát; v) khả năng chịu đựng

nhiều các gốc thuốc tương phản/chụp ảnh/quan sát bằng phương tiện của một loạt các

kỹ thuật hình ảnh đa phương thức [6], mô hình tổng hợp hạt nano bằng phương pháp tự

lắp ghép được trình bày ở Hình 1.1.

Hình 1.1. Sơ đồ hình thành hạt nano đa chức năng [7].

Trong thực tế, việc tổng hợp các hạt nano đa chức năng phức tạp thông qua các

quá trình tự lắp ráp là khá khó khăn. Cho đến nay, vài ví dụ đã được công bố. Nasongkla

và cộng sự [6] đã mô tả quá trình tổng hợp của poly (ethylene glycol) -b-poly (D, L-

lactide) hạt nano đóng gói Doxorubicin hóa trị liệu và hạt nano ôxit sắt siêu thuận từ.

Tương tự như vậy, Yang và cộng sự [8] đã công bố việc tổng hợp poly (d, l-lactide-

coglycolide) hạt nano đóng gói các vật liệu tương tự. Tuy nhiên, các kỹ thuật tổng hợp

được sử dụng như bay hơi dung môi và nhũ tương hóa bị một số nhược điểm như: bề

mặt thiếu ổn định và qua nhiều bước làm sạch để chuẩn bị các hạt có kích thước thống

nhất [6, 8]. Ngoài ra, khả năng tải của các chất kỵ nước thường bị hạn chế bởi khả năng

hòa tan hợp chất trong lõi hạt [9]. Mặt khác, các quá trình tổng hợp không cho phép

phân tách độc lập kết cấu của các hợp phần, không đảm bảo sự phân bố đồng đều của

các hoạt chất trong nội tại các hạt nano. Như vậy, các kỹ thuật lắp ráp mới cho phép

linh hoạt, được điều chỉnh cho các ứng dụng cụ thể là rất cần thiết [9, 10].

+ Tiềm năng của HDTNN

Ngày nay, với sự phát triển vượt bậc của công nghệ nano, các vật liệu, thiết bị và

các HDTNN được chế tạo và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, đặc biệt các

HDTNN được chế tạo trên nền công nghệ nano cũng không phải là một ngoại lệ.

Việc ứng dụng các hạt nano để phân phối và nhắm đích của dược phẩm, tác nhân

điều trị và chẩn đoán đã nhận được sự quan tâm lớn trong những năm gần đây. Các hạt

nano có thể được xây dựng từ nhiều loại vật liệu và được sử dụng để đóng gói hoặc làm

hòa tan các tác nhân hóa trị liệu để cải thiện khả năng phân phối thuốc trong cơ thể.

Thế hệ tiếp theo của HDTNN được nghiên cứu hướng vào việc củng cố và thiết

kế hệ thống đa chức năng, có thể tạo thuận lợi cho việc thực hiện trị liệu. Các hạt nano

ghép có khả năng xác định các tế bào ác tính, xác định vị trí của chúng trong cơ thể

bằng các kỹ thuật chẩn đoán hình ảnh, tiêu diệt tế bào ác tính và giảm thiểu tác dụng

phụ thông qua việc nhắm đích chọn lọc và theo dõi điều trị.

Các hệ thống phân phối có thể được thiết kế để cung cấp, giải phóng có kiểm

soát hoặc giải phóng kích hoạt các phân tử điều trị. Bề mặt hạt nano có thể được chức

năng hóa bằng các phương pháp khác nhau để tạo thành các dạng khác nhau.

Sự chức năng hóa bề mặt có thể được sử dụng để tăng thời gian lưu trú trong

máu, giảm phân phối không đặc hiệu, và trong một số trường hợp, nhắm đích các mô

hoặc các kháng nguyên bề mặt tế bào đích với một yếu tố gắn kết nhắm đích (peptide,

aptamer, kháng thể/đoạn kháng thể, phân tử nhỏ). Ví dụ, hạt nano được tạo thành từ các

polyme ưa nước, đáng chú ý nhất poly (ethylene glycol) (PEG), có thể được ghép, tạo

phức, hoặc bị hấp thụ lên bề mặt của các hạt nano để tạo thành dạng vành, tạo nên sự

ổn định về không gian và hình thành nên các thuộc tính "tàng hình" như ngăn chặn sự

hấp thụ bề mặt của protein, qua đó làm tăng thời gian lưu thông trong dòng máu [11,

12].

Sự chức năng hóa có thể giải quyết các hạn chế lớn đối với các HDTNN như sự

hấp thụ protein. Nhờ sự chức năng hóa bề mặt các hệ phân phối thuốc nano copolyme

có những thuộc tính hơn hẳn so với các hệ phân phối thuốc nano polyme như thời gian

lưu thông trong máu lâu hơn, tránh được sự hấp thụ bề mặt do các protein huyết tương

gây ra, tránh được sự thủy phân do các enzyme. Mặt khác khi được chức năng hóa bề

mặt các hạt nano copolyme có thể gắn với các yếu tố hướng đích như các kháng thể,

protein, aptamer hoặc các phối tử tự nhiên như Folat để tăng khả năng bám đích của 10

các hệ nano copolyme mang thuốc trong chẩn đoán và điều trị ung thư, qua đó tăng khả

năng và hiệu quả điều trị của thuốc [13].

- Cấu trúc và chức năng HDTNN

+ Kết cấu theo chức năng

Hệ dẫn thuốc kích thước nano kết cấu lõi-vỏ với hạt nano copolyme được xác

định bởi hình thái và thành phần polyme của chúng (trong cấu trúc lõi-vỏ của các

copolyme), được trình bày ở Hình 1.2. Trong cấu trúc này, tác nhân chẩn đoán và điều

trị thường được liên hợp với các bề mặt của các hạt nano hoặc đóng gói và bảo vệ bên

trong lõi, tạo thành HDTNN kết cấu lõi-vỏ với phần lõi là các tác nhân theo dõi, chẩn

đoán và điều trị như các phân tử thuốc, các hạt nano từ, hạt nano vàng. Trong khi đó,

phần vỏ là các polyme giúp tăng khả năng và thời gian lưu thông máu, tăng khả năng

hướng đích, giảm tác dụng phụ, nâng cao khả năng theo dõi, chẩn đoán bằng hình ảnh

và tăng hiệu quả điều trị.

Hình 1.2. Các loại hạt nano nền polyme cấu trúc lõi-vỏ đặc trưng cho phân phối thuốc [7].

Các hệ dẫn thuốc nano được thiết kế để tích hợp các thành phần điều trị, chẩn

đoán hoặc theo dõi để đạt được khả năng nhắm đích mạnh hơn.

Hệ dẫn thuốc nano đa chức năng (Hình 1.3) với các thành phần vật liệu đặc trưng,

phần lõi là các tác nhân theo dõi, chẩn đoán và điều trị như các phân tử thuốc, các hạt

nano từ, hạt nano vàng,… được bao bọc bởi các polyme phân hủy sinh học như poly

(styrene), poly (methyl methacrylate), poly (hydrôxybutyrate), poly (D, L-lactide), poly

(L-lactide) và poly (D, L-lactide- đồng glycolide). Trong khi đó, phần vỏ là các polyme

tương thích sinh học như polyethylene glycol (PEG) giúp tăng khả năng và thời gian

lưu thông máu, tăng khả năng hướng đích [12].

Hình 1.3. Sơ đồ hệ dẫn thuốc nano đa chức năng [7].

HDTNN chứa hạt nano từ tăng tính tương phản hình ảnh MRI - là phù hợp hơn

cho các ứng dụng y sinh học trong cơ thể [14, 15]. Tuy nhiên, khi được tổng hợp, các

hạt nano vô cơ không phù hợp với môi trường sinh học do bề mặt kỵ nước hoặc những

hạn chế về độc tính. Do đó, một số phương pháp tạo lớp phủ đã được phát triển để nâng

cao tính tương thích sinh học của chúng, cải thiện sự ổn định trong dung dịch nước của 12

chúng và cung cấp các tính chất hóa học cho các phản ứng về sau với các phân tử sinh

học [16, 17].

+ Kích thước hệ dẫn thuốc

Các hệ dẫn thuốc kích thước micromet (10-6 m) gặp rất nhiều hạn chế như khả

năng bám đích kém do trọng lượng phân tử lớn, khả năng lưu thông và nhập bào bị hạn

chế do kích thước lớn (ở hai cơ chế chủ động và bị động) [18]. Đối với cơ chế chủ động,

hệ dẫn thuốc micromet do kích thước và trọng lượng phân tử lớn nên chúng khó bám

đích vì khó thắng được áp lực lưu thông của dòng máu nên dễ dàng bị cuốn trôi và tách

khỏi các tế bào đích [18]. Đối với cơ chế bám đích thụ động, kích thước của hệ dẫn

thuốc micromet lớn hơn nhiều so với kích thước các lỗ màng tế bào (thường < 0,2 μm)

nên khó thâm nhập vào tế bào, vì vậy chúng sẽ lưu thông theo dòng máu đến các cơ

quan bài tiết, đào thải ra khỏi cơ thể [12, 19].

Đối với các hạt nano đa chức năng (Hình 1.4) phẩm chất được quyết định bởi

kích thước phần lõi là chính, phần vỏ chủ yếu giúp hạt nano phân tán [11, 20]. Việc đặc

trưng kích thước hạt nano có nhiều phương pháp khác nhau, đối với các hạt nano có

phần lõi là các polyme rắn hoặc các loại polyme kỵ nước có thể đặc trưng bằng phương

pháp hiển vi điện tử quét FE-SEM có thể cho thông tin kích thước phần lõi hoặc đặc

trưng bằng phổ tán xạ ánh sáng động có thể cho kích thước tổng thể của hạt nano phân

tán trong môi trường nước. Đối với các hạt nano có phần lõi là các hạt nano kim loại

hoặc ôxit của chúng hoặc phức hợp có thể đặc trưng bằng phương pháp hiển vi điện tử

FE-SEM, TEM, nnnhieeux xạ tia X hoặc phổ tán xạ ánh sáng động. Việc kết hợp đặc

trưng kích thước hạt nano bằng phương pháp hiển vi điện tử và phổ tán xạ ánh sáng

động có thể cho thông tin về kích thước phần lõi và phần vỏ của hạt nano đa chức năng.

Kích thước hạt nano đặc trưng bằng phổ tán xạ ánh sáng động thường cho kích thước

lớn hơn so với đặc trưng bằng phương pháp FE-SEM, TEM.

Hình 1.4. Cấu trúc hệ dẫn thuốc đa chức năng với: A) Các hạt nano đa chức năng đơn giản với thuốc và/hoặc các liệu pháp được mang vào bên trong; B) Các hạt nano đa chức năng phức tạp bao gồm hạt nano ôxit sắt, hạt nano lõi silica – vỏ hạt vàng, hạt nano Gadolinium biến tính bề mặt gắn các phối tử hướng đích và đóng gói thuốc [7].

Khác với hệ dẫn thuốc micromet, HDTNN của nhiều vật liệu (polyme, kim loại,

chất bán dẫn) tạo lợi thế riêng biệt cho các ứng dụng in vivo. Do có kích thước nanomet

nên các HDTNN (từ 10 đến 200 nm) dễ dàng thắng áp lực lưu thông của dòng máu để

bám dính trên bề mặt và thâm nhập vào tế bào đích (bám đích chủ động), hoặc các

HDTNN do kích thước nhỏ hơn nhiều so với các lỗ màng tế bào nên chúng dễ dàng

thâm nhập vào tế bào (bám đích thụ động). Bên cạnh đó, HDTNN còn thể hiện nhiều

ưu điểm khác như tăng khả năng lưu thông và nhập bào, tăng diện tích bề mặt và hiệu

ứng lượng tử, điện tử, từ trường và cấu trúc mới [12].

Các hệ dẫn thuốc nano có kích thước thủy động học từ 10 đến 100 nm được xem

là tối ưu và có thể lưu thông trong nhiều giờ và thoát mạch hoặc khuếch tán vào các mô

bị bệnh bởi một cơ chế nhắm đích thụ động [18]. Gần đây, các hạt nano nhắm đích

được chức năng hóa với các phối tử có ái lực và tính đặc hiệu cao đã được chứng minh

là có hiệu quả tích lũy trong các mô cụ thể và tăng đáng kể hiệu quả điều trị của các

HDTNN [18, 20]. Kích thước của các hệ dẫn thuốc thích hợp cho mục đích nhập bào

nằm trong vùng từ 10 đến 200 nm [12, 19].

- Các vật liệu bảo đảm các chức năng hệ dẫn thuốc nano

+ Vật liệu cho chức năng thích ứng môi trường sinh hóa

Hệ dẫn thuốc nano cấu trúc lõi-vỏ, với phần lõi là các polyme phân hủy sinh học

và phần vỏ là các polyme tương thích sinh học được thiết kế để mang một tải trọng

thuốc hoặc các tác nhân chẩn đoán và điều trị, cung cấp hoặc giải phóng kiểm soát hoặc

giải phóng kích hoạt các phân tử điều trị bằng cơ chế nhắm đích thụ động hoặc chủ

động thông qua các yếu tố nhắm đích (peptide, aptamer, kháng thể/đoạn kháng thể,

phân tử nhỏ) được chức năng hóa và gắn trên bề mặt hệ dẫn thuốc.

Hệ dẫn thuốc nano được chức năng hóa bởi polyme ưa nước polyethylene glycol

(PEG) có thể được ghép, tạo phức, hoặc hấp thụ lên bề mặt của các hạt nano để tạo

thành dạng vành (vỏ), tạo nên sự ổn định về không gian và hình thành nên các thuộc

tính "tàng hình" như ngăn chặn sự hấp thụ bề mặt của protein [11].

+ Vật liệu cho chức năng hóa trị liệu

Một số phân tử thuốc kháng ung thư bao gồm β-Cyclodextrin, Doxorubicin,

Dopamine và Curcumin đã được sử dụng trong điều trị hoặc hỗ trợ điều trị ung thư [21-

23].

Trong các loại thuốc nêu trên, Curcumin được xem như một dược chất kháng

ung thư tiềm năng có nguồn gốc thiên nhiên nhờ những đặc tính ưu việt của chúng.

Curcumin: thuốc kháng ung thư tiềm năng

Curcumin (Cur) hoặc Diferuloylmethane (Hình 1.5) là một polyphenol màu vàng

chiết xuất từ thân rễ của củ nghệ (Curcuma longa), một loài cây trồng phổ biến ở vùng

nhiệt đới Đông Nam Châu Á và Ấn Độ [24]. Trong nhiều thế kỷ, nghệ đã được sử dụng

như một loại gia vị và màu thực phẩm tại Ấn Độ, Việt Nam và một số nước khác, cũng

như một tác nhân trị liệu trong y học truyền thống Ấn Độ và Việt Nam. Curcumin là

một tác nhân chống ung thư được phát triển dựa trên các bằng chứng dịch tễ học, cho

thấy mối tương quan giữa chế độ ăn uống giàu bột nghệ và giảm tỷ lệ bệnh ung thư 15

niêm mạc đường tiêu hóa [25, 26]. Curcumin là tác nhân đã được nghiên cứu rộng rãi

đối với các hoạt động dược lý bao gồm chống ung thư, chống viêm, chống ôxy hóa,

chống loét, điều hòa miễn dịch , chữa lành vết thương, bảo vệ thần kinh, và các hiệu

ứng chống lão hóa [27, 28]. Curcumin cũng đã được chứng minh là chất có nhiều thuộc

tính ưu việt trên mà không tác dụng gây độc tế bào trên các tế bào khỏe mạnh [29]. Nó

cũng cho thấy hiệu quả ngăn ngừa ung thư đáng kể so với khối u ác tính khác nhau

chẳng hạn như ung thư vú, ung thư cổ tử cung, ung thư đại tràng, ung thư dạ dày, ung

thư gan, ung thư biểu mô tế bào biểu mô, ung thư tuyến tụy[30].

Hình 1.5. Cấu trúc Curcumin

Cơ chế kháng ung thư của Curcumin

Một số nghiên cứu đã cho thấy rằng chất Curcumin gây chết tế bào tự hủy trong

các tế bào ác tính [31]. Các cơ chế chính xác gây chết tế bào của Curcumin vẫn còn

được xác định, với vai trò của các họ protein Bcl-2 (protein gây chết tế bào tự hủy)[32].

Ngoài ra, còn có bằng chứng cho thấy Curcumin có thể gây chết đối các tế bào

có khả năng kháng sự chết rụng của tế bào [33]. Một số nghiên cứu đã cho thấy rằng

Curcumin gây ra sự bắt giữ trong các pha G2/M (G2- pha trống 2, M-pha nguyên phân)

của chu kỳ tế bào, cùng với sự gián đoạn phân bào chính thức, các khuyết tật trong sự

phân bào và sự tạo thành vi hạt [33, 34]. Gần đây hơn, điều trị bằng Curcumin đã được

báo cáo là gây chết rụng tế bào ác tính [35].

Mặc dù Curcumin là một hợp chất hiệu quả và an toàn cho điều trị ung thư, điều

đó không có nghĩa là chúng được chấp nhận là một "thuốc chữa bách bệnh". Lý do quan

trọng nhất là sinh khả dụng của Curcumin giảm khi sử dụng qua đường uống [36]. Vì

vậy, việc phát triển hệ nano copolyme PLA-PEG với các thành phần khác nhau sử dụng

cho mục đích mang Curcumin và gắn yếu tố hướng đích Folat tạo thành hệ nano mang

thuốc hướng đích Fol-PLA-PEG/Cur sẽ có thể giải quyết nhiều hạn chế của Curcumin.

Ở Việt Nam

Cho đến nay đã có nhiều nhóm nghiên cứu ứng dụng Curcumin đã được nano

hóa trong các lĩnh vực dược, y sinh, điều trị ung thư đã và đang phát triển rất mạnh,

trong đó các nhóm nghiên cứu thuộc các đơn vị khác nhau như Viện Khoa học vật liệu,

Viện Hóa học, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên thuộc Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam được xem là những nhóm đi tiên phong ở Việt Nam trong việc

nghiên cứu và ứng dụng nano Curcumin trong các lĩnh vực nêu trên.

+ Vật liệu cho chức năng lý trị liệu

Hệ dẫn thuốc nano ngoài chức năng mang, giúp phân tán và lưu thông các dược

chất (thuốc) trong môi trường sinh lý tốt hơn, chúng còn có thể mang (bọc) các tác nhân

lý trị liệu khác nhau như hạt nano vàng, hạt nano từ, tác nhân phóng xạ, v.v. .

Hệ hạt vàng:

Hạt nano vàng được sử dụng rộng rãi như vật liệu ưa thích trong nhiều lĩnh vực

do tính chất quang học và vật lý độc đáo của chúng, chẳng hạn như dùng hiệu ứng dao

động plasmon bề mặt để đánh dấu, chụp hình, và làm cảm biến.

Hạt nano vàng có thể kết hợp được với nhiều tác nhân như polyme, phối tử,

thuốc, DNA, RNA, protein, peptide và các oligonucleotide. Việc sử dụng các hạt nano

vàng và sự chức năng hóa bề mặt với một loạt các phân tử sẽ mở rộng và nâng cao khả

năng ứng dụng các hạt nano vàng để điều trị quang nhiệt với ưu thế giảm tác động gây

độc tế bào trong điều trị các bệnh ung thư khác nhau, liệu pháp gen và nhiều bệnh khác

[37, 38].

Trong vài năm qua, việc sử dụng hạt nano vàng tập trung vào việc khám phá các

đặc tính độc đáo của chúng như chẩn đoán hình ảnh và các ứng dụng điều trị. Gần đây,

hạt nano vàng đã được sử dụng như làm chất nền cho việc phân phối thuốc có hiệu quả

và hướng đích bằng cách đánh dấu hạt nano vàng với các chất mang sinh học và y sinh

học [39, 40].

Hiện nay, các nghiên cứu tập trung vào các phương pháp tổng hợp hạt nano vàng,

từ những keo nano hạt vàng hình cầu, thanh nano, hoặc vỏ silica bọc lõi nano vàng, hạt 17

nano dạng ngôi sao, v.v. [41, 42]. Các phương pháp chức năng hóa bề mặt hạt nano

vàng đã được phát triển và sử dụng trong các ứng dụng y sinh học khác nhau, chẳng

hạn như tạo phức hợp giữa hạt nano vàng và đầu dò phân tử, bao gồm các kháng thể

đơn dòng và đa dòng, oligonucleotide, DNA, enzyme, và các loại thuốc ứng dụng trong

chẩn đoán và điều trị [43, 44].

Hệ hạt từ:

Hạt nano từ với kích thước, thành phần, cấu trúc và tính chất lý hóa khác nhau

có thể được sử dụng để sàng lọc và phân tách dòng tế bào, tăng độ tương phản ảnh cộng

hưởng từ hạt nhân (MRI), dẫn truyền thuốc hay tăng nhiệt cục bộ trong nhiệt từ trị [45,

46].

Hạt nano sắt từ Fe3O4 nhờ có thành phần không độc hại nên đến nay vẫn là hệ

chất được nghiên cứu ứng dụng nhiều nhất trên thế giới. Tùy từng ứng dụng cụ thể khác

nhau với những yêu cầu đặc thù riêng, các hạt từ quan tâm ứng dụng y sinh có kích

thước nằm trong giải từ vài nm đến cỡ 100 nm. Trong thực tế, kích thước hạt càng to

việc bọc các hạt từ bằng các chất làm chức năng bảo vệ (tăng độ bền) càng khó, trái lại

hạt từ có kích thước càng to thì việc tách tuyển từ càng dễ; mặt khác về tính chất hấp

phụ thì hạt càng bé độ hấp phụ càng lớn do diện tích bề mặt của chúng lớn [47-49].

Ở Việt Nam, việc tổng hợp hạt nano từ cho mục đích ứng dụng y sinh cũng đã

được quan tâm nghiên cứu ở một số cơ sở như: Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội, Trường

ĐH Khoa học Tự nhiên Hà Nội, Viện Khoa học Vật liệu (KHVL), Viện Vật lý Tp Hồ

Chí Minh, v…v.

+ Vật liệu cho chức năng chẩn đoán hình ảnh

Các hệ dẫn thuốc nano với khả năng phân phối thuốc trong phạm vi liều dùng tối

ưu, thường dẫn đến tăng hiệu quả điều trị của thuốc, giảm tác dụng phụ. Các hạt nano

với đặc tính tự lắp ráp, ổn định, độ đặc hiệu, đóng gói thuốc và tăng độ tương phản hình

ảnh đã được sử dụng trên lâm sàng để phân phối mô đích của các liệu pháp hóa trị, cải

thiện sinh khả dụng của thuốc, tăng hiệu lực thuốc trong mô đích và chẩn đoán bệnh

[45, 50].

Sự phát triển liên tục của các tác nhân phân phối thuốc nano, trị liệu và hình ảnh

trong chẩn đoán và điều trị ung thư cho thấy tiềm năng cho sự phát triển của các hạt

nano đa chức năng kết hợp một số đặc tính thành một hệ thống nano duy nhất. Các hệ

thống đa chức năng có thể có khả năng phát hiện các tế bào ung thư ác tính trong cơ

thể, giết chết các tế bào ung thư với ít tác dụng phụ với tế bào bình thường (phân phối

thuốc nhắm đích hoặc giải phóng thuốc kiểm soát) và nâng cao hiệu quả điều trị.

Kỹ thuật hình ảnh như MRI, PET và CT là rất quan trọng trong việc chẩn đoán

các bệnh khác nhau. Mỗi phương thức hình ảnh có những ưu và nhược điểm riêng của

nó, và một kỹ thuật đơn lẻ không có được tất cả các tính năng cần thiết cho hình ảnh

toàn diện. Do đó, phương pháp chẩn đoán hình ảnh phối hợp đa kỹ thuật đang trở thành

công cụ quan trọng cho nghiên cứu y sinh học. Tác nhân tương phản với sự hỗ trợ của

nhiều kỹ thuật hình ảnh khác nhau có thể cải thiện việc chẩn đoán và điều trị các bệnh

ở giai đoạn sớm nhất bằng cách cung cấp dữ liệu toàn diện hơn cho các chẩn đoán lâm

sàng [51].

Ví dụ, đầu dò hai chế độ MRI-Quang bao gồm một loại thuốc nhuộm huỳnh

quang silica pha tạp lõi được bao quanh bởi các hạt nano từ tính có thể phát hiện các tế

bào ung thư não bằng MRI cùng với thông tin tế bào thông qua ảnh huỳnh quang [51].

Hạt nano từ tính cũng có thể được kết hợp với tác nhân phóng xạ để xây dựng MRI-

PET dò đa chiều [52], nhờ đó có thể phát hiện chính xác các tế bào ung thư trong các

hạch bạch huyết. Hệ thống sử dụng các hạt nano từ tính biến đổi với các đầu dò huỳnh

quang và phân tử sinh học cũng có thể theo dõi biểu hiện gen và các dấu hiệu khác

trong nghiên cứu điều trị tế bào [53].

+ Vật liệu cho chức năng bám đích

Hoạt động hướng đích của các hạt nano liên quan đến việc tạo phức của các phối

tử nhắm đích với các hạt nano, hoặc sử dụng từ trường ngoài để điều khiển các hạt

nano, đặc biệt là các hạt nano từ tính định vị tại các vị trí đích, hoặc dựa vào đặc tính

cấu tạo màng tế bào có thể thực hiện các hoạt động nhắm đích [4, 54].

Nhắm đích thụ động: Nhắm đích thụ động liên quan đến sự tích tụ của chất

mang thuốc hoặc bản thân thuốc đến tế bào đích do các yếu tố lý hóa hoặc dược lý [51].

Ví dụ, sự hấp thụ các hạt nano trên tế bào Kupffer của gan. Tuy nhiên, trong những

trường hợp nhất định liên quan đến những thay đổi cấu trúc tế bào do các bệnh lý cụ

thể cũng có thể được khai thác để thực hiện phương pháp nhắm đích thụ động các hạt

nano đến mô bệnh. Ví dụ, các mô bình thường có các thành mạch liên tục, chặt chẽ, với

kích thước các lỗ màng tế bào dao động từ 10 - 50 nm [13], các hạt nano trong phạm vi

kích thước này sẽ thoát ra từ mạch máu vào mạch bạch huyết, đến các hạch bạch huyết

và đến các tế bào đích [55]. Tuy nhiên, đối với các mô bệnh do sự thay đổi cấu trúc tế

bào liên quan đến bệnh lý, kích thước lỗ màng tế bào có thể mở rộng trong khoảng từ

100 - 400 nm, tạo điều kiện thuận lợi để các hạt nano co kích thước trong phạm vi này

thoát mạch và tích tụ trên các tế bào đích [56].

Nhắm đích chủ động: Ngoài việc nhắm đích thụ động, việc phân phối các

hạt nano hoặc hệ nano mang thuốc đến khối u rắn và các tế bào di căn có thể thực hiện

bằng cách nhắm đích chủ động, với việc chức năng hóa bề mặt các hạt nano bởi các

yếu tố hướng đích. Các hạt nano hoặc hệ nano mang thuốc có thể nhắm đích tế bào,

khối u rắn theo nguyên tắc ổ khóa – chìa khóa nhờ các thụ cảm thể đặc hiệu có trên bề

mặt các loại tế bào khác nhau, ví dụ kháng thể đơn dòng kháng CD33 khi được tiêm và

cơ thể chúng sẽ lưu thông theo dòng máu và gắn đặc hiệu trên bề mặt tế bào ung thư vú

người HER-2 [57].

Hiện nay, các hệ dẫn thuốc được chức năng hóa với các phối tử nhắm đích khác

nhau. Với mục tiêu cung cấp một liều điều trị cao đến các mô hoặc tế bào cụ thể, kiểm

soát số lượng phối tử nhắm đích trên bề mặt của các hạt nano để tăng tính đặc hiệu và

ái lực liên kết thông qua cơ chế gắn kết đặc hiệu giữa phối nhắm đích với các thụ cảm

thể trên bề mặt tế bào đích [58, 59]. Gần đây, Davis và cộng sự [13], đã chứng minh

tác động điều trị của sự phân phối khác biệt giữa phạm vi nội bào và ngoại bào của khối

u. Hạt nano trên nền Cyclodextran chứa phối tử nhắm đích transferrin (hạt nano kích

thước khoảng 70 nm) cho thấy tăng cường tích tụ nội bào trong khối u.

Trong hoạt động nhắm đích chủ động, đối với các hạt nano từ có thể sử dụng từ

trường ngoài xoay chiều như một lực tác động có khả năng điều khiển và định vị các

hạt nano từ tại vị trí đích, giúp thực hiện các phương pháp chẩn đoán hình ảnh và điều

trị đạt hiệu quả cao hơn [52].

1.1.3. Các loại polyme nghiên cứu ứng dụng

- Liposome: đã được sử dụng như các hạt mang thuốc tiềm năng với những lợi

thế riêng của chúng như khả năng bảo vệ thuốc tránh bị đào thải sớm, nhắm đích đến

các vị trí cụ thể và làm giảm độc tính hoặc tác dụng phụ [55]. Tuy nhiên, việc thiết kế

các liposome có một số hạn chế như hiệu quả đóng gói thấp, rò rỉ nhanh chóng đối với

thuốc tan trong nước khi có sự hiện diện của các thành phần trong máu và khó bảo

quản.

- Polyme phân hủy sinh học: so với liposome, polyme phân hủy sinh học (polyme

tự nhiên, polyme dendrit, copolyme) cung cấp một số lợi thế cụ thể hơn liposome, giúp

tăng độ ổn định của thuốc/protein và những thuộc tính giải phóng được kiểm soát hữu

ích.

Những lợi thế của các hệ phân phối thuốc polyme phân hủy sinh học và tương

thích sinh học [56] so với các dạng truyền thống bao gồm: (1) cải thiện hiệu quả điều

trị và độc tính giảm; (2) liều lượng thấp nhưng hiệu quả cao hơn; (3) giảm số lần dùng

thuốc; (4) khả năng ổn định thuốc tăng và bảo vệ chống lại sự phân hủy do thủy phân

hoặc enzyme; (5) không cần phẫu thuật để loại bỏ các polyme phân phối thuốc do chúng

tự phân hủy.

Lợi thế chính của hệ thống phân phối thuốc polyme là thuốc bọc trong chất nền

polyme và không làm thay đổi dược tính của thuốc, do đó tác dụng sinh học, khả năng

hấp thu, phân bố, chuyển hóa và bài tiết sau khi thuốc được giải phóng từ polyme là

giống như của các thuốc truyền thống [55]. Hơn nữa, thuộc tính giải phóng thuốc có

thể được điều chỉnh bằng cách kiểm soát các thông số thích hợp khi điều chế hoặc tổng

hợp.

1.1.4. Copolyme phân hủy sinh học PLA-PEG

- Polyme PLA

Polyme phân hủy sinh học được sử dụng để thiết kế các hệ phân phối thuốc kích

thước nano với những đặc tính ưu việt hơn so với các hệ phân phối thuốc truyền thống

như kiểm soát giải phóng thuốc, tự phân hủy và không gây độc sau khi sử dụng, giảm

liều dùng và sự phụ thuộc của bệnh nhân vào thuốc được cải thiện [60]. Trong số các

polyme phân hủy sinh học phải kể đến polylactic axit (PLA), poly(lactic-co-glycolic)

(PLGA), … đã được cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ (FDA) cho phép ứng

dụng trong dược phẩm và lưu hành trên thị trường [61].

Polylactic axit (PLA) là polyme phân hủy sinh học có nguồn gốc tự nhiên, không

gây độc cho cơ thể, sản phẩm sau khi phân hủy PLA là các monome (lactic axit), là

thành phần thiết yếu được sử dụng trong quá trình tái tạo tế bào mới trong cơ thể người

và động vật [60].

Tuy nhiên, ngoài những đặc tính ưu việt trên các hệ nano polyme phân phối thuốc

vẫn có những hạn chế như dễ bị đào thải bởi các thực bào (đơn nhân và đa nhân), các

tế bào của hệ lưới nội mô, sự tập trung của các protein trên bề mặt hạt nano như

apolipoproteins (các protein kết hợp với lipid để tạo lipoprotein tham gia vào quá trình

vận chuyển lipid) và protein C3 (một loại protein trong hệ thống miễn dịch), qua đó

làm giảm đáng kể thời gian lưu thông máu của các hạt nano [60].

Do đó, việc chức năng hóa bề mặt polyme phân hủy sinh học như PLA bởi PEG

(polyethylene glycol) để cải thiện những hạn chế của polyme phân hủy sinh học là rất

quan trọng.

- Polyme PEG

PEG là một oligome ưa nước có thể được hấp thụ hoặc gắn liền với bề mặt của

các hạt nano [62]. Polyethylene glycol (PEG) có độc tính thấp, không gây miễn dịch và

được sự chấp thuận của Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm (FDA) cho sử dụng

lâm sàng. Hợp chất PEG-thuốc hoặc các hạt nano được chức năng hóa với chuỗi PEG

đã được mô tả như các hệ thống phân phối thuốc lưu thông lâu dài có tiềm năng ứng

dụng cho hệ thống quản lý thuốc [3, 63].

PEG làm giảm đáng kể sự tương tác không đặc hiệu với protein, tránh sự đào

thải của các thực bào, các tế bào của hệ lưới nội mô, đồng thời tăng khả năng phân tán

trong nước, qua đó tăng đáng kể khả năng lưu thông trong máu. Vì vậy, hạt nano

copolyme PLA-PEG được nghiên cứu tổng hợp và chế tạo hệ nano copolyme PLA-

PEG mang thuốc hướng đích nhằm cải thện các hạn chế của polyme phân hủy sinh học

PLA.

Bazile và cộng sự [64], đã chứng minh sự hình thành của hạt nano PLA-PEG

trong một cấu trúc lõi-vành với một lõi rắn và chuỗi PEG neo trên bề mặt. Kết quả của

họ cho thấy lần đầu tiên chuỗi PEG gắn liền với một bề mặt hạt, tương tự như polyme

PEG tự do hòa tan trong nước. Hơn nữa, PEG đã được chứng minh là làm giảm đáng

kể sự tương tác không đặc hiệu với protein thông qua sự thủy phân của chúng và sự

hoạt hóa bổ sung [64, 65]. Chiều dài chuỗi, hình dạng và mật độ của PEG trên bề mặt

hạt đã thể hiện được các thông số chính ảnh hưởng đến tính ưa nước của hạt nano và

thực bào. Các cơ chế tham gia vào thực bào của các hạt nano là thụ quan trung gian bởi

sự tương tác của các protein cụ thể được hấp thụ trên bề mặt của các hạt nano với thực

bào.

Gref và cộng sự [57], là người đầu tiên báo cáo những lợi thế của sự PEG hóa

trên hạt nano PLGA-PEG, dẫn đến một sự gia tăng đáng kể trong thời gian lưu trú trong

máu giảm đáng kể sự hấp thụ protein, đặc biệt là apolipoproteins và bổ sung cho protein

C3 kể trên bề mặt của các hạt nano PLA-PEG so với PLA tinh khiết. Gref và cộng sự

đã nghiên cứu một cách hệ thống các tác động của độ dài chuỗi PEG trong việc ngăn

chặn sự hấp thụ protein trên bề mặt của các hạt nano. Kết quả cho thấy một khối lượng

phân tử trong phạm vi tối ưu (từ 2 đến 5 kDa) đã làm giảm sự hấp phụ của protein huyết

tương. Lượng protein hấp thụ vào PLA-PEG 5 kDa được giảm đáng kể (~80%) so với

số lượng của các hạt nano PLA không xử lý. Lượng PEG thấp hơn 0,5% trọng lượng

trên bề mặt của các hạt nano đã giảm đáng kể lượng protein hấp thụ bề mặt khi so sánh 23

với các hạt nano PLA tinh khiết. Hiệu quả của việc gắn PEG trên bề mặt của các hạt

nano trong việc ngăn chặn sự hấp thụ protein tương quan với sự hấp thụ các bạch cầu

đa nhân (PMN – polymorphonuclear leukocytes) và bạch cầu đơn nhân (mononuclear).

Kể từ đó, nhiều nhóm nghiên cứu đã khảo sát sự tương tác của các hạt nano polyme với

các opsonin (các phân tử tăng cường thực bào) huyết thanh, đặc trưng cho cả hai cơ chế

hấp thu và động học [18, 20].

Tương tự như vậy, Fang và cộng sự [66], gần đây đã cho thấy tác động của khối

lượng phân tử của PEG để nhắm mục tiêu thụ động của các hạt nano tàng hình

poly(cyanoacrylate-co-n-hexadecyl) cyanoacrylate (PHDCA). Như trong các nghiên

cứu trước đó, thay đổi bề mặt PEG của các hạt nano đã có thể làm giảm đáng kể sự hấp

thụ protein như được phát hiện bằng cách sử dụng các xét nghiệm định lượng (BCA

assay). Kết quả cho thấy sự che chắn PEG dày đặc trên một bề mặt tích điện âm đóng

vai trò quan trọng trong việc ngăn ngừa sự hấp thụ protein. Nhìn chung, các hạt nano

đã được PEG hóa được tìm thấy có thời gian lưu thông dài hơn và mức độ tích lũy khối

trong u cao hơn các hạt nano không được PEG hóa.

Hiệu quả của các PEG trong việc thay đổi sự phân bố sinh học của các hạt nano

đã được chứng minh rõ ràng, các nghiên cứu in vivo cho thấy sự gia tăng mạnh mẽ thời

gian lưu thông máu với sự gia tăng mật độ bề mặt PEG. Nó cũng rõ ràng là các khác

biệt hóa lý tương đối nhỏ có ý nghĩa sinh học quan trọng trong sự phân bố sinh học của

các hạt nano. Các hạt nano được PEG hóa có kích thước từ 10 đến 100 nm có thể vẫn

còn trong lưu thông trong nhiều giờ và thoát mạch hoặc khuếch tán vào các mô bị bệnh

bởi một cơ chế nhắm đích thụ động. Gần đây, các hạt nano nhắm đích được chức năng

hóa với các phối tử có ái lực và tính đặc hiệu cao đã được chứng minh là có hiệu quả

tích lũy trong các mô cụ thể và tăng đáng kể hiệu quả điều trị của các hệ thống phân

phối thuốc nano lưu thông lâu [18, 20, 66].

- Tổng hợp copolyme PLA-PEG

Copolyme PLA-PEG có thể được tổng hợp bằng phản ứng mở vòng trùng ngưng

axit lactic với polyethylene glycol tạo thành block copolyme PLA-PEG (Hình 1.6) với 24

sự có mặt của muối thiếc II (Sn(Oct)2) [67] đóng vai trò như xúc tác tạo thành copolyme

PLA-PEG với các tỷ lệ thành phần PLA:PEG khác nhau ảnh hưởng đến kích thước và

khả năng mang thuốc của hạt nano được quan tâm trong đã được chúng tôi quan tâm

và nghiên cứu. Hợp phần kỵ nước (PLA) đóng một vai trò rất quan trọng đối với kích

thước của hạt nano khi chúng tạo thành mixen phân tán trong môi trường phân cực như

môi trường nước hoặc môi trường sinh lý, khi đó kích thước của chúng do phần lõi kỵ

nước quyết định là chủ yếu [68]. Mặt khác, hợp phần kỵ nước PLA cũng đóng vai trò

hết sức quan trọng đối với khả năng mang các loại thuốc kỵ nước của hệ nano copolyme

PLA-PEG, khi đó thuốc sẽ liên kết với hợp phần kỵ nước PLA của hệ copolyme PLA-

PEG bằng lực liên kết kỵ nước [69] và kẹt trong chất nền kỵ nước PLA và giúp các loại

thuốc kỵ nước phân tán trong môi trường phân cực. Trong khi đó, hợp phần ưa nước

PEG giúp hệ nano copolyme PLA-PEG phân tán tốt trong môi trường phân cực và tăng

tính tương thích sinh học của hệ.

Vì vậy, việc tổng hợp hệ nano copolyme PLA-PEG phân phối thuốc với các tỷ

lệ thành phần PLA:PEG khác nhau, trên cơ sở đó đánh giá khả năng mang thuốc, khả

năng tương thích sinh học và khả năng nhập bào của hệ nano copolyme PLA-PEG mang

thuốc hướng đích đóng một vai trò rất quan trọng.

Trong nghiên cứu của chúng tôi, copolyme PLA-PEG với các tỷ lệ thành phần

về trọng lượng giữa PLA và PEG khác nhau được tiến hành tổng hợp nhằm đánh giá

ảnh hưởng của các hợp phần PLA và PEG đến kích thước, khả năng mang thuốc cũng

như khả năng tương thích sinh học của hệ nano copolyme PLA-PEG mang thuốc hướng

đích. Theo đó, copolyme PLA-PEG với các tỷ lệ thành phần PLA:PEG khác nhau được

tổng hợp thông qua phản ứng mở vòng trùng ngưng giữa monome của axit lactic và

polyethylene glycol (PEG) với sự có mặt của xúc tác Tin (II) 2-ethylhexanoate.

Hình 1.6. Sơ đồ tổng hợp copolyme PLA-PEG bằng phương pháp trùng ngưng mở vòng polyme 25

Copolyme PLA-PEG sau khi tổng hợp được kết hợp với các phân tử thuốc (Cur)

tạo thành hệ dẫn thuốc nano, gắn yếu tố hướng đích tạo thành hệ dẫn thuốc nano hướng

đích hoặc kết hợp với hạt nano từ tạo thành hệ dẫn thuốc nano từ tính với những tính

chất nổi bật ứng dụng trong y sinh.

1.2. Hệ dẫn thuốc nano từ tính

1.2.1. Hạt nano từ

- Cấu trúc

Khi kích thước các hạt của vật liệu từ tính giảm đến giá trị nào đó (khoảng vài

chục nanomet) sẽ trở thành vật liệu siêu thuận từ thể hiện những tính chất đặc biệt [45].

Fe3O4 là hợp chất ôxít phổ biến của nguyên tố sắt, vật liệu này thuộc họ ferrite

spinel có hai phân mạng từ không tương đương và tương tác giữa các phân mạng là

phản sắt từ. Vật liệu Fe3O4 có cấu trúc spinel đảo.

2-.

Công thức phân tử: FeO. Fe2O3 = Fe. Fe2O4,

Mô hình ion: [Fe3+]A[ Fe3+Fe2+]B O4

Các ion Fe3+, Fe2+ có bán kính ion nhỏ hơn sẽ phân bố trong khoảng trống giữa

các ion O2-, các ion O2- hình thành nên mạng lập phương tâm mặt với hằng số mạng a

= 8,398 Ǻ. Ion Fe2+ chiếm 1/4 ở vị trí bát diện và ion Fe3+ chiếm 1/8 ở vị trí tứ diện và

1/4 ở vị trí bát diện. Cấu trúc này được mô tả như trên Hình 1.7, trong đó một ô mạng

8 Fe3+

cơ sở bao gồm 8 ô đơn vị và công thức Fe24O32 phân bố như sau: Fe3+ 8A[ Fe2+

]BO32, trong đó A là vị trí tứ diện, B là vị trí bát diện [70].

Hình 1.7. Cấu trúc tinh thể của Fe3O4

- Các tính chất khả dụng y sinh

Trong các loại vật liệu nano y sinh, các hạt nano từ tính (Magnetic Nanoparticles

– MNPs) chiếm một vị trí rất quan trọng, nhờ lợi thế về khả năng tương tác của chúng

đối với từ trường ngoài các hạt nanô từ tính có một số tiềm năng ứng dụng rộng rãi

trong y sinh như: (i) Tách chiết các tế bào và các thực thể sinh học, (ii) Dẫn truyền

thuốc, gen và các tác nhân phóng xạ tới những vùng bệnh nằm sâu trong cơ thể, (iii)

Tăng cường độ tương phản trong chẩn đoán cộng hưởng từ hạt nhân, và (iv) Nhiệt trị

điều trị ung thư [50]. Hai ứng dụng đầu dựa trên nguyên lý hình thành lực khi từ trường

ngoài tác động lên hạt nano từ có từ độ đáng kể [71]. Theo yêu cầu sử dụng chính trong

luận án này, dưới đây sẽ giới thiệu kỹ hơn về hai ứng dụng (iii) và (iv): ứng dụng hạt

nano từ Fe3O4 trong tăng cường ảnh cộng hưởng hạt nhân MRI, và hiệu ứng đốt nóng

cảm ứng từ (MIH) dùng cho nhiệt từ trị.

- Chức năng chẩn đoán hình ảnh

Khi được định vị trong môi trường sinh học, các hạt nano từ có thể tạo sự nhiễu

loạn từ trường cục bộ do đó ảnh hưởng đến tốc độ hồi phục từ trong các mô chứa nước.

Vì vậy, chúng được nghiên cứu kỹ và được sử dụng như một tác nhân tăng độ tương

phản ảnh cộng hưởng từ hạt nhân MRI trong chẩn đoán lâm sàng [71, 72].

Cơ sở của việc chụp ảnh cộng hưởng từ là dựa trên tín hiệu hồi phục spin của các

proton trong các phân tử nước có trong các mô sinh học khi bị kích thích bởi các chuỗi

xung tần số vô tuyến điện dưới tác dụng của từ trường ngoài cố định (B0) [73, 74].

Nguyên lý của kỹ thuật chụp ảnh cộng hưởng từ có thể được trình bày tóm tắt như trong

Hình 1.8.

Khi chịu tác động của từ trường cố định B0, spin của các proton sẽ định hướng

theo từ trường B0 và quay quanh trục từ trường với một tần số góc không đổi ω0 (là tần

số Larmor, Hình 1.8 a) có giá trị phụ thuộc vào cường độ từ trường B0 theo biểu thức:

(1.1) ω0 = γB0

với γ là một hằng số.

Spin của các proton sẽ bị kích thích và dẫn đến lệch khỏi hướng B0 ban đầu. Khi

áp vào một từ trường xoay chiều có tần số radio theo phương vuông góc với B0 (hình

chiếu của mômen từ lên phương của từ trường cố định (Mz) giảm xuống, trong khi hình

chiếu của nó lên mặt phẳng vuông góc với từ trường ngoài cố định, (Mxy) tăng lên. Sau

khi ngắt từ trường xoay chiều, năng lượng kích thích được giải phóng thông qua 2 quá

trình trao đổi năng lượng spin - mạng và spin – spin, được xác định bởi thời gian hồi

phục tương ứng là T1 và T2 (Hình 1.8 c, d), các proton sẽ trở về trạng thái định hướng

và năng lượng ban đầu của chúng. Quá trình hồi phục phụ thuộc vào hai thông số, đó

là thời gian hồi phục dọc T1 và thời gian hồi phục ngang T2, cho bởi công thức:

(1.2)

(1.3)

Mz là hình chiếu của mômen từ spin lên phương từ trường B0 (trục z),

Mxy là hình chiếu lên mặt phẳng vuông góc với B0 (mặt phẳng xy),

t là thời gian và φ là hằng số pha,

T1 đặc trưng cho sự giải phóng năng lượng ra môi trường xung quanh,

T2 đặc trưng cho sự lệch pha của proton với từ trường xoay chiều, thời gian T2

thường ngắn hơn T1 [74].

Mặc dù mômen từ của một proton rất nhỏ (1,5x10-3 Magneton Bohr) nhưng trong

cơ thể động vật có một lượng rất lớn proton (số hạt nhân nguyên tử hydro của phân tử

nước trong cơ thể (6,6x1019) nên có thể tạo ra một hiệu ứng có thể đo được [73].

Ảnh cộng hưởng từ chụp được dựa trên các quá trình hồi phục của proton, cường

độ của tín hiệu có xu hướng tăng tỉ lệ nghịch của thời gian hồi phục dọc (1/T1 hay còn

gọi là tốc độ hồi phục R1) và giảm cũng tỉ lệ nghịch với thời gian hồi phục ngang (1/T2

hay tốc độ hồi phục R2).

Hình 1.8. Nguyên lý của chụp ảnh cộng hưởng từ: a) spin của các proton của phân tử nước quay tròn dưới sự tác dụng của từ trường ngoài B0 với tần số Larmor (ω0); b) sau khi áp dụng từ trường xoay chiều tần số radio (RF) có hướng vuông góc với B0 spin proton sẽ bị kích thích và lệch khỏi hướng ban đầu; c) thời gian phục hồi dọc T1; d) thời gian phục hồi ngang T2 [74].

Xuất phát từ sự khác biệt về thời gian hồi phục của của proton kết hợp với môi

trường của từng loại mô, sự khác biệt tín hiệu giữa các vùng khác nhau trong cơ thể tạo

nên sự tương phản trong hình ảnh cộng hưởng từ. Các hạt nano từ khi vào cơ thể, nếu

tích tụ tại các vị trí bị tổn thương hoặc tại vị trí các khối u sẽ làm thay đổi từ trường cục

bộ ở những nơi có hạt nano từ (lúc này từ trường cục bộ bằng tổng của B0 và từ trường

do các hạt nano gây ra) dẫn đến sự thay đổi thời gian hồi phục T1 và T2 của spin của

các proton và do đó làm thay đổi độ tương phản trên ảnh cộng hưởng từ [74]. Trong

khoảng 2 thập kỷ qua, cùng với sự phát triển của công nghệ nano, hạt nano ôxit sắt (IO)

đang được nghiên cứu mạnh [2, 75], nhiều dòng sản phẩm thương mại chất tăng tương

phản MRI dùng trên loại vật liệu này, chứng minh rằng các hạt nano ôxit sắt MRI (IO-

MRI) có thể cho chất lượng tăng tương phản tốt hơn cả Gd-DTPA (Gadolinium

diethylenetriaminopentaacetic acid, sản phẩm thương mại được sử dụng trong chụp ảnh

MRI) do hạt ôxit sắt có hệ số cảm từ lớn hơn [76].

Để trở thành sản phẩm tăng tương phản ảnh MRI, hạt nano từ phải có độ phân

bố kích thước hạt tương đối đều, từ độ bão hòa đủ lớn và chất bọc phải có độ tương hợp

sinh học tốt. Trong khi chất thương phẩm Resovist với hạt lõi Fe3O4 cỡ 10 nm cho từ

độ bão hòa cỡ 65 emu/g bọc bởi dextran kích thước thủy động 60 nm, chất thương phẩm

Ferumoxytol là hạt nano ôxit sắt bọc bởi Carboxylmethyl Dextran, có kích thước thủy

động 30 nm; nhỏ hơn Resovist (60 nm). Vì vậy, một số nghiên cứu mới đây tìm cách

nâng từ độ bão hòa Ms. Ví dụ, Eun và cộng sự đã sử dụng phương pháp hóa siêu âm,

chế tạo được hệ hạt nano Fe3O4 kích thước hạt lõi 15 nm và kích thước thủy động

khoảng 65 nm, được bọc chitosan và cho Ms đạt khoảng 80 emu/g [77], hay nhóm của

Ding Jun [78] dùng phương pháp phân hủy nhiệt không sử dụng dung môi đã thu được

Ms khoảng 76 emu/g cho hạt kích thước 9 – 10 nm. Cả hai trường hợp đều cho chất

lượng ảnh MRI tương đương của Resovist. Năm 2009, Thoeny và cộng sự [79] đã sử

dụng chất tương phản IO siêu mịn để có thể phát hiện hạch bạch cầu di căn ung thư tại

vùng bẹn của bệnh nhân ung thư tiền liệt tuyến dùng kỹ thuật phối hợp trọng khuyếch

tán với MRI. Các kết quả trên cho thấy một số thành công trong việc sử dụng chất tương

phản nền ôxit sắt trong chẩn đoán và phát hiện ung thư bằng ảnh MRI [80].

- Hiệu ứng đốt nóng cảm ứng từ và nhiệt từ trị

Có lẽ thuộc tính hấp dẫn nhất của các hạt nano từ là đốt nóng cảm ứng từ

(Magnetic Inductive Heating – MIH) dựa trên khả năng hấp thụ năng lượng từ từ trường

xoay chiều tạo nên nguồn đốt nóng dựa trên các hiệu ứng tổn hao mà chủ yếu là hồi

phục Neel và Brown [81, 82]. Khi được đưa vào trong các khối u các hạt nano từ có thể

đóng vai trò tiêu diệt tế bào ung thư do khả năng nhạy nhiệt của các tế bào ung thư. Đây

là lý do tại sao chúng được nghiên cứu kỹ để sử dụng như tác nhân nhiệt trị ung thư

dùng chất lỏng từ (Magnetic Fluid Hyperthermia – MFH). Các kim loại Fe và Co, các

hợp kim FeCo và Fe/CoPt, ferit của các ion từ khác nhau, và đặc biệt ôxit sắt là những

vật liệu được quan tâm nhất [82-84]. Trong tất cả những vật liệu này, Fe3O4 đã được và

sẽ là đối tượng được nghiên cứu kỹ, bởi vì chúng dễ tổng hợp, có đặc tính siêu thuận từ

tốt cũng như rất an toàn cho ứng dụng y sinh [85].

Nhiệt trị là liệu pháp trị bệnh đã biết đến từ rất lâu. Ngày nay, người ta biết rằng

đối với tế bào ung thư có 2 chế độ nhiệt trị liệu: vùng 42 - 47 oC chữa theo cách diệt tế

bào ung thư theo chế độ chết rụng tế bào (apoptosis) và vùng 47 - 60 oC chữa theo cách

bóc bỏ (ablation) [85], trong khi tế bào lành có thể chịu được nhiệt độ đến 70 oC tùy

loại tế bào. Vật liệu hạt từ, từ những năm 50 của thế kỷ XX, đã được biết đến với khả

năng tự đốt nóng dưới tác động của từ trường xoay chiều. Khi chất lỏng chứa hạt nanô

từ đặt trong từ trường xoay chiều, có 4 cơ chế tổn hao có thể đóng góp vào quá trình

gia nhiệt như: cơ chế từ trễ - liên quan đến chuyển động đảo chiều từ độ theo từ trường

ngoài, hồi phục Neel - chuyển động quay mômen từ đơn hạt siêu thuận từ trong từ

trường xoay chiều, hồi phục Brown - chuyển động quay toàn bộ hạt trong môi trường

chất lỏng, và dòng Fuco - dòng điện tử trên bề mặt hạt [86, 87]. Vùng tần số từ trường

gây nên sự gia nhiệt do các hấp phụ tổn hao này nằm trong dải rộng từ sóng radio đến

vi ba. Riêng về cơ chế hồi phục Neel đối với hạt siêu thuận từ khi đặt trong từ trường

xoay chiều, công suất tỏa nhiệt P (được xác định bằng tham số SAR, công thức bên

dưới) được xác định bởi công thức sau:

(1.4a)

Trong đó là phần ảo của độ cảm từ xoay chiều, là tần số của từ trường

là mômen từ của một hạt

(1.4b)

Công suất hấp thụ riêng (SAR) với mẫu CLT nano ở một nồng độ nhất định được

xác định theo công thức:

(1.5)

Trong đó: C là nhiệt dung riêng của nước (C=4,18 J/kg), mchatlong/mhattu là nồng

độ hạt từ trong chất lỏng, ( ) là tốc độ tăng nhiệt ban đầu (0C/s), ( ) được xác

định từ tiếp tuyến của đường cong đốt nhiệt tại thời điểm bật từ trường, ( ) là tham

số đặc trưng khả năng gia nhiệt của vật liệu, với dT là độ gia tăng của nhiệt độ và dt là

thời gian đốt tương ứng.

Ngoài ra để loại bỏ ảnh hưởng của các thông số trên thiết bị khác nhau như cường

độ từ trường và tần số, người ta dùng khái niệm công suất tổn hao nội tại (ILP -Intrinsic

loss power) được xác định theo công thức:

(1.6)

Trong đó SAR, H và f tương ứng là tốc độ hấp thụ riêng, cường độ từ trường và

tần số từ trường xoay chiều.

Từ (1.4a,b) và (1.5) ta thấy, phẩm chất gia nhiệt từ sẽ tăng mạnh khi mẫu CLT

có hạt lõi với từ độ M được nâng cao.

Gilchrist và cộng sự đã đề xuất khái niệm sinh nhiệt qua vật liệu từ và thử nghiệm

áp dụng lần đầu tiên cho việc chữa trị khối u cách đây nửa thế kỷ bằng cách tập trung

các hạt từ trong vùng khối u và sau đó đốt nóng chúng dưới tác dụng của một từ trường

xoay chiều, do vậy chỉ những vùng mô tế bào nào có chứa hạt từ mới chịu tác dụng của

nhiệt [88]. Trong thí nghiệm của Gilchrist năm 1957, các hạt Fe3O4 với kích thước 0,02

÷ 0,1 μm được tiêm vào dưới màng thanh dịch trong thành ruột của chó để chúng có

thể tập trung trong vùng các hạch bạch cầu, sau đó các hạch này được cắt ra khỏi cơ thể

và đưa vào vùng từ trường xoay chiều có cường độ 200 ÷ 240 Oe. Kết quả cho thấy

oC/3 phút. Hai năm sau đó, cũng nhóm này tiếp tục thực hiện nghiên cứu thử nghiệm

nồng độ 5 mg hạt từ trên mỗi gam hạch bạch cầu có thể đạt được tốc độ tăng nhiệt 14

trên thỏ và thu được kết quả tốt khi các hạch đã bị hoại tử hoàn toàn sau 3 phút đốt nóng

trong từ trường 470 Oe. Kể từ các thành công ban đầu này, nhiệt - từ trị sử dụng hạt từ

đã được coi như một trong những phương pháp triển vọng nhất trong cuộc chiến chống

lại ung thư. Phương pháp này sau đó được phát triển theo ba hướng, phân loại bởi các

cách đưa hạt từ vào vùng khối u là: i) Nhiệt trị theo đường động mạch; ii) Nhiệt trị tiêm

trực tiếp; iii) Nhiệt trị nội tế bào [89].

Phương pháp nhiệt từ trị với nhiều ưu việt như: môi trường sinh nhiệt là các hạt

từ kích thước bé hơn tế bào, có thể bám và diệt trúng đích tế bào bệnh, có thể khống

chế được nhiệt độ đốt bão hòa v.v, hướng nghiên cứu ứng dụng CLT trong nhiệt từ trị

đã thu hút sự quan tâm của rất nhiều phòng thí nghiệm không chỉ ở Âu - Mỹ mà ở cả

các quốc gia khác như: Hàn Quốc, Trung Quốc, Singapore, Australia…từ năm 2000

đến nay. Về mặt phát triển thiết bị trị liệu, có một số hãng thiết bị y tế ở Mỹ, Australia

và đặc biệt là ở Đức [90] đã quan tâm phát triển các thiết bị chiếu từ để thử nghiệm

chữa trị lâm sàng. Hãng NanoMagforce của Jordan đã cùng với Đại học Y ở Berlin đến

nay đã tiến hành chữa thử nghiệm lâm sàng cho gần 100 bệnh nhân các loại ung thư

khác nhau như ung thư não, ung thư lách, ung thư tiền liệt tuyến, tử cung… cho kết quả

rất khả quan. Tuy lịch sử hình thành và phát triển hướng nhiệt từ nanô ứng dụng cho

việc đốt diệt tế bào ung thư đã có đến vài chục năm, việc nghiên cứu chế tạo vật liệu

hạt nanô từ và bọc phủ chất tương hợp sinh học thích hợp vẫn đang là vấn đề nghiên

cứu rất quan trọng, đặc biệt là yêu cầu chất lỏng hạt từ nanô phải bền, có thông số tốc

độ hấp thụ riêng (SAR) ban đầu đủ lớn [86].

1.2.2. Các phương pháp chế tạo hạt nano từ

Phương pháp đồng kết tủa

Trong số các phương pháp hóa học để tổng hợp hạt nano từ, phương pháp đồng

kết tủa được sử dụng phổ biến nhất do kỹ thuật đơn giản, không đòi hỏi các trang thiết

bị và các tiền chất đắt tiền. Với phương pháp này hạt thường được tổng hợp trong dung

môi là nước dưới điều kiện kiềm (thu được bằng cách thêm hydrôxit (NaOH) hoặc

amoni hydrôxit (NH4OH)). Quá trình này thường được dùng để tổng hợp các hạt nano

ôxit và ferit. Phương trình phản ứng hóa học dùng tổng hợp các hạt ferit có thể được

biểu diễn như sau [91]:

(1.7) M2+ + 2Fe3+ + 8OH- → MFe2O4 + 4H2O

Trong đó M là: Fe, Co, Ni, Mn, Zn, Mg.

Một trong những nhóm nghiên cứu đầu tiên về phương pháp đồng kết tủa cho chế

tạo hạt nano ferit phải kể đến nhóm của tác giả Massart [92] vào năm 1981. Theo nhóm

tác giả này, các hạt nano Fe3O4 được tạo ra bằng cách kết tủa dung dịch muối FeCl2 và

FeCl3 trong môi trường kiềm. Kích thước, hình dạng và độ phân tán của hạt phụ thuộc

nhiều tới các yếu tố như: môi trường kiềm, độ pH, tốc độ nhỏ giọt, tốc độ khuấy và tỷ

lệ Fe2+/Fe3+. Tùy vào từng điều kiện phản ứng có thể thu được hạt có kích thước từ 4,2

-16,6 nm.

Phương pháp khử

Trái với phương pháp đồng kết tủa dùng để tổng hợp các hạt nano ôxit hay ferit,

phương pháp khử được dùng để tổng hợp các hạt nano từ kim loại hoặc hợp kim sử

dụng chất khử natri borohydride (NaBH4) hoặc hydrazine (N2H4). Linderoth và các

đồng nghiệp [93, 94] đã công bố kết quả tổng hợp các hạt nano bằng việc khử ion Fe2+

bằng NaBH4 trong nước.

Tổng hợp các hạt nano từ tính trong dung dịch nước bằng phương pháp khử có

nhiều ưu điểm như đơn giản và dễ dàng mở rộng quy mô. Hơn nữa, hạt nano được tổng

hợp bằng phương pháp này dễ phân tán trong nước, đó là một yêu cầu quan trọng đối

với các ứng dụng y sinh. Tuy nhiên, các nghiên cứu đã cho thấy rằng việc kiểm soát

hình dạng, kích thước và độ đồng nhất của hạt nano gặp nhiều khó khăn. Ngoài ra, các

hạt nano được tổng hợp bởi phương pháp khử thường ở trạng thái vô định hình và đôi

khi sản phẩm cuối cùng bị nhiễm bẩn, đặc biệt là khi NaBH4 được sử dụng làm chất

khử.

Phương pháp vi nhũ tương

Phương pháp vi nhũ tương là phương pháp tạo hạt nano nhờ vào các phản ứng bên

trong các hạt mixen của các hệ vi nhũ tương. Có thể hiểu hệ vi nhũ tương là sự phân

tán cân bằng nhiệt động của hai pha lỏng (nước - dầu) không tan lẫn nhau khi có chất

hoạt động bề mặt đồng thời các phân tử chất hoạt động bề mặt sẽ hình thành một đơn 34

lớp tại bề mặt tiếp giáp giữa dầu – nước. Trong cấu trúc này, pha nước phân tán thành

các giọt nước nhỏ được bao xung quanh bởi một đơn lớp phân tử chất hoạt động bề mặt

gọi là các hạt micelle. Khi trộn hai hệ vi nhũ tương chứa các chất phản ứng, các hạt

mixen sẽ kết tụ vào nhau và tạo phản ứng trong hạt mixen. Sản phẩm sau phản ứng

được thu hồi khi thêm một số dung môi vào hệ nhũ tương như: cồn, axeton. Các hạt

nano từ được chế tạo bằng phương pháp vi nhũ tương thường có dạng hình cầu hoặc

ống với phân bố kích thước hạt hẹp.

Phương pháp sol-gel

Một phương pháp thông dụng khác hiện đang được sử dụng phổ biến để tổng

hợp các vật liệu nano nói chung và các hệ nano ferit nói riêng là phương pháp sol-gel.

Kỹ thuật sol-gel liên quan đến quá trình phản ứng thuỷ phân và phản ứng cô đặc của

các muối vô cơ hoà tan trong dung môi (thông thường là nước hoặc cồn) (gọi là sol)

dưới điều kiện axít hoặc kiềm. Tiếp theo của các phản ứng này là quá trình polyme hoá

hay là các phản ứng tạo gel để tạo thành một mạng không gian 3 chiều các liên kết ôxit

kim loại [95]. Sản phẩm cuối cùng của quá trình thu được bằng cách loại bỏ dung môi

thông qua việc xử lý nhiệt. Các thông số của phản ứng như bản chất của dung môi,

nhiệt độ, độ pH và nồng độ của các các tiền chất ban đầu cũng như tốc độ khuấy ảnh

hưởng đến cấu trúc và hình thái của các hạt ferit thu được [95].

Tương tự như phương pháp đồng kết tủa, phương pháp sol-gel có ưu điểm là rẻ

tiền, tương đối thân thiện môi trường và cho phép tổng hợp được các hạt nano với khối

lượng lớn. Tuy nhiên nhược điểm lớn nhất của phương pháp này là tạo ra sản phẩm chủ

yếu ở dạng vô định hình, ngoài ra các hạt nano tạo thành thường bị kết đám và rất khó

điều khiển hình dạng và độ đồng đều.

Phương pháp thủy nhiệt

Tổng hợp hạt nano bằng phương pháp thủy nhiệt được thực hiện dựa trên khả

năng thủy phân và khử nước của các muối ở áp suất và nhiệt độ cao. Phản ứng hóa học

luôn được thực hiện trong các hệ kín (nồi hấp hoặc autoclave) ở áp suất cao. Ở nhiệt độ

cao, sự hòa tan và khả năng phản ứng của các chất tăng lên. Nhiều tiền chất không tan

trong nước ở điều kiện bình thường có thể được sử dụng trong phương pháp thủy nhiệt.

Hiện nay quá trình thủy nhiệt đang được sử dụng rộng rãi để tổng hợp các hạt nano từ

tính như ôxít, ferit hoặc hợp kim [96]. Các thông số như áp suất, nhiệt độ, thời gian

phản ứng, nồng độ tiền chất và độ pH có thể được sử dụng để điều khiển kích thước,

hình dạng và độ kết tinh của sản phẩm [96].

Tổng hợp hạt nano bằng phương pháp thủy nhiệt có ưu điểm là thân thiện với

môi trường. Phương pháp này còn có thể chế tạo ra các hạt nano với khả năng điều

khiển về kích thước và hình dạng. Nhược điểm của phương pháp này là việc sử dụng

nồi hấp hoặc lò phản ứng áp suất cao để tổng hợp mẫu và điều này có thể gây nên rủi

ro cháy nổ.

Phương pháp phân hủy nhiệt

Với phương pháp này, các hạt nano từ thường được tạo thành bằng cách phun

nhanh các tiền chất là các hợp chất cơ kim chứa nguyên tố kim loại cần tổng hợp vào

trong dung môi hữu cơ đang sôi với sự có mặt của chất hoạt động bề mặt (phương pháp

hot injection) hoặc bằng cách đun nóng từ từ hỗn hợp phản ứng từ nhiệt độ phòng lên

nhiệt độ sôi của dung môi (phương pháp heating up) [97, 98].

Tổng hợp hạt nano trong dung môi hữu cơ ở nhiệt độ cao mang đến nhiều ưu

điểm vượt trội hơn các phương pháp khác. Tuy nhiên các hạt nano từ được tổng hợp

bằng phương pháp này không được tinh khiết, bề mặt bị bao bọc bởi các chất hoạt động

bề mặt và tác nhân khử được sử dụng trong quá trình tổng hợp như axit oleic (OA) và

oleylamine (OLA), đây là các chất khử mạnh rất khó tách rửa khỏi bề mặt hạt nano từ

dẫn đến khó chuyển pha và khó chức năng hóa bề mặt để ứng dụng cho các mục đích

khác nhau.

Trong luận án này, chúng tôi sử dụng phương pháp đồng kết tủa để tổng hợp hạt

nano sắt từ Fe3O4 do dễ tổng hợp, giá thành thấp, kích thước hạt phân bố khá hẹp, các

hạt nano sau khi tổng hợp có độ thuần khiết vì được phân tán trong môi trường nước

nên dễ chức năng hóa bề mặt bằng các vật liệu khác nhau.

1.2.3. Bọc bảo vệ và chức năng hệ nano từ tính

Mục đích chính của việc bọc bảo vệ và chức năng hệ nano từ tính (Hình 1.9) là

thử nghiệm tính tương hợp sinh học của các hạt ôxít sắt đã được bọc các polyme bề mặt

và khảo sát tương tác của các hạt từ với các loại tế bào khác nhau trong dung dịch, cũng

như khảo sát các đặc tính từ của hệ nano. Các lớp bọc thường được sử dụng là các

polyme như dextran, carbôxydextran, citrate, polyethylene glycol, tinh bột hoặc

copolyme như poly(lactic axit)-polyethyleneglycol (PLA-PEG), poly(lactic-co-

glycolic)-polyethylene glycol (PLGA-PEG), poly(lactic axit)-vitamin E (PLA-TPGS),

methôxy poly(ethylene glycol)-poly(lactic axit) (MPEG-PLA).

Sự chức năng hóa các hạt nano từ là một bước thực sự quan trọng trong điều chế

các chất keo y sinh. Khi được bọc với một lớp tương hợp sinh học, các hạt nano từ

không những được bảo vệ khỏi các quá trình ôxy hóa, trong nhiều trường hợp quá trình

này cũng có thể ảnh hưởng đến các thuộc tính từ của chính lõi của các hạt nano từ [21,

99-102]. Một số nghiên cứu được báo cáo đối với ôxit sắt cho thấy rằng do sự tương

tác của vật liệu phủ với bề mặt hạt nano sự từ hóa về sau của chính nó có thể giảm hoặc

tăng phụ thuộc vào vật liệu sử dụng cũng như quá trình bọc [100, 101]. Sự gia tăng độ

từ hóa trong các hạt nano đã được bọc được giải thích như là sự phục hồi lại hướng của

các spin nghiêng trong lớp được gọi là từ chết tại bề mặt của hạt [21]. Đối với các vật

liệu phủ, ngoài silica và cacbon, hầu hết các vật liệu được nghiên cứu là các loại

polymer [103-108]. Một số nghiên cứu gần đây cho thấy việc sử dụng copolyme rất

hiệu quả cho việc đóng gói các hạt nano để tạo ra các chất keo từ tính phân tán trong

nước [106-108]. Một monome kỵ nước như axit poly-lactic (PLA) có thể neo tốt trên

hạt nano ôxit sắt, trong khi một monome ưa nước như poly ethylene glycol (PEG) khi

được gắn thêm vào có thể giúp sự phân tán tốt hơn trong môi trường chứa nước. Để tạo

nên chất mang nano từ có khả năng thêm vào hóa chất trị liệu, một số phân tử thuốc

bao gồm Doxorubicin, Dopamine và Curcumin đã được mang vào các hạt nano tương

hợp sinh học [21-23, 109]. Quá trình mang thuốc có thể lại ảnh hưởng đến tính chất từ

và thuộc tính thủy động lực học của toàn bộ hệ keo.

Hình 1.9. Mô hình hệ nanovector lõi hạt từ tính

Trong nghiên cứu của chúng tôi, hạt nano sắt từ Fe3O4 sau khi tổng hợp được

chức năng hóa bằng copolyme PLA-PEG tạo thành hệ dẫn thuốc nano cấu trúc lõi-vỏ

và mang Curcumin tạo thành hệ dẫn thuốc nano đa chức năng cấu trúc lõi-vỏ ứng dụng

trong chẩn đoán hình ảnh cộng hưởng từ MRI, nhiệt trị ung thư dựa vào khả năng tăng

nhiệt tại chỗ nhờ từ trường ngoài và khả năng tăng nhiệt giải phóng Curcumin.

Tóm lược chương 1

Việc phát triển một phương pháp trị liệu đóng một vai trò rất quan trọng trong

chẩn đoán và điều trị bệnh. Các hệ dẫn thuốc với khả năng bảo quản tốt, tăng thời gian

lưu thông thuốc đủ dài, tác động tại vị trí đích, giảm tác dụng phụ, v..v. đã góp phần

tăng hiệu quả điều trị của thuốc.

Ngày nay, với sự phát triển vượt bậc của công nghệ nano dẫn đến các hệ dẫn

thuốc nano cùng liệu pháp điều trị đi kèm được phát triển liên tục. Các HDTNN ra đời

trên nền tảng công nghệ nano đã tạo nên một cuộc cách mạng trong việc chẩn đoán và

điều trị bệnh.

Polyme phân hủy sinh học đóng vai trò rất quan trọng trong việc phát triển các

HDTNN, tăng khả năng tương thích sinh học khi được chức năng hóa bề mặt và tăng

hiệu quả nhập bào khi được gắn yếu tố hướng đích, qua đó tăng hiệu quả điều trị của

thuốc và giảm tối đa tác dụng phụ.

Copolyme phân hủy sinh học với những tiềm năng và tính chất ưu việt như tăng

hòa tan các dạng thuốc kỵ nước, không gây độc cho cơ thể, giảm thiểu sự lắng đọng

trên bề mặt tế bào, tăng thời gian lưu thông trong máu, vì vậy rất thích hợp cho việc

thiết kế các hệ dẫn thuốc nano.

Hạt nano từ tính sau khi tổng hợp được bọc bởi copolyme phân hủy sinh học tạo

thành HDTNN từ tính, khi mang thêm các phân tử thuốc tạo thành HDTNN đa chức

năng lõi hạt từ cho khả năng ứng dụng đa năng trong chẩn đoán và điều trị bệnh.

Chương 2 CÁC KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM

2.1. Phương pháp tổng hợp PLA-PEG

2.1.1. Hóa chất và thiết bị

Axit lactic, polyethylene glycol - 2000 (PEG 2000), xúc tác Sn(II) 2-

ethylhexanoate và axit folic được mua từ hãng Sigma (St. Louis, MO, USA). Dung môi

toluen, dichlomethan (DCM, C2H2Cl2), methanol (CH3OH), ethanol (C2H5OH) được

mua từ hãng Merck (CHLB Đức), Curcumin được mua từ Ấn Độ (độ tinh khiết trên

99%). Các thiết bị sử dụng để tổng hợp và hỗ trợ trong quá trình chế tạo mẫu bao gồm:

máy khuấy từ gia nhiệt, máy cô quay chân không, máy ly tâm, máy rung siêu âm và tủ

sấy mẫu.

2.1.2. Tổng hợp PLA-PEG

Phản ứng mở vòng trùng ngưng axit lactic với polyethylene glycol tạo thành

copolyme PLA-PEG với sự có mặt của muối thiếc II (Sn(Oct)2) [67] đóng vai trò như

xúc tác tạo thành copolyme PLA-PEG với các tỷ lệ thành phần PLA:PEG khác nhau đã

được quan tâm nghiên cứu.

Theo đó, copolyme PLA-PEG với các tỷ lệ thành phần PLA:PEG là 3:1, 2:1, 1:1,

1:2 và 1:3 được tổng hợp thông qua phản ứng mở vòng trùng ngưng giữa monome của

axit lactic và polyethylene glycol (PEG) với sự có mặt của xúc tác thiếc (II) 2-

ethylhexanoat. Phản ứng được thực hiện ở 1450C trong 8 giờ. Sau khi thực hiện phản

ứng xong, dung môi phản ứng được đuổi bay hơi, sản phẩm được hòa tan trong DCM,

sau đó sản phẩm được kết tủa bằng methanol lạnh, ly tâm 5000 vòng/phút loại bỏ xúc

tác và PLA, PEG dư. Sản phẩm thu được đem sấy ở nhiệt độ 450C trong 48 giờ và cất

giữ ở nhiệt độ phòng [67].

2.2. Phương pháp chế tạo các hạt nano

2.2.1. Chế tạo hệ nano PLA-PEG, Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol

- Chế tạo hạt nano PLA-PEG

Copolyme PLA-PEG sau khi tổng hợp được sử dụng để chế tạo hạt nano PLA-

PEG bằng phương pháp bay hơi dung môi. Copolyme PLA-PEG được phân tán trong

dung môi không phân cực DCM, sau đó phân tán ngược vào dung môi nước, cho bay

hơi dung môi DCM, thu được copolyme PLA-PEG dạng mixen cấu trúc lõi-vỏ phân

tán trong nước [69].

- Chế tạo hạt nano Cur/PLA-PEG

Hạt nano PLA-PEG sau khi chế tạo được sử dụng để mang Cucurmin tạo thành

hệ hạt nano Cur/PLA-PEG, theo đó Curcumin sẽ được bọc trong phần lõi PLA của hạt

nano PLA-PEG bằng liên kết kỵ nước giữa hợp phần kỵ nước PLA với Curcumin [69].

- Chế tạo hạt nano Cur/PLA-PEG-Fol

Hạt nano PLA-PEG sau khi chế tạo được hoạt hóa tạo thành dạng PLA-PEG-

COOH. Axit folic được hoạt hóa tạo thành dạng Folat-NHS, sau đó được cho vào phản

ứng với PLA-PEG-COOH bằng phản ứng este hóa tạo thành hạt nano PLA-PEG-Fol

và mang Curcumin tạo thành hạt nano Cur/PLA-PEG-Fol [69].

2.2.2. Chế tạo hạt nano Fe3O4@PLA-PEG, Fe3O4@PLA-PEG/Cur

Tổng hợp Fe3O4 bằng phương pháp đồng kết tủa

- Hóa chất và thiết bị

FeCl3, FeCl2.4H2O, NH4OH, HCl dùng để tổng hợp mẫu là các sản phẩm thương

mại của các hãng Sigma - Aldrich và Merck, với độ sạch 99 %. Các thiết bị dùng để hỗ

trợ trong quá trình chế tạo và thu rửa mẫu bao gồm: Bình ba cổ, sinh hàn, máy khuấy

từ, máy rung siêu âm, máy ly tâm và tủ sấy mẫu.

- Phương pháp tổng hợp

Hạt nano sắt từ được tổng hợp bằng phương pháp đồng kết tủa như mô tả trong

[110] theo phương trình sau:

2Fe3+ + Fe2+ + 8OH- = Fe3O4 + 4H2O

Hạt nano sắt từ sau khi tổng hợp được phân tán trong nước để chuẩn bị cho các

nội dung tiếp theo.

Chế tạo hạt nano Fe3O4@PLA-PEG, Fe3O4@PLA-PEG/Cur

- Chế tạo hạt nano Fe3O4@PLA-PEG

Hạt nano sắt từ sau khi được tổng hợp và phân tán trong nước, nhỏ từ từ vào

copolyme PLA-PEG đã được phân tán trong nước, kết hợp với rung siêu âm, khuấy từ

trong 24 giờ tạo thành hạt nano Fe3O4@PLA-PEG phân tán trong nước.

- Chế tạo hạt nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur

Curcumin được hòa tan trong C2H5OH nồng độ 4 mg/mL, được nhỏ từ từ vào hệ

nano Fe3O4@PLA-PEG phân tán trong nước cho đến dư, khuấy từ trong 48 giờ, cho

bay hơi dung môi C2H5OH, thu được hệ nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur phân tán trong

nước.

2.3. Các phương pháp đặc trưng

2.3.1. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ copolyme và hạt nano Fe3O4 đến độ bền

phân tán của hệ nano Fe3O4@PLA-PEG

Trong luận án chúng tôi tiến hành khảo sát và đánh giá độ bền phân tán hệ nano

Fe3O4@PLA-PEG. Theo đó copolyme PLA-PEG với các nồng độ 0,1 mg/mL, 0,2

mg/mL, 0,3 mg/mL, 0,4 mg/mL, 0,5 mg/mL và hạt nano Fe3O4 với nồng độ 1 mg/mL,

2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL và 5 mg/mL được khảo sát để đánh giá ảnh hưởng của

nồng độ copolyme PLA-PEG, nồng độ của hạt nano Fe3O4 đến khả năng phân tán trong

nước của hệ nano Fe3O4@PLA-PEG.

Copolyme PLA-PEG với các tỷ lệ thành phần PLA:PEG 3:1, 2:1, 1:1, 1:2 và 1:3

được dùng để bọc hạt nano Fe3O4 để đánh giá ảnh hưởng của tỷ phần PLA:PEG đến

khả năng phân tán trong nước của hệ nano Fe3O4@PLA-PEG. Kết quả được thể hiện

thông qua phép đo thế Zeta của các mẫu hạt nano.

2.3.2. Hiển vi điện tử

Cơ sở vật lý của phân tích kính hiển vi điện tử là chiếu lên mẫu (đối tượng nghiên

cứu) một chùm điện tử năng lượng cao, gọi là điện tử sơ cấp; ghi nhận và phân tích các

tín hiệu được phát ra do tương tác của điện tử sơ cấp với các nguyên tử của mẫu, gọi là

tín hiệu thứ cấp; để thu thập các thông tin về mẫu.

Tùy thuộc vào loại tín hiệu thứ cấp nào được sử dụng mà ta có các phương pháp

cụ thể. Theo cách sử dụng các tín hiệu thứ cấp nói trên, kính hiển vi điện tử có thể phân

thành hai loại cơ bản sau:

Kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope - SEM): Chụp ảnh SEM

cho thông tin về hình dạng, kích thước và sự sắp xếp của các hạt. Việc chụp và phân

tích ảnh SEM trong luận án được thực hiện trên thiết bị kính hiển vi điện tử quét phát

xạ trường (FE-SEM) Hitachi S - 4800 đặt tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Vật liệu và

linh kiện điện tử thuộc Viện Khoa học vật liệu, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ

Việt Nam.

Hình 2.1. Ảnh thiết bị kính hiển vi điện tử quét phát xạ trường Hitachi S-4800.

Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron Microscopy - TEM):

ngoài thông tin về hình dạng, kích thước và sự sắp xếp của các hạt, ảnh TEM phân giải

cao còn có thể cho ta biết thông tin về cấu trúc tinh vi bên trong hạt mẫu. Dựa trên

nguyên tắc hoạt động cơ bản của kính hiển vi quang học, kính hiển vi điện tử truyền

qua có ưu điểm nổi bật nhờ bước sóng của chùm electron ngắn hơn rất nhiều so với ánh

sáng nhìn thấy nên nó có thể quan sát với kích thước cỡ 0,2 nm. Chụp và phân tích ảnh

TEM trong luận án được thực hiện trên thiết bị kính hiển vi điện tử truyền qua JEOL

JEM - 1010 tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương – Hà Nội.

Hình 2.2. Ảnh thiết bị kính hiển vi điện tử truyền qua JEOL JEM - 1010.

2.3.3. Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR)

Phổ hồng ngoại FT - IR hoạt động dựa trên sự hấp thụ bức xạ hồng ngoại của vật

chất cần nghiên cứu, ghi nhận các dao động đặc trưng của các liên kết hóa học giữa các

nguyên tử, cho phép phân tích với hàm lượng chất mẫu rất thấp và có thể phân tích cấu

trúc, định tính và cả định lượng. Phổ hồng ngoại cho biết các dao động đặc trưng của

các nhóm liên kết khác nhau dựa trên sự xuất hiện của các đỉnh (pic) đặc trưng trong

vùng hồng ngoại. Sự xuất hiện các pic cũng như sự dịch chuyển các pic này sẽ cho ta

biết sự hình thành các liên kết đặc trưng cũng như sự liên kết giữa các nhóm chức. Đối

với việc đặc trưng các phối tử của hệ dẫn thuốc nano, phổ hồng ngoại là một trong

những kỹ thuật được sử dụng nhiều nhất để khẳng định hạt nano lõi đã được chức năng

hoá do tính đơn giản và sẵn có của phép đo này. Trong luận án này, chúng tôi sử dụng

phổ FT-IR để xác định các pic đặc trưng của các liên kết được hình thành trong các

phản ứng hóa học, sự tương tác giữa các nhóm chức, chức năng hóa hạt nano từ để tạo

thành các hệ nano mang thuốc.

Các phép đo hồng ngoại trong luận án được thực hiện trên hệ đo Shimadzu UV

1800 (Nhật Bản) trên vùng phổ có số sóng từ 4500 và 400 cm-1, đặt tại Phòng thí nghiệm

Hóa học thuộc Trường đại học Sư phạm Hà Nội.

2.3.4. Giản đồ tán xạ ánh sáng động (Dynamic Light Scattering - DLS)

Phương pháp tán xạ ánh sáng động là phép đo tính toán sự phụ thuộc của cường

độ tán xạ ánh sáng (từ nguồn laser) vào thời gian tán xạ ánh sáng trong mẫu, từ đó xác

định hệ số khuếch tán D và đường kính thủy động DH của mẫu hạt trong huyền phù.

Đại lượng đặc trưng cho độ ổn định của hệ phân tán keo là thế Zeta (ζ), Các hạt

với điện tích bề mặt nhất định sẽ hấp phụ từ dung dịch những ion có điện tích trái dấu.

Thế Zeta thể hiện mức độ đẩy giữa các hạt tích điện cùng dấu gần nhau trong hệ phân

tán, đối với các phân tử và các hạt đủ nhỏ. Thế Zeta cao (âm hoặc dương) sẽ cho độ ổn

định cao, hệ phân tán tốt và sẽ chống lại sự keo tụ.

Phân bố kích thước hạt và phân bố thế Zeta của các mẫu trong luận án được thực

hiện trên thiết bị Zetasizer-Nano ZS của hãng Malvern – UK được đặt tại Viện Khoa

học vật liệu.

2.3.5. Phổ tử ngoại khả kiến UV-Vis (Ultraviolet-Visible)

Phổ tử ngoại khả kiến UV-Vis là phương pháp phân tích được sử dụng rộng rãi

từ lâu, gồm hai vùng là vùng tử ngoại (UV) với bước sóng  từ 200 – 400 nm và vùng

khả kiến (Vis) có  từ 400 – 800 nm.

Trong luận án này, chúng tôi phân tích mẫu bằng phổ tử ngoại khả kiến UV-Vis

trên hệ Aligent 840 đặt tại Phòng thí nghiệm Hóa phân tích thuộc Trường đại học Bách

khoa Hà Nội. Kết hợp số liệu đo trên máy tính với đường chuẩn xây dựng được, ta có

thể định lượng được nồng độ của các chất cho phổ trong vùng tử ngoại và vùng khả

kiến, trên cơ sở đó cho phép xác định được nồng độ các chất trong mẫu. Trong luận án

này, chúng tôi sử dụng phổ UV-Vis để xây dựng đường chuẩn và xác định nồng độ

thuốc Curcumin được bọc trong các hạt copolyme phân phối thuốc.

2.3.6. Nhiễu xạ tia X (XRD)

Phương pháp nhiễu xạ tia Ronghen (Powder X-ray diffraction - XRD) cho biết

vị trí và độ rộng của các vạch nhiễu xạ, cùng cường độ tỷ đối của chúng. Bằng việc

phân tích số liệu từ giản đồ nhiễu xạ ta có thể thu được các thông tin định tính, định

lượng về pha tinh thể, độ kết tinh của mẫu nghiên cứu, xác định được hệ cấu trúc và

các hằng số mạng tinh thể cũng như đánh giá kích thước hạt nano. Ngoài việc xác định

hằng số mạng dễ dàng dựa trên vị trí của đỉnh nhiễu xạ, để thu được những thông tin

liên quan đến cấu trúc bên trong ô cơ sở mạng có thể sử dụng phương pháp phân tích

Fourier đối với hàm phân bố cường độ nhiễu xạ quanh một đỉnh nhiễu xạ Bragg.

Trong luận án này chúng tôi phân tích cấu trúc tinh thể các mẫu bằng phương

pháp nhiễu xạ Ronghen mẫu bột (Powder X-ray diffraction). Thiết bị thực hiện phép

đo là hệ Siemens D5000, đặt tại Phòng phân tích cấu trúc tia X thuộc Viện Khoa học

vật liệu, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.3.7. Phân tích nhiệt vi lượng (Thermal Gravimetric Analysis-TGA)

Phương pháp phân tích nhiệt vi lượng TGA dựa vào hiệu ứng nhiệt để nghiên

cứu những quá trình phát sinh khi đun nóng hoặc làm nguội chất. Từ trên giản đồ nhiệt

với các đường DTA (Differential Thermal Analysis) và TGA (Thermo-Gravimetric

Analysis) thu được từ kết quả phân tích nhiệt ta có thể giải thích được các quá trình lý

hóa xảy ra khi tiến hành nung mẫu. TGA là phương pháp hóa lý thường dùng để phân

tích cấu trúc vật liệu, cung cấp những thông tin về tính chất nhiệt của vật liệu, cho phép

xác định tỷ phần trọng lượng và vùng nhiệt độ chuyển hóa của các thành phần khi gia

giảm nhiệt độ của mẫu.

Trên giản đồ phân tích nhiệt gồm các đường cơ bản sau:

- Đường TG (Thermogram): ghi lại sự biến đổi đơn thuần về nhiệt độ của mẫu

theo thời gian, cho biết nhiệt độ xảy ra sự biến đổi của mẫu.

- Đường TGA (Thermo-Gravimetric Analysis): khảo sát sự biến đổi khối lượng

của mẫu trong quá trình đun nóng, cho phép xác định sự thay đổi thành phần của mẫu

khi xảy ra hiệu ứng nhiệt.

- Đường DTA (Differential Thermal Analysis): cho phép phát hiện sự chênh lệch

nhiệt độ của mẫu nghiên cứu với mẫu chuẩn trong quá trình nâng nhiệt. Nhờ đó có thể

xác định được các hiệu ứng nhiệt xảy ra là tỏa nhiệt hay thu nhiệt. Các thông tin thu

được từ giản đồ nhiệt không những cho phép giải thích cơ chế của quá trình mà còn cho

phép xác định thành phần định tính và định lượng của các pha có trong mẫu, đặc biệt

phương pháp này cho thông số chính xác đối với các hệ mẫu vừa có cả hợp phần vô cơ

và hữu cơ. Trong luận án này chúng tôi sử dụng TGA để xác định hàm lượng các chất

hữu cơ như copolyme và Curcumin trong mẫu.

Đặc điểm nổi bật của thiết bị phân tích nhiệt vi lượng TGA có độ nhạy cao và ổn

định trên toàn thang nhiệt độ. Các phép đo phân tích nhiệt trong luận án này được thực

hiện trên hệ Setaram Labsys 18 tại Phòng thí nghiệm Hoá học thuộc Trường Đại học

Sư phạm Hà Nội.

2.3.8. Từ kế mẫu rung (Vitrating Sample Magetometer – VSM)

Đường cong từ hóa là đồ thị mô tả quá trình từ hóa vật từ từ trạng thái ban đầu

chưa nhiễm từ (trạng thái khử từ), mà thể hiện trên đồ thị là sự thay đổi của tính chất từ

(thông qua giá trị của từ độ, cảm ứng từ...) theo giá trị của từ trường ngoài. Ở phạm vi

cấu trúc vi mô, quá trình từ hóa chính là sự thay đổi về cấu trúc từ (cấu trúc đômen)

thông qua các cơ chế khác nhau.

Từ độ bão hòa: Nếu từ trường từ hóa đủ lớn sao cho tất cả các mômen từ song

song với nhau, ta sẽ thu được giá trị từ độ bão hòa (ký hiệu là Ms). Đối với hạt nano

siêu thuận từ, điểm uốn của đường cong từ hóa sẽ đi qua gốc tọa độ, tại đó giá trị từ độ

gần bằng 0 khi từ trường ngoài tác động lên hệ hạt nano bằng 0.

Các phép đo tính chất từ đối với các mẫu sử dụng trong luận án được thực hiện

trên hệ từ kế mẫu rung.

Hệ từ kế mẫu rung sử dụng là hệ tự xây dựng của Phòng Vật lý vật liệu từ và siêu

dẫn thuộc Viện Khoa học vật liệu, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Hệ này có độ nhạy 10-4 emu, có thể hoạt động trong khoảng nhiệt độ từ 77 K đến 1000

K và trong khoảng từ trường từ -12 kOe đến 12 kOe.

2.3.9. Đốt nóng cảm ứng từ (Magnetic Inductive Heating - MIH)

Hầu hết các phép đo đốt nóng cảm ứng từ trong luận án được thực hiện trong từ

trường xoay chiều có tần số trong vùng 170-240 kHz và cường độ 40 ÷ 100 Oe. Từ

trường được tạo trên cuộn dây cảm ứng (7 vòng, đường kính 3 cm và dài 11,5 cm) bởi

một máy phát thương mại RDO-HFI có công suất lối ra 5 kW (Hình 2.3). Các mẫu đo

được phân tán trong môi trường nước và được đặt cách nhiệt với môi trường ngoài bằng

một vỏ bình thuỷ tinh được hút chân không 10-2 ÷ 10-3 Torr. Nhiệt độ được đo bằng

nhiệt kế quang (GaAs sensor, Opsens) với độ chính xác 0,3oC trong dải 0-250oC.

Thông thường công suất tổn hao riêng (SLP- Specific loss power), được xác định

từ công thức sau:

(2.1)

Trong đó C là nhiệt dung riêng của hệ mẫu (hạt từ và dung dịch), ms là khối lượng

là tốc độ tăng nhiệt ban đầu, xác tổng cộng của hệ mẫu và mi là khối lượng hạt từ.

định từ tiếp tuyến của đường cong nhiệt độ phụ thuộc thời gian tại thời điểm bật từ

trường.

(b) (a)

Hình 2.3. (a) Hệ thí nghiệm đốt nóng cảm ứng từ, (b) Minh họa bố trí thí nghiệm đốt nóng cảm ứng từ

Thiết bị đo sử dụng được đặt tại Phòng Vật liệu nano y sinh - Viện Khoa học vật

liệu - Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam. Ngoài ra, có tiến hành một số

thí nghiệm nghiên cứu thêm trên hệ từ trường cao tới 800 Oe tại Đại học Nam Florida.

2.3.10. Cộng hưởng từ hạt nhân

Các phép đo và chụp ảnh MRI trên các mẫu CLT Fe3O4@PLA-PEG và

Fe3O4@PLA-PEG/Cur ở các nồng độ khác nhau trong dung môi nước được thực hiện

trên thiết bị cộng hưởng từ Bruker Biospec, tần số từ trường xoay chiều 300 MHz, từ

trường tĩnh 7 tesla tại Trung tâm chụp ảnh động vật, thuộc Trường Đại học Đông Bắc,

Thành phố Boston, Hoa Kỳ.

Chuẩn bị mẫu:

Các bộ mẫu Fe3O4@PLA-PEG, Fe3O4@PLA-PEG/Cur có nồng độ pha loãng

trong vùng từ 0-90 µg/mL (tính cho nguyên tố Fe) cách quãng 15 µg/mL, đặt vào trong

các bình chứa có dung tích 2 mL. Phép pha loãng được thực hiện bằng cách quay 2 phút

trong bình 3 mg/mL.

Chụp ảnh và xác định độ hồi phục:

Độ hồi phục (r1, r2) cho mỗi mẫu CLT được xác định từ phép đo tốc độ hồi phục

tương ứng (R1, R2) cho loạt các loạt mẫu pha loãng khác nhau.

Trong luận án này, mỗi bộ mẫu Fe3O4@PLA-PEG, Fe3O4@PLA-PEG/Cur được

pha loãng theo 6 nồng độ, cho vào 6 bình dung tích 2 mL xếp theo vòng tròn xung

quanh 1 bình chứa mẫu nước cất. Thời gian hồi phục dọc T1 được đo theo trình tự spin-

echo, biến thiên thời gian lặp TR, còn thời gian hồi phục ngang T2 đo theo trình tự spin-

echo đa tiếng vọng (multi-echo) giữ TR cố định. Sử dụng phầm mềm ParaVison 5.1 để

vẽ vùng quan tâm và để tính các giá trị của thời gian hồi phục. Phương trình đơn

exponential (2.2) được sử dụng để tính thời gian đặc trưng cho quá trình tăng trở lại giá

trị từ độ Mz cực đại (xem hình 1.7c trong Chương 1), tức thời gian hồi phục dọc T1:

(2.2)

Đường cong suy giảm tín hiệu từ độ ngang Mxy (hình 1.7d) được fit bởi phương

trình suy giảm đơn exponential (2.3) để tính thời gian hồi phục ngang T2 theo biểu thức

(2.3)

Nghịch đảo của các thời gian hồi phục T1, T2 là tốc độ hồi phục R1, R2. Đặc trưng

cho khả năng tăng tương phản MRI của một vật liệu là độ hồi phục r1 và r2, được xác

định như là hệ số góc của đường thực nghiệm phụ thuộc R vào nồng độ CLT:

(2.4)

Trong đó: R1,2 – tốc độ hồi phục, Ro1,2 – tốc độ hồi phục khi không có chất tương

phản, r1,2 – tham số độ hồi phục tính theo đơn vị (mM.s)-1, C – nồng độ chất tương phản

tính theo đơn vị milimole (1 mM = 10-3 M/lit).

Trình tự xung Bruker Multi-Slice Multi-Echo (MSME) để xác định đường cong

phục hồi Mz và suy giảm Mxy được thực hiện với các tham số sau: thời gian spin-echo

TE hiệu dụng: 4,25 ms, với 30 tiếng vọng trong vùng 4,25-127,5 ms, thời gian lặp TR

= 2500 ms, từ trường quan sát (FOV) x-y 40x40 mm2, chiều dày lát cắt 30 mm, kích

thước ma trận 200x200 cho độ phân giải x-y 200 μm2, số các lần lấy trung bình bằng 2,

tổng thời gian ghi dữ liệu là 11 phút 55 giây.

Các mẫu đo T1 được thực hiện với việc dùng chế độ thu thập dữ liệu nhanh, trình

tự xung với các tham số sau: TE = 4,25 ms, thời gian lặp TRs trải từ 100 đến 2500 ms,

độ dày lớp cắt 30 mm, kích thước ma trận 200x200 cho độ phân giải x-y 200 μm2. Số

lần lấy trung bình bằng 1, toàn bộ thời gian lấy mẫu là 27 phút 15 giây. Đế chứa mẫu

H2O (de-ion) khi đo T1 và T2 đã chạy quét 2 lần tách nhau với thời gian TE = 40 ms

cho T2, và TRs trong khoảng từ 100 - 3500 cho T1.

2.3.11. Chụp ảnh cộng hưởng từ hạt nhân cho mẫu động vật

Ảnh CHTHN trên mẫu động vật được thực hiện trên thiết bị chụp ảnh cộng hưởng

từ hạt nhân 3 Tesla của hãng Philips, tại Khoa chẩn đoán hình ảnh, Bệnh viện Trung

Ương Quân đội 108.

Chụp MRI trong điều kiện in vitro

Mẫu hạt nano từ được phân tán trong dung dịch Agar 1,5% , ảnh chụp theo chế

độ trọng T2 (T2W), các tham số thời gian vọng TE = 80 ms thời gian lặp lại TR = 3,0

giây, góc chụp là 90o.

Chụp MRI chuột Swiss mang khối u rắn

Chuột Swiss mang khối u rắn 10 ngày tuổi được gây mê bằng thiopentaone

(Rotexmedica GMBH – Germany). Tiến hành tiêm trực tiếp hệ nano từ vào khối u của

chuột. Ảnh chụp theo chế độ trọng T2 (TE 80 ms, TR 3,0 giây, góc chụp 90o và 180o).

2.4. Phương pháp nghiên cứu giải phóng chậm thuốc

2.4.1. Giải phóng chậm Curcumin bằng ủ nhiệt

Nghiên cứu phản ứng giải phóng chậm thụ động (tự giải phóng) Curcumin từ

HDTNN được thực hiện với mục đích đánh giá khả năng giải phóng thuốc (Cur) theo

thời gian khi các hệ nano được ủ trong bể nước ở 37oC.

Trong luận án, nghiên cứu giải phóng chậm Curcumin trên các hệ nano Cur/PLA-

PEG, Cur/PLA-PEG-Fol và Fe3O4@PLA-PEG/Cur đã được tiến hành. Theo đó 30 mL

mẫu Fe3O4@PLA-PEG/Cur được ủ trong bể nhiệt 370C, sau các khoảng thời gian (0

giờ, 3 giờ, 6 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ và 48 giờ) 2 mL mẫu được lấy ra và xác định

lượng Curcumin giải phóng bằng phổ UV-Vis.

2.4.2. Giải phóng chậm Curcumin bằng MIH

Hiệu ứng đốt nóng cảm ứng từ được ứng dụng nhằm nghiên cứu phản ứng nhả

chậm Curcumin dựa trên khả năng tăng nhiệt tại chỗ của hạt nano sắt từ khi chiếu từ

trường ngoài vào.

Trong luận án này chúng tôi đã khảo sát 2 chế độ động học: biến thiên cả nhiệt

độ (T) theo thời gian (t) và biến thiên thời gian đạt cùng nhiệt độ đối với hệ CLT

Fe3O4@PLA-PEG/Cur để khảo sát khả năng giải phóng chậm Curcumin. Lượng mẫu

được dùng cho mỗi thí nghiệm động học nhả chậm Curcumin chủ động này là 1 mL

mẫu Fe3O4@PLA-PEG/Cur. Lượng Curcumin giải phóng sau mỗi thí nghiệm nhả thuốc

kích thích bằng đốt từ được đặc trưng bằng phổ UV-Vis.

Chế độ tăng nhiệt theo thời gian thực hiện khi mẫu đốt nóng trên hệ đốt nóng

cảm ứng từ (MIH) được ngắt ở các khoảng thời gian (5 phút, 10 phút, 15 phút, 20 phút

và 25 phút).

Chế độ biến thiên thời gian với cùng một nhiệt độ được khảo sát thông qua việc

dùng từ trường ngoài với một số cường độ khác nhau để khống chế tốc độ gia nhiệt

khác nhau và ngắt chúng khi đạt nhiệt độ định khảo sát. Cụ thể đã khảo sát lượng

Curcumin nhả tại hai nhiệt độ ngắt là 370C và 450C.

2.5. Thực nghiệm sinh học

2.5.1. Thử nghiệm độc tính in vitro trên dòng tế bào HepG2

Trong luận án chúng tôi tiến hành thử nghiệm gây độc in vitro của Curcumin tự

do, hệ nano Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol được đặc trưng chống lại tế bào

HepG2 (dòng tế bào ung thư gan người với biểu hiện mạnh thụ thể Folat) sử dụng

phương pháp của Skehan và cộng sự 1990 [111] và phương pháp của Likhiwitayawuid

và cộng sự năm 1993 [112] hiện đang được áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thư Quốc

gia của Mỹ (NCI) và Trường đại học Dược, Đại học Tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ.

Dòng tế bào

- HepG2: Human Hepatocellular carcinoma (Ung thư gan người)

Môi trường nuôi cấy tế bào: Dùng DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle

Medium) có bổ sung L-glutamine, Sodium piruvat, NaHCO3 (Natri Bicacbonat), PSF

(Penixillin- Streptomycin sulfate- Fungizone); NAA (Non-Essential Amino Acids);

10% BCS (Bovine Calf Serum) Tripsin-EDTA 0,05%; DMSO (Dimethyl Sulfoside);

TCA (Trichloro Acetic acid); Tris Base; PBS (Phosphate Buffered Saline); SRB (Sulfo

Rhodamine B); Acid Acetic.

Các dụng cụ dùng 1 lần: Chai nuôi cấy tế bào, đĩa 96 giếng, pipet pasteur, các

đầu tuýp cho micropipet…

Chất chuẩn chứng dương tính:

Dùng chất chuẩn có khả năng diệt tế bào: Ellipithine pha trong DMSO. Đọc trên

máy ELISA ở bước sóng 495-515 nm.

Tính kết quả:

Giá trị CS: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của chất thử tính

theo % so với đối chứng. Dựa trên kết quả đo được của chúng OD (ngày 0), DMSO

10% và so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu để tìm giá trị CS (%) theo công thức:

OD (mẫu) – OD (ngày 0) x 100 (2.5)

CS% = OD (DMSO) – OD (ngày 0)

Giá trị CS% sau khi tính theo công thức trên, đựơc đưa vào tính toán Excel để

tìm ra % trung bình ± độ lệch tiêu chuẩn của phép thử được lặp lại 3 lần theo công thức

của Ducan như sau: Độ lệch tiêu chuẩn 

(2.6)

 (xi - x )2  = n - 1

Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS < 50%) sẽ được chọn ra để thử nghiệm tiếp

để tìm giá trị IC50.

Giá trị IC50: dùng giá trị CS của 10 thang nồng độ, dựa vào chương trình Table

Curve theo thang gía trị logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng độ chất thử

để tính giá trị IC50 theo công thức:

1/y=a+blnX (2.7)

Trong đó Y: nồng độ chất thử; X: Giá trị CS (%).

2.5.2. Thử nghiệm sinh học trên tế bào ung thư và chuột mang khối u

Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu

- Dòng tế bào: Trong chuyên đề này chúng tôi lựa chọn hai dòng tế bào ung thư

nuôi cấy:

+ Dòng tế bào ung thư mô liên kết chuột Sarcoma180,

+ Dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến vú người BT-474.

Cả hai dòng tế bào trên được cung cấp bởi trung tâm lưu trữ giống nuôi cấy Hoa

Kỳ (ATCC) và được bảo quản tại Nhóm nghiên cứu Ung thư học Thực nghiệm, Bộ

môn Sinh học Tế bào, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học

Quốc Gia Hà Nội.

- Chuột thí nghiệm: Chúng tôi sử dụng chuột nhắt trắng dòng Swiss, 4 - 6 tuần

tuổi, trọng lượng trung bình 20 - 22 g, do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp,

làm đối tượng nghiên cứu.

Vật liệu nghiên cứu

Hệ nano Fe3O4@PLA-PEG: Được tổng hợp theo quy trình đã được trình bày ở

Chương 4 với tỷ lệ thành phần các chất Fe3O4 ~ 3 mg/mL, PLA-PEG ~ 0,3 mg/mL,

nồng độ hệ nano Fe3O4@PLA-PEG ~ 3 mg/mL.

Thử độc tính tế bào

Trong luận án này, chúng tôi sử dụng bộ kit CellTiter-Glo Luminescent Cell

Viability Assay (PROMEGA) để đánh giá độc tính của các chất thử nghiệm lên tế bào

ung thư nuôi cấy.

Quy trình thực hiện:

 Tế bào sau khi nhân nuôi được bổ sung vào các giếng của đĩa nuôi cấy 96 giếng

tối mầu với mật độ 2000 tế bào/giếng và nuôi cấy ổn định tại điều kiện 37oC, 5%

CO2, 95% không khí trong 24 h.

 Bổ sung các chất thử nghiệm và các giếng tế bào nói trên để đạt nồng độ Fe3O4

lần lượt là 100; 10; 1; 0,1; 0,01 µg/mL. Mỗi nồng độ được lặp lại 3 lần.

 Sau 48 h, các đĩa tế bào thử nghiệm được đo bởi máy đo quang phổ huỳnh quang

laminator ở bước sóng kích thích 500 nm.

Tính giá trị IC50.

Phương pháp nghiên cứu độc tính cấp

 Phương pháp tiêm truyền

Tiêm truyền hệ nano cho chuột: Hệ nano được tiêm qua đường tĩnh mạch đuôi. Sau

khi tiêm, chuột được chăm sóc và theo dõi về tình trạng sức khỏe.

 Phương pháp nghiên cứu độc tính cấp

Để nghiên cứu độc tính cấp của chế phẩm chúng tôi tiến hành hai thí nghiệm:

 Thí nghiệm xác định liều cận trên và cận dưới:

 Để xác định được giá trị LD50 cần khảo sát sơ bộ để tìm khoảng liều thử

độc tính cấp. Khoảng liều này nằm giữa liều cận trên (là liều cao nhất gây

chết 100% động vật thí nghiệm) và liều cận dưới (là liều thấp nhất gây chết

một cá thể động vật thí nghiệm).

 Để xác định liều cận trên và liều cận dưới chúng tôi sử dụng 40 chuột nhắt

trắng Swiss giống đực, đủ các tiêu chuẩn đã nêu, chia làm 7 lô, mỗi lô 5

con.

 Lô 1: dùng làm lô đối chứng sinh học, không tiêm chế phẩm (kí hiệu

ĐCSH).

 Lô 2: dùng thử hệ nano (liều 30 mg/kg trọng lượng).

 Lô 3: dùng thử hệ nano (liều 55 mg/kg trọng lượng).

 Lô 4: dùng thử hệ nano (liều 80 mg/kg trọng lượng).

 Lô 5: dùng thử hệ nano (liều 105 mg/kg trọng lượng).

 Lô 6: dùng thử hệ nano (liều 130 mg/kg trọng lượng).

 Lô 7: dùng thử hệ nano từ (liều 155 mg/kg trọng lượng).

 Lô 8: dùng thử hệ nano từ (liều 180 mg/kg trọng lượng).

Hệ nano được tiêm tĩnh mạch đuôi và được tiêm 1 lần duy nhất, trong quá trình

thí nghiệm chúng tôi tiến hành quan sát, theo dõi tình trạng sức khỏe, ghi lại thời điểm

và số chuột chết trong vòng 72 giờ để xác định liều cận trên và liều cận dưới.

 Thí nghiệm xác định LD50.

Dựa vào kết quả thí nghiệm xác định liều cận trên và cận dưới, chia khoảng liều

giữa cận trên và cận dưới thành 5 phân khoảng (6 liều nhỏ) để xác định LD50, thí nghiệm

được bố trí như sau:

 70 chuột được chia làm 7 lô: 1 lô ĐCSH không tiêm chế phẩm; 6 lô thí

nghiệm tiêm 6 liều như đã nêu trên.

 Theo dõi chuột hàng ngày, ghi lại số chuột chết trong vòng 72 giờ.

 Xây dựng đường cong thực nghiệm về sự phụ thuộc tỷ lệ tử vong vào

liều.

 Xác định đường cong lí thuyết từ số liệu thực nghiệm theo phương pháp

LITCHFELD WICOXON.

Tính LD50 bằng công thức sau:

Y = ax + b (2.8)

Trong đó: Y: % chuột chết (con),

x: Liều thuốc (mg/kg),

b: Hệ số,

a: Hệ số góc.

Thí nghiệm xác định LD50 được lặp lại 2 lần.

2.5.3. Phương pháp nhiệt từ trị tiêm trực tiếp vào khối u

Trong luận án này chúng tôi tiến hành nhiệt từ trị tiêm trực tiếp vào khối u trên mô

hình khối u rắn gây tạo trên chuột nhắt trắng Swiss được khảo sát trên khối u trong giai

đoạn phát triển (5 ngày tuổi sau cấy truyền) với quy trình tương tự được mô tả như sau:

Chuột được tiêm CLT 40 phút trước khi nhiệt từ trị để đảm bảo độ phân tán hạt

trong khối u và chiếu từ trường trên hệ RDO, model HFI với cường độ 70 Oe, tần số

178 kHz.

Cân nặng, kích thước, hình ảnh khối u được ghi lại trước và sau khi điều trị 1 ngày

nhằm đánh giá ảnh hưởng của nhiệt từ trị lên sự phát triển của khối u cũng như thể trạng

chuột.

Trước khi bắt đầu nhiệt trị, chuột được đánh dấu và phân lô với số lượng 6 con/1

lô, thí nghiệm được bố trí như bảng sau:

Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm nhiệt từ trị trên chuột mang khối u rắn dưới da

Lô thử nghiệm

Thể tích hệ nano tiêm vào

Thời gian chiết từ trường

Số lần chiếu từ trường

30 μL

40 phút

3 lần

Lô 1

20 μL

40 phút

3 lần

Lô 2

–

40 phút

3 lần

Lô 3

30 μL

–

Lô 4

–

Lô 5

–

Lô 6

Trong đó:

 Lô 1 và lô 2 là hai lô điều trị: Tiêm hệ thuốc nano vào khối u và chiếu từ

trường,

 Lô 3 - Đối chứng hóa trị: Không tiêm hệ thuốc nano từ nhưng chiếu từ trường,

 Lô 4 - Đối chứng nhiệt trị: Tiêm hệ thuốc nano từ nhưng không chiếu từ

trường,

 Lô 5 - Đối chứng ung thư: Không tiêm thuốc và không chiếu từ trường.

 Lô 6 - Đối chứng sinh học.

Tóm lược chương 2

Trong chương này chúng tôi đã trình bày chi tiết phương pháp tổng hợp

copolyme PLA-PEG với các tỷ lệ thành phần PLA:PEG là 3:1, 2:1, 1:1, 1:2 và 1:3, chế

tạo hệ dẫn thuốc nano copolyme PLA-PEG mang Curcumin không gắn và có gắn yếu

tố hướng đích Folat tạo thành hệ dẫn thuốc nano Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol.

Đã tổng hợp thành công hạt nano sắt từ Fe3O4 bằng phương pháp đồng kết tủa,

Fe3O4 được chức năng hóa bề mặt bởi copolyme PLA-PEG có mang và không mang

Curcumin tạo thành hệ dẫn thuốc nano từ tính Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-

PEG/Cur cũng được đề cập.

Đa số các phép đo đặc trưng sử dụng trong luận án được thực hiện tại Phòng thí

nghiệm Trọng điểm thuộc Viện Khoa học vật liệu trên các thiết bị hiện đại có độ chính

xác và tin cậy. Ngoài ra, một số phép đo, thử nghiệm sinh học các hệ dẫn thuốc trên tế

bào và chuột mang khối u, nghiên cứu độ hồi phục và chụp ảnh cộng hưởng từ MRI

được thực hiện tại các cơ sở nghiên cứu khác như: Nhóm nghiên cứu Ung thư học Thực

nghiệm, Bộ môn Sinh học Tế bào – Khoa Sinh học, Khoa Hóa học – Trường Đại học

Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên

– Viện HLKHCNVN, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, Bệnh viện Trung Ương Quân

đội 108 và Trường Đại học Đông Bắc, Thành phố Boston, Hoa Kỳ. Các kết quả thực

nghiệm sẽ được phân tích và bàn luận trong các chương 3, chương 4, chương 5.

Chương 3

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VÀ ĐẶC TÍNH CỦA HỆ NANO COPOLYME PLA-PEG ĐA CHỨC NĂNG

Nhiều loại thuốc đã bị hạn chế trong chữa trị lâm sàng do khả năng hòa tan kém

của chúng và nhiều thuộc tính không thuận lợi khác. Do đó, các hệ thống phân phối có

kiểm soát của polyme phân hủy sinh học có thể mang lại hiệu quả điều trị của thuốc

cao hơn và các ứng dụng tốt hơn đối với các loại thuốc ung thư [60, 113].

Nhiều tác nhân chữa trị không được thành công bởi vì khả năng nhắm mô đích

bị giới hạn, vì vậy việc phát triển công nghệ nano cho các hệ thống phân phối thuốc

hướng đích mang một ý nghĩa lớn, sự phát triển các hệ thống phân phối hướng đích đối

với các tác nhân chống ung thư, hóc môn và vắc xin được mong đợi nhất bởi vì tính an

toàn, thuận tiện và hiệu quả của chúng [3].

Curcumin là tác nhân chống ung thư đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi

[26]. Theo các kết quả nghiên cứu của một số chuyên gia thuộc Đại học dược Bang

Ohio, Mỹ năm 2012 cho biết: nano Curcumin có khả năng hấp thu đến 80%, vượt xa

rất nhiều so với các loại Curcumin thông thường khác [114]. Các nhà khoa học Mỹ, Ấn

Độ, Trung Quốc, Hà Lan, Nhật Bản, v.v. còn chứng minh được rằng nano Curcumin có

tác dụng chống lại hầu hết các loại ung thư như: ung thư vú, ung thư não, u phổi, máu,

gan, ruột, v.v. dựa trên các kết quả nghiên cứu và thử nghiệm lâm sàng và tiền lâm sàng

thu được [115].

Theo các nghiên cứu gần đây, các nhà khoa học khẳng định nano Curcumin có

tác dụng là chất giúp hủy diệt các tế bào ung thư vào loại mạnh nhất và ngăn cản không

cho các tế bào ung thư mới hình thành mà không hề gây tổn hại hay ảnh hưởng gì đến

các tế bào lành tính khác của cơ thể. Tác dụng của nano Curcumin khác biệt hoàn toàn

so với các loại thuốc chữa ung thư khác không những loại bỏ các tế bào ác tính mà còn

diệt luôn cả những tế bào lành tính khiến cơ thể người bệnh bị suy kiệt, chán ăn, rụng

tóc, buồn nôn, thâm chí có loại thuốc còn gây tử vong ngay sau khi sử dụng thuốc [26].

Với những ý nghĩa trên, việc chế tạo hệ nano copolyme mang Curcumin hướng

đích ứng dụng trong chữa trị ung thư mang một ý nghĩa và tầm quan trọng lớn. Trong

nghiên cứu này chúng tôi chế tạo hệ nano copolyme PLA-PEG mang Cur không và có

gắn yếu tố hướng đích Folat thử nghiệm trên dòng tế bào ung thư gan người HepG2.

3.1. Chế tạo các hệ nano copolyme PLA-PEG, Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-

PEG-Fol

3.1.1. Chế tạo hạt nano copolyme PLA-PEG

Hạt nano copolyme sử dụng trong luận án đã được chế tạo dựa theo phương pháp

bay hơi dung môi [69].

Sau khi được tổng hợp, mỗi loại copolyme PLA-PEG với các tỷ lệ thành phần

khác nhau được cân một lượng 20 mg, hòa tan trong 20 mL DCM, khuấy từ trong vòng

1 giờ. Sau đó cho thêm 20 mL H2O vào dung dịch copolyme. Cho hỗn hợp dung dịch

vào bình kín và tiếp tục khuấy 24 giờ trên máy khuấy từ. Copolyme PLA-PEG phân

tán dần dần vào trong pha nước. Đuổi hết dung môi DCM ta thu được copolyme PLA-

PEG phân tán trong nước tạo thành mixen có cấu trúc lõi-vỏ (dung dịch A).

3.1.2. Chế tạo hạt nano copolyme PLA-PEG mang Curcumin (Cur/PLA-PEG)

Việc mang Curcumin lên hệ nano PLA-PEG cũng đã được thực hiện dựa theo tài

liệu [69], quy trinh cụ thể như sau:

Curcumin được phân tán trong ethanol (C2H5OH) với nồng độ 4 mg/mL, sau đó

Curcumin được nhỏ từ từ vào dung dịch copolyme PLA-PEG, đậy kín nắp và tiếp tục

khuấy từ trong 24 giờ, tiếp theo mở nắp và tiếp tục khuấy từ đuổi dung môi ethanol, ly

tâm 5000 vòng/phút loại bỏ phần Curcumin không được bọc (phần tủa sau khi ly tâm)

và lấy phần dung dịch có màu vàng nghệ ở trên là hệ nano copolyme PLA-PEG mang

Curcumin (Cur/PLA-PEG), Cur/PLA-PEG được đặc trưng cấu trúc bằng phổ FT-IR và

lượng Curcumin mang vào được tính toán bằng phổ UV-Vis ở bước sóng 431 nm. Quá

trình trên được thực hiện tương tự đối với các copolyme PLA-PEG có các tỷ lệ thành

phần PLA:PEG khác nhau.

3.1.3. Chế tạo hạt nano copolyme PLA-PEG mang Curcumin và gắn yếu tố

hướng đích Folat (Cur/PLA-PEG-Fol)

Việc chế tạo hệ nano copolymer gắn thêm Folat đã được thực hiện dựa theo tài

liệu [69], các bước công nghệ cụ thể như sau. Copolyme PLA-PEG được hoạt hóa để

chuyển thành dạng PLA-PEG-COOH, theo đó PLA-PEG được hoạt hóa bằng axit

aspartic (AA) và DCC (N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide) với tỷ lệ khối lượng PLA-

PEG:AA:DCC là 20:1:1 hòa tan trong dimethyl sulfoxide (DMSO). Phản ứng thực hiện

ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ, sau khi phản ứng sản phẩm được chuyển lại trong môi

trường nước, cất quay chân không và sấy không. PLA-PEG-COOH sau đó được hoạt

hóa bằng EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) và NHS (N-

Hydrôxysuccinimide) với tỷ lệ khối lược PLA-PEG-COOH:EDC:NHS là 25:1,25:1 hòa

tan trong DMSO phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 5 giờ.

Folat được hoạt hóa bằng EDC và NHS với tỷ lệ mol Folat:EDC:NHS là 1:1,2:2

để tổng hợp Folat-NHS, phản ứng được thực hiện ở 50oC trong 6 giờ.

Folat-NHS được cho vào phản ứng với PLA-PEG-COOH đã được hoạt hóa với

tỷ lệ khối lượng PLA-PEG-COOH:Folat-NHS là 10:1, phản ứng được thực hiện ở nhiệt

độ phòng trong 48 giờ tạo thành sản phẩm PLA-PEG-Folat (PLA-PEG-Fol), sau khi

phản ứng sản phẩm được chuyển lại trong môi trường nước để loại bỏ Folat-NHS không

phản ứng, cất quay chân không và sấy khô.

Quy trình mang Curcumin lên hạt nano PLA-PEG-Folat được thực hiện tương tự

quy trình mang Curcumin lên hạt nano copolyme PLA-PEG tạo thành hệ nano

copolyme PLA-PEG mang Curcumin và gắn yếu tố hướng đích Folat (Cur/PLA-PEG-

Fol).

Quy trình chế tạo hạt nano copolyme PLA-PEG, hệ dẫn thuốc nano Cur/PLA-

PEG và Cur/PLA-PEG-Fol được mô tả cụ thể ở Hình 3.1.

Hình 3.1. Mô tả quy trình chế tạo hệ dẫn thuốc nano Cur/PLA-PEG, Cur/PLA-PEG-Fol

3.2. Cấu trúc, hình thái học và đặc trưng tính chất của các hạt nano PLA-PEG,

Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol

3.2.1. Hình dạng, kích thước và sự phân bố kích thước hạt nano PLA-PEG

Hạt nano PLA-PEG với các tỷ lệ thành phần PLA:PEG 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3 sau

khi tổng hợp được đặc trưng bằng chụp ảnh kính hiển vi điện tử quét FE-SEM. Kết quả

chụp ảnh SEM được trình bày ở Hình 3.2.

Hình 3.2. Ảnh FE-SEM của hạt nano copolyme PLA-PEG với các hợp phần PLA:PEG 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3 tương ứng với các hình 1A, 1B, 1C, 1D, 1E

Ảnh SEM cho thấy hạt nano PLA-PEG đều có dạng hình cầu và đơn phân tán,

kích thước trung bình dưới 100 nm. Tuy nhiên, hạt nano PLA-PEG với các tỷ lệ thành

phần PLA:PEG khác nhau có kích thước khác nhau, cụ thể với các hạt nano PLA-PEG

có tỷ lệ thành phần PLA:PEG càng cao kích thước càng lớn (copolyme PLA-PEG 3:1

có kích thước lớn nhất đạt trung bình 59 nm) và kích thước hạt càng giảm khi giảm tỷ

lệ thành phần PLA:PEG, hạt nano PLA-PEG có tỷ lệ thành phần PLA:PEG 1:3 có kích

thước trung bình nhỏ nhất, khi giữ nguyên hợp phần PLA và tăng hợp phần PEG thì

kích thước của hạt nano PLA-PEG không thay đổi nhiều. Trên cơ sở quan sát này chúng

ta biết được vai trò của các hợp phần PLA và PEG đến kích thước, hình dạng và sự

phân bố kích thước của hạt nano PLA-PEG và ảnh hưởng của các hợp phần trên đến

khả năng mang thuốc, nhập bào và giải phóng thuốc của hạt nano PLA-PEG với vai trò

là hệ nano phân phối thuốc phân hủy sinh học.

Hình 3.3. Phân bố kích thước thủy động (DLS) của các hệ nano PLA-PEG với tỷ lệ thành phần PLA:PEG 3:1, 2:1, 1:1, 1:2 và 1:3 tương ứng các hình A, B, C, D và E

So với kết quả ảnh SEM, kết quả đo phân bố kích thước hạt bằng phương pháp

tán xạ ánh sáng động (DLS) cho thấy kích thước (thủy động) của hạt có xu hướng tăng

lên. Kết quả phân bố hạt thu được bằng DLS được trình bày cụ thể ở Hình 3.3. Nguyên

nhân có thể do hai phương pháp đo khác nhau, phương pháp SEM đo mẫu khô vì vậy

khi sấy mẫu phần vỏ ưa nước bị co cụm lại, gần như chỉ đo được kích thước phần lõi 64

PLA. Ngược lại phương pháp DLS đo mẫu phân tán trong chất lỏng nên sẽ đo được

kích thước của cả phần lõi PLA và phần vỏ PEG, vì vậy kích thước có xu hướng tăng.

Qua đó cho thấy, hợp phần PLA đóng vai trò quyết định đối với độ lớn và kích

thước của hạt nano PLA-PEG. Điều này phù hợp với các công trình nghiên cứu đã được

công bố của nhóm nghiên cứu ở Singapore do S.S. Feng đứng đầu, theo đó trong cấu

trúc của copolyme PLA-PEG hợp phần PLA đóng vai trò là phần lõi kỵ nước quyết

định đến khả năng mang các loại thuốc kỵ nước, khi tăng hợp phần kỵ nước đồng nghĩ

với việc tăng khối lượng phần lõi của hạt nano, từ đó tăng kích thước hạt nano [68].

Trong khi đó hợp phần PEG đóng vai trò là phần vỏ ưa nước giúp hệ phân tán trong

môi trường nước hoặc môi trường sinh lý và giúp hệ nano tăng tính tương thích sinh

học [57, 116].

Mặt khác, nhờ hợp phần ưa nước PEG trong thành phần cấu tạo giúp các

copolyme PLA-PEG có khả năng phân tán tốt và ổn định trong môi trường nước [57].

Kết quả đo DLS của các copolyme mẫu PLA-PEG cho thấy thế Zeta đều < -30 mV

(Hình 3.4, Bảng 3.1).

Hình 3.4. Thế Zeta của copolyme PLA-PEG

Bảng 3.1. Phân bố kích thước hạt và thế Zeta của các hạt nano PLA-PEG

Mẫu

Kích thước SEM (nm) Kích thước DLS (nm) Thế Zeta (mV)

PLA-PEG 3:1

59

76 PLA-PEG 2:1

55

71 -33,7

PLA-PEG 1:1

50

68 PLA-PEG 1:2

49

65 PLA-PEG 1:3

49

65

Kết quả trên cho thấy thế Zeta của các copolyme PLA-PEG nằm trong khoảng

điện thế bề mặt ổn định (< -30 mV), hạt phân tán tốt và và ổn định. Kết quả này cũng

phù hợp với công bố của nhóm S.S. Feng [117] đối với hệ nano copolyme phân phối

thuốc.

3.2.2. Hình dạng, kích thước và sự phân bố kích thước hạt nano Cur/PLA-

PEG

Hạt nano PLA-PEG sau khi mang thuốc (Cur) tạo thành hệ nano Cur/PLA-PEG,

đã được đặc trưng bằng kính hiển vi điện tử FE-SEM. Kết quả ảnh chụp SEM của hệ

nano Cur/PLA-PEG được trình bày ở Hình 3.5.

Từ ảnh SEM ta thấy, sau khi mang thuốc hệ nano Cur/PLA-PEG có dạng hình

cầu và đơn phân tán. Như vậy, sau khi mang thuốc hình dạng và sự phân tán của hệ

không có sự thay đổi nhiều so với trước khi mang thuốc. Tuy nhiên, sau khi mang thuốc

kích thước của hệ nano Cur/PLA-PEG có tăng so với trước khi mang thuốc, điều này

được thể hiện ở Hình 3.5 và số liệu được trình bày ở Bảng 3.2.

Như vậy, thuốc (Cur) sau khi được mang vào trong hạt nano PLA-PEG đã làm

tăng kích thước của hệ nano Cur/PLA-PEG, cụ thể kích thước của hệ nano Cur/PLA-

PEG đã tăng khoảng 17% so với copolyme PLA-PEG và có xu hướng tăng tuyến tính

đối với các copolyme với các tỷ lệ thành phần PLA:PEG 3:1, 2:1, 1:1, 1:2 và 1:3.

Cụ thể, sau khi mang thuốc hệ nano Cur/PLA-PEG với tỷ lệ PLA:PEG 3:1 có

kích thước lớn nhất đạt khoảng 69 nm, sau đó giảm dần còn 65 nm, 61 nm, 60 nm và

60 nm đối với các hệ nano Cur/PLA-PEG có tỷ lệ thành phần PLA:PEG lần lượt là 2:1,

1:1, 1:2 và 1:3. Nguyên nhân tăng kích thước của hệ nano Cur/PLA-PEG so với

copolyme PLA-PEG được cho là do Curcumin sau khi được mang vào trong copolyme

PLA-PEG chúng sẽ chui vào phần lõi PLA và kết hợp với PLA thông qua phản ứng kỵ

nước giữa phần lõi kỵ nước PLA và thuốc kỵ nước Curcumin, qua đó làm tăng kích

thước của phần lõi và tăng kích thước chung của hệ nano Cur/PLA-PEG [118].

Hình 3.5. Ảnh FE-SEM của hệ hạt nano Cur/PLA-PEG với các hợp phần PLA:PEG 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, tương ứng với các hình A, B, C, D, E 67

Kết quả đo phân bố kích thước hạt bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động DLS

đối với các hạt nano Cur/PLA-PEG tương tự như trường hợp copolyme PLA-PEG chưa

mang Curcumin. Kích thước hạt tỏ ra lớn hơn so với kích thước hạt xác định từ ảnh

SEM, như có thể thấy trên Hình 3.6.

Hình 3.6. Phân bố kích thước thủy đông (DLS) của các hệ nano Cur/PLA-PEG với tỷ lệ thành phần PLA:PEG 3:1, 2:1, 1:1, 1:2 và 1:3, tương ứng các hình A, B, C, D và E

Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu đã được công bố bởi nhóm Gref và

cộng sự [57] về vai trò của hợp phần ưa nước PEG đối với khả năng tương thích sinh

học và sự tăng kích thước thủy động học trong môi trường sinh lý, giúp tăng khả năng

phân tán của hệ phân phối thuốc.

So với copolyme PLA-PEG, các hạt nano Cur/PLA-PEG có độ bền và khả năng

phân tán kém hơn (-20 mV< thế Zeta < -30 mV), tuy nhiên vẫn đảm bảo khả năng và

độ bền phân tán tạo thành hệ dẫn thuốc nano phân tán tương đối tốt trong môi trường

nước tạo thành dạng dung dịch, kết quả được trình bày ở Hình 3.7.

Hình 3.7. Thế Zeta của hạt nano Cur/PLA-PEG

Bảng 3.2. Phân bố kích thước hạt và thế Zeta của các hạt nano Cur/PLA-PEG

Mẫu

Kích thước SEM (nm) Kích thước DLS (nm) Thế Zeta (mV)

Cur/PLA-PEG 3:1

69

87 Cur/PLA-PEG 2:1

65

85 Cur/PLA-PEG 1:1

61

80 -23,7

Cur/PLA-PEG 1:2

60

78 Cur/PLA-PEG 1:3

60

78

Điều này có thể do sau khi mang Curcumin làm tăng tải trọng hợp phần kỵ nước

(Curcumin được mang vào trong lõi PLA), qua đó làm giảm khả năng phân tán của hệ

dẫn thuốc, kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu đã được công bố bởi nhóm

của giáo sư Feng [117].

3.2.3. Hình dạng, kích thước và sự phân bố kích thước hệ nano Cur/PLA-

PEG-Fol

Hạt nano PLA-PEG sau khi mang Curcumin và gắn yếu tố hướng đích Folat tạo

thành hệ nano Cur/PLA-PEG-Fol. Hình dạng, kích thước và sự phân bố kích thước của

hệ nano Cur/PLA-PEG-Fol được đặc trưng bằng kính hiển vi điện tử FE-SEM. Kết quả

ảnh SEM hệ nano Cur/PLA-PEG-Fol với các tỷ lệ thành phần PLA:PEG khác nhau

được trình bày ở Hình 3.8.

Hình 3.8. Ảnh FE-SEM của hạt nano Cur/PLA-PEG-Fol với các hợp phần PLA:PEG 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, tương ứng với các hình A, B, C, D, E 70

Kết quả ảnh SEM cho thấy, hệ nano Cur/PAL-PEG-Fol có dạng hình cầu đơn

phân tán, kích thước trung bình của hệ nano Cur/PLA-PEG-Fol lớn hơn so với hệ nano

Cur/PLA-PEG, trong đó kích thước trung bình của hệ nano Cur/PLA-PEG-Fol với tỷ

lệ PLA:PEG 3:1 là khoảng 86 nm và là lớn nhất (lớn hơn khoảng 17 nm so với hệ nano

Cur/PLA-PEG có cùng tỷ lệ PLA:PEG là 3:1). Tuy nhiên, đối với hệ nano Cur/PLA-

PEG-Fol có tỷ lệ PLA:PEG 1:3 kích thước trung bình nhỏ nhất đạt khoảng 80 nm nhưng

lớn hơn kích thước trung bình của hệ nano Cur/PLA-PEG với cùng tỷ lệ PLA:PEG 1:3

tới 20 nm.

So với kết quả ảnh SEM, phép đo phân bố kích thước hạt theo phương pháp tán

xạ ánh sáng động DLS của HDTNN Cur/PLA-PEG-Fol cho thấy kích thước hạt có xu

hướng tăng lên, như trình bày cụ thể ở Hình 3.9.

Hình 3.9. Đường phân bố kích thước (DLS) của các hệ nano Cur/PLA-PEG-Fol với tỷ lệ thành phần PLA:PEG 3:1, 2:1, 1:1, 1:2 và 1:3, tương ứng các hình A, B, C, D và E

Như vậy, kích thước của hệ nano copolyme sau khi mang thuốc và chức năng

hóa bởi yếu tố hướng đích Folat là tăng lên so với khi không được chức năng hóa yếu

tố hướng đích Folat, tuy nhiên biên dộ dao động kích thước của các hệ nano Cur/PLA-

PEG-Fol có tỷ lệ thành phần PLA:PEG khác nhau là hẹp hơn so với các hệ nano

Cur/PLA-PEG tương ứng.

Điều này có thể là do mật độ chuỗi ưa nước PEG trên các hệ nano có tỷ phần

PEG lớn sẽ làm tăng mật độ Folat gắn lên bề mặt hạt nano do đó chúng có xu hướng

làm tăng kích thước của hệ nano tương ứng, điều đó có thể dẫn đến hệ quả thu hẹp biên

độ giao động kích thước các hệ nano Cur/PLA-PEG-Fol [117, 119]. Cụ thể, hệ nano

Cur/PLA-PEG-Fol với các tỷ lệ thành phần PLA:PEG 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3 kích thước

trung bình tương ứng là 86 nm, 82 nm, 80 nm, 80 nm và 80 nm; trong khi đó kích thước

trung bình của các hệ nano Cur/PLA-PEG với các tỷ lệ PLA:PEG tương ứng là 69 nm,

65 nm, 61 nm, 60 nm và 60 nm.

Hình 3.10. Thế Zeta của hạt nano Cur/PLA-PEG-Fol

Hình 3.11. Phân bố kích thước các hệ nano PLA-PEG, Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol

So với các hạt nano PLA-PEG và Cur/PLA-PEG, hạt nano Cur/PLA-PEG-Fol

có độ bền và khả năng phân tán tốt nhất (thế Zeta -42.6 mV), tạo thành hệ dẫn thuốc

nano phân tán tốt trong môi trường nước, như thấy trên Hình 3.10.

Bảng 3.3. Phân bố kích thước hạt và thế Zeta của các hạt nano Cur/PLA-PEG-Fol

Mẫu

Kích thước SEM (nm) Kích thước DLS (nm) Thế Zeta (mV)

Cur/PLA-PEG 3:1

86

116 Cur/PLA-PEG 2:1

82

110 Cur/PLA-PEG 1:1

80

96 -42,6

Cur/PLA-PEG 1:2

80

95 Cur/PLA-PEG 1:3

80

96

Điều này có thể do khi được hoạt hóa và gắn yếu tố hướng đích (Folat) đã làm

tăng khả năng phân tán của hệ [117, 120, 121], kết quả cho thấy độ bền phân tán, độ ổn

định và khả năng ứng dụng HDTNN copolyme PLA-PEG mang thuốc gắn yếu tố hướng

đích (Cur/PLA-PEG-Fol) trong lĩnh vực y sinh, đặc biệt mang các loại thuốc hướng

đích trong điều trị ung thư.

3.2.4. Khả năng mang thuốc của các hạt nano PLA-PEG

Hạt nano PLA-PEG với các tỷ lệ thành phần PLA:PEG khác nhau được tiến hành

mang Curcumin để đánh giá khả năng mang thuốc của hệ, ảnh hưởng của các thành

phần PLA và PEG đến khả năng mang thuốc của copolyme PLA-PEG, qua đó đánh giá

vai trò của các thành phần trên đến khả năng mang thuốc.

Sau khi mang Curcumin vào các hạt copolyme PLA-PEG, lượng Curcumin được

tính toán thông qua các bước đo trên phổ UV-Vis kết hợp với đường chuẩn Curcumin

đã xây dựng trước đó để tính toán lượng Curcumin được mang vào trên mỗi loại

copolyme PLA-PEG với các thành phần PLA:PEG khác nhau.

Hình 3.12. Phổ UV-Vis (B) và phương trình đường chuẩn Curcumin (A)

Từ phổ UV-Vis (hình 3.12 B) và phương trình đường chuẩn được xác định theo

hình 3.12 A, kết hợp với cượng độ hấp thụ Curcumin của các mẫu hạt nano Cur/PLA-

PEG được xác định bằng phổ UV-Vis (Hình 3.13) ta có thể xác định được nồng độ Curcumin

trong các mẫu hạt nano Cur/PLA-PEG, kết quả cho thấy copolyme PLA-PEG có tỷ lệ thành

phần PLA càng cao khả năng mang Curcumin càng nhiều, copolyme PLA-PEG có tỷ

lệ thành phần PLA thấp lượng Curcumin mang vào thấp hơn. Số liệu thu nhận cụ thể

được trình bày ở Bảng 3.4.

Hình 3.13. Phổ UV-Vis của các hệ nano Cur/PLA-PEG với các tỷ lệ

thành phần PLA:PEG là 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3

Bảng 3.4. Kích thước hạt, lượng Curcumin và hiệu quả mang Curcumin của các hệ copolyme PLA-PEG, Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol

Kích thước các hệ nano (nm)

Tỷ lệ PLA/PEG

PLA-PEG Cur/PLA-PEG Cur/PLA-PEG-Fol

Lượng Cur mang vào (mg/mL)

Hiệu quả mang thuốc (%)

3:1

59

69

86 0,73

91,3

2:1

55

65

82 0,63

78,8

1:1

50

61

80 0,43

53,8

1:2

49

60

80 0,40

50 1:3

49

60

80 0,39

48,8

Khi tăng thành phần PLA trong copolyme PLA-PEG phần lõi PLA sẽ tăng lên,

chính vì vậy khi mang Curcumin vào sẽ tăng các mối liên kết kỵ nước giữa phần lõi

PLA với Curcumin [118, 122, 123], qua đó làm tăng lượng Curcumin được mang vào

và tăng hiệu quả mang thuốc. Do đó, copolyme PLA-PEG có tỷ lệ PLA:PEG càng lớn

khả năng mang Curcumin và hiệu quả mang Curcumin càng tăng, điều này được thể

hiện ở Hình 3.14 và Bảng 3.4, trong khi đó khi tăng thành phần PEG gần như không

ảnh hưởng đến khả năng và hiệu quả mang thuốc.

Hình 3.14. Ảnh hưởng của tỷ lệ PLA:PEG đến hiệu quả mang thuốc của hệ nano Cur/PLA-PEG 75

Với kết quả nghiên cứu trên ta thấy, khả năng hòa tan của Curcumin khi được

mang trong các hạt nano copolyme PLA-PEG đạt nồng độ cao nhất khoảng 0,73

mg/mL, cao hơn khoảng 7x102 lần so với độ hòa tan trong nước của Curcumin tinh chất

(11 μg/mL) [124]. Do đó, kết quả trên cho thấy cấu trúc mixen copolyme làm tăng đáng

kể khả năng hòa tan của Curcumin trong môi trường nước. Kết quả này có ý nghĩa quan

trọng trong việc nâng cao độ hòa tan, khả năng tương thích sinh học của các dược chất

khó tan trong môi trường nước hoặc môi trường sinh lý (Curcumin) nhờ các hệ nano

dẫn truyền và phân phối thuốc như copolyme PLA-PEG, qua đó nâng cao hiệu quả điều

trị của thuốc (Cur).

3.2.5. Kết quả đo phổ UV-Vis

Kết quả phân tích phổ UV-Vis của Curcumin, Cur/PLA-PEG, axit folic và

Cur/PLA-PEG-Fol cho thấy có sự khác nhau đối với các pic đặc trưng của Curcumin,

axit folic tinh chất so với Curcumin đã được mang vào copolyme PLA-PEG và axit

folic đã được gắn vào copolyme PLA-PEG. Kết quả được trình bày ở Hình 3.15A và

3.15B.

Hình 3.15. Phổ UV-Vis của Curcumin, Cur/PLA-PEG (A) và Curcumin, axit folic và Cur/PLA-PEG-Fol (B)

Các phổ đo được cho thấy, sau khi được mang vào copolyme PLA-PEG đỉnh hấp

thụ của Curcumin dịch chuyển từ 431 nm tới 426 nm, tương tự trường hợp của axit folic

đỉnh hấp thụ dịch chuyển từ 283 nm tới 276 nm sau khi được gắn vào copolyme PLA-

PEG, qua đó cho thấy đã có gắn kết axit folic vào copolyme PLA-PEG và Curcumin đã

được mang vào copolyme PLA-PEG [117].

3.2.6. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại FT-IR

Các mẫu copolyme PLA-PEG, copolyme PLA-PEG mang Curcumin (Cur/PLA-

PEG) và copolyme PLA-PEG gắn yếu tố hướng đích Folat (PLA-PEG-Fol), sau khi

tổng hợp xong, sấy khô và tiến hành đo FT-IR để xác định dao động của các liên kết

trong cấu tạo phân tử của chúng. Phổ hồng ngoại FT-IR đo được cho các mẫu với tỷ

phần PLA:PEG khác nhau được trình bày ở Hình 3.16.

Các phổ hồng ngoại (FT-IR) của PEG và copolyme PLA-PEG cho thấy dao động

của nhóm C-O-C trên PEG xuất hiện ở vị trí 1097 cm-1 đã dịch chuyển tới vị trí 1114

cm-1 trên các copolyme PLA-PEG, mặt khác dao động của nhóm –CO-O- (nhóm

cacboxyl) trên PLA xuất hiện ở vị trí 1480 cm-1 đã dịch chuyển tới vị trí 1539 cm-1 trên

các copolyme PLA-PEG và liên kết C-H ở vị trí 2924 cm-1 của PLA đã dịch chuyển tới

vị trí 2978 cm-1 của PLA-PEG. Vị trí 1539 cm-1 là dao động đặc trưng được hình thành

trong phản ứng trùng ngưng. Qua đó, có thể nói rằng copolyme PLA-PEG đã được tạo

thành thông qua phản ứng trùng ngưng mở vòng polyme hóa giữa PEG và mono axit

lactic [109].

Hình 3.16. Phổ FT-IR của PLA, PEG và PLA-PEG với tỷ lệ thành phần PLA:PEG khác nhau

Sau khi được tạo thành, copolyme PLA-PEG với các tỷ lệ thành PLA:PEG phần

khác nhau được mang Curcumin, sấy khô và tiến hành đặc trưng cấu trúc bằng phổ FT-

IR. Kết quả được trình bày ở Hình 3.17.

Hình 3.17. Phổ FT-IR của PLA, PLA-PEG, Curcumin, Cur/PLA-PEG

Các phổ FT-IR thu được cho các mẫu Curcumin, copolyme PLA-PEG và

Cur/PLA-PEG cho thấy có sự dịch chuyển bước sóng từ 1751 cm-1 (dao động C=O)

trên phổ Curcumin đến 1746 cm-1 trên phổ của Cur/PLA-PEG và 1250 cm-1 (dao động

biến dạng C-O) đến 1276 cm-1. Bên cạnh đó, dao động đặc trưng của copolyme PLA-

PEG tại vị trí 1539 cm-1 đã dịch chuyển đến vị trí 1506 cm-1 trên phổ của Cur/PLA-

PEG, qua đó cho thấy Curcumin đã được mang vào copolyme PLA-PEG [109, 125].

Hình 3.18. Phổ FT-IR của axit folic, PLA-PEG, Cur/PLA-PEG

và PLA-PEG-Fol

Copolyme PLA-PEG với các tỷ lệ thành phần PLA:PEG khác nhau sau khi gắn

yếu tố hướng đích Folat được đặc trưng bằng phổ FT-IR, kết quả được trình bày ở

Hình 3.18.

Hình 3.19. Phổ FT-IR của Cur/PLA-PEG với các tỷ lệ thành phần PLA:PEG khác nhau

Hình 3.20. Phổ FT-IR của Cur/PLA-PEG-Fol với các tỷ lệ thành phần PLA:PEG khác nhau

Phổ FT-IR của axit folic và PLA-PEG-Fol cho thấy có sự dịch chuyển dao động

ở bước sóng từ 1602 cm-1 (nhóm cacboxyl của axit folic) của axit folic sang 1607 cm-1

của PLA-PEG-Fol, mặt khác khi so sánh giữa copolyme PLA-PEG với PLA-PEG-Fol

ta thấy có sự dịch chuyển dao động từ vị trí 2978 cm-1 trên copolyme PLA-PEG (dao

động hóa trị C-H của nhóm CH3) của PLA-PEG) đến vị trí 2930 cm-1 trên PLA-PEG-

Fol, trong khi sự dịch chuyển dao động của Cur/PLA-PEG tới vị trí 2985 cm-1, có thể

Fol đã gắn thành công lên hệ mi-xen PLA-PEG [117].

Không có sự khác nhau đáng kể trên phổ FT-IR của các mẫu copolyme PLA-

PEG với các tỷ lệ trọng lượng PLA:PEG khác nhau.

3.3. Nghiên cứu giải phóng chậm Curcumin

10 mg hạt nano Cur/PLA-PEG hoặc Cur/PLA-PEG-Fol được phân tán trong 30

mL Đệm PBS, pH 7,4. Sau đó, được ủ trong bể nước ở 37oC, ở các khoảng thời gian

nhất định, 2 mL mẫu được lấy ra và đặt lại môi trường mới với cùng thể tích ban đầu,

nồng độ Curcumin trong mỗi mẫu được đặc trưng bằng phổ UV-Vis.

Hình 3.21. Tỷ lệ % giải phóng chậm Cur từ hệ nano Cur/PLA-PEG (A) và Cur/PLA-PEG-Fol (B) tại 37oC

Kết quả nghiên cứu thuộc tính giải phóng chậm in vitro của Curcumin từ hệ nano

Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol ở bảng 3.5, 3.6 và Hình 3.21A, 3.21B cho thấy,

lượng Curcumin giải phóng chậm sau 48 giờ có xu hướng bão hòa trên cả hai hệ nano

Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol, trong đó đối với hệ nano Cur/PLA-PEG tỷ lệ nhả

chậm Curcumin đạt cao nhất 91,1% với Cur/PLA-PEG có tỷ lệ thành phần PLA:PEG

3:1 và thấp nhất 83,2% với Cur/PLA-PEG có tỷ lệ thành phần PLA:PEG 1:3, kết quả

tương ứng trên hệ nano Cur/PLA-PEG-Fol là 89,1% và 72,3%. Như vậy, khi so sánh

khả năng giải phóng chậm trên hai hệ Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol ta thấy, hệ

nano Cur/PLA-PEG có tỷ lệ giải phóng chậm Cucurmin cao hơn hệ nano Cur/PLA-

PEG-Fol với tỷ lệ thành phần PLA:PEG tương ứng, với hệ nano Cur/PLA-PEG có tỷ

lệ PLA:PEG 3:1 có tỷ lệ giải phóng chậm Curcumin cao hơn hệ nano Cur/PLA-PEG-

Fol tương ứng khoảng 2 %. Tỷ lệ này tăng dần và đạt cao nhất khoảng 11% đối với hệ

nano Cur/PLA-PEG có tỷ lệ PLA:PEG 1:3.

Bảng 3.5. Tỷ lệ % Curcumin giải phóng chậm từ hệ nano Cur/PLA-PEG tại 37oC

Curcumin giải phóng chậm (%)

Thời gian

PLA:PEG 3:1

PLA:PEG 2:1

PLA:PEG 1:1

PLA:PEG 1:2

PLA:PEG 1:3

0 0 giờ

31,1±1,6

26,2±1,3

22,1±1,1

21,2±1,1

20,2±1,0

3 giờ

6 giờ

58,8±2,9

51,2±2,6

44,1±2,2

42,5±2,1

40,5±2,0

12 giờ

81,1±4,1

78,2±3,9

72,2±3,6

70,9±3,5

69,6±3,5

24 giờ

88,8±4,4

85,7±4,3

83,1±4,2

81,1±4,1

36 90,4±4,5

88,6±4,4

84,3±4,2

83,1±4,2

82,2±4,1

48 giờ

91,1±4,6

89,1±4,5

85,1±4,3

84,2±4,2

83,2±4,2

Bảng 3.6. Tỷ lệ % Curcumin giải phóng chậm từ hệ nano Cur/PLA-PEG-Fol tại 37oC

Curcumin giải phóng chậm (%)

Thời gian

PLA:PEG 3:1

PLA:PEG 2:1

PLA:PEG 1:1

PLA:PEG 1:2

PLA:PEG 1:3

0 0 giờ

31,2±1,6

26,2±1,3

21,2±1,1

17,3±0,9

6,2±0,3

3 giờ

58,8±2,9

51,2±2,6

45,3±2,3

38,5±1,9

20,5±1,0

6 giờ

12 giờ

81,2±4,1

78,3±3,9

70,1±3,0

66,9±3,3

50,5±2,5

24 giờ

88,8±4,4

85,7±4,3

80,2±4,0

77,1±3,9

68,1±3,4

36 giờ

90,5±4,5

88,6±4,4

82,1±4,1

79,1±4,0

70,2±3,5

48 giờ

89,1±4,5

88,1±4,4

83,3±4,2

80,2±4,0

72,3±3,6

Kết quả nghiên cứu thuộc tính giải phóng chậm in vitro của Curcumin từ hệ nano

Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol ở bảng 3.5, 3.6 và Hình 3.21A, 3.21B cho thấy,

lượng Curcumin giải phóng chậm sau 48 giờ có xu hướng bão hòa trên cả hai hệ nano

Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol, trong đó đối với hệ nano Cur/PLA-PEG tỷ lệ nhả

chậm Curcumin đạt cao nhất 91,1% với Cur/PLA-PEG có tỷ lệ thành phần PLA:PEG

3:1 và thấp nhất 83,2% với Cur/PLA-PEG có tỷ lệ thành phần PLA:PEG 1:3, kết quả

tương ứng trên hệ nano Cur/PLA-PEG-Fol là 89,1% và 72,3%.

Như vậy, khi so sánh khả năng giải phóng chậm trên hai hệ Cur/PLA-PEG và

Cur/PLA-PEG-Fol ta thấy, hệ nano Cur/PLA-PEG có tỷ lệ giải phóng chậm Cucurmin

cao hơn hệ nano Cur/PLA-PEG-Fol với tỷ lệ thành phần PLA:PEG tương ứng, với hệ

nano Cur/PLA-PEG có tỷ lệ PLA:PEG 3:1 có tỷ lệ giải phóng chậm Curcumin cao hơn

hệ nano Cur/PLA-PEG-Fol tương ứng khoảng 2 %. Tỷ lệ này tăng dần và đạt cao nhất

khoảng 11% đối với hệ nano Cur/PLA-PEG có tỷ lệ PLA:PEG 1:3.

Cơ chế giải phóng chậm của Curcumin từ hệ nano Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-

PEG-Fol có thể liên quan đến sự khuếch tán của thuốc (Curcumin) từ trong nhân ra

ngoài vỏ và có sự phân hủy của vật liệu polymer [126, 127]. Đầu tiên, môi trường dần

dần đi vào bên trong lõi của mi-xen để phân tán Curcumin và Curcumin phân tán chậm

vào môi trường, sau đó các vật liệu mang (copolyme PLA-PEG) bị ăn mòn và phân

hủy, Curcumin được giải phóng chậm vào môi trường. Tuy nhiên, khi so sánh khả năng

giải phóng chậm Curcumin của hệ nano Cur/PLA-PEG với Cur/PLA-PEG-Fol, ta thấy

khả năng giải phóng chậm Curcumin của hệ nano Cur/PLA-PEG cao hơn Cur/PLA-

PEG-Fol, nguyên nhân có thể là do yếu tố Folat, khi Folat gắn kết và bao phủ trên bề

mặt của hệ nano đã làm giảm quá trình thâm nhập của môi trường vào bên trong lõi,

qua đó làm chậm quá trình ăn mòn và phân hủy vật liệu mang (phần lõi PLA của

copolyme PLA-PEG), hệ quả là làm chậm quá trình giải phóng Curcumin vào môi

trường và dẫn đến làm giảm tỷ lệ giải phóng Curcumin vào môi trường [127, 128].

3.4. Nghiên cứu khả năng gây độc trên tế bào ung thư của các hệ nano

Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol

Đã tiến hành nghiên cứu khả năng gây độc tế bào in vitro với mục tiêu đánh giá

khả năng ức chế tế bào ung thư (HepG2, dòng tế bào ung thư gan người) của hệ nano

Cur/PLA-PEG, Cur/PLA-PEG-Fol so với Curcumin tự do copolyme PLA-PEG, qua đó

đánh giá vai trò của các hệ nano phân phối thuốc trong việc ức chế và tiêu diệt tế bào

ung thư.

Kết quả thử nghiệm trên các hệ copolyme PLA-PEG, Cur/PLA-PEG, Cur/PLA-

PEG-Fol và Curcumin tự do cho thấy: đối với copolyme PLA-PEG không mang thuốc

không biểu hiện khả năng gây độc trên dòng tế bào HepG2, do đó copolyme PLA-PEG

là tương thích sinh học với dòng tế bào này. Trong khi đó, số liệu ở Bảng 3.7 và Hình

3.22 cho thấy khả năng gây độc của Curcumin tự do (Cur/H2O) và mi-xen Cur/PLA-

PEG, Cur/PLA-PEG-Fol sau khi ủ 48 giờ với dòng tế bào HepG2 có sự khác biệt lớn.

Giá trị IC50 của Curcumin tự do (Cur/H2O) đối với dòng tế bào HepG2 đạt khoảng

820 μm/mL, trong khi hiệu quả gây độc của Curcumin được mang trong hệ nano

Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol đối với dòng tế bào HepG2 là rất đáng kể, giá trị

IC50 của các hệ nano Cur/PLA-PEG dao động từ 94,4 μm/mL đến 114,8 μm/mL tương

ứng với tỷ lệ PLA:PEG từ 3:1 đến 1:3, đối với hệ nano Cur/PLA-PEG-Fol giá trị IC50

dao động từ 12,7 μm/mL đến 19,0 μm/mL. Kết quả trên cho thấy, giá trị IC50 của hệ

nano Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol thấp hơn Cur/H2O lần lượt khoảng 7 lần và

60 lần, điều đó cho thấy hệ nano Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol làm tăng khả

năng hòa tan của Curcumin đồng thời tăng khả năng nhập bào và Curcumin đã được

giải phóng từ hệ nano Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol khi được ủ với dòng tế bào

HepG2 [129]. Khi so sánh kết quả IC50 giữa hệ nano Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-

Fol cho thấy giá trị IC50 của hệ nano Cur/PLA-PEG-Fol thấp hơn hệ nano Cur/PLA-

PEG khoảng 7 lần, kết quả trên có thể do khi gắn yếu tố hướng đích Folat sẽ làm tăng

khả năng nhập bào và tăng hiệu quả tiêu diệt tế bào [129].

Hình 3.22. Giá trị IC50 của Cur/H2O, Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol

Bảng 3.7. Giá trị IC50 của hệ nano Cur/PLA-PEG, Cur/PLA-PEG-Fol và Cur/H2O

Cur/H2O

Tỷ lệ PLA:PEG

IC50 (μg/mL)

Cur/PLA-PEG IC50 (μg/mL)

Cur/PLA-PEG-Fol IC50 (μg/mL)

3:1

114,8±5,7

19,0±0,9

2:1

106,9±5,3

14,2±0,7

820,6±41,0

1:1

97,5±4,9

12,8±0,6

1:2

98,8±4,9

12,1±0,6

1:3

94,4±4,7

12,7±0,6

Những kết quả trên cho thấy, copolyme PLA-PEG đóng một vai trò rất quan

trọng trong việc tăng khả năng hòa tan của Curcumin trong nước hoặc đệm sinh lý

(PBS) và tăng khả năng nhập bào, đặc biệt khi copolyme PLA-PEG được gắn với yếu

tố hướng đích (Folat). Kết quả này có thể tạo nên một số đóng góp ý nghĩa để nghiên

cứu và tổng hợp hệ nano copolyme phân phối thuốc hướng đích sử dụng những loại

thuốc (dược chất) tự nhiên khó tan trong nước như Curcumin. Kết quả này cũng phù

hợp với những công trình do nhóm của TS. Hà Phương Thư và cộng sự công bố trước

đây trên các tạp chí quốc tế và trong nước trong lĩnh vực nghiên cứu sử dụng các hạt

nano phân hủy sinh học gắn Folat nhằm nâng cao hiệu quả nhập bào của thuốc trị ung

thư [109, 130].

Hình 3.23. Giá trị IC50 của Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol

Bảng 3.8. Giá trị IC50, hiệu quả mang Cur và hiệu quả nhập bào của hệ nano Cur/PLA-PEG

IC50

Cur/PLA-PEG (PLA:PEG)

(μg/mL)

Lượng Cur mang vào (mg/mL)

Hiệu quả mang Cur (%)

Hiệu quả nhập bào (%)

3:1

114,8±5,7

0,73

91,3

82,2

2:1

106,9±5,3

0,63

78,8

88,3

1:1

97,5±4,9

0,43

53,8

96,8

1:2

98,8±4,9

0,40

50 95,5

1:3

94,4±4,7

0,39

48,8

100 Bảng 3.9. Giá trị IC50, hiệu quả mang Cur và hiệu quả nhập bào của hệ nano Cur/PLA-PEG-Fol

IC50

Cur/PLA-PEG-Fol (PLA:PEG)

Lượng Cur mang vào (mg/mL)

Hiệu quả mang Cur (%)

Hiệu quả nhập bào (%)

(μg/mL)

3:1

19,0±0,9

0,73

91,3

63,7

2:1

14,2±0,7

0,63

78,8

85,2

1:1

12,8±0,6

0,43

53,8

94,5

1:2

12,1±0,6

0,40

50 98,4

1:3

12,7±0,6

0,39

48,8

100

So sánh mối tương quan giữa khả năng mang thuốc và hiệu quả tiêu diệt tế bào

ung thư của hệ nano Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol đã thu được kết quả trình

Đối chứng

Cur/PLA-PEG

Cur/PLA-PEG-Fol

bày ở Bảng 3.8, 3.9 và Hình 3.23.

Cur/PLA-PEG-Fol

PLA-PEG (3:1)

PLA-PEG (2:1)

PLA-PEG (1:1)

PLA-PEG (1:2)

PLA-PEG (1:3)

Cur/PLA-PEG-Fol Cur/PLA-PEG-Fol

Hình 3.24. Sự thay đổi hình dạng tế bào HepG2 dưới tác dụng của Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol

Kết quả trên cho thấy, copolyme PLA-PEG 3:1 có hiệu quả mang Curcumin cao

nhất đạt 91,3% (tương ứng với 0,73 mg/mL) và thấp nhất là copolyme PLA-PEG 1:3

đạt 48,8% (tương ứng với 0,39 mg/mL). Khi so sánh khả năng nhập bào của các hệ

nano Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol, ta thấy hiệu quả nhập bào của hệ nano

Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol có tỷ lệ PLA:PEG 1:3 đạt hiệu quả cao nhất. Tuy

nhiên, khi so sánh mối tương quan đồng thời các yếu tố như khả năng mang Curcumin,

hiệu quả nhập bào của cả hệ nano Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol ta thấy

copolyme PLA-PEG với tỷ lệ thành phần PLA:PEG 2:1 đạt kết quả tốt nhất với khả

năng mang Curcumin là 0,63 mg/mL (78,8%), hiệu quả nhập bào đạt 88,3 % (trên hệ

Cur/PLA-PEG) và 85,2 % (trên hệ Cur/PLA-PEG-Fol). Kết quả trên cho thấy, đối với

hệ nano phân phối thuốc copolyme PLA-PEG có sự tương quan giữa phần lõi PLA và

phần vỏ PEG, phần lõi PLA đóng vai trò quyết định đến khả năng mang thuốc, phần

lõi càng lớn khả năng mang thuốc càng tang [68], trong khi đó phần vỏ PEG đóng vai

trò rất quan trọng đối với khả năng tương thích sinh học và nhập bào [57].

Các ảnh quang học thu được (Hình 3.24) cho thấy mixen Cur/PLA-PEG-Fol nhập

bào và gây ức chế tế bào cao hơn Cur/PLA-PEG, kết quả này phần nào chứng minh yếu

tố hướng đích Folat đóng vai trò quan trọng tăng khả năng hướng đích và nhập bào đối

với các hệ mi-xen.

Kết luận chương 3

Đã tổng hợp được hệ nano copolyme PLA-PEG với tỷ lệ thành phần PLA:PEG

3:1, 2:1, 1:1, 1:2 và 1:3 có cấu trúc lõi-vỏ, với phần lõi kỵ nước PLA và phần vỏ ưa

nước PEG, kích thước hạt trung bình dưới 100 nm phù hợp để mang và phân phối các

thuốc (dược chất kỵ nước) như Curcumin.

Khả năng mang Curcumin của hệ nano do hợp phần PLA quyết định là chủ yếu,

copolyme PLA-PEG 3:1 mang được lượng Curcumin nhiều nhất (0,73 mg/mL) và đạt

hiệu quả mang thuốc cao nhất (91,3%). Sau khi mang thuốc kích thước hạt tăng trung

bình khoảng 17% trên tất cả các copolyme PLA-PEG có tỷ lệ PLA:PEG khác nhau.

Đã gắn được yếu tố hướng đích Folat lên hệ copolyme PLA-PEG, sau khi gắn

yếu tố hướng đích kích thước hạt có xu hướng tăng so với trước.

Kết quả thử nghiệm in vitro cho thấy hệ nano Cur/PLA-PEG-Fol có chỉ số IC50

tốt nhất, hiệu quả cao hơn khoảng 7 lần so với hệ nano Cur/PLA-PEG và khoảng 60 lần

so với Cur/H2O.

Trong các hệ nano copolyme PLA-PEG với các tỷ lệ thành phần PLA:PEG 3:1,

2:1, 1:1, 1:2 và 1:3, copolyme PLA-PEG 2:1 vừa đảm bảo khả năng mang thuốc vừa

đảm bảo khả năng nhập bào của hệ sau khi đã gắn yếu tố hướng đích Folat.

Chương 4 NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VÀ ĐẶC TÍNH CỦA HỆ CHẤT LỎNG NANO TỪ ĐA CHỨC NĂNG LÕI HẠT Fe3O4

Trong tự nhiên, ôxit sắt từ (Fe3O4) là vật liệu ôxit từ có từ độ bão hòa lớn nhất

tại nhiệt độ phòng [131]. Nhờ hầu như không độc với cơ thể người và có tính ổn định

trong môi trường không khí nên hạt nano Fe3O4 được quan tâm nghiên cứu và sử dụng

nhiều nhất trong nhiệt trị ung thư nói riêng và các ứng dụng trong y học nói chung

[132]. Để đảm bảo độ phân tán trong dung môi cũng như tính tương hợp sinh học với

cơ thể, hạt nano từ thường được bọc với nhiều vật liệu có bản chất khác nhau: các phân

tử nhỏ và chất hoạt hóa bề mặt, các phân tử sinh học (như protein, kháng nguyên, biotin,

v.v.), vật liệu vô cơ (như vàng, bạc, platin, cacbon, silica, titan diôxit) hoặc bằng các

polyme tự nhiên như tinh bột, chitosan, dextran hay polyme tổng hợp như polyethylene

glycol (PEG), Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA), dendrime,v.v. [48, 133, 134].

Trong luận án này, chúng tôi tiến hành chức năng hóa bề mặt hạt nano ôxit sắt

bằng copolyme PLA-PEG có và không mang Curcumin tạo thành các hệ chất lỏng từ

nano đa chức năng, sau đó đặc trưng hình dạng, cấu trúc, nghiên cứu các đặc tính từ,

khảo sát hiệu ứng đốt nóng cảm ứng từ (MIH) và nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc

(Cur) dựa vào hiệu ứng này. Những kết quả nghiên cứu trong chương này là cần thiết

cho các thử nghiệm sinh học tiếp theo đối với hệ chất lỏng nano từ đa chức năng.

Các hạt nano Fe3O4, Fe3O4@PLA-PEG, Fe3O4@PLA-PEG/Cur sau khi chế tạo

được thực hiện các phép đo đặc trưng khác nhau. Cấu trúc tinh thể của hạt lõi Fe3O4

được đặc trưng bằng phổ nhiễu xạ tia X. Hình dạng, kích thước và sự phân bố kích

thước các hạt nano được đặc trưng bởi chụp ảnh kính hiển vi điện tử quét (SEM) và

kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM). Khả năng phân tán và độ bền phân tán của các

hạt nano được khảo sát bằng phép đo thế Zeta. Đường cong từ trễ, và từ độ bão hòa

M(H) được đặc trưng bằng hệ đo từ kế mẫu rung (VSM). Phổ hồng ngoại FT-IR được

tiến hành để đánh giá khả năng liên kết hạt nano Fe3O4 với PLA-PEG tạo thành hạt

nano Fe3O4@PLA-PEG và mang Curcumin tạo thành hạt nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur.

Phép đo cộng hưởng từ hạt nhân của mẫu hạt nano Fe3O4@PLA-PEG, Fe3O4@PLA-

PEG/Cur trong dung dịch nước đựợc thực hiện theo chế độ trọng T1, T2 để xác định độ

hồi phục dọc (r1) và độ hồi phục ngang (r2). Trong khi đó, khả năng mang Curcumin

của hệ nano copolyme đa chức năng được đặc trưng bởi phổ UV-Vis, hiệu ứng đốt từ

của các hệ nano được đặc trưng bằng hệ đốt nóng cảm ứng từ, khả năng giải phóng

Curcumin của hệ nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur được thực hiện đồng thời theo hai

phương pháp ủ nhiệt theo thời gian (thụ động) và kích nhiệt tại chỗ dựa vào từ trường

ngoài (chủ động).

4.1. Chế tạo hệ nano Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur

4.1.1. Tổng hợp hạt nano Fe3O4

Muối FeCl3 và FeCl2.4H2O với khối lượng lần lượt 0,65 g và 0,398 g được hòa

tan trong 50 mL HCl 2 M, sau đó chuyển vào bình 3 cổ dung tích 500 mL, phản ứng

xảy ra trong môi trường kiềm, dung dịch NH4OH 2M được nhỏ chậm vào dung dịch

phản ứng, phản ứng được thực hiện ở 70oC, khuấy từ và sục khí N2 liên tục trong suốt

quá trình phản ứng, sơ đồ phản ứng được trình bày ở Hình 4.1.

Hình 4.1. Sơ đồ tổng hợp hạt nano Fe3O4 bằng phương pháp đồng kết tủa

Sau khi tổng hợp hạt nano sắt từ được phân tán trong môi trường nước, chuẩn

bị để thực hiện các nội dung tiếp theo.

4.1.2. Chế tạo hệ nano Fe3O4@PLA-PEG

Hạt nano Fe3O4 sau khi tổng hợp được phân tán vào trong nước, chức năng hóa

bởi PLA-PEG tạo thành hạt nano Fe3O4@PLA-PEG.

Theo đó, copolyme PLA-PEG với tỷ lệ trọng lượng PLA:PEG 3:1 được hòa tan

trong DCM, khuấy từ trong vòng 2 giờ. Sau đó cho thêm H2O vào, cho hỗn hợp dung

dịch vào bình kín và khuấy từ trong 24 giờ để phân tán copolyme PLA-PEG từ dung

môi DCM vào H2O, mở nắp đuổi hết dung môi DCM, thu được copolyme PLA-PEG

phân tán trong nước. Sau đó, hạt nano Fe3O4 phân tán trong nước được nhỏ từ từ vào

dung dịch copolyme PLA-PEG, khuấy từ trong 24 giờ thu được hạt nano Fe3O4@PLA-

PEG (Hình 4.2 hàng trên).

4.1.3. Chế tạo hệ nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur

Hạt nano Fe3O4@PLA-PEG sau khi chế tạo được phân tán trong nước và mang

Curcumin tạo thành hệ nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur theo sơ đồ Hình 4.2.

Hình 4.2. Mô tả quy trình chế tạo hệ dẫn thuốc nano Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur

4.2. Cấu trúc, hình thái học và đặc trưng tính chất các mẫu hạt nano Fe3O4,

Fe3O4@PLA-PEG, Fe3O4@PLA-PEG/Cur

4.2.1. Phân tích XRD

Các đặc tính của hệ nano Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur được xác

định cẩn thận và các đặc tính này cũng đã được trình bày trong công bố [135] của chúng

tôi. Giản đồ XRD (Hình 4.3) của tất cả 3 mẫu Fe3O4, Fe3O4@PLA-PEG và

Fe3O4@PLA-PEG/Cur cho thấy chỉ có tất cả 6 pic nhiễu xạ tương ứng 6 mặt (200),

(311), (400), (422), (511) và (440) của cấu trúc spinel, chứng tỏ rằng sự hình thành hệ

nano Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur không ảnh hưởng đến cấu trúc tinh

thể của hạt lõi nano từ Fe3O4. Kết quả này có thể dẫn đến việc bảo toàn các thuộc tính

từ của hệ nano, điều này có thể thấy rõ ở các kết quả nghiên cứu tiếp theo.

Hình 4.3. Giản đồ XRD của Fe3O4, Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur

4.2.2. Phân tích FT-IR

Các mẫu hạt nano Fe3O4, Fe3O4@PLA-PEG, Fe3O4@PLA-PEG/Cur được chuẩn

bị dưới dạng bột khô để đo FT-IR, các phổ thu nhận được được trình bày ở Hình 4.4.

So sánh các phổ FT-IR của các mẫu hạt nano Fe3O4 và Fe3O4@PLA-PEG cho

thấy dao động 632 cm-1 trên phổ của hạt nano Fe3O4 chuyển dịch về 628 cm-1, đồng

thời xuất hiện thêm dao động ở vị trí 1384 cm-1 trên phổ FT-IR của hạt nano

Fe3O4@PLA-PEG, qua đó chứng tỏ bề mặt hạt nano sắt từ có thể đã được liên kết bởi

và bọc bằng copolyme [109] (Hình 4.4).

Hình 4.4. Phổ FT-IR của các hệ mẫu hạt nano Fe3O4, Fe3O4@PLA-PEG, Fe3O4@PLA- PEG/Cur

Đối với hệ mẫu Fe3O4@PLA-PEG/Cur, xuất hiện thêm dao động tại vị trí 1276

cm-1, bên cạnh dao động tại vị trí 1589 cm-1, qua đó cho thấy có thể hệ nano

Fe3O4@PLA-PEG/Cur đã được tạo thành trên cơ sở kết hợp giữa hạt nano sắt từ và

Curcumin tạo thành hệ mang thuốc đa chức năng [109] (Hình 4.4).

4.2.3. Hình dạng, kích thước và sự phân bố kích thước các hạt nano Fe3O4,

Fe3O4@PLA-PEG, Fe3O4@PLA-PEG/Cur

Các hạt nano Fe3O4, Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur khi được đặc

trưng bởi kính hiển vi điện tử quét FE-SEM và kính hiển vi điện tử truyền qua TEM

cho thấy các hạt nano có dạng hình cầu đơn hạt.

Phân tích ảnh TEM cho thấy hạt nano Fe3O4@PLA-PEG, Fe3O4@PLA-PEG/Cur

có kích thước gần tương đương nhau, đạt khoảng 20 nm và lớn hơn khoảng 5 nm so

với hạt nano Fe3O4 (kích thước khoảng 15 nm). Các ảnh hiển vi điện tử phân giải cao

(Hình 4.5-1b, 4.5-2b, 4.5-1c, 4.5-2c) thể hiện quần sáng mờ bao quanh phần lõi đen.

Như vậy có thể nói rằng sau khi chức năng hóa Fe3O4 bằng PLA-PEG đã tạo thành cấu

trúc lõi-vỏ, có dạng đơn hạt lõi và kích thước của hạt nano có tăng lên. Cụ thể kích

thước hạt nano Fe3O4 sau khi chức năng hóa tăng trung bình khoảng 25%.

Fe3O4

Fe3O4@PLA-PEG

Fe3O4@PLA-PEG/Cur

Fe3O4

Fe3O4@PLA-PEG

Fe3O4@PLA-PEG/Cur

Hình 4.5. Ảnh SEM, TEM và phân bố kích thước của các hạt nano Fe3O4, Fe3O4@PLA- PEG, Fe3O4@PLA-PEG/Cur tương ứng hình 1A, 1B, 1C; 2A, 2B, 2C và 3A, 3B, 3C

Sau khi hạt nano Fe3O4 được chức năng hóa bởi PLA-PEG tạo thành hạt nano

Fe3O4@PLA-PEG có cấu trúc lõi-vỏ, với phần lõi là hạt nano Fe3O4 được tin là tiếp

giáp với hợp phần PLA, còn phần vỏ bọc là hợp phần PEG. Sau khi mang Curcumin

tạo thành hạt nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur cũng có cấu trúc lõi-vỏ tương tự như hạt nano

Fe3O4@PLA-PEG (Hình 4.5-2b, 4.5-2c).

Sự hình thành cấu trúc lõi-võ như vậy được giả định như sau: Sau khi thâm nhập

vào trung tâm của hạt nano PLA-PEG (kích thước trung bình khoảng 50 nm) [136] hạt

nano Fe3O4 gắn kết với hợp phần PLA tạo liên kết mạnh trên bề mặt hạt Fe3O4, do đó

kích thước tổng thể của hạt copolyme sẽ giảm xuống còn khoảng 20 nm, kết quả này

có thể quan sát khi phân tích ảnh TEM, copolyme PLA-PEG tạo thành một lớp vỏ mỏng

bên ngoài hạt nano Fe3O4. Đối với hạt nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur, phân tử Curcumin

thâm nhập vào bên trong trung tâm hạt copolyme và hấp thụ trên bề mặt hạt Fe3O4 giúp

tăng cường gắn kết hạt nano Fe3O4 với lớp bọc và làm cho kích thước của hệ nano mang

Curcumin gần như giống với kích thước hệ nano không mang Curcumin.

Khác với những kết quả có được từ ảnh FE-SEM và TEM, kích thước của các

mẫu Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur được đo trong môi trường nước

(Hình 4.6) có sự thay đổi đáng kể.

Hình 4.6. Kích thước thủy động (DLS) các hạt nano Fe3O4, Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur tương ứng các hình (A), (B) và (C)

Kích thước hạt nano Fe3O4 đo trong môi trường nước khoảng 37 nm, lớn hơn

kích thước hạt nano Fe3O4 khô, điều này có thể được giải thích do sự hấp phụ trên bề

mặt của các ion OH- trong dung dịch nước lên bề mặt của hạt nano Fe3O4. Trong khi

đó, kích thước trung bình của hạt nano Fe3O4@PLA-PEG tăng lên 45 nm do sự mở

rộng trong nước của hợp phần ưa nước PEG trong lớp vỏ ngoài cùng của hạt nano. Đối

với hệ nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur sự có mặt của Curcumin trong lõi có thể dẫn đến

sự tăng kích thước của nhân PLA- Fe3O4-Curcumin từ đó dẫn đến sự tăng kích thước

của toàn bộ hệ nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur. Tất cả 3 kích thước DLS của 3 mẫu với sự

phân bố kích thước hẹp cho thấy các mẫu đã được chuẩn bị tốt và phân tán ổn định.

4.2.4. Ảnh hưởng của nồng độ copolyme PLA-PEG và hạt nano Fe3O4 đến độ

bền phân tán của hệ nano Fe3O4@PLA-PEG

Ảnh hưởng của nồng độ copolyme PLA-PEG đến độ bền phân tán của

hệ nano Fe3O4@PLA-PEG

Copolyme PLA-PEG với các nồng độ 0,1 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,3 mg/mL, 0,4

mg/mL, 0,5 mg/mL trong nước được sử dụng để bọc hạt nano Fe3O4 nồng độ 3 mg/mL

để khảo sát ảnh hưởng của nồng độ PLA-PEG đến độ bền phân tán của hạt nano

Fe3O4@PLA-PEG trong nước. Kết quả được trình bày ở Bảng 4.1.

Bảng 4.1. Ảnh hưởng của nồng độ PLA-PEG đến độ bền phân tán hạt nano Fe3O4@PLA- PEG trong nước

Thành phần

Mẫu

Độ bền phân tán (ngày)

Fe3O4 (mg/mL)

PLA-PEG (mg/mL)

3Fe3O4@0,1PLA-PEG

0,1

< 1

3 3Fe3O4@0,2PLA-PEG

0,2

7 < 20

3 3Fe3O4@0,3PLA-PEG

0,3

> 90

3 3Fe3O4@0,4PLA-PEG

0,4

6 < 20

3 3Fe3O4@0,5PLA-PEG

0,5

< 1

3

Bảng 4.1 cho thấy, nồng độ PLA-PEG ảnh hưởng rất lớn đến độ bền phân tán

của hệ nano Fe3O4@PLA-PEG trong nước, trong dãy nồng độ PLA-PEG khảo sát cho

thấy với nồng độ PLA-PEG 0,3 mg/mL có độ bền phân tán trong nước là tốt nhất (trên

90 ngày), các nồng độ còn lại có độ bền phân tán thấp hơn.

Kết quả đo thế Zeta hệ hạt nano Fe3O4@PLA-PEG trình bày trên Hình 4.7 cho

thấy thế Zeta của chất lỏng chứa hệ hạt nano 3Fe3O4@0,3PLA-PEG đạt giá trị cao nhất

(- 40,9 mV). Trong khi đó, đối với các hệ hạt nano Fe3O4@PLA-PEG có tỷ lệ thành

phần khác thế Zeta đạt giá trị cao nhất khoảng (-21,2 mV), còn thế Zeta của hạt nano

Fe3O4 phân tán trong nước gần như bằng 0. Chứng tỏ rằng, hạt nano với tỷ lệ thành

phần 3Fe3O4@0,3PLA-PEG đạt độ ổn định cao nhất, phân tán tốt nhất so với các hệ hạt

nano Fe3O4@PLA-PEG khác.

Hình 4.7. Thế Zeta của hệ hạt nano Fe3O4 (A), 3Fe3O4@0,3PLA-PEG (C) và của một vài hệ hạt nano Fe3O4@PLA-PEG khác (B)

Như vậy, nồng độ PLA-PEG ảnh hưởng nhiều đến độ bền phân tán của hạt nano

Fe3O4@PLA-PEG. Trong cấu trúc hệ nano Fe3O4@PLA-PEG, hợp phần PEG trong

PLA-PEG đóng vai trò là phần vỏ ưa nước giúp hạt nano phân tán trong nước, vì vậy

nếu nồng độ PLA-PEG thấp sẽ ảnh hưởng đến độ bền phân tán của hạt nano

Fe3O4@PLA-PEG [57]. Tuy nhiên, nếu nồng độ PLA-PEG quá lớn sẽ dẫn đến hiện

tượng tụ đám của các hạt nano [116], nói cách khác nồng độ PLA-PEG cao sẽ tăng khả

năng tụ đám của hạt nano Fe3O4@PLA-PEG khi phân tán trong nước, qua đó làm giảm

độ bền phân tán của hệ nano Fe3O4@PLA-PEG.

Ảnh hưởng của lõi hạt nano Fe3O4 đến độ bền phân tán của hệ nano

Fe3O4@PLA-PEG

Hạt nano Fe3O4 với nồng độ 1 mg/mL, 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5 mg/mL

được chức năng hóa bởi PLA-PEG 0,3 mg/mL để khảo sát ảnh hưởng của nồng độ hạt

nano Fe3O4 đến độ bền phân tán của hạt nano Fe3O4@PLA-PEG trong nước, kết quả

được trình bày ở Bảng 4.2.

Số liệu trong Bảng 4.2 cho thấy, nồng độ hạt nano Fe3O4 ảnh hưởng rất lớn đến

độ bền phân tán của hệ nano Fe3O4@PLA-PEG trong nước, với nồng độ hạt nano Fe3O4

3 mg/mL hạt nano Fe3O4@PLA-PEG có độ bền phân tán trong nước là tốt nhất (trên

90 ngày), các nồng độ còn lại có độ bền phân tán thấp hơn.

Bảng 4.2. Ảnh hưởng của nồng độ Fe3O4 đến độ bền phân tán hạt nano Fe3O4@PLA-PEG trong nước

Thành phần

Mẫu

Độ bền phân tán (ngày)

Fe3O4 (mg/mL)

PLA-PEG (mg/mL)

1Fe3O4@0,3PLA-PEG

0,3

< 1

1 2Fe3O4@0,3PLA-PEG

0,3

10< 30

2 3Fe3O4@0,3PLA-PEG

0,3

> 90

3 4Fe3O4@0,3PLA-PEG

0,3

9< 60

4 5Fe3O4@0,3PLA-PEG

0,3

< 7

5

Như vậy, nồng độ hạt nano Fe3O4 ảnh hưởng nhiều đến độ bền phân tán của hạt

nano Fe3O4@PLA-PEG. Khi giữ nguyên nồng độ PLA-PEG, nếu tăng nồng độ hạt

nano Fe3O4 sẽ làm giảm tỷ lệ PLA-PEG trong hạt nano Fe3O4@PLA-PEG, qua đó làm

giảm tỷ lệ hợp phần ưa nước PEG, làm giảm khả năng phân tán trong nước của hạt nano

Fe3O4@PLA-PEG [57, 116], kết quả làm giảm độ bền phân tán của hạt nano

Fe3O4@PLA-PEG trong nước. Ngược lại, nếu giảm nồng độ hạt nano Fe3O4 sẽ làm tăng

tỷ lệ PLA-PEG trong hạt nano Fe3O4@PLA-PEG, qua đó làm tăng tỷ lệ hợp phần PEG

quá nhiều dẫn đến khả năng làm tăng khả năng tụ đám của hạt nano Fe3O4@PLA-PEG

[116], kết quả làm giảm độ bền phân tán của hạt nano Fe3O4@PLA-PEG trong nước.

Vì vậy, với tỷ lệ nồng PLA-PEG và hạt nano Fe3O4 thích hợp sẽ đảm bảo hạt nano

Fe3O4@PLA-PEG có được độ bền để phân tán tốt trong nước, kết quả cho thấy hạt nano

Fe3O4@PLA-PEG với tỷ lệ thành phần PLA-PEG: Fe3O4 0,3:3 (mg/mL) có độ bền

phân tán tốt nhất (trên 90 ngày) được thể hiện qua thế Zeta được trình bày ở Hình 4.7.

4.3. Đặc trưng đóng góp khối lượng và từ tính của các mẫu Fe3O4@PLA-PEG

và Fe3O4@PLA-PEG/Cur

Để xác định hàm lượng chất bọc phi từ PLA-PEG và Curcumin được dùng vào

trong hệ nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur, các mẫu hạt nano Fe3O4@PLA-PEG và

Fe3O4@PLA-PEG/Cur được phân tích nhiệt vi trọng (TGA) để tính phần trăm khối

lượng các hợp phần Fe3O4, PLA-PEG/Curcumin trong mẫu. Giai đoạn đầu, khi nhiệt

độ tăng tới khoảng 100 0C trọng lượng mẫu giảm chủ yếu do quá trình bay hơi nước.

Giai đoạn tiếp theo, khi nhiệt độ tăng tới khoảng 300 0C và đạt đến khoảng 600 0C các

hợp phần hữu cơ trong mẫu gần như bị phân hủy hết, khi đó trọng lượng mẫu giảm là

TGA) phù hợp với khối

do sự phân hủy copolyme PLA-PEG và Curcumin có trong mẫu (Hình 4.8, Bảng 4.3).

cal (từ thành phần cho vào khi chế tạo mẫu) đối với các mẫu có và

Tóm lại, khối lượng vỏ hữu cơ đã được xác định bởi TGA (ms

lượng tính toán ms

không mang Curcumin. Tỷ lệ giảm trọng lượng của mẫu Fe3O4@PLA-PEG/Cur cao

hơn so với mẫu Fe3O4@PLA-PEG chứng tỏ sự có mặt của Curcumin trong mẫu

Fe3O4@PLA-PEG/Cur. Dữ liệu từ kết quả đo cũng chỉ ra rằng phần trăm khối lượng

được xác định bằng thực nghiệm TGA là phù hợp với những số liệu ước tính từ thành

phần cho vào khi chế tạo mẫu.

Ảnh hưởng của lớp vỏ bọc phi từ và Curcumin đã mang lên các thuộc tính từ

được nghiên cứu dựa trên từ độ (Mcs) đạt được từ các đường từ trễ trong Hình 4.8 và

Bảng 4.3. Từ độ của của lõi Fe3O4 trong các hạt nano Fe3O4@PLA-PEG và

Fe3O4@PLA-PEG/Cur sau đó được suy ra từ tỷ lệ phần trăm khối lượng của Fe3O4

cal:

trong mẫu được xác định bằng thực nghiệm bởi TGA và từ lý thuyết (từ thành phần cho

TGA) cal)

vào khi chế tạo mẫu), Mco

ex = Mcs/(1-%ms cal = Mcs /(1-% ms

Mc Mc

Như đã chỉ ra, giá trị từ độ bão hòa Ms của lõi Fe3O4 sau khi chức năng hóa bằng

PLA-PEG và mang Curcumin có xu hướng tăng khoảng 10%.

Hình 4.8. Kết quả phân tích TGA cho mẫu hạt nano Fe3O4@PLA-PEG (A) và Fe3O4@PLA-PEG/Cur (B)

ex là giá trị

Kết quả đo M(H) và giá trị Ms của các hạt nano Fe3O4, Fe3O4@PLA-PEG và

cal tương

Fe3O4@PLA-PEG/Cur được trình bày trên Hình 4.9 và Bảng 4.3, ở đây: Mc

cal và Mc

từ độ bão hòa xác trịnh từ phép đo VSM cho mẫu bột đông khô; ms

ex tương ứng là % khối lượng lớp vỏ thu

ứng là % khối lượng lớp vỏ tính lý thuyết theo danh định và từ độ bão hòa được hiệu

TGA và Mc

chỉnh theo khối lượng này, còn ms

được từ phép đo TGA và từ độ bão hòa hiệu chỉnh theo khối lượng vỏ thực nghiệm này.

Kết quả Bảng 4.3 cho thấy, từ độ bão hòa của hạt nano Fe3O4 trong các hệ mẫu hạt nano

Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur đạt giá trị lần lượt 70,4 emu/g và 70,5

emu/g nếu tính lý thuyết theo công thức danh định 3 (Fe3O4 mg/mL):0,3 (PLA-PEG

mg/mL) và 3 (Fe3O4 mg/mL):[0,3 (PLA-PEG mg/mL) + (0,7 Curcumin mg/mL). Khi

tính hiệu chỉnh Ms dùng số lượng khối lượng từ phân tích TGA thì các giá trị từ độ bão

hòa thu được cho riêng hạt lõi Fe3O4 của các hệ mẫu hạt nano Fe3O4@PLA-PEG và

Fe3O4@PLA-PEG/Cur lần lượt là 73,2 emu/g và 70,4 emu/g.

Hình 4.9. Từ độ phụ thuộc từ trường của Fe3O4, Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur tính trên khối lượng tổng vỏ-lõi (A) và sau khi trừ đóng góp lượng vỏ hữu cơ (B)

Bảng 4.3. Từ độ bão hòa: đo trực tiếp cho mẫu lõi+vỏ (Mcs); hiệu đính bởi khối lượng vỏ ex) của các mẫu hạt nano Fe3O4, danh định (Mc

cal) và bởi khối lượng vỏ thí nghiệm TGA (Mc

Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur

cal

Mẫu

Mcs (emu/g)

cal ms (%)

Mc (emu/g)

TGA ms (%)

Mc (emu/g)

Fe3O4

64,4

0 64,4

Fe3O4@PLA-PEG

64,5

9,1

70,4

13,5

73,2

Fe3O4@PLA-PEG/Cur

52,9

25 70,5

24,9

70,4

Như vậy, gía trị từ độ riêng của hạt lõi Fe3O4 sau khi được chức năng hóa thể

hiện sự tăng lên đáng kể, đối với mẫu hạt nano Fe3O4@PLA-PEG tăng 13,6% (từ 64,4

lên 73,2 emu/g), còn với Fe3O4@PLA-PEG/Cur tăng 8,9% (từ 64,4 lên 70,4 emu/g).

Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với công bố của tác giả Y. Piñeiro-Redondo và

cộng sự [137].

Việc quan sát được sự gia tăng từ độ nội tại của hạt nano lõi thông qua cách phân

tích số liệu từ 2 phương pháp VSM và TGA có ý nghĩa rất quan trọng. Nó một mặt

khẳng định rằng các quá trình chức năng hóa hạt Fe3O4 không ảnh hưởng đến cấu cấu 100

tinh thể của mẫu hạt lõi đã tổng hợp trước bằng phương pháp đồng kết tủa (như quan

sát trên hình 4.2). Hơn thế nữa, việc gia tăng cỡ 10% từ độ riêng của bản thân hạt lõi

Fe3O4 nhờ quá trình bọc chứng tỏ lớp chết từ [137, 138] ngoài bề mặt của các hạt này

có thể đã được hồi sinh nhờ quá trình neo bám của phân tử hữu cơ, cụ thể là đầu kỵ

nước PLA của copolyme. Mặt khác, khi được chức năng hóa bằng PLA-PEG sẽ giúp

tăng độ bền và thời gian phân tán của hạt nano Fe3O4 trong nước, qua đó làm tăng khả

năng ứng dụng của hạt nano Fe3O4 trong y sinh. Kết quả này có ý nghĩa rất quan trọng,

chứng tỏ hệ hạt chế tạo hứa hẹn cho hiệu năng tốt đối với các ứng dụng y sinh như nhiệt

từ trị, chụp ảnh cộng hưởng từ hạt nhân (MRI), cũng như nghiên cứu các cơ chế vật lý

ảnh hưởng đến từ độ bão hòa của chúng.

4.4. Ảnh cộng hưởng từ hạt nhân hệ nano Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-

PEG/Cur

Tốc độ hồi phục cộng hưởng từ hạt nhân (CHTHN) là thước đo của tương tác

mô men từ hạt nhân nước trong mô tế bào với môi trường từ xung quanh. Khi dùng các

chất tăng tương phản, tốc độ hồi phục R1, R2 sẽ thay đổi. Đại lượng đặc trưng cho độ

ảnh hưởng này đối với mỗi chất tăng tương phản gọi là độ hồi phục (relaxivity), tương

ứng là r1 và r2. Trong phần lớn các trường hợp, tốc độ hồi phục CHTNHN R1, R2 phụ

thuộc một cách tuyến tính vào độ hồi phục của chất tăng tương phản theo công thức 2.4

(chương 2).

Ảnh cộng hưởng từ hạt nhân chụp trên thiết bị cộng hưởng từ Bruker Biospec 7

Tesla theo chế độ trọng T2 của mẫu Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur được

giới thiệu trên Hình 4.10. Mẫu nước ở giữa có ảnh mầu trắng là mẫu có nồng độ CLT

C (S1) = 0 µg/mL. Sáu ảnh thứ tự từ trắng đến đen đặt vòng tròn xung quanh theo chiều

kim đồng hồ là của các mẫu có nồng độ CLT tương ứng 15, 30, 45, 60, 75 và 90 µg/mL

(tính cho nguyên tố Fe). Ta thấy độ tương phản thay đổi rất rõ ràng khi thay đổi một

lượng nhỏ nồng độ chất S1 15 µg/mL.

Tốc độ hồi phục dọc và ngang (R1 = 1/T1 và R2 = 1/T2) được tính toán từ phép

đo thời gian hồi phục T1 và T2 của các hạt nano ở các nồng độ khác nhau. Ảnh chụp

101

theo chế độ trọng T2 cho thấy độ tương phản ảnh chụp theo chế độ trọng T2 của các

mẫu có hạt nano Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur (đậm mầu) lớn hơn nhiều

so sánh với ảnh chụp nguyên tố H2O, và sự thay đổi theo nồng độ hạt nano hết sức rõ

ràng: khi tăng nồng độ các hạt nano cho thấy tín hiệu ảnh tăng (đậm mầu) đáng kể (Hình

4.10).

(A)

(B)

Hình 4.10. So sánh độ tương phản ảnh cộng hưởng từ hạt nhân theo chế độ trọng T2 của các hạt nano Fe3O4@PLA-PEG (A) và Fe3O4@PLA-PEG/Cur (B)

Tuy nhiên khi so sánh ảnh tương ứng của mẫu Fe3O4@PLA-PEG với mẫu

Fe3O4@PLA-PEG/Cur bằng mắt thường có th thấy độ thay đổi tín hiệu ảnh (độ đậm

mầu) có sự khác nhau, ví dụ như cho mẫu 90 µg/mL, mẫu Fe3O4@PLA-PEG cho độ

đen bằng ảnh nền nhưng mẫu Fe3O4@PLA-PEG/Cur vẫn còn nhận rõ độ sáng hơn ảnh

nền (Hình 4.10). Điều này có thể do sự có mặt của Curcumin trong mẫu Fe3O4@PLA-

PEG/Cur đã tác động đến độ tương phản của ảnh.

102

Hình 4.11. Đường tốc độ hồi phục phụ thuộc nồng độ pha loãng mẫu: R1 với C (A) và R2 với C (B) của các các chất lỏng từ Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur

Từ những kết quả trên (Hình 4.11) có thể nhận thấy rằng tốc độ hồi phục của

mẫu Fe3O4@PLA-PEG/Cur tăng tuyến tính theo nồng độ hạt nano từ, thỏa mãn quan

hệ trên công thức (2.4) (chương 2). Tuy nhiên, đối với mẫu Fe3O4@PLA-PEG sự thay

đổi tốc độ hồi phục R2 không còn tăng tuyến tính với nồng độ chất tương phản tại vùng

nồng độ lớn hơn 60 μg/mL. Theo quan sát, trong khi giá trị tham số độ hồi phục r1 được

tính của hai mẫu là như nhau, thì độ hồi phục r2 của mẫu Fe3O4@PLA-PEG lớn hơn

đáng kể so với của mẫu Fe3O4@PLA-PEG/Cur, điều này có thể do sự thay đổi trong

mômen từ μ (hoặc từ độ bảo hòa Ms) nhờ sự liên kết của phân tử Curcumin trên bề mặt

hạt nano Fe3O4, từ đó ảnh hưởng đến các trạng thái hồi phục dọc của các hạt nano huyền

phù, có thể hiểu qua công thức:

(4.1)

Khi nghiên cứu tốc độ hồi phục R1 và R2 của các mẫu hạt nano ở các nồng độ

khác nhau có thể nhận thấy rằng độ hồi phục của mẫu Fe3O4@PLA-PEG có sự thay đổi

khi tốc độ hồi phục R2 không còn tăng tuyến tính theo nồng độ C tại vùng lớn hơn 50

μg/mL; trong khi đối với mẫu Fe3O4@PLA-PEG/Cur vẫn duy trì sự tăng tuyến tính

trong vùng nồng độ cao này. Điều này gợi lên rằng, mẫu hạt nano được mang Curcumin

(Fe3O4@PLA-PEG/Cur) phân tán tốt hơn mẫu hạt nano không được mang Curcumin

103

(Fe3O4@PLA-PEG), điều này có ý nghĩa quan trọng đối với những ứng dụng trong y

sinh của hệ nano đa chức năng.

Từ Bảng 4.4 ta thấy, mẫu khi mang Curcumin vào r1 chỉ giảm cỡ 10% nhưng r2

giảm đến gần 40% và kết quả là tỷ số r1/r2 tăng cỡ 42%. Phân tử thuốc Curcumin khi

được mang lên hệ hạt Fe3O4 bọc copolyme lưỡng tính đã làm suy giảm thêm một phần

từ độ riêng từ đó suy giảm các tham số hồi phục ri. Việc tăng tỷ số r1/r2 của mẫu CLT

bọc copolyme có mang Curcumin (Fe3O4@PLA-PEG/Cur) là dấu hiệu thực nghiệm nói

lên rằng Curcumin có thể đã làm tăng khả năng phân tán của hệ nano Fe3O4@PLA-

PEG/Cur.

Hình 4.12. Tốc độ hồi phục dọc R1 (A) và gang R2 (B) phụ thuộc nồng độ mẫu Fe3O4@PLA- PEG S1 (C) và Fe3O4@PLA-PEG/Cur S2 (D)

104

So sánh với sản phẩm thương phẩm, sử dụng chất lỏng từ thương phẩm Resovist

làm chất đối chứng để so sánh với các tham số chất lỏng từ chúng tôi chế tạo. Resovist

là chất lỏng từ có hạt lõi là Fe3O4 bọc bởi loại Dextran biến tính Carboxydextran, từ độ

bão hòa đạt khoảng 65 emu/g, với kích thước thủy động khoảng 60 nm. Chúng tôi còn

sử dụng một chất lỏng từ thương phẩm khác là Ferumoxytol làm chất so sánh các số

liệu đo độ hồi phục. Ferumoxytol có độ hồi phục r1 = 15 (lớn hơn gấp rưỡi so với giá

trị của Resovist), r2 = 89 (bằng cỡ một nửa giá trị của Resovist), kết quả được trình bày

trong Bảng 4.4.

Bảng 4.4. Kết quả tính toán độ hồi phục r1, r2 và tỷ số r1/r2 cho 2 mẫu Fe3O4@PLA-PEG (S1), Fe3O4@PLA-PEG/Cur (S2) và chất thương phẩm Resovist, Ferumoxytol

Mẫu

r1 (mM s)-1

r2 (mM s)-1

r1/r2

Fe3O4@PLA-PEG

364,75

0,002796

1,02

Fe3O4@PLA-PEG/Cur

228,74

0,003978

0,91

Resovist

189 0,0513

9,7

Ferumoxytol

89 0,016739

15

Kết quả Bảng 4.4 cho thấy, độ phục hồi r1 của chất lỏng từ Fe3O4@PLA-PEG và

Fe3O4@PLA-PEG/Cur nhỏ hơn so với chất thương phẩm Resovist và Ferumoxytol, tuy

nhiên nếu xét giá trị độ phục hồi r2 ta thấy cả hai chất lỏng từ Fe3O4@PLA-PEG và

Fe3O4@PLA-PEG/Cur đều lớn hơn hai chất thương phẩm, kết quả tính toán độ hồi phục

r2 của chất lỏng từ nano Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur có ý nghĩa rất

quan trọng. Kết quả này chứng minh hệ nano chất lỏng từ được chế tạo hoàn toàn có

thể được ứng dụng trong chẩn đoán hình ảnh [139].

Như vậy, hệ chất lỏng từ nano Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur

chứng tỏ là hệ đa chức năng (tương phản MRI, mang nhả thuốc và cả nhiệt từ trị - trình

bày ở mục sau) ứng dụng cho chẩn đoán và điều trị trong y sinh, mở ra một hướng mới

trong việc ứng dụng các chất lỏng nano từ tính.

105

4.5. Kết quả đốt nóng cảm ứng từ của hệ nano Fe3O4@PLA-PEG và

Fe3O4@PLA-PEG/Cur

Hiệu ứng đốt nóng cảm ứng từ của các hạt nano Fe3O4@PLA-PEG và

Fe3O4@PLA-PEG/Cur sau khi được phân tán trong nước được nghiên cứu bằng phương

pháp đo lường nhiệt trên hệ đốt từ dùng từ trường xoay chiều cường độ từ 0 – 800 Oe,

ở tần số 310 kHz tại Trường ĐH Nam Florida. Kết quả đo trình bày trên Hình 4.13 cho

thấy, khi tăng từ trường xoay chiều nhiệt độ sẽ tăng và đạt đến nhiệt độ khoảng 42oC

đối với mẫu Fe3O4@PLA-PEG sau khoảng 5 phút. Điều này mở ra khả năng điều trị

đối với liệu pháp nhiệt từ trị ung thư, và có thể dễ dàng đạt được bằng cách điều chỉnh

cường độ của từ trường xoay chiều để đạt nhiệt độ trong vùng 40 – 45oC. Kết quả đo

nhiệt từ này cũng chỉ ra rằng, tốc độ tăng nhiệt của hệ nano Fe3O4@PLA-PEG cao hơn

so với hệ nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur.

Để thấy được khả năng nhiệt trị của các hạt nano, chúng tôi đã tính hiệu ứng

nhiệt hoặc đại lượng tốc độ hấp phụ riêng SAR (Specific Absorption Rate) của hệ nano

Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur với hai nồng độ khác nhau, 1 và 3 mg/mL.

Theo phương pháp đo lường nhiệt [140, 141], SAR có thể tính trực tiếp từ tốc độ gia

nhiệt ban đầu, theo công thức (1.5).

Hình 4.13 và Bảng 4.5 giới thiệu các giá trị SAR tương ứng của các hệ CLT

Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur. Có thể thấy các giá trị SAR thu được từ

mẫu Fe3O4@PLA-PEG cao hơn mẫu Fe3O4@PLA-PEG/Cur, đặc biệt ở mẫu 1 mg/mL

đạt giá trị cao nhất khoảng 230 W/g. Giá trị SAR này tương ứng với những kết quả đã

được công bố trong các tài liệu [142-144]. Khi nồng độ tăng lên 3 mg/mL, giá trị SAR

của mẫu Fe3O4@PLA-PEG giảm đáng kể so với mẫu Fe3O4@PLA-PEG/Cur, sự suy

giảm này có thể liên quan đến ảnh hưởng của sự kết đám khi tăng nồng độ các hạt nano

[137, 145, 146]. Đối với hệ nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur hiệu ứng này ít được nhận

thấy, có thể liên quan đến sự phân tách giữa các hạt nano do lớp phủ ngoài, điều này

giúp ngăn chặn sự kết đám [146].

106

Hình 4.13. Đường gia nhiệt của hệ chất lỏng từ nồng độ 1 mg/mL của Fe3O4@PLA-PEG (A) và Fe3O4@PLA-PEG/Cur (B), đo với các từ trường khác nhau, và kết quả tính SAR cho các nồng độ 1 mg/mL của hệ nano Fe3O4@PLA-PEG (C) và Fe3O4@PLA-PEG/Cur (D)

Bảng 4.5. Kết quả tính SAR của hệ nano Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur ở các từ trường khác nhau

Từ trường (Oe)

Khối lượng nước (g)

Khối lượng mẫu (g)

SAR (Fe3O4@PLA- PEG) (W/g)

SAR (Fe3O4@PLA- PEG/Cur) (W/g)

200 1,00

0,001

94

72

400 1,00

0,001

152

94

600 1,00

0,001

202

143

800 1,00

0,001

228

190

Vì vậy, với những kết quả như đã trình bày, hiệu ứng đốt nóng của các hạt nano

được bọc rất đáng được quan tâm và chúng có thể được sử dụng hiệu quả trong điều trị

bằng nhiệt từ trị.

107

4.6. Đốt nóng cảm ứng từ giải phóng Curcumin của hệ nano Fe3O4@PLA-PEG

và Fe3O4@PLA-PEG/Cur

4.6.1. Đốt nóng cảm ứng từ bởi từ trường cường độ yếu

Việc giải phóng thuốc có thể thực hiện theo chế độ chủ động dùng phương pháp

đốt nóng cảm ứng từ MIH, vì nhiệt độ được tăng ngay tại vùng hạt phức hợp (chứa cả

hạt nano từ cùng phân tử thuốc) khi từ trường ngoài xoay chiều được bật lên. Phương

pháp này sẽ cho phép kết hợp hai liệu pháp: hóa trị liệu thông qua giải phóng thuốc

(Curcumin) tại đúng đích có hạt từ, với liệu pháp nhiệt trị (hyperthermia) thông qua gia

nhiệt diệt tế bào ung thư [147].

Nhằm mục đích nghiên cứu này, các mẫu hạt nano Fe3O4, Fe3O4@PLA-PEG và

Fe3O4@PLA-PEG/Cur được phân tán trong nước và tiến hành đốt nóng cảm ứng từ trên

hệ đo RDO-HFI (tại Viện KH vật liệu) với từ trường cường độ dưới 100 Oe tại tần số

178 kHz. Các đường đo gia nhiệt cảm ứng từ thu được của các hệ mẫu Fe3O4,

Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur (Hình 4.14) cho thấy, hạt nano Fe3O4 sau

khi chức năng hóa bằng PLA-PEG và mang Curcumin khả năng tăng nhiệt của hạt nano

Fe3O4 có xu hướng giảm, cụ thể đối với hạt nano Fe3O4@PLA-PEG đạt 77 oC và

Fe3O4@PLA-PEG/Cur đạt 61 oC cho các mẫu có nồng độ hạt nano Fe3O4 là 3 mg/mL.

Hình 4.14. Đường gia nhiệt MIH của các hệ mẫu Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur

108

4.6.2. Giải phóng Curcumin của hệ nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur bằng phương

pháp ủ nhiệt

Hạt nano Fe3O4 sau khi chức năng hóa bằng PLA-PEG và mang Curcumin tạo

thành hệ nano mang thuốc đa chức năng Fe3O4@PLA-PEG/Cur được thực nghiệm đánh

giá khả năng giải phóng Curcumin theo phương pháp ủ nhiệt ở 37oC (thân nhiệt).

Kết quả nghiên cứu khả năng giải phóng Curcumin theo phương pháp ủ nhiệt

được trình bày ở Hình 4.15.

Kết quả trên Hình 4.15 cho thấy, độ giải phóng Curcumin theo phương pháp ủ

nhiệt đạt khoảng 82% và có xu hướng bão hòa sau 48 giờ ủ nhiệt (Bảng 4.6).

Hình 4.15. Phổ UV-Vis (A) và lượng Curcumin giải phóng theo thời gian (B) từ hệ nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur ủ tại nhiệt độ 37oC

Bảng 4.6. Phần trăm Curcumin giải phóng từ hệ nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur khi được ủ tại 37oC

Thời gian (giờ)

Fe3O4@PLA- PEG/Cur

0

3

6

12

24

36

48

0 18,2±0,9 38,9±1,9 68,7±3,4 80,7±4,0 81,5±4,1 83,6±4,2

Giải phóng Curcumin (%)

4.6.3. Giải phóng Curcumin của hệ nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur kích bởi đốt

nóng cảm ứng từ

Nghiên cứu độ giải phóng theo chế độ kích nhiệt MIH được thực hiện trên hệ từ

trường yếu như đã khảo sát trong mục 4.8.1. Mục này trình bày kết quả đánh giá độ

giải phóng Curcumin theo thời gian chiếu từ trường để nhiệt độ lúc ngắt từ trường đạt

109

trong vùng từ thân nhiệt (37oC) đến không quá giới hạn trên của nhiệt độ nhiệt từ trị

ung thư (59oC).

Các đường gia nhiệt của hệ nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur với nồng độ hạt sắt từ 3

mg/mL, Curcumin 0,7 mg/mL ở các khoảng thời gian đóng từ trường 5 phút, 10 phút,

15 phút, 20 phút và 25 phút với ngưỡng nhiệt độ đạt được tương ứng với các khoảng

thời gian trên là 37 phút, 45 phút, 48 phút, 53 phút và 56 phút, được thể hiện ở Hình

4.16.

Hình 4.16. Đốt nóng cảm ứng từ hệ Fe3O4@PLA-PEG/Cur với các khoảng thời gian 5 – 10 – 15 – 20 – 25 phút tương đương hình A – B – C – D – E

110

Các đường đo phổ hấp phụ UV-Vis và phụ thuộc lượng thuốc nhả ra vào thời

gianCurcumin kích từ của hệ nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur (phương pháp giải phóng

chủ động điều khiển bằng từ trường ngaoif) được trình bày ở Hình 4.17.

Kết quả trên cho thấy, khả năng giải phóng Curcumin theo phương pháp đốt nóng

cảm ứng từ cho kết quả nhanh, cụ thể ngay khi thời gian đốt được 5 phút, lượng

Curcumin giải phóng khoảng 27,1% và lần lượt tăng lên 43,6%, 63,5%, 94,1% tương

ứng với các khoảng thời gian đốt 10 phút, 15 phút, 20 phút và đạt khoảng 94% sau 25

phút đốt và có xu hướng bão hòa (Hình 4.17).

Hình 4.17. Phổ UV-Vis (A) và phần trăm giải phóng Curcumin (B) từ hệ nano Fe3O4@PLA- PEG/Cur theo phương pháp đốt nóng cảm ứng từ tại các khoảng thời gian khác nhau

Khi so sánh giữa phương pháp giải phóng kích từ này với nhả thuốc thụ động ta

thấy: khi dùng từ trường ngoài kích thích tăng nhiệt hạt nano từ Fe3O4, khả năng giải

phóng Curcumin đạt hiệu suất trên 90 % và thời gian giải phóng thuốc ngắn còn khoảng

từ 20 đến 25 phút và chủ động lựa chọn thời gian giải phóng thuốc (giải phóng thuốc

chủ động). Trong khi đó khả năng giải phóng thuốc theo phương pháp ủ nhiệt theo thời

gian đạt hiệu suất khoảng 80 % và thời gian giải phóng thuốc kéo dài lên đến trên 48

giờ (giải phóng thuốc bị động).

4.6.4. Kết quả đốt từ giải phóng chậm Curcumin hệ nano Fe3O4@PLA-

PEG/Cur khi ngắt tại cùng nhiệt độ

Hệ nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur với khả năng tăng nhiệt tại chỗ nhờ từ trường

ngoài xoay chiều, dựa vào các thông số về nồng độ hạt nano sắt từ Fe3O4 và từ trường

ngoài xoay chiều áp vào có thể ước tính nhiệt độ tại vị trí tập trung hạt từ với khoảng

111

thời gian tăng nhiệt tương ứng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã ước tính dựa trên

nồng độ hạt nano sắt từ trong hệ nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur và các từ trường khác

nhau trên hệ đốt nóng cảm ứng từ từ trường yếu để đạt được nhiệt độ tại 2 điểm ngắt từ

trường là 370C (thân nhiệt) và 450C (nhiệt từ trị ung thư) với các khoảng thời gian khác

nhau. Kết quả được trình bày ở Hình 4.18 và 4.19.

Hình 4.18. Kết quả thí nghiệm MIH giải phóng chậm Curcumin trong hệ nano Fe3O4@PLA- PEG/Cur ngắt tại 370C với thời gian chiếu khác nhau: đường gia nhiệt với các từ trường khác nhau (A), phổ UV-Vis của mẫu khi ngắt (B), và phần trăm giải phóng Curcumin (C)

Kết quả trên cho thấy nếu biết trước nồng độ hạt nano sắt từ Fe3O4 ta có thể điều

chỉnh từ trường ngoài áp vào để đạt được nhiệt độ mong muốn trong vùng từ 37 đến

46oC, điều này rất quan trọng cho việc ứng dụng hạt nano sắt từ trong điều trị ung thư

khi phối hợp liệu pháp hóa trị chủ động này với nhiệt từ trị. Vì ngưỡng chịu nhiệt của

tế bào ung thư và tế bào lành là khác nhau, thông thường đối với tế bào ung thư ngưỡng

chịu nhiệt không quá 42-460C, trong khi đó ngưỡng chịu nhiệt của tế bào lành khoản từ

520C đến 700C [50]. Khống chế được nhiệt độ và nồng độ thuốc chính xác sẽ giảm thiểu

tác động đến tế bào lành, mở ra một khả năng mới trong nhiệt trị ung thư.

112

Hình 4.19. Kết quả giải phóng chậm Curcumin từ hệ nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur tại nhiệt độ dừng chiếu từ 45oC: đường gia nhiệt với các từ trường khác nhau (A), phổ UV- Vis của mẫu mới ngắt (B) và phần trăm giải phóng Curcumin (C)

Bảng 4.7. Số liệu đo giải phóng Curcumin của hệ nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur đạt được ở 37oC và 45oC bằng phương pháp đốt nóng cảm ứng từ

Nhiệt độ đạt được

Từ trường (Oe)

dT/dt o (C/s)

SAR (W/g)

ILP (nH.m2kg-1)

Thời gian đóng (s)

Curcumin giải phóng (%)

45 0,019

26,5

11,5

897 40,2±2,0

47 0,025

34,8

13,8

742 37,5±1,9

37oC

50 0,034

47,4

16,6

479 36,1±1,8

53 0,039

54,3

16,9

363 34,2±1,7

50 0,029

40,4

14,2

1024

60,2±3,0

53 0,038

52,9

16,5

716 55,4±2,8

45oC

55 0,043

59,9

17,4

605 52,3±2,6

63 0,069

96,1

21,2

316 50,1±2,5

113

Kết luận chương 4

Đã tổng hợp thành công hạt nano Fe3O4 với kích thước khoảng 15 nm được chức

năng hóa bởi PLA-PEG tạo thành hệ nano Fe3O4@PLA-PEG và mang Curcumin tạo

thành hệ nano mang thuốc đa chức năng Fe3O4@PLA-PEG/Cur. Các hạt nano có dạng

hình cầu và đơn hạt, có cấu trúc lõi-vỏ, lõi là hạt nano Fe3O4 được bọc bởi PLA-PEG,

vỏ là PEG giúp hạt nano phân tán trong nước, làm tăng độ bền phân tán nhưng vẫn đảm

bảo các tính chất từ, qua đó tăng khả năng ứng dụng y sinh.

Kết quả đo độ hồi phục hệ nano Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur

cho thấy độ hồi phục r2 của mẫu Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur đều lớn

hơn các chất thương phẩm (Resovist và Ferumoxytol).

Hạt nano Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur có khả năng tăng nhiệt tại

chỗ dựa vào từ trường ngoài nên hoàn toàn có thể được sử dụng hiệu quả trong nhiệt từ

trị và tăng khả năng giải phóng thuốc.

Từ các kết quả trên cho thấy hệ nano mang thuốc đa chức năng có lõi hạt nano

từ Fe3O4 có tiềm năng ứng dụng lớn trong lĩnh vực y sinh như tăng tính tương phản

trong chẩn đoán hình ảnh (MRI), tăng độ bền phân tán và khả năng tương thích sinh

học, tăng nhiệt tại chỗ dựa vào từ trường ngoài ứng dụng trong nhiệt từ trị, chủ động

giải phóng thuốc nhờ khả năng tăng nhiệt tại chỗ.

114

Chương 5 THỰC NGHIỆM SINH HỌC HỆ CHẤT LỎNG NANO TỪ ĐA CHỨC NĂNG LÕI HẠT Fe3O4

Trong chương này chúng tôi sẽ trình này kết quả nghiên cứu các tác động sinh

học của hệ CLT Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur như: thử độc tính cấp

trên hai kiểu ung thư tế bào phổ biến là ung thư mô liên kết (sử dụng dòng ung thư mô

liên kết Sarcoma 180 có nguồn gốc từ chuột) và ung thư biểu mô (sử dụng dòng ung

thư biểu mô tuyến vú BT-474 có nguồn gốc từ người), thử nghiệm khả năng tăng tương

phản chụp ảnh cộng hưởng từ trên tế bào và khối u chuột; nhiệt trị tiêu diệt tế bào ung

thư và tiêu diệt khối u trên chuột thử nghiệm.

5.1. Kết quả thử nghiệm độc tính

Theo quy định của tổ chức y tế thế giới (WHO) và của Bộ Y tế nước CHXHCN

Việt Nam [148] bất kì chế phẩm nào muốn bào chế thành dược phẩm đều phải được

nghiên cứu về tính độc của nó. Nghiên cứu độc tính bao gồm các nội dung sau: nghiên

cứu độc tính cấp (Acute toxicity), nghiên cứu độc tính trường diễn (Long - term

toxicity), nghiên cứu độc tính tại chỗ (Local toxicity), và nghiên cứu một số độc tính

chuyên biệt (Special toxicity) (độc tính gây biến chủng, độc tính gây ung thư, độc tính

đối với sinh sản và phát triển). Trong đó nghiên cứu độc tính cấp là bắt buộc [149] và

các bước thử đầu tiên đều thường được thực hiện trên động vật có hệ gen gần giống với

hệ gen người.

5.1.1. Độc tính tế bào

Độc tính của hai hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG, Fe3O4@PLA-PEG/Cur

trên hai dòng tế bào nuôi cấy là BT-474 và Sarcoma 180 được kiểm tra bằng hai bộ kit

MTT và Luminescent Cell Viability Assay (PROMEGA). Khả năng tăng sinh của tế

bào được thử nghiệm với hệ nano sắt từ ở những nồng độ rất cao vẫn đạt 80-90% so

với đối chứng sinh học. Ở những nồng độ thấp hơn gần như không có sự khác biệt.

115

Hình 5.1. Tỉ lệ tăng sinh của tế bào Sarcoma 180 (A) và BT-474 (B) so với đối chứng sinh học khi được thử nghiệm độc tính với hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG theo dải nồng độ 0,01-100 µg/mL. Tỉ lệ tăng sinh của tế bào ở nồng độ thử nghệm cao nhất vẫn đạt 85 % so với DCSH, ở 3 nồng độ tiếp theo đạt 90-95 % và ở nồng độ thấp nhất không có sự khác biệt so với ĐCSH.

Kết quả tính toán IC50 theo khuyến cáo của hãng với các bộ kit sử dụng cho thấy

hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG hoàn toàn không gây độc trên hai dòng tế bào

thử nghiệm với giá trị IC50 ở mức rất lớn, phù hợp cho các ứng dụng trong y sinh. Quan

sát này nhất trí với đánh giá trong một số công bố trước đây, vd. C. Buzea và cộng sử

đã công bố về độc tính của các hạt nano ứng dụng trong y sinh [150].

Kết quả cho thấy các hệ chất lỏng từ nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur và

Fe3O4@PLA-PEG gần như không gây độc đối với cả hai dòng tế bào trên và phù hợp

cho các ứng dụng trong y sinh [150, 151], ngay cả với nồng độ cao nhất là 100 µg/mL

cũng chỉ có thể ức chế sinh trưởng ở mức trên dưới 20%. Như vậy, ở điều kiện bình

thường hệ chất lỏng nano từ đa chức năng Fe3O4@PLA-PEG không gây độc đối với tế

bào, tạo điều kiện thuận lợi và mở ra tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực y sinh (chụp

ảnh MRI, nhiệt từ trị ung thư), điều này được thể hiện cụ thể trong các kết quả thực

nghiệm.

5.1.2. Độc tính cấp

Thử nghiệm độc tính cấp hệ CLT nano Fe3O4@PLA-PEG được tiến hành trên

chuột nhắt trắng Swiss, thông qua việc xác định liều cận dưới và liều cận trên từ đó xác

định giá trị LD50 (liều gây chết trung bình).

116

Sử dụng phương pháp xác định giá trị LD50 theo Litchfield – Wilcoxon với hai

lần lặp lại, đường cong đáp ứng liều thu được như Hình 5.2.

Hình 5.2. Đường cong đáp ứng liều của hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG dựa trên phương pháp Litchfield - Wilcoxon: (A) Thí nghiệm lần 1, (B) Thí nghiệm lần 2.

Từ đồ thị đường cong đáp ứng liều với hai lần lặp lại, giá trị LD50 (liều gây chết

trung bình, tính theo công thức 2.8, mục 2.6, chương 2) tính toán được là:

LD50 (Fe3O4 - PLA - PEG) = 120.945 ± 2.07 (mg/kg thể trọng), R2 = 0,95

Đối chiếu với thang độc tính Hodge và Stener, có thể thấy rằng hệ chất lỏng nano

từ Fe3O4@ PEG-PLA có độc tính nhẹ đối với cơ thể chuột nhắt trắng Swiss. Kết quả

trên cho thấy hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@ PEG-PLA hoàn toàn có thể sử dụng như

một chế phẩm ứng dụng trong y sinh học [150].

5.2. Khả năng tăng tương phản ảnh cộng hưởng từ hạt nhân

5.2.1. Khả năng tăng tương phản ảnh cộng hưởng từ mẫu dịch tế bào

Vật liệu nano từ với lõi sắt từ Fe3O4 được coi là các chất siêu thuận từ [85]. Do

đó, chúng sẽ tác động trực tiếp làm giảm thời gian hồi phục T2, làm tăng độ tương phản

của hình ảnh trong chế độ chụp trọng T2 (T2W). Kết quả thu được khi tiến hành chụp

cộng hưởng từ với hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG hoàn toàn tuân theo lý thuyết

trên [139], thể hiện qua dải tín hiệu tối màu tăng dần theo nồng độ vật liệu nano có

trong các giếng so với đối chứng (Hình 5.3). Ở nồng độ cao như 0,05 mg/mL, tín hiệu

tối gần như chiếm toàn bộ giếng ở tất cả các thử nghiệm (Hình 5.3 A, B, C, D). Mẫu hệ

chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG/Cur được mang thuốc Curcumin (Hình 5.3 D) vẫn 117

cho khả năng tương phản tốt, thậm chí cao hơn so với mẫu không có Curcumin (Hình

5.3B). Trong điều kiện môi trường chứa tế bào (Hình 5.3 A, C), khả năng tăng tương

phản hình ảnh của hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG, có hay không mang

Curcumin cũng không bị ảnh hưởng.

1 2 3

4

5

6 A

C D

Hình 5.3. Ảnh MRI của hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur chụp theo chế độ T2W, TE 80ms, TR 3,0s ở điều kiện: (A) Fe3O4@PLA-PEG trong môi trường Agar 1,5 % chứa 2.106 tế bào Sarcoma 180; (B) Fe3O4@PLA-PEG trong môi trường Agar 1,5 %, (C) Fe3O4@PLA-PEG/Cur trong môi trường Agar 1,5 % chứa 2.106 tế bào sarcoma 180; (D) Fe3O4@PLA-PEG/Cur trong môi trường Agar 1,5 %. Nồng độ sắt từ trong mỗi giếng là: (1) 0,000 mg/mL; (2) 0,01 mg/mL; (3) 0,05 mg/mL; (4) 0,1 mg/mL; (5) 0,2 mg/mL; (6) 0,5 mg/mL.

Kết quả trên cho thấy hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG/Cur và

Fe3O4@PLA-PEG có tiềm năng ứng dụng lớn trong chụp ảnh cộng hưởng từ, ứng dụng

trong chẩn đoán hình ảnh, mở ra khả năng ứng dụng hệ CLT nano đã chế tạo trong chẩn

đoán bằng hình [152].

5.2.2. Khả năng tăng tương phản ảnh chụp cộng hưởng từ khối u rắn

Khối u rắn dưới da 10 ngày tuổi có hình bán nguyệt, phần chân gắn vào phần da

bụng của chuột. Khối u đặc, chưa hoại tử và có cấu trúc tương đối đồng nhất. Với kích

thước hai chiều trung bình khoảng 10 x 10 mm, trong điều kiện bình thường, gần như

không quan sát được sự có mặt của khối u trên cơ thể chuột tại vị trí mũi tên (Hình 5.4

A). Tuy nhiên, sau khi tiêm hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG, có thể nhận thấy 118

một vùng tối màu có hình dạng tương tự khối u xuất hiện trên ảnh chụp (Hình 5.4 B).

Như vậy, sự có mặt của hạt nano từ đã hỗ trợ hệ thống chụp cộng hưởng từ 3T phát

hiện được khối u ngay ở nồng độ vật liệu thấp, 50 µg/0,5cm3 khối u (Hình 5.4 B2).

1 2 3

Hình 5.4. Khả năng tăng tương phản MRI của hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG ở chế độ T2W, TE 80ms, TR 3,0s, góc chụp 180o (cắt lớp theo trục đầu – đuôi chuột). (A) Ảnh trước khi tiêm hệ chất lỏng nano từ; (B) Ảnh sau khi tiêm hệ chất lỏng nano từ: (1) chuột không được tiêm, (2) chuột tiêm 50 µg hạt từ trực tiếp vào khối u, (3) chuột tiêm 250 µg hạt từ trực tiếp vào khối u.

Sự phân bố đồng đều trong toàn bộ khối u của hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-

PEG liên quan trực tiếp đến hiệu quả của vật liệu trong ứng dụng vào chụp cộng hưởng

từ (MRI) và nhiệt từ điều trị khối u vì nó cho phép xây dựng hình ảnh khối u một cách

thực tế cũng như khả năng tiêu diệt các tế bào khối u triệt để hơn [153]. Để đánh giá sự

phân bố của hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG trong khối u rắn dưới da chuột,

khối u sau khi được tiêm hệ chất lỏng nano từ sẽ được theo dõi theo thời gian dưới góc

chụp 90o. Với lượng hạt nano từ tiêm vào khối u là 50 µg/0,5 cm3 khối u, hình ảnh cho

thấy không có sự lan rộng của vật liệu theo thời gian (Hình 5.6). Như vậy lượng tiêm

50 µg cho phép phát hiện khối u trên hình ảnh nhưng chưa đủ để hệ chất lỏng nano từ

có thể phát tán ra toàn bộ khối u. Với lượng tiêm 250 µg/0,5 cm3 khối u, tín hiệu chụp

119

cho thấy vật liệu nano gần như bao phủ toàn bộ khối u vào thời điểm 15 phút sau khi

tiêm và duy trì liên tục trong gần 1 giờ sau đó (Hình 5.5). Kết quả này cho thấy để nhiệt

trị hiệu quả, nồng độ hệ chất lỏng nano từ phải đạt tối thiểu là 250 µg/0,5 cm3 khối u,

thời gian bắt đầu chiếu từ trường điều trị nên là 15 phút sau tiêm.

Đối chứng

25 μg

250 μg

0 phút

15 phút

30 phút

60 phút

Hình 5.5. Ảnh chụp MRI theo chế độ T2W, TE 80ms, TR 3,0s, góc chụp 90o cho thấy tốc độ lan truyền của hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG trong khối u rắn dưới da chuột theo thời gian ở hai nồng độ vật liệu thử nghiệm là 25 µg/0,5 cm3 và 250 µg/0,5 cm3.

Kết quả chụp ảnh cộng hưởng từ ở chế độ T2W cho thấy hệ chất lỏng nano từ

Fe3O4@PLA-PEG mở ra hướng mới trong ứng dụng y sinh và chẩn đoán bằng hình

ảnh. So với kết quả chụp ảnh MRI chế phẩm chất lỏng nano sắt từ S11_PMAO (hạt nano

sắt từ Fe3O4 bọc PMAO) đã được công bố của TS. Vương Thị Kim Oanh [154], hệ chất

lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG cho kết quả hình ảnh MRI tập trung khối u và rõ nét,

kết quả này tạo điều kiện thuận lợi ứng dụng hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG

tiêu diệt tế bào ung thư và khối u ác tính bằng phương pháp nhiệt trị (hyperthermia).

120

5.3. Khả năng điều trị ung thư bằng nhiệt từ trị

5.3.1. Khả năng tiêu diệt tế bào ung thư bằng nhiệt từ trị

Trong ứng dụng nhiệt từ trị liệu ung thư, sử dụng từ trường đạt vùng nhiệt độ 42

- 46oC đảm bảo phù hợp nhất cho tiêu diệt các tế bào ung thư và hạn chế ảnh hưởng lên

các mô bình thường [155]. Trong thử nghiệm này, Từ trường 80 Oe đạt nhiệt độ thích

hợp ở tất cả nồng độ hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG trong khoảng 0,1 - 2

mg/mL, từ trường 70 Oe đạt yêu cầu với nồng độ CLT lớn hơn 0,5 mg/mL và 60 Oe

chỉ đạt yêu cầu với nồng độ 2 mg/mL (Bảng 5.1).

Bảng 5.1. Nhiệt độ bão hòa đạt được (oC) khi kích thích hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA- PEG bằng những từ trường có cường độ khác nhau

Từ trường khảo sát

0,1 mg/mL

Nồng độ vật liệu hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG 0,5 mg/mL 36,1 o C 40,7 o C 47,5 o C

0,2 mg/mL 34,1 o C 37,6 o C 43,1 o C

1,0 mg/mL 37,9 o C 45,6 o C 52,1 o C

2,0 mg/mL 41,5o C 50,5 o C 59,6 o C

32,4o C 33,9o C 38,6o C

60 Oe, 178 kHz 70 Oe, 178 kHz 80 Oe, 178 kHz

Để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ hạt nano từ đến hiệu quả nhiệt trị liệu trên

mô hình tế bào ung thư nuôi cấy in vitro, 5.106 tế bào Sarcoma 180 sẽ được trộn với

các nồng độ CLT khác nhau lần lượt là 0; 0,1; 0,2; 0,5; 1,0; 2,0 mg/mL. Sau khi nhiệt

trị 30 phút ở từ trường xoay chiều có cường độ 70 Oe, tần số 178 kHz, mẫu tế bào được

nhuộm với blue trypan để xác định tỷ lệ sống chết.

Hình 5.6. Tế bào Sarcoma 180 sau khi đốt từ 30 phút với hệ chất lỏng nano từ nồng độ 2 mg/mL ở từ trường 70 Oe, 178 kHz. Mẫu thí nghiệm (A), Đối chứng (ĐC) nhiệt trị - có hạt từ, không chiếu từ trường (B), và Đối chứng sinh học - ĐCSH (C).

121

Bảng 5.2. Tỷ lệ tế bào chết (%) sau khi được trộn với hệ chất lỏng nano từ và chiếu từ trường 30 phút

0 mg/mL 11,7 12,3 11,5

0,1 mg/mL 12,3 11,5 11,9

0,2 mg/mL 12,9 12 12,1

0,5 mg/mL 15,4 11,8 11,5

1,0 mg/mL 21,2 12,5 10,2

2,0 mg/mL 38,6 13,6 9,4

Nồng độ chất lỏng hệ chất lỏng nano từ Nhiệt trị ĐC nhiệt trị ĐCSH

Trong đó:

ĐCSH: Tế bào Sarcoma 180 không trộn CLT không chiếu từ trường.

ĐC nhiệt trị: Tế bào sarcoma 180 trộn với CLT, ủ trong 30 phút, không

chiếu từ trường.

Nhiệt trị: Tế bào Sarcoma 180 trộn với CLT, ủ trong 30 phút, chiếu từ

trường.

ĐC không nhiệt trị: Tế bào Sarcoma 180 không trộn với CLT, ủ trong 30

phút, chiếu từ trường.

Kết quả từ Bảng 5.2 và Hình 5.7 cho thấy có sự khác biệt rõ rệt giữa tỷ lệ chết

của nhóm đối chứng và nhóm thử nghiệm: tỷ lệ chết của tế bào tăng khi tăng nồng độ

hạt nano, nồng độ hạt nano 1 mg/mL và 2 mg/mL cho hiệu quả tiêu diệt tế bào rõ ràng

nhất, lần lượt là 21,2% và 38,6%.

Hình 5.7. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ hạt nano từ đến tỉ lệ chết của tế bào Sarcoma 180

122

Bảng 5.3. Tỷ lệ tế bào chết tại các thời điểm sau khi chiếu từ trường với nồng độ chất lỏng nano từ 2 mg/mL

0 phút 10 phút 20 phút 30 phút 60 phút

Tỷ lệ chết (%) tại các thời điểm sau khi kết thúc chiếu từ trường

18,0

30,9

36,1

41,3

50,0

Mẫu thí nghiệm

Đốt 45 phút

6,0

7,4

8,3

8,7

9,8

ĐC không nhiệt trị

23,1

37,8

50,7

56,3

61,4

Mẫu thí nghiệm

Đốt 60 phút

6,9

7,5

7,0

7,3

8,6

ĐC không nhiệt trị

Bảng 5.4. Tỷ lệ tế bào chết tại các thời điểm sau khi chiếu từ trường với nồng độ chất lỏng nano từ 1 mg/mL

0 phút 10 phút 20 phút 30 phút 60 phút

Tỷ lệ chết (%) tại các thời điểm sau khi kết thúc chiếu từ trường

7,1

9,6

12,1

14,3

16,7

Mẫu thí nghiệm

Đốt 45 phút

7,4

7,3

8,2

8,7

9,1

ĐC không nhiệt trị

18,6

28,5

29,6

36,0

36,2

Mẫu thí nghiệm

Đốt 60 phút

7,4

7,8

8,2

8,5

9,1

ĐC không nhiệt trị

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian đốt nhiệt lên tỷ lệ chết của tế bào ung

thư Sarcoma 180 với hai nồng độ 1 và 2 mg/mL tại hai thời điểm chiếu từ trường khác

nhau là 45 phút và 60 phút. Số lượng tế bào chết được kiểm tra tại các thời điểm 0, 10,

20, 30, 60 phút sau khi chiếu từ trường, kết quả được trình bày trong Bảng 5.3 và 5.4.

Sau khi dừng chiếu từ trường và để ở môi trường ngoài tế bào tiếp tục chết thêm,

điều này có thể do tác động của quá trình nhiệt trị đã làm tế bào ung thư bị suy yếu và

tiếp tục chết sau khi kết thúc nhiệt trị (Hình 5.9), số lượng tế bào chết (màu xanh) tăng

lên đáng kể sau khi kết thúc nhiệt trị.

Hình 5.8. Tế bào Sarcoma 180 tại thời điểm: 0 phút (A) và 60 phút (B) 123

Hình 5.9. Tỷ lệ tế bào Sarcoma 180 chết theo thời gian sau khi đốt nhiệt 60 phút với nồng độ 1 mg/mL và 2 mg/mL hệ chất lỏng nano từ ở từ trường 70 Oe, 178 kHz.

Từ biểu đồ Hình 5.9 ta thấy tế bào chết tỷ lệ thuận với nồng độ hạt và thời gian

chiếu từ trường và tế bào tiếp tục chết khi ngừng từ trường; tại thời điểm 60 phút sau

khi ngừng chiếu từ trường, số lượng tế bào chết ở cả hai nồng độ 1 mg/mL và 2 mg/m

đều rất cao, lần lượt là 36,2% và 61,4%.

Từ các kết quả trên, có thể nhận xét:

Phương pháp nhiệt từ trị sử dụng hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG hoàn

toàn có khả năng giết chết tế bào ung thư Sarcoma 180.

Nồng độ hạt nano và thời gian đốt nhiệt tỷ lệ thuận với tỷ lệ chết của tế bào, nồng

độ 1 mg/mL và 2 mg/mL cho hiệu quả tiêu diệt tế bào rõ ràng nhất, lần lượt là 36,2%

và 61,4 % khi chiếu từ trường 60 phút. Mặt khác, sau khi ngừng đốt nhiệt, tế bào ung

thư vẫn tiếp tục chết theo thời gian, tại thời điểm 60 phút khi kết thúc nhiệt từ trị, tỷ lệ

tế bào chết tăng 40% so với thời điểm 0 phút. Từ những kết quả trên cho thấy hệ chất

lỏng nano đa chức năng lõi hạt Fe3O4 mở ra hướng nghiên cứu và triển vọng ứng dụng

to lớn nhiệt trị điều trị ung thư nói riêng và trong lĩnh vực y sinh học nói chung.

Một số kết quả nghiên cứu trước đây [155] cho thấy khi sử dụng từ trường ngoài

xoay chiều làm nóng cục bộ các hạt nano từ có khả năng làm tổn thương, trực tiếp tiêu

diệt các tế bào ung thư, mặt khác hạt nano từ cần được bọc bao phủ bề mặt để tăng khả 124

năng tương thích sinh học, giảm độc tố và tăng thời gian lưu thông máu [155]. Khả

năng tăng nhiệt cục bộ của hạt nano từ dựa vào từ trường xoay chiều được nghiên cứu

và ứng dụng trong nhiệt trị tiêu diệt tế bào ác tính, khối u ác tính do dễ thực hiện, chi

phí thấp và giảm thiểu biến chứng [156]. Các nghiên cứu gần đây cho thấy hạt nano từ

được xem như một công cụ hữu hiệu, linh hoạt và khả năng ứng dụng to lớn trong lĩnh

vực y sinh, bao gồm khả năng nhiệt trị tiêu diệt tế bào ung thư [157].

5.3.2. Tiêu diệt khối u bằng nhiệt từ trị sử dụng Fe3O4@PLA-PEG

Gây tạo u trên chuột

Cấy truyền tế bào Sarcoma 180 để gây tạo u rắn dưới da trên tổng số 90 chuột,

số chuột lên u là 82, số chuột không lên u 8, tỷ lệ lên u là 91,1%.

- Sau 2 ngày tiêm đã có thể nhìn thấy được khối u.

- Sau 5 ngày khối u lồi tròn, kích thước trung bình đạt được 4,7±0,6mm x 4,8±0,5

mm.

- Sau 10 ngày, kích thước khối u trung bình đạt được là 7,9±1,2mm x 8,5±1,4

(A)

(B)

(C)

mm.

Hình 5.10. Ảnh khối u rắn dưới da sau 5 ngày (A), 10 ngày (B) và 15 ngày (C) cấy truyền.

125

Sau khi cấy tế bào ung thư, khối u rắn phát triển rất nhanh, chỉ 2 ngày sau đã có

thể nhìn rõ bằng mắt thường, những ngày sau kích thước khối u tăng lên không ngừng.

Đến ngày thứ 5 khối u lồi tròn, kích thước trung bình đạt được 5,5±0,5mm x

6,0±0,5mm. Ngày thứ 8, nhiều khối u xuất hiện lõi hồng ở trung tâm khối u (dấu hiệu

của hoại tử). Trong những ngày tiếp theo, lõi hoại tử dần lan rộng, sâu hơn và lớn lên

cùng kích thước khối u.

Kết quả nhiệt trị trên chuột mang khối u

Tiến hành đánh giá hiệu quả nhiệt từ trị trên hai mô hình chuột nhắt trắng Swiss

mang khối u rắn 5 ngày tuổi bằng cách tiêm hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG

trực tiếp vào khối u. Thực hiện ba lần điều trị trong từ trường có tần số xoay chiều 178

kHz và cường độ 70 Oe với thời gian giữa hai điều trị liên tiếp là 48 giờ. So sánh thể

tích khối u giữa các lô điều trị và lô đối chứng trong trong quá trình điều trị và 21 ngày

sau khi kết thúc điều trị cho thấy hệ chất lỏng nano từ từ Fe3O4@PLA-PEG có khả năng ức chế tăng trưởng khối u trong thời gian điều trị trong cả hai thí nghiệm [147].

Kết quả thực nghiệm cho thấy: Thể tích khối u ở lô được điều trị giảm mạnh, đặc

biệt có 50% cá thể đáp ứng rất tốt với điều trị khi khối u hoàn toàn biến mất sau ba lần

chiếu từ trường. Tại lần nhiệt trị đầu tiên, trên bề mặt khối u điều trị xuất hiện lớp vảy

đen, lớp vảy này lan rộng cùng sự giảm thể tích khối, sau đó khi bong ra để lộ mô sẹo

trên da và chuột có thể mọc lông trở lại (Hình 5.11).

Ở hai lô điều trị thể hiện những đặc điểm khác biệt rõ rệt so với các lô đối chứng.

Sau lần đốt nhiệt thứ 2, bề mặt khối u xuất hiện lớp vảy đen khô cứng do tế bào chết

tạo thành, kích thước khối u vẫn tăng nhẹ. Lớp vảy này lan rộng ra và bao phủ hết bề

mặt sau lần điều trị thứ 3 (Hình 5.11). Ở những ngày tiếp theo, khối u không tăng kích

thước và dần xẹp xuống, lớp vảy đen dần bong ra và để lại mô sẹo trên da.

Ngược lại, ở các lô đối chứng kích thước khối u tăng mạnh qua các lần đo và đến

ngày thứ 12 (kết thúc thử nghiệm), khối lượng khối u tăng khoảng 22 lần so với ban

đầu.

126

Điều trị lần 3

Điều trị lần 2

Điều trị lần 1

Trước điều trị (C) Đối chứng ung thư

Trước điều trị Trước điều trị (A) Điều trị (B) Đối chứng nhiệt trị Hình 5.11. Ảnh khối u trước và sau khi điều trị trên khối u 5 ngày tuổi.

Tính đến ngày thứ 12 kể từ khi bắt đầu nhiệt trị lần đầu tiên, ở cả hai lô điều trị

đều có 3/6 chuột tiêu giảm khối u hoàn toàn, các cá thể còn lại khối u không tăng hoặc

tăng rất chậm (Hình 5.12) và khối u không bị hoại tử, trong khi đó đối chứng ung thư

khối u tăng khoảng 22 lần so với ban đầu và bị hoại tử mạnh.

Theo dõi đồ thị tăng trưởng thể tích khối u 5 ngày tuổi sau liệu trình điều trị có thể

nhận thấy kích thước trung bình của khối u ở thời điểm nhiệt trị cuối cùng (khoảng

600%) chỉ tương đương 37-38% so với đối chứng ung thư (khoảng 2100%) (Hình 5.13)

127

Ngày 1

Ngày 2

Ngày 4

Ngày 7

Ngày 12

Ngày 10 Hình 5.12. Ảnh về tăng khối u chuột đối chứng trong 12 ngày theo dõi.

Hình 5.13. Theo dõi sự thay đổi thể tích khối u được nhiệt trị trên khối u 5 ngày tuổi, Lô 1 – tiêm 30 µL hạt nano, lô 2 – tiêm 20 µL hạt nano

Tái tăng trưởng khối u sau điều trị là yếu tố quan trọng để đánh giá hiệu quả của

một phương pháp điều trị. Tiến hành theo dõi khối u 5 ngày tuổi sau liệu trình nhiệt trị,

có thể nhận thấy thể tích khối u vẫn tiếp tục giảm trong 4-5 ngày tiếp theo và duy trì

không đổi trong 2 ngày sau đó. Sau ngày thứ 8, khối u bắt đầu có dấu hiệu tăng sinh trở 128

lại với tấc độ rất chậm. Ở ngày theo dõi thứ 14, kích thước u gần như không thay đổi

so với thời điểm kết thúc điều trị (Hình 5.11A).

Nghiên cứu sử dụng hệ đa chức năng nano copolyme lõi hạt Fe3O4 trong luận án

này là phù hợp với một số kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học, nghiên cứu sinh

tại Viện khoa học vật liệu (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) tiến hành

trước đây trên hệ chất lỏng từ đơn giản khác [89, 154, 158]. Các kết quả của nhóm

nghiên cứu nói chung và và của luận án nói riêng cũng phù hợp với các kết quả nghiên

cứu của thế giới về tiềm năng ứng dụng của hạt nano từ nói chung, đặc biệt là với các

kết quả nghiên cứu đã được công bố bởi nhóm của giáo sư S.S. Feng ở Singapore sử

dụng lớp bọc copolyme [69].

Kết quả nghiên cứu này một lần nữa khẳng định phương pháp nhiệt từ trị sử dụng

hạt nano lõi Fe3O4 bọc bởi copolyme PLA-PEG cho triển vọng mở ra hướng mới trong

các ứng dụng y sinh, đặc biệt trong nhiệt từ trị điều trị ung thư.

Kết luận chương 5

Kết quả thử độc tính tế bào cho thấy hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG và

Fe3O4@PLA-PEG/Cur không gây độc đối với tế bào Sarcoma 180 và BT-474, giá trị

LD50 là 120.945 ± 2.07 mg/kg thể trọng.

Thí nghiệm MRI cho thấy hệ chất lỏng nano từ hoàn toàn tuân theo lý thuyết làm

tăng độ tương phản của hình ảnh trong hình chụp trọng T2. Ảnh MRI trên khối u cho

thấy với lượng tiêm 250 µg/0,5cm3 khối u cho tín hiệu ảnh tốt nhất.

Nhiệt từ trị tiêu diệt tế bào ung thư của hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG

đạt hiệu quả rõ ràng ở nồng độ 1 mg/mL và 2 mg/mL, ở từ trường cường độ 70 Oe, tần

số 178 kHz và thời gian chiếu từ trường nhiệt trị là 60 phút đạt hiệu quả tiêu diệt tế bào,

tương ứng là 36,2% và 61,4 %.

Thí nghiệm nhiệt từ trị tiêu diệt khối u cho thấy: Thể tích khối u ở lô được điều

trị giảm mạnh, đặc biệt có 50% cá thể đáp ứng rất tốt với điều trị khi khối u hoàn toàn

biến mất sau ba lần chiếu từ trường.

129

Tóm lại, từ các kết quả nghiên cứu trên cho thấy hệ chất lỏng nano từ

Fe3O4@PLA-PEG đã chế tạo hoàn toàn có thể ứng dụng trong chẩn đoán bằng hình ảnh

cộng hưởng từ và nhiệt từ trị tiêu diệt ung thư dựa vào khả năng đốt nóng cảm ứng từ

tại chỗ, mở ra hướng mới trong ứng dụng y sinh.

130

KẾT LUẬN CHUNG

Từ các kết quả nghiên cứu và thảo luận, một số kết luận chính được rút ra như sau:

1. Đã tổng hợp được hệ nano copolyme PLA-PEG với tỷ lệ thành phần PLA:PEG

3:1, 2:1, 1:1, 1:2 và 1:3 có cấu trúc lõi-vỏ, với phần lõi kỵ nước PLA và phần vỏ ưa

nước PEG, kích thước hạt trung bình dưới 100 nm, kích thước của hệ nano copolyme

PLA-PEG do phần lõi PLA quyết định là chủ yếu.

2. Đã mang được Curcumin vào hạt nano copolyme PLA-PEG, đã gắn được yếu

tố hướng đích Folat lên hệ copolyme PLA-PEG tạo thành hệ nano mang thuốc đa chức

năng.

3. Kết quả thử nghiệm in vitro cho thấy hệ nano Cur/PLA-PEG-Fol có chỉ số IC50

tốt nhất, hiệu quả cao hơn khoảng 7 lần so với hệ nano Cur/PLA-PEG và khảng 60 lần

so với Cur/H2O. Trong các hệ dẫn thuốc nano, hệ nano copolyme PLA-PEG 2:1 vừa

đảm bảo khả năng mang thuốc vừa đảm bảo khả năng nhập bào.

4. Đã tổng hợp thành công hạt nano Fe3O4 kích thước khoảng 15 nm, được chức

năng hóa bởi PLA-PEG có mang và không mang Curcumin tạo thành hệ chất lỏng nano

từ Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur ứng dụng trong y sinh (tương phản

MRI, mang nhả thuốc và cả nhiệt từ trị).

5. Kết quả đo độ hồi phục hệ nano Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur

cho thấy độ hồi phục r2 của mẫu Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur đều lớn

hơn các chất thương phẩm (Resovist và Ferumoxytol). Hạt nano Fe3O4@PLA-PEG và

Fe3O4@PLA-PEG/Cur có khả năng tăng nhiệt tại chỗ dựa vào từ trường ngoài nên hoàn

toàn có thể được sử dụng hiệu quả trong nhiệt từ trị và tăng khả năng giải phóng thuốc.

6. Hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur không gây

độc đối với tế bào Sarcoma 180 và BT-474, giá trị LD50 là 120.945 ± 2.07 mg/kg thể

trọng.

7. Thí nghiệm MRI cho thấy hệ chất lỏng nano từ hoàn toàn tuân theo lý thuyết

làm tăng độ tương phản của hình ảnh trong hình chụp cộng hưởng từ.

131

8. Nhiệt từ trị tiêu diệt tế bào ung thư của hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG

đạt hiệu quả rõ ràng ở nồng độ 1 mg/mL và 2 mL/mL, ở từ trường cường độ 70 Oe, tần

số 178 kHz và thời gian chiếu từ trường nhiệt trị là 60 phút. Thí nghiệm nhiệt trị tiêu

diệt khối u cho thấy 50% cá thể đáp ứng rất tốt với điều trị.

Từ các kết luận 4-8 thấy rằng, hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG và

Fe3O4@PLA-PEG/Cur chế tạo được chứng tỏ là hệ thuốc nano đa chức năng tiềm chứa

khả năng ứng dụng đa năng (tương phản MRI, mang – giải phóng thuốc và nhiệt điều

trị) cho chẩn đoán và điều trị trong y sinh.

Tóm lại, trong luận án này chúng tôi đã tổng hợp, chế tạo và nghiên cứu một cách

hệ thống từ các thành phần cơ bản cho cấu trúc nano trong môi trường nước là copolyme

PLA-PEG, qua việc mang thuốc Curcumin và đính yếu tố định đích Folat lên hệ nano

này (Chương 3). Sau đó, hai hệ tương tự đã được tạo thêm yếu tố từ tính dung hạt nano

Fe3O4 đưa vào làm hạt lõi, như Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur. Các

nghiên cứu trình bày trong chương 4 và 5 chứng tỏ hệ nano phức hợp từ tính chế tạo

được chứa đựng phẩm năng ưu việt cho đa dạng ứng dụng trong sinh y như tăng tương

phản ảnh MRI, nhiệt từ trị hay điều khiển giải phóng thuốc từ xa.

132

DANH MỤC CÁC TÀI LIỆU ĐÃ CÔNG BỐ

A. CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ SỬ DỤNG TRONG LUẬN ÁN

1. Phan Quốc Thông, Hà Phương Thư, Đỗ Hùng Mạnh, Nguyễn Xuân Phúc, Ảnh

hưởng của poly (lactide) (pla) đến kích thước và khả năng mang thuốc của hạt nano

copolyme poly (lactide)-poly (ethylene glycol) (PLA-PEG), Hội nghị VLCR & KHVL

SPMS2013, Thái Nguyên 11-2013.

2. Phan Quoc Thong, Nguyen Hoai Nam, Nguyen Xuan Phuc, Do Hung Manh, Ha

Phuong Thu, Impact of PLA/PEG ratios on Curcumin solubility and encapsulation

efficiency, size and release behavior of Curcumin loaded poly(lactide)-

poly(ethylenglycol) polymeic micelles, International Journal of Drug Delivery 6 (2014)

279-285.

3. Quoc Thong Phan, Mai Huong Le, Thi Thu Huong Le, Thi Hong Ha Tran, Phuc

Nguyen Xuan, Phuong Thu Ha, Characteristics and cytotoxicity of folate-modified

Curcumin-loaded PLA-PEG micellar nano systems with various PLA:PEG ratios,

International Journal of Pharmaceutics 507 (2016) 32–40.

4. Phan Quoc Thong, Ha Phuong Thu., Le Thi Thu Huong, Luu Huu Nguyen, Nguyen

Xuan Phuc, Structure and properties of Fe3O4 nanoparticles coated by PLA-PEG

copolyme with and without loading of Curcumin. J. Sci. Technol, 2016. 54 (1A): p.

268–276.

5. Hong Nam Pham, Thi Ha Giang Pham, Dac Tu Nguyen, Quoc Thong Phan, Thi

Thu Huong Le, Phuong Thu Ha, Hung Manh Do, Thi My Nhung Hoang and Xuan Phuc

Nguyen, Magnetic inductive heating of organs of mouse models treated by copolymer

coated Fe3O4 nanoparticles, Adv. Nat. Sci.: Nanosci. Nanotechnol. 8 (2017) 025013

(10pp)

133

B. CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN HƯỚNG NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN

1. Ha P.T., Duong T.Q., Mai T.T.T., Tran T.H.H., Nguyen H.N., Nguyen X. P., Tran

T.M.N., Phan Q.T., Phan T.H.T., Vuong T.K.O., Le M.H., In Vitro Apoptosis

Enhancement of HepG2 Cells by PLA–TPGS and PLA–PEG Block Copolyme

Encapsulated Curcumin Nanoparticles. Chemistry letters, 2013. 42: p. 255-257.

2. Lưu Hữu Nguyên, Phan Quốc Thông, Phạm Hồng Nam, Lê Thị Hồng Phong, Đỗ

Hùng Mạnh, Phạm Thanh Phong, Ảnh hưởng của từ độ bão hòa và độ nhớt đến công

suất đốt từ của hai hệ hạt nano từ CoFe2O4 và MnFe2O4, Hội nghị VLCR & KHVL

SPMS2015, Tp HCM 11-2015.

3. Lê Thị Thu Hương, Nguyễn Hoài Nam, Đỗ Hải Đoan, Hoàng Thị Mỹ Nhung, Phạm

Hồng Nam, Phan Quốc Thông, Nguyễn Xuân Phúc, Hà Phương Thư, Hệ dẫn thuốc

nano đa chức năng dựa trên hạt nano Fe3O4 mang curcumin gắn yếu tố hướng đích

folate ứng dụng trong điều trị ung thư, Hội nghị VLCR & KHVL SPMS2015, Tp HCM

11-2015.

4. Luu Huu Nguyen, Phan Quoc Thong, Pham Hong Nam, Le Thi Hong Phong, Pham

Thanh Phong, Nguyen Xuan Phuc, Influence of saturation magnetization and viscosity

on specific loss power for CoFe2O4 and MnFe2O4 magnetic nanoparticles. J. Sci.

Technol, 2016. 54 (1A): p. 33-41.

5. Le Thi Thu Huong, Nguyen Hoai Nam, Do Hai Doan, Hoang Thi My Nhung, Bui

Thuc Quang, Pham Hong Nam, Phan Quoc Thong, Nguyen Xuan Phuc, Ha Phuong

Thu, Folate attached, Curcumin loaded Fe3O4 nanoparticles: A novel multifunctional

drug delivery system for cancer treatment, Materials Chemistry and Physics xxx (2016)

1e7.

134

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Ferrari M., Cancer nanotechnology: opportunities and challenges. Nat. Rev.

Cancer, 2005. 5: p. 161-171.

2. Cuenca A.G., Jing H., Hochwald S.N., Delano M., Cance W.G., Grobmyer S. and

R., Emerging implications of nanotechnology on cancer diagnostics and

therapeutics. Cancer, 2006. 107: p. 459-466.

3. Moghimi S.M., Hunter A.C., Murray J.C., Long-circulating and target-specific

nanoparticles: Theory to practice. Pharmacol. ReV, 2001. 53: p. 283–318.

4. Freeman A. I., Mayhew E., Targeted drug delivery. Cancer, 1986. 58: p. 573–583.

5. Torchilin V.P., et al., Multifunctional nanocarriers. Adv Drug Deliv Rev, 2006.

58(14): p. 1532-1555.

6. Nasongkla N., Bey E., Ren J.M. et al., Multifunctional polymeric micelles as

cancer-targeted, MRI-ultrasensitive drug delivery systems. Nano Lett, 2006.

6(11): p. 2427-2430.

7. Gang B., et al., Annu. Rev. Biomed. Eng, 2013.

8. Yang J., Lee C.H., Park J. et al., Antibody conjugated magnetic PLGA

nanoparticles for diagnosis and treatment of breast cancer. J Mater Chem, 2007.

17(26): p. 2695-2705.

9. Liu J., Lee H., Allen C., Formulation of drugs in block copolymer micelles: drug

loading and release. Curr Pharm Des, 2006. 12(36): p. 4685-4701.

10. Takaichi W., Yui S., Tetsuya I., Yukitaka K., Tsutomu O., Indocyanine green-

laden poly(ethylene glycol)-block-polylactide (PEG-b-PLA) nanocapsules

incorporating reverse micelles: Effects of PEG-b-PLA composition on the

nanocapsule diameter and encapsulation efficiency. Colloids and Surfaces A,

2017. 520: p. 764-770.

11. Owens D.E., Peppas N.A., Opsonization, biodistribution, and pharmacokinetics of

polymeric nanoparticles. Int. J. Pharm, 2006. 307: p. 93–102.

135

12. Romberg B., Hennink W.E., Storm G., Sheddable coatings for long-circulating

nanoparticles. Pharm. Res, 2008. 25: p. 55–71.

13. Bartlett D.W., Su H., Hildebrandt I.J., Weber W.A., Davis M.E., Impact of tumor-

specific targeting on the biodistribution and efficacy of siRNA nanoparticles

measured by multimodality in vivo imaging. Proc. Natl. Acad. Sci, 2007. 104: p.

15549–15554.

14. Hainfeld J.F., Slatkin D.N., Focella T.M. et al., Gold nanoparticles: a new X-ray

contrast agent. Br J Radiol, 2006. 79(93): p. 248-253.

15. Bulte J.W.M., Kraichman D.L., Iron oxide MR contrast agents for molecular and

cellular imaging. Nmr Biomed, 2004. 17(7): p. 484-499.

16. Otsuka H., Nagasaki Y., Kataoka K., PEGylated nanoparticles for biological and

pharmaceutical applications. Adv Drug Deliv Rev, 2003. 55: p. 403-19.

17. Wang S., L.Y., Zhou J., Wang M., Wang Y., PLA-PEG-FA NPs for drug delivery

system: Evaluation of carrier micro-structure, degradation and size-cell

proliferation relationship. Materials Science and Engineering: C, 2018. 91: p. 297-

302.

18. Nagayama S., O.K., Fukuoka Y., Higaki K., Kimura T., Time-dependent changes

in opsonin amount associated on nanoparticles alter their hepatic uptake

characteristics. Int. J. Pharm, 2007. 342: p. 215–221.

19. Kandasamy V., Mariappan R., Mechanism for the Nano-Based Drug Delivery

System. Characterization and Biology of Nanomaterials for Drug Delivery, 2018:

p. 219-263.

20. Beletsi A., Panagi Z., Avgoustakis K., Biodistribution properties of nanoparticles

based on mixtures of PLGA with PLGA PEG diblock copolymers. Int. J. Pharm,

2005. 298: p. 233–241.

21. Nagesha D.K., Plouffe B.D., Phan M., Lewis L.H., Sridhar S., Murthy S.K.,

Functionalization-induced improvement in magnetic pproperties of Fe3O4

nanoparticles for biomedical applications. J. Applied Physics, 2009. 105.

136

22. Purushtham S., Ramanujan R.V., Thermoresponsive magnetic composite

nanomaterials for multimodal cancer therapy. Acta Biomaterialia, 2010. 6: p. 502-

510.

23. Hayashi K., Ono K., Suzuki H., Sawada M., Moriya M., Sakamoto W. et al., High-

frequency, magnetic-field-responsive drug release from magnetic

nanoparticle/organic hybrid based on hyperthermic effect. ACS Appl. Mater.

Interfaces, 2010. 2: p. 1903–1911.

24. Sharma R.A., Gescher A.J., Steward W.P., Curcumin: the story so far. Eur J

Cancer, 2005. 41: p. 1955–1968.

25. Yallapu M.M., Jaggi M., Chauhan S.C., Curcumin nanoformulations: a future

nanomedicine for cancer. Drug Discov Today, 2012. 7(2): p. 71-80.

26. Syng-Ai C., Kumari A.L., Khar A., Effect of curcumin on normal and tumor cells:

role of glutathione and bcl-2. Mol Cancer Ther, 2004. 3: p. 1101–1108.

27. Surh Y.J., et al., Cancer chemoprevention with dietary phytochemicals. Nat Rev

Cancer, 2003. 3: p. 768–780.

28. Maheshwari R.K., Singh A.K., Gaddipati J., Srimal R.C., Multiple biological

activities of curcumin: a short review. Life Sci, 2006. 78: p. 2081-2087.

29. Inano H., Onoda M., Inafuku N., Kubota M., Kamada Y., Osawa T., Kobayashi

H., Wakabayashi K., Chemoprevention by curcumin during the promotion stage

of tumorigenesis of mammary gland in rats irradiated with gamma-rays.

Carcinogenesis, 1999. 20: p. 1011-1018.

30. Kawamori T., Lubet R., Steele V.E., Kelloff G.J., Kaskey R.B., Rao C.V., Reddy

B.S., Chemopreventive effect of curcumin, a naturally occurring anti-

inflammatory agent, during the promotion/ progression stages of colon cancer.

Cancer Res, 1999. 59: p. 597-601.

31. Aoki H., Takada Y., Kondo S., Sawaya R., Aggarwal B.B., Kondo Y., Evidence

that curcumin suppresses the growth of malignant gliomas in vitro and in vivo

137

through induction of autophagy: role of Akt and extracellular signal-regulated

kinase signaling pathways. Mol Pharmacol, 2007. 9.

32. Aggarwal B.B., Kumar A., Bharti A.C., Anticancer potential of curcumin:

preclinical and clinical studies. Anticancer Res, 2003. 23: p. 363–398.

33. Castedo M., PerfettiniJ.L., Roumier T., Andreau K., Medema R., Kroemer G., Cell

death by mitotic catastrophe: a molecular definition. Oncogene, 2004. 23: p.

2825–2837.

34. Johnstone R.W., Ruefli A.A., Lowe S.W., Apoptosis: a link between cancer

genetics and chemotherapy. Cell, 2002. 18: p. 153– 164.

35. Hsu C.H., Cheng A.L., Clinical studies with curcumin. Adv Exp Med Biol, 2007.

595: p. 471-480.

36. Lao C.D., Ruffin M.T.T., Normolle D., Heath D.D., Murray S.I., Bailey J.M.,

Boggs M.E., Crowell J., Rock C.L., Brenner D.E., Dose escalation of a

curcuminoid formulation. BMC Complement Altern Med, 2006. 6: p. 10-18.

37. Stewart M. E., et al., Nanostructured plasmonic sensors. Chem. Rev, 2008. 108:

p. 494-521.

38. Zharov V., Galanzha E., Shashkov E., Khlebtsov N., Tuchin V., In vivo photo

acoustic flow cytometry for monitoring circulating single cancer cells and contrast

agents. Opt. Lett, 2006. 31: p. 3623-3625.

39. Pissuwan D., Niidome T., Cortie M.B., The forthcoming application of Au

nanoparticles in drug and gene delivery systems. J. Control. Release, 2011. 149:

p. 65-71.

40. Ghosh P., Han G., De M., Kim C. K., Rotello V. M., Au nanoparticles in delivery

applications. Adv. Drug Deliv. Rev, 2008. 60: p. 1307-1315.

41. Sun Y., Xia Y., Shape-controlled synthesis of Au and silver nanoparticles.

Science, 2002. 298: p. 2176-2179.

138

42. Sun Y., Xia Y., Alloying and dealloying processes involved in the preparation of

metal nanoshells through a galvanic replacement reaction. Nano Lett, 2003. 3: p.

1569-1572.

43. Glomm W.R., Functionalized Au nanoparticles for applications in

bionanotechnology. J. Disp. Sci. Technol, 2005. 26: p. 389-414.

44. Mitamura K., Imae T., Functionalization of Au nanorods toward their

applications. Plasmonics, 2009. 4: p. 23-30.

45. Fukumori Y., Ichikawa H., Nanoparticles for cancer therapy and diagnosis. Adv

Powder Technol, 2006. 17(1): p. 1-28.

46. Prabhakaran T., Hemalatha J., Ferroelectric and magnetic studies on unpoled Poly

(vinylidine Fluoride)/Fe3O4 magnetoelectric nanocomposite structures. Materials

Chemistry and Physics, 2013. 137: p. 781-787.

47. Tsonos C., Pandis C., Soin N., Sakellari D., Myrovali E., Kripotou S., Kanapitsas

A., Siores E., Multifunctional nanocomposites of poly(vinylidene fluoride)

reinforced by carbon nanotubes and magnetite nanoparticles. eXPRESS Polymer

Letters, 2015. 9(12): p. 1104-1118.

48. Farshid H.P., Seyed J.P., Soodabeh D., Roya S., Development and

characterization of PLA-mPEG copolymer containing iron nanoparticle-coated

carbon nanotubes for controlled delivery of Docetaxel. Polymer, 2017. 117: p.

117-131.

49. Solmaz R., Firoozabati M., Bonyadi A., Lashanizadegan G., Experimental

investigation of Fe3O4 nanoparticles effect on the carbon dioxide hydrate

formation in the presence of magnetic field. Journal of Natural Gas Science and

Engineering, 2018. 59: p. 374-386.

50. Brigger I., Dubernet C., Couvreur P., Nanoparticles in cancer therapy and

diagnosis. Adv Drug Deliv Rev, 2002. 54(5): p. 631-651.

139

51. Lee J.H., Jun Y.W., Yeon S.I., et al., Dual-mode nanoparticle probes for high-

performance magnetic resonance and fluorescence imaging of neuroblastoma.

Angew Chem Int Ed, 2006. 45(48): p. 8160-8162.

52. Lee H.Y., Li Z., Chen K. et al., PET/MRI dual-modality tumor imaging using

arginine-glycine-aspartic (RGD)-conjugated radiolabeled iron oxide

nanoparticles. J Nucl Med, 2008. 49(8): p. 1371-1379.

53. Cheon J., Lee J.H., Synergistically integrated nanoparticles as multimodal probes

for nanobiotechnology. Acc Chem Res, 2008. 141(12): p. 1630-1640.

54. Peppas N.A., Intelligent therapeutics: Biomimetic systems and nanotechnology in

drug delivery. AdV. Drug DeliVery ReV, 2004. 56: p. 1529–1531.

55. Knight C.G., et al., Liposomes From Physical Structure To Therapeutic

Applications. Elsevier, 1981.

56. Gardner W. I., Cole C.L., Behavior treatment, behavior management, and

behavior control: Needed distinctions. Behav Inter, 1987. 2(1): p. 37-53.

57. Gref R., et al., ‘Stealth’ corona-core nanoparticles surface modified by

polyethylene glycol (PEG): Influences of the corona (PEG chain length and

surface density) and of the core composition on phagocytic uptake and plasma

protein adsorption. Colloids Surf, 2000. 18: p. 301–313.

58. Graff C.P., Wittrup K.D., Theoretical analysis of antibody targeting of tumor

spheroids: Importance of dosage for penetration, and affinity for retention. Cancer

Res, 2003. 63: p. 1288–1296.

59. Clauss M. A., Jain R.K., Interstitial transport of rabbit and sheep antibodies in

normal and neoplastic tissues. Cancer Res, 1990. 50: p. 3487–3492.

60. Couvreur P., Grislain L., Lenaert V., Brasseur F., Guiot P., Biernacki A.,

Biodegradable polymeric nanoparticles as drug carrier for antitumor agents. Poly

Nano and Micro, 1986: p. 27-93.

61. Langer R., Biomaterials in drug delivery and tissue engineering: One laboratory’s

experience. Acc Chem Res, 2000. 33: p. 94–101.

140

62. Ben-Shabat S., Kumar N., Domb A.J., PEG-PLA block copolymer as potential

drug carrier: Preparation and characterization. Macromol. Biosci, 2006. 6: p.

1019–1025.

63. Gref R., et al., Biodegradable long-circulating polymeric nanospheres. Science,

1994. 263: p. 1600–1603.

64. Bazile D., et al., Stealth Me.PEG-PLA nanoparticles avoid uptake by the

mononuclear phagocytes system. J. Pharm. Sci, 1995. 84: p. 493–498.

65. Francis G. E., Delgado C., Fisher D., Malik F., Agrawal A. K., results of

polystyrene nanoparticles with consistent composi- Polyethylene glycol

modification: Relevance of improved methodology to tumour targeting. J. Drug

Targeting, 1996. 3: p. 321–340.

66. Fang C., et al., In vivo tumor targeting of tumor necrosis factor- R-loaded stealth

nanoparticles: Effect of MePEG molecular weight and particle size. Eur. J. Pharm.

Sci, 2006. 27: p. 27–36.

67. Ferruti P., Penco M., D’Addato P., Ranucci E., De-ghenghi R., Synthesis and

properties of novel block copolymers containing poly(lactic-glucolic acid) and

poly-(ethyleneglycol) segments. Biomaterials, 1995. 16: p. 1423-1428.

68. Zhang Z., Feng S.S., In vitro investigation on poly(lactide)-tween 80 copolymer

nanoparticles fabricated by dialysis method for chemotherapy.

Biomacromolecules, 2006. 7: p. 1139-1146.

69. Zhang Z.P., Feng S.S., Nanoparticles of poly(lactide)/vitamin E TPGS copolymer

for cancer chemotherapy: synthesis, formulation, characterization and in vitro

drug release. Biomaterials, 2006. 27: p. 262–270.

70. Cullity B.D., Graham C.D., Introduction to magnetic materials. John Wiley &

Sons, Inc., Hoboken, New Jersey, 2009.

71. Wilhelm C., Gazeau F., Barci J.C., Magnetophoresis and ferromagnetic resonance

of magnettically labeled cells. Eur. Biophys. J, 2002. 31: p. 118-125.

141

72. Goodwill P.W., Saritas E.U., Croft L.R., Kim T.N., Krishnan K.M., Schaffer D.V.

et al., X-Space MPI: Magnetic nanoparticles for safe medical imaging. Adv.

Mater, 2012. 24: p. 3870–3877.

73. Elster A., Burdette J., Questions and Answers in Magnetic Resonance Imaging. St.

Louis, USA:Mosby, 2001.

74. Na H.B., Song I.C., Hyeon T., Inorganic Nanoparticles for MRI Contrast Agents.

Advanced Materials, 2009. 21: p. 2133-2148.

75. Shubayev V.I., Pisanic I., Thomas R., Jin S., Magnetic nanoparticles for

theragnostics. Advanced Drug Delivery Reviews, 2009. 61: p. 467-477.

76. Wang Y.X., Hussain .S.M., Krestin G.P., Superparamagnetic iron oxide contrast

agents: physicochemical characteristics and applications in MR imaging.

European Radiology, 2001. 11: p. 2319-2331.

77. Hee K.E., Sook L.H., Kook K.B., Kim B.K., Synthesis of ferrofluid with magnetic

nanoparticles by sonochemical method for MRI contrast agent. Journal of

Magnetism and Magnetic Materials, 2005. 289: p. 328-330.

78. Maity D., Choo S.G., Yi J., Ding J., Xue J.M., Synthesis of magnetite nanoparticles

via a solvent-free thermal decomposition route. Journal of Magnetism and

Magnetic Materials, 2009. 321: p. 1256-1259.

79. Thoeny H.C., Triantafylluo M., Birkhaeuser F.D., Froehlich J.M., Tshering D.W.,

Binser T., Fleischmann A., Vermathen P., Studer U.E., Combined ultrasmall

superparamagnetic particles of iron oxide-enhanced and diffusion-weighted

magnetic resonance imaging reliably detect pelvic lymph node metastases in

normalsized nodes of bladder and prostate cancer patients. European Urology,

2009. 55: p. 761-769.

80. Fortina P., Kricka L.J., Graves D.J., Park J., Hyslop T., Tam F., Halas N., Surrey

S., Waldman S.A., Applications of nanoparticles to diagnostics and therapeutics

in colorectal cancer. Trends Biotechnol, 2007. 25: p. 145-152.

142

81. Mornet S.V.S., Grassef F., Duguet E., Magnetic nanoparticle design for diagnosis

and therapy. J. Mat. Chem, 2004. 14: p. 2161-2175.

82. Jordan A., Wust P., Fahling H., John W., Hinz A., Felix R., Inductive heating of

ferrimagnetic particles and magnetic fluids: Physical evaluation of their potential

for hyperthermia. Int. J. Hyperthermia, 1993. 9: p. 51-68.

83. Hilger I., Kaiser W.A., Iron-oxide based nanostructures for MRI and magnetic

hyperthermia. Nanomedicine, 2012. 7(9): p. 1443-1451.

84. Saima A., Afzal S., Akhtar N., Sevinc K., Tejraj M.A., Nanomedicine: An effective

tool in cancer therapy. International Journal of Pharmaceutics, 2018. 540(1-2): p.

132-149.

85. Jordan A., S.R., Wust P., Fähling H., Roland F., Magnetic fluid hyperthermia

(MFH): Cancer treatment with AC magnetic field induced excitation of

biocompatible superparamagnetic nanoparticles. Journal of Magnetism and

Magnetic Materials, 1999. 201(3): p. 413-419.

86. Hergt R., Dutz S., Müller R., Zeisberger M., Magnetic particle hyperthermia:

nanoparticle magnetism and materials development for cancer therapy. Journal of

Physics: Condensed Matter, 2006. 18.

87. Gneveckow U., Jordan A., Scholz R., Bruss V., Waldofner N., Ricke J., Feussner

A., Hildebrandt B., Rau B., Wust P., Description and characterization of the novel

hyperthermia- and thermoablation-system MFH 300F for clinical magnetic fluid

hyperthermia. Medical Physics, 2004. 31: p. 1444-1451.

88. Gilchrist R.K., Medal R., Shorey W.D., Hanselman R.C., Parrott J.C., Taylor C.B.,

Magenheim M.Y., Levy S.B., Selective inductive heating of lymph nodes. Annals

of Surgery, 1997. 146: p. 596-606.

89. Tuấn, A.N., Hiệu ứng đốt từ trong các hạt từ kích thước nanomet. 2008. Luận văn

cao học.

90. Gneveckow U., Jordan A., Scholz R., Bruss V., Waldofner N., Ricke J., Feussner

A., Hildebrandt B., Rau B., Wust P., "Description and characterization of the

143

novel hyperthermia- and thermoablation-system MFH 300F for clinical magnetic

fluid hyperthermia". Medical Physics, 2004. 31: p. 1444-1451.

91. Sophie Laurent, et al., Magnetic Iron Oxide Nanoparticles: Synthesis,

Stabilization, Vectorization, Physicochemical Characterizations, and Biological

Applications. Chem. Rev., 2008. 108: p. 2064–2110.

92. Massart, R., Preparation of Aqueous Magnetic Liquids in Alkaline and Acidic

Media. IEEE Trans. Magn, 1981. 17(2): p. 1247 - 1248.

93. Linderoth S. and Morup S., Chemically prepared amorphous Fe-B particles:

Influence of pH on the composition. Journal of Applied Physics, 1990. 67: p. 4472-

4474.

94. Oppegard A. L., Darnell F.J., and Miller H. C., Magnetic Properties of Single-

Domain Iron and Iron-Cobalt Particles Prepared by Borohydride Reduction.

Journal of Applied Physics, 1981. 32: p. 184-190.

95. Cushing B.L., Vladimir L., Kolesnichenko V.L., O’Connor C.J., Recent Advances

in the Liquid-Phase Syntheses of Inorganic Nanoparticles. Chem. Rev, 2004.

104(9): p. 3893-3946.

96. Zhao D., et al., Study on supercritical hydrothermal synthesis of CoFe2O4

nanoparticles. The Journal of supercritical fluids, 2007. 42: p. 226-233.

97. Park J., et al., Synthesis of monodisperse spherical nanocrystals. Angewandte

Chemie International Edition, 2007. 46(25): p. 4630-4660.

98. Ung D., et al., Variant shape growth of nanoparticles of metallic Fe-Pt, Fe-Pd and

Fe-Pt-Pd alloys. CrystEngComm, 2009. 11(7): p. 1309-1316.

99. Felder-Flesch., Sylvie Begin-Coline and Delphine., Functionalization of Magnetic

Iron Oxide Nanoparticles, Chapter 6 in ‘Magnetic nanoparticles: From

fabrication to Clinical application’, Nguyen T.K. Thanh ed. rotocol, Contrast

Media Mol. Imaging, 2011: p. 189–199.

144

100. Daou T.J., Guillon D., Begin-Colin S., Coupling Agent Effect on Magnetic

Properties of Functionalized Magnetite-Based Nanoparticles. Chem. Mater, 2008.

20(18): p. 5869–5875.

101. Smolensky E.D., Part H.Y.E., Berquó T.S., Pierre V.C., Surface functionalization

of magnetic iron oxide nanoparticles for MRI applications - effect of anchoring

group and ligand exchange protocol. Contrast Media Mol. Imaging, 2011. 6: p.

189–199.

102. Lai T.P., Julien J., Geneviève P., Agnetic iron oxide and the effect of grafting on

the magnetic properties. in: Proc. SPIE, 2012: p. 1–9.

103. Laurent S., Forge D., Port M., Roch A., Robic C., Elst L.V. and Muller R. N.,

Magnetic iron oxide nanoparticles: Synthesis, stabilization, vectorization,

physicochemical characterizations, and biological applications. Chem. Rev,

2008. 108: p. 2064–2110.

104. Reddy L.H., Arias J.L., Nicolas J., Couvreur P., Magnetic nanoparticles: Design

and Characerization,Toxicity and Biocompatibility,Pharmaceutical and

Biomedical Applications. Chem. Rev, 2012. 112: p. 5818–5878.

105. Wang Y., Ng Y.W., Chen Y, Shuter B., Yi J., Ding J. et al., Formulation of

Superparamagnetic Iron Oxides by Nanoparticles of Biodegradable Polymers for

Magnetic Resonance Imaging. Adv. Funct. Mater, 2008. 18: p. 308–318.

106. Lodge T.P., Bryant P., Hanley K.J., The full phase behaviour of block copolymers

in sovlvents of varying selectivity. Macromolecules, 2002. 35: p. 4707–4717.

107. Prashant C., Dipak M., Yang C.T., Chuang K.H., Jun D., Feng S.S.,

Superparamagnetic iron oxide - Loaded poly (lactic acid)-d-a-tocopherol

polyethylene glycol 1000 succinate copolymer nanoparticles as MRI contrast

agent. Biomaterials, 2010. 31: p. 5588–5597.

108. Hickey R.J., Haynes A.S., Kikkawa J.M., Park S.J., Controlling the selfassembly

structure of magnetic nanoparticles and amphiphilic block-copolymers: from

micelles to vesicles. J. Am. Chem. Soc, 2011. 133(5): p. 1517-1525.

145

109. Ha P.T., Duong T.Q., Mai T.T.T, Tran T.H.H., Nguyen H.N., Nguyen X.P., Tran

T.M.N., Phan Q.T., Phan T.H.T., Vuong T.K.O. and Le M.H., In Vitro Apoptosis

Enhancement of Hep-G2 Cells by PLA–TPGS and PLA–PEG Block Copolymer

Encapsulated Curcumin Nanoparticles. Chemistry letters, 2013. 42: p. 255-257.

110. Shen T., Weissleder R., Papisov M., Bogdanov A., Brady T. J., Monocrystalline

iron oxide nanocompounds (MION): Physicochemical properties. Magn. Reson.

Med, 1993. 29: p. 599.

111. Skehan., et al., New Colorimetric Cytotoxicity Assay for Anticancer-Drug

Screening. Journal of National Cancer Institute, 1990. 82: p. 1107-1112.

112. Likhitwitayawuid K., et al., Cytotoxic antimalarial bisbenzylisoquinoline

aklaloids from Stephania erecta. Journal of Natural Products, 1993. 56: p. 30–38.

113. Labhasetwar V., Song C., Levy R.J., Nanoparticle drug delievry systems. Adv

Drug Del Rev, 1997. 24: p. 63-85.

114. Heger M., van Golen .R.F., Broekgaarden M., Michel M.C., The molecularbasis

for the pharmacokinetics and pharmacodynamics of curcumin and itsmetabolites

in relation to cancer. Pharmacol. Rev, 2014. 66: p. 222–307.

115. Srivastava R.M., Singh S., Dubey S.K., Misra K., Khar A., Immunomodulatory

and therapeutic activity of curcumin. Int. Immunopharmacol, 2011. 11: p. 331.

116. Francis G.E., Delgado C., Fisher D., Malik F. Agrawal, A.K., Results of

polystyrene nanoparticles with consistent composi- Polyethylene glycol

modification: Relevance of improved methodology to tumour targeting. J. Drug

Targeting, 1996. 3: p. 321–340.

117. Pan J., Feng S.S., Targeted delivery of paclitaxel using folate-decorated

poly(lactide)evitamin E TPGS nanoparticles. Biomaterials, 2008. 29: p. 2663–

2672.

118. Jeong Y.I., et al., Clonazepam release from core-shell type nanoparticles in vitro.

Journal of Controlled Release, 1998. 51(3): p. 169-178.

146

119. Sun C., Su K., Wang W., Zhao Y.T., Liu Y., Gao H.Z., He G., Yin Y.,

Encapsulation and controlled release of hydrophilic pesticide in shell cross-linked

nanocapsules containing aqueous core. International Journal of Pharmaceutics,

2014. 463(1): p. 108-114.

120. Arun K., Shantanu V.L., Alex M.R, Veena C., Folic acid and trastuzumab

conjugated redox responsive random multiblock copolymeric nanocarriers for

breast cancer therapy: In-vitro and in-vivo studies. Colloids and Surfaces B, 2017.

149: p. 369-378.

121. Farnaz B., Mohammad-Jafar A., Hamid S.A., Leila S., Hossein B., Engineering

folate-targeting diselenide-containing triblock copolymer as a redox-responsive

shell-sheddable micelle for antitumor therapy in vivo. Acta Biomaterialia, 2018.

76: p. 239-256.

122. Arijit B., Konda R.K., Sindhu D., Abraham J.D., Wahid K., Poly(lactic acid)

based hydrogels. Advanced Drug Delivery Reviews, 2016. 107: p. 192-205.

123. Anand S.D., Pratik N.C., Malleshappa N.N., Kiran C., Tejraj M.A., Polymeric

micelles: Basic research to clinical practice. International Journal of

Pharmaceutics, 2017. 532: p. 249-268.

124. Song Z., Feng R., Sun M., Guo C., Gao Y., Li L., Zhai G., Colloid Interf. Science,

2011. 116: p. 354-364.

125. Yallapu M.M., Nagesh P.K., Jaggi M., Chauhan S.C., Therapeutic Applications of

Curcumin Nanoformulations. AAPS J, 2015. 17(6): p. 1341-1356.

126. Liu L., Li C., Li X., Yuan Z., An Y., He B., Biodegradable polylactide/poly

(ethylene glycol)/polylactide triblock copolymer micelles as anticancer drug

carriers. Journal of applied polymer, 2001. 80: p. 1976-1982.

127. Ruan G., Feng S.S., Preparation and characterization of poly(lactic acid)-

poly(ethylene glycol)-poly(lactic acid) (PLA-PEG-PLA) microspheres for

controlled release of paclitaxel. Biomaterials, 2003. 24(27): p. 5037-44.

147

128. Xu L., Bai Q., Zhang X., Yang H., Folate-mediated chemotherapy and

diagnostics: An updated review and outlook. Journal of Controlled Release, 2017.

252: p. 73-82.

129. Low P.S., et al., Folate-targeted therapeutic and imaging agents for cancer.

Current Opinion in Chemical Biology, 2009. 13: p. 256–262.

130. Ha P.T., Nguyen H.N., Bui T.Q, Ho A.S., Nguyen T.T., Duong T.Q., In vitro and

in vivo targeting effect of folate decorated paclitaxel loaded PLA–TPGS

nanoparticles. Saudi Pharm J, 2015. 23(6): p. 683–688.

131. Mehdaoui B., Meffre A., Lacroix L.M., Carrey J., Lachaize S., Gougeon M.,

Respaud M., Chaudret B., Large specific absorption rates in the magnetic

hyperthermia properties of metallic iron nanocubes. Journal of Magnetism and

Magnetic Materials, 2010. 322(19): p. 49-52.

132. Burnham P., Dollahon N., Li C.H., Viescas A.J., Papaefthymiou G.C.,

Magnetization and specific absorption rate studies of ball-milled iron oxide

nanoparticles for biomedicine. Journal of Nanoparticles, 2013. 13: p. 1-2.

133. Olimpia G., Alice B., Mariacristina G., Giuseppe B., Biomedical nanoparticles:

Overview of their surface immune-compatibility. Open Access Publishing, 2014.

4: p. 139-159.

134. Reza T., Negar S., Comparisonof magnetic Fe3O4/chitosan and arginine modified

magnetic Fe3O4/chitosan nanoparticles in simultaneous multidye removal:

Experimental design and multicomponent analysis. International Journal of

Biological Macromolecules, 2018.

135. Phan Q.T, Ha P.T., Le T.T.H., Luu H.N, Nguyen X.P., Structure and properties of

Fe3O4 nanoparticles coated by PLA-PEG copolymer with and without loading of

curcumin. J. Sci. Technol, 2016. 54: p. 268–276.

136. Torchilin V.P., et al., PEG-based micelles as carriers of contrast agents for

different imaging modalities. Adv. Drug Deliv. Rev, 2002. 54: p. 235–252.

148

137. Piñeiro-Redondo Y., et al., The influence of colloidal parameters on the specific

power absorption of PAA-coated magnetite nanoparticles. Nanoscale Res Lett,

2011. 6(1): p. 383-392.

138. Guardia P., Batlle-Bragal B., Roca A. G., Iglesias O., Morales M. P., Serna C. J.,

et al., Surfactant effects in magnetite nanoparticles of controlled size. J. Magn.

Magn. Mater, 2007. 316: p. 756–759.

139. Quang, T.Đ., Nguyên lý và kĩ thuật chụp cộng hưởng từ. 2007. NXB ĐHQG TP

Hồ Chí Minh.

140. Kallumadil M., Tada M., Nakagawa T., Abe M., Southern P., Pankhurst Q.A.,

Suitability of commercial colloids for magnetic hyperthermia. J. Magn. Magn.

Mater, 2009. 321: p. 1509–1513.

141. Gonzalez-Fernandez M. A., Torres T.E., Costo R., de la Presa P., Serna C.J. et al.,

Agnetic nanoparticles for power absorption: Optimizing size, shape and magnetic

properties. J. Solid State Chem, 2009. 182: p. 2779–2784.

142. Lima Jr E., De Biasi B.E., Mansilla M.V., Saleta M.E., Granada M., Troiani H.E.

et al., Heat generation in agglomerated ferrite nanoparticles in an alternating

magnetic field. J. Phys. D. Appl. Phys, 2013. 46: p. 13pp.

143. Zhang Y., Zhai Y., Magnetic Induction Heating of Nano-sized Ferrite Particles.

Adv. Induction Microw. Heat. Miner. Orga Nic Mater, 2011: p. 483–500.

144. Parmar H., Smokova I.S., Kazantseva N.E., Babayan V., Smolka P., Moučka R. et

al., Size dependent heating efficiency of iron oxide single domain nanoparticles.

Procedia Eng, 2015. 102: p. 527–533.

145. Pham H.L, Pham V.T., Nguyen A.T., Nguyen C.T., Do H.M., Nguyen X.P et al.,

Magnetic fluid based on Fe 3 O 4 nanoparticles: Preparation and hyperthermia

application. J. Phys. Conf. Ser, 2009. 187.

146. Urtizberea A., Natividal E., Arizaga A., Castro M., Mediano A., Specific

Absorption Rates and Magnetic Properties of Ferrofluids with Interaction Effects

at Low Concentrations. J. Phys. Chem. C, 2010. 114: p. 4916–4922.

149

147. Pham H.N, Pham T.H.G., Nguyen D.T., Phan Q.T., Le T.T.H., Ha P.T., Do H.M.,

Hoang T.M.N., Nguyen X. P.,, Magnetic inductive heating of organs of mouse

models treated by copolymer coated Fe3O4 nanoparticles. Adv. Nat. Sci.:

Nanosci. Nanotechnol, 2017. 8: p. 10pp.

148. Do T.D., Phương pháp xác định độc tính của thuốc. 2014. Nhà xuât bản Y học.

149. Nguyen T.D., Do T.N., Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ

dược thảo. 2006. Viện dược liệu (Vietnam), NXB Khoa học và Kỹ thuật.

150. Buzea C., Pacheco I.I., Robbie K., Nanomaterials and nanoparticles: Sources and

toxicity. Biointerphases, 2007. 2(4): p. 17-71.

151. Shanavas A., Sasidharan S., Bahadur D., Magnetic core-shell hybrid nanoparticles

for receptor targeted anti-cancer therapy and magnetic resonance imaging.

Journal of Colloid and Interface Science, 2017. 486: p. 112-120.

152. Peer D., Karp J.M., Hong S., Farokhzad O. C., Margalit R., Langer R.,

Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy. Nature

Nanotechnology, 2007. 2: p. 751-760.

153. Schadlich A., Caysa H., Mueller T., Tenambergen F., Rose C., Gopferich A.,

Kuntsche J., Mader K., Tumor accumulation of NIR fluorescent PEG-PLA

nanoparticles: impact of particle size and human xenograft tumor model. ACS

Nano, 2011. 5(11): p. 8710-8720.

154. Oanh, V.T.K., Nghiên cứu chế tạo chất lỏng từ trên nền hạt nano Fe3O4 chất

lượng cao định hướng cho một số ứng dụng y sinh. 2016. Luận án tiến sỹ Khoa

học vật liệu.

155. Giustini A. J., Petryk A.A., Cassim S. M., Tate J. A, Baker I., and Hoopes P. J.,

Magnetic nanoparticle hyperthermia in cancer treatment. Nano Life. 2010

March-June; 1(01n02): 10.1142/S1793984410000067 2010.

156. Salloum M., Ma R.H., Weeks D., and Zhu L., Controlling nanoparticle delivery

in magnetic nanoparticle hyperthermia for cancer treatment: Experimental study

in Agar gel. International Journal of Hyperthermia, 2008. 24(4): p. 337-345. 150

157. Bakhtiary Z., Saei A.A., Hajipour M. J., et al., Targeted superparamagnetic iron

oxide nanoparticles for early detection of cancer: possibilities and challenges.

Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine, 2016. 12(2): p. 287–307.

158.Linh, P.H., Nghiên cứu chế tạo chất lỏng từ nền hạt nano Fe3O4 ứng dụng trong

y sinh. 2013. Luận án tiến sỹ Khoa học vật liệu.

151