Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của cây tốc thằng cáng (Anodendron paniculatum (Wall. ex Roxb.) A.DC.)

ĐẠI HỌC HUẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

…………***…………

HOÀNG THỊ NHƯ HẠNH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT

TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÂY TỐC

THẰNG CÁNG (ANODENDRON PANICULATUM

(WALL. EX ROXB.) A.DC.)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

HUẾ, NĂM 2018

ĐẠI HỌC HUẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

…………***…………

HOÀNG THỊ NHƯ HẠNH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT

TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÂY TỐC

THẰNG CÁNG (ANODENDRON PANICULATUM

(WALL. EX ROXB.) A.DC.)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Chuyên ngành: Hóa học hữu cơ

Mã số: 62.44.01.14

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Thị Hoài

HUẾ, NĂM 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của

PGS.TS. Nguyễn Thị Hoài. Các kết quả thu được trong luận án hoàn toàn trung

thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả luận án

Hoàng Thị Như Hạnh

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận án, tôi đã nhận

được sự giúp đỡ, tạo điều kiện nhiệt tình và quý báu của nhiều cá nhân và tập

thể.

Trước hết, cho phép tôi bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất

đến PGS.TS. Nguyễn Thị Hoài, người đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời

gian thực hiện luận án này.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại học Khoa học -

Đại học Huế, Ban Chủ nhiệm Khoa Hóa học, Bộ môn Hóa hữu cơ và Ban Giám

Hiệu Trường THPT Đặng Trần Côn đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi

cho tôi trong thời gian học tập và thực hiện luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Thử nghiệm sinh học,

Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã

giúp đỡ tôi hoàn thành các nghiên cứu về hoạt tính sinh học.

Tôi cũng xin chân thành cám ơn tập thể cán bộ phòng Dược liệu – Dược

cổ truyền – Thực vật dược, Khoa Dược – Trường Đại học Y Dược Huế đã hỗ trợ

tôi trong quá trình thực hiện luận án.

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn cổ vũ,

động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Tôi xin trân trọng cảm ơn !

Huế, ngày tháng năm 2018

Tác giả luận án

Hoàng Thị Như Hạnh

MỤC LỤC MỤC LỤC ............................................................................................................... i

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ........................................... iii

DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................... vi

DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................... vii

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC ............................................................................... x

MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 3

1.1. Giới thiệu sơ lược về họ Trúc đào (Apocynaceae) ..................................... 3 1.2. Giới thiệu về chi Anodendron ..................................................................... 3 Vị trí phân loại ..................................................................................... 3 Đặc điểm thực vật và phân bố ............................................................. 4 Các nghiên cứu về thành phần hóa học ............................................... 6 Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học ................................................ 18 1.3. Giới thiệu sơ lược về loài Tốc thằng cáng ................................................ 21

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 23

2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................... 23 2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 24 Phương pháp phân lập, tinh chế các hợp chất ................................... 24 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất ................ 24 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học ......................................... 26

Chương 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ...................................................... 29

3.1. Xử lý mẫu và chuẩn bị các cao chiết ........................................................ 29 3.2. Quá trình phân lập các hợp chất ............................................................... 30 3.3. Tính chất vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất đã phân lập ................. 33 3.4. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của một số chất tinh khiết .................... 36

Chương 4. BÀN LUẬN ....................................................................................... 38

4.1. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập ......................... 38 Hợp chất AP1: Cycloartenol.............................................................. 38 Hợp chất AP2: Anopaniester (Chất mới) .......................................... 40 Hợp chất AP3: (E)-Phytol ................................................................. 49 Hợp chất AP4: Desmosterol .............................................................. 50 Hợp chất AP5: Ursolic acid ............................................................... 52 Hợp chất AP6: Vanillin ..................................................................... 54 Hợp chất AP7: Esculentic acid .......................................................... 55 Hợp chất AP8: Kaempferol-3-O-rutinoside ...................................... 57 Hợp chất AP9: Rutin ......................................................................... 60 Hợp chất AP10: Anopanin A (Chất mới) ........................................ 62 Hợp chất AP11: Anopanin B (Chất mới) ........................................ 71

Hợp chất AP12: Anopanin C (Chất mới) ........................................ 79 Hợp chất AP13: Sargentol ............................................................... 87 89 .. Hợp chất AP14: 4-O-β-D-Glucopyranosyl-3-prenylbenzoic acid 90 .................................................. Hợp chất AP15: Inugalactolipid A Hợp chất AP16: Gingerglycolipid A ............................................... 94 Hợp chất AP17: Gingerglycolipid B ............................................... 97 Hợp chất AP18: Gingerglycolipid C ............................................... 99 Hợp chất AP19: (2S)-1-O-Palmitoyl-3-O-[-D-galactopyranosyl- 101 ................................................. (1→6)-O-β-D-galactopyranosyl]glycerol Hợp chất AP20: (2R)-1-O-Palmitoyl-3-O-α-D-(6-

sulfoquinovopyranosyl)glycerol ................................................................ 102 4.2. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các hợp chất tinh khiết .. 105 KẾT LUẬN ........................................................................................................ 112

KIẾN NGHỊ ....................................................................................................... 113

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ.......................................... 114

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 115

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Column Chromatography Sắc ký cột

Thin Layer Chromatography Sắc ký bản mỏng

13C-NMR

Các phương pháp sắc ký CC GC-MS Gas Chromatography-Mass Spectrometry Sắc ký khí ghép khối phổ TLC Các phương pháp phổ 1H-NMR

COSY Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Correlation Spectroscopy

DEPT Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 Phổ tương tác hai chiều 1H-1H Phổ DEPT

EIMS ESIMS

HMBC

Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer Electron Impact Mass Spectrometry Electrospray Ionization Mass Spectrometry Heteronuclear Multiple Bond Correlation

Phổ khối va đập điện tử Phổ khối ion hóa phun mù điện tử Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết Phổ khối phân giải cao ion hóa phun mù điện tử

HSQC

HMQC Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết

HRESIMS High Resolution - Electrospray Ionization - Mass Spectrometry Heteronuclear Single Quantum Coherence Heteronuclear Multiple Quantum Coherence Infrared Spectroscopy J coupling constant IR J (Hz)

NOESY Phổ hồng ngoại Hằng số tương tác tính bằng Hz Phổ NOESY

ROESY Phổ ROESY

UV δ (ppm) Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy Rotating frame nuclear Overhauser Effect Spectroscopy Ultraviolet Spectroscopy δ (ppm = part per million)

Phổ tử ngoại Độ dịch chuyển hóa học tính bằng phần triệu double triplet broad

singlet doublet triplet q quint dd quartet quintet double doublet dt br m multiplet

iii

s d t

Human bronchogenic carcinoma Ung thư phổi

Human breast adenocarcinoma Ung thư vú

Human gastrocarcinoma Ung thư dạ dày

Human hepatoma Ung thư gan

Human prostate adenocarcinoma Ung thư tuyến tiền liệt

Human cervical adenocarcinoma Ung thư cổ tử cung

Human promyelocytic leukemia Ung thư máu cấp tính Ung thư máu lympho Lymphocytic leukemia

Human colon carcinoma Ung thư ruột kết

Chronic myelogenous leukemic Ung thư bạch cầu tủy Human epidermoid carcinoma Melanoma Rat bladder epithelial Ung thư biểu mô Khối u ác tính Ung thư bàng quang chuột

Các dòng tế bào A549 H522 LU-1 H460 Bcap-37 MCF-7 BGC MCG MKN-7 Bel-7402 Hep-G2 DU145 LNCaP PC-3 HeLa ME-180 HL-60 P-388 HT-29 SW-480 K562 KB M-14 NBT-T2 Các ký hiệu viết tắt khác CTPT DBE Double Bond Equivalent ED50 Effective Dose 50%

FAME Fatty Acid Methyl Ester

FRAP Ferric Reducing Antioxidant Power

IC50 Inhibitory Concentration 50% MBC Minimum Bactericidal Concentration

Công thức phân tử Số tương đương nối đôi Liều có tác dụng đối với 50% cá thể Dẫn xuất methyl ester của acid béo Lực chống oxy hóa được đo bằng khả năng khử ion sắt (III) Nồng độ ức chế 50% Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu

MFC Minimum Fungicidal Concentration tối

Melting point Optical Density

MIC Minimum Inhibitory Concentration mp OD CHCl3 DMSO EtOAc MeOH Chloroform Dimethylsulfoxide Ethyl acetate Methanol Nồng độ diệt nấm thiểu Nồng độ ức chế tối thiểu Điểm chảy Mật độ quang SRB Sulforhodamine B Ac Acetyl Me Methyl TMS Tetramethylsilane

Ghi chú: Tên các hợp chất, lớp chất, nhóm thế, chức hóa học được viết theo

nguyên bản Tiếng Anh để đảm bảo tính thống nhất và chính xác.

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Các tên loài thuộc chi Anodendron đã được chấp nhận ....................... 4

Bảng 1.2. Sự phân bố các loài thuộc chi Anodendron ở Việt Nam ....................... 5

Bảng 1.3. Hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất phân lập từ A. formicinum . 19

Bảng 1.4. Hoạt tính ức chế sự phát triển của ấu trùng Bombyx mori của cardenolide từ A. affine ........................................................................................ 20

Bảng 3.1. Hoạt tính gây độc của các hợp chất đã phân lập trên các dòng tế bào ung thư .................................................................................................................... 1

Bảng 4.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP1 và hợp chất tham khảo .............. 39

Bảng 4.2. Số liệu phổ NMR hợp phần triterpenoid của hợp chất AP2 ................ 41

Bảng 4.3. Số liệu phổ NMR hợp phần acid béo của hợp chất AP2 ..................... 42

Bảng 4.4. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP3 và hợp chất tham khảo .............. 49

Bảng 4.5. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP4 và hợp chất tham khảo .............. 51

Bảng 4.6. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP5 và hợp chất tham khảo .............. 53

Bảng 4.7. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP6 và hợp chất tham khảo .............. 55

Bảng 4.8. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP7 và hợp chất tham khảo .............. 56

Bảng 4.9. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP8 và hợp chất tham khảo .............. 58

Bảng 4.10. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP9 và hợp chất tham khảo ............ 61

Bảng 4.11. Số liệu phổ NMR phần aglycone của hợp chất AP10 ........................ 70

Bảng 4.12. Số liệu phổ NMR phần đường của hợp chất AP10 và chất tham khảo .............................................................................................................................. 71

Bảng 4.13. Số liệu phổ NMR phần aglycone của hợp chất AP11 ........................ 77

Bảng 4.14. Số liệu phổ NMR phần đường của hợp chất AP11 ............................ 78

Bảng 4.15. Số liệu phổ NMR phần aglycone của hợp chất AP12 ........................ 84

Bảng 4.16. Số liệu phổ NMR phần đường của hợp chất AP12 ............................ 85

Bảng 4.17. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP13 và hợp chất tham khảo .......... 88

Bảng 4.18. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP14 và hợp chất tham khảo .......... 90

Bảng 4.19. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP15 ................................................ 92

Bảng 4.20. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP16 và hợp chất tham khảo .......... 95

Bảng 4.21. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP17 và hợp chất tham khảo .......... 97

Bảng 4.22. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP18 và hợp chất tham khảo ........ 100

Bảng 4.23. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP19 và hợp chất tham khảo ........ 102

Bảng 4.24. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP20 và hợp chất tham khảo ........ 104

Bảng 4.25. Thống kê các hợp chất phân lập từ cây Tốc thằng cáng ................. 105

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc chung (a) và vị trí dễ bị oxy hóa (b) của cardenolide ........... 15

Hình 1.2. Con đường sinh tổng hợp của cardenolide .......................................... 15

Hình 1.3. Hệ thống vòng ngưng tụ kiểu cis-trans-cis của cardenolide aglycone 16

Hình 1.4. Phần đường của các cardenolide glycoside phân lập từ họ Apocynaceae......................................................................................................... 17

Hình 2.1. Loài Tốc thằng cáng: a. Phần trên mặt đất, b. Lá và quả, c. Đại bổ đôi, d. Hạt mang chùm lông ........................................................................................ 23

Hình 3.1. Sơ đồ chiết các phân đoạn từ phần trên mặt đất của cây Tốc thằng cáng ...................................................................................................................... 29

Hình 3.2. Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn chloroform của cây Tốc thằng cáng ...................................................................................................................... 31

Hình 3.3. Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn nước của cây Tốc thằng cáng 32

Hình 4.1. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP1 .................................................... 38

Hình 4.2. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP2 .................................................... 43

Hình 4.3. Tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất AP2 .......................... 44

Hình 4.4. Tương tác NOESY chính của hợp chất AP2 ........................................ 44

Hình 4.5. Phổ HRESIMS của hợp chất AP2 ........................................................ 44

Hình 4.6. Phổ UV của hợp chất AP2 ................................................................... 45

Hình 4.7. Phổ IR của hợp chất AP2 ..................................................................... 45 Hình 4.8. Phổ 1H-NMR của hợp chất AP2 ........................................................... 46 Hình 4.9. Phổ 13C-NMR của hợp chất AP2 ......................................................... 46

Hình 4.10. Phổ HMQC của hợp chất AP2 ........................................................... 47

Hình 4.11. Phổ HMBC của hợp chất AP2 ........................................................... 47

Hình 4.12. Phổ COSY của hợp chất AP2 ............................................................. 48

Hình 4.13. Phổ NOESY của hợp chất AP2 .......................................................... 48

Hình 4.14. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP3 .................................................. 50

Hình 4.15. Tương tác HMBC chính của hợp chất AP3 ....................................... 50

Hình 4.16. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC, COSY chính (b) của hợp chất AP4 ............................................................................................................... 52

Hình 4.17. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP5 .................................................. 54

Hình 4.18. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP6 .................................................. 54

Hình 4.19. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC, COSY chính (b) của hợp chất AP7 ............................................................................................................... 57

vii

Hình 4.20. Tương tác NOESY chính của hợp chất AP7 ...................................... 57

Hình 4.21. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC, COSY chính (b) của hợp chất AP8 ............................................................................................................... 59

Hình 4.22. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC, COSY chính (b) của hợp chất AP9 ............................................................................................................... 60

Hình 4.23. Phổ HRESIMS của hợp chất AP10 .................................................... 63

Hình 4.24. Phổ IR của hợp chất AP10 ................................................................. 63 Hình 4.25. Phổ 1H-NMR của hợp chất AP10 ....................................................... 64 Hình 4.26. Phổ 13C-NMR của hợp chất AP10 ..................................................... 64

Hình 4.27. Phổ DEPT của hợp chất AP10 ........................................................... 65

Hình 4.28. Phổ HMQC của hợp chất AP10 ......................................................... 65

Hình 4.29. Phổ HMBC của hợp chất AP10 ......................................................... 66

Hình 4.30. Phổ COSY của hợp chất AP10 ........................................................... 66

Hình 4.31. Phổ ROESY của hợp chất AP10 ......................................................... 67

Hình 4.32. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP10 ................................................ 68

Hình 4.33. Tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất AP10 ...................... 68

Hình 4.34. Tương tác ROESY chính của hợp chất AP10 ..................................... 69

Hình 4.35. Sắc ký đồ GC-MS của dẫn xuất alditol hexaacetate của hợp chất AP10 ..................................................................................................................... 69

Hình 4.36. Phổ HRESIMS của hợp chất AP11 .................................................... 72

Hình 4.37. Phổ IR của hợp chất AP11 ................................................................. 72 Hình 4.38. Phổ 1H-NMR của hợp chất AP11 ....................................................... 73 Hình 4.39. Phổ 13C-NMR của hợp chất AP11 ..................................................... 73

Hình 4.40. Phổ DEPT của hợp chất AP11 ........................................................... 74

Hình 4.41. Phổ HMQC của hợp chất AP11 ......................................................... 74

Hình 4.42. Phổ HMBC của hợp chất AP11 ......................................................... 75

Hình 4.43. Phổ COSY của hợp chất AP11 ........................................................... 75

Hình 4.44. Phổ ROESY của hợp chất AP11 ......................................................... 76

Hình 4.45. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP11 ................................................ 76

Hình 4.46. Tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất AP11 ...................... 78

Hình 4.47. Tương tác ROESY chính của hợp chất AP11 ..................................... 79

Hình 4.48. Phổ HRESIMS của hợp chất AP12 .................................................... 80

viii

Hình 4.49. Phổ IR của hợp chất AP12 ................................................................. 80 Hình 4.50. Phổ 1H-NMR của hợp chất AP12 ....................................................... 81 Hình 4.51. Phổ 13C-NMR của hợp chất AP12 ..................................................... 81

Hình 4.52. Phổ DEPT của hợp chất AP12 ........................................................... 82

Hình 4.53. Phổ HMQC của hợp chất AP12 ......................................................... 82

Hình 4.54. Phổ HMBC của hợp chất AP12 ......................................................... 83

Hình 4.55. Phổ COSY của hợp chất AP12 ........................................................... 83

Hình 4.56. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP12 ................................................ 85

Hình 4.57. Tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất AP12 ...................... 86

Hình 4.58. Phổ ROESY của hợp chất AP12 ......................................................... 86

Hình 4.59. Tương tác ROESY chính của hợp chất AP12 ..................................... 86

Hình 4.60. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC, COSY (b) chính của hợp chất AP13 ............................................................................................................. 88

Hình 4.61. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC, COSY chính (b) của hợp chất AP14 ............................................................................................................. 89

Hình 4.62. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP15 ................................................ 93

Hình 4.63. Tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất AP15 ...................... 93

Hình 4.64. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP16 ................................................ 96

Hình 4.65. Sự tạo thành sản phẩm oxy hóa sơ cấp của hợp chất AP16 .............. 96

Hình 4.66. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP17 ................................................ 98

Hình 4.67. Sự tạo thành sản phẩm oxy hóa sơ cấp của hợp chất AP17 .............. 99

Hình 4.68. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP18 .............................................. 100

Hình 4.69. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP19 .............................................. 101

Hình 4.70. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP20 .............................................. 103

Hình 4.71. Tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất AP20 .................... 103

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC Phụ lục 1. Các phổ của hợp chất AP1 ............................................................... PL1

Phụ lục 2. Các phổ của hợp chất AP2 ............................................................... PL3

Phụ lục 3. Các phổ của hợp chất AP3 ............................................................... PL6

Phụ lục 4. Các phổ của hợp chất AP4 ............................................................... PL9

Phụ lục 5. Các phổ của hợp chất AP5 ............................................................. PL13

Phụ lục 6. Các phổ của hợp chất AP6 ............................................................. PL17

Phụ lục 7. Các phổ của hợp chất AP7 ............................................................. PL20

Phụ lục 8. Các phổ của hợp chất AP8 ............................................................. PL24

Phụ lục 9. Các phổ của hợp chất AP9 ............................................................. PL29

Phụ lục 10. Các phổ của hợp chất AP10 ......................................................... PL34

Phụ lục 11. Các phổ của hợp chất AP11 ......................................................... PL37

Phụ lục 12. Các phổ của hợp chất AP12 ......................................................... PL39

Phụ lục 13. Các phổ của hợp chất AP13 ......................................................... PL41

Phụ lục 14. Các phổ của hợp chất AP14 ......................................................... PL46

Phụ lục 15. Các phổ của hợp chất AP15 ......................................................... PL50

Phụ lục 16. Các phổ của hợp chất AP16 ......................................................... PL56

Phụ lục 17. Các phổ của hợp chất AP17 ......................................................... PL58

Phụ lục 18. Các phổ của hợp chất AP18 ......................................................... PL60

Phụ lục 19. Các phổ của hợp chất AP19 ......................................................... PL62

Phụ lục 20. Các phổ của hợp chất AP20 ......................................................... PL64

Phụ lục 21. Biên bản giám định tên khoa học của cây Tốc thằng cáng .......... PL69

Phụ lục 22. Biên bản thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư các chất phân lập từ

cây Tốc thằng cáng .......................................................................................... PL70

MỞ ĐẦU

Sự gia tăng nhanh chóng của nhiều căn bệnh nguy hiểm có khả năng lan rộng

như HIV/AIDS, ung thư, viêm đường hô hấp cấp SARS, cúm gia cầm H5N1, cúm

lợn H1N1, dịch Ebola, chứng đầu nhỏ do virus Zika… đang là một cuộc khủng

hoảng thực sự cho sức khỏe cộng đồng và là thách thức không nhỏ cho hệ thống y

tế trên toàn thế giới. Nhằm bảo vệ con người trước những nguy cơ về bệnh tật, các

nhà khoa học đang không ngừng nghiên cứu để tìm ra các loại thuốc mới, các

phương thức điều trị mới vừa hiệu quả vừa an toàn với cơ thể. Một xu hướng quan

trọng trong quá trình này là tìm kiếm các hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên bởi

chúng thường phù hợp với cơ thể sống, ít độc, thân thiện với môi trường, đa dạng

về cấu trúc, có thể sử dụng trực tiếp để làm thuốc, hoặc làm các mô hình để nghiên

cứu tổng hợp thuốc mới. Nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng như trong nước cho

thấy thực vật là nguồn tài nguyên có giá trị trong việc khám phá và phát triển thuốc.

Có thể kể một vài ví dụ điển hình như taxol từ cây Thông đỏ (Taxus brevifolia);

vinblastine, vincristine từ cây Dừa cạn (Catharanthus roseus); camptothecin từ cây

Hỉ thụ (Camptotheca acuminata); podophyllotoxin từ cây Khoai ma Mỹ

(Podophyllum peltatum)…

Trong quá trình sàng lọc hoạt tính diệt tế bào ung thư một số cây thuốc của

đồng bào Pako, Vân Kiều ở Quảng Trị mà chúng tôi đã khảo sát, 10 cây thuốc chữa

bệnh liên quan đến tác dụng chống ung thư đã được đưa vào sàng lọc hoạt tính gây

độc tế bào in vitro. Trong đó, cây Tốc thằng cáng (Anodendron paniculatum Roxb.

A.DC. – Apocynaceae) thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển của tế bào ung thư tốt

trên 5 dòng tế bào ung thư thử nghiệm với giá trị IC50 thấp, đặc biệt là trên các dòng

tế bào LU-1 (ung thư phổi), Hep-G2 (ung thư gan) và MKN-7 (ung thư dạ dày) [4].

Tuy nhiên cho đến nay, ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về thành phần hóa học

và tác dụng sinh học của loài này. Việc sử dụng cây Tốc thằng cáng để chữa các bệnh

liên quan đến khối u chủ yếu dựa vào tri thức bản địa của đồng bào Pako, Vân Kiều.

Điều này cho thấy loài cây này cần được nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học

cũng như hoạt tính sinh học.

Từ những lí do trên, chúng tôi đề xuất đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa

học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của cây Tốc thằng cáng (Anodendron

paniculatum A.DC.)”

Roxb.) (Wall. ex

Mục tiêu của luận án:

1. Nghiên cứu để làm rõ thành phần hóa học chính của loài Anodendron

paniculatum (Roxb.) A.DC.

2. Đánh giá hoạt tính gây độc bào ung thư của các hợp chất phân lập được tế

từ loài này

tách,

phân

lập,

Nội dung nghiên cứu của luận án:

chế

các

hợp

từ

loài

Anodendron

1. Chiết paniculatum

(Roxb.) A.DC.

Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập

hoạt tính gây độc

tế

bào ung thư của các hợp chất đã phân lập.

Thử

các dòng

tinh chất

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu sơ lược về họ Trúc đào (Apocynaceae)

Họ Trúc đào (Apocynaceae) là họ lớn, được chia thành 5 phân họ

(Plumerioideae, Apocynoideae, Periplocoideae, Secamonoideae và Asclepiadoideae)

với gần 200 chi, hơn 2000 loài, phân bố rộng ở vùng nhiệt đới [2], [8].

Họ Trúc đào gồm các đại diện là thân cỏ hoặc thân gỗ to hay nhỏ, phần lớn là

dây leo hay bụi đứng. Cây có nhựa mủ trắng, thường độc. Lá đơn, nguyên, mọc đối,

đôi khi mọc cách hoặc mọc vòng, không có lá kèm. Hoa đơn độc hoặc tập hợp

thành cụm hoa vô hạn hoặc hình xim, ở nách lá hay ở ngọn. Hoa đều, lưỡng tính,

mẫu 5, đài 5 thường hợp. Tràng hình ống thường có phần phụ ở trong ống tràng,

giống như lông hay vảy hoặc tạo thành tràng phụ. Tiền khai hoa vặn [2].

Bộ nhị gồm 5 nhị đính trên ống tràng. Chung đới có thể kéo dài thành mũi

nhọn, đôi khi có mang lông dài hoặc úp lên mặt trên của đầu nhụy. Chỉ nhị rời hoặc

dính liền thành một ống bao quanh bầu. Bao phấn thường chụm vào nhau tạo như

một cái mái che trên đầu nhụy và có thể đính vào đầu nhụy (phân họ Echitoideae)

hoặc đính vào 5 mặt của đầu nhụy 5 góc. Phía ngoài bộ nhị có thể mang những phụ

bộ, tạo thành một tràng phụ thứ nhì do nhị sinh ra. Hạt phấn rời hay dính thành tứ tử

hoặc phấn khối [2].

Bộ nhụy gồm 2 lá noãn (ít khi 3-5), tự do ở phần đầu, dính nhau ở phần vòi,

một vòi duy nhất. Đầu nhụy hình trụ ngắn hoặc hình mâm 5 góc. Mỗi lá noãn có

nhiều noãn tạo thành bầu 2 ô, đính noãn trung trụ hay bầu 1 ô, đính noãn bên. Đáy

bầu thường có đĩa mật. Quả đại, quả nang, đôi khi gặp quả mọng. Hạt có cánh hay có

chùm lông và nội nhũ. Các cây trong họ Trúc đào thường có ống nhựa mủ thật, libe

quanh tủy. Trong thân có hai vòng libe. Mạch thủng lỗ đơn, một số có mạch thang

ngắn. Ở Việt Nam, họ Apocynaceae có khoảng 100 chi với khoảng 280 loài [2], [8].

1.2. Giới thiệu về chi Anodendron

Vị trí phân loại Theo hệ thống phân loại của Takhtajan [116], chi Anodendron A.DC. có vị

trí phân loại như sau: Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta), lớp Ngọc lan

(Magnoliopsida), phân lớp Hoa môi (Lamiidae), bộ Long đởm (Gentianales), họ

Trúc đào (Apocynaceae), chi Anodendron.

Dự án “The plant list” khởi động từ năm 2010 đã thống kê được 38 tên loài

thuộc chi Anodendron thu thập từ nhiều cơ sở dữ liệu khác nhau trên thế giới, trong

đó chỉ có 17 tên loài được chấp nhận (Bảng 1.1) [52].

Bảng 1.1. Các tên loài thuộc chi Anodendron đã được chấp nhận

STT Tên khoa học

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Anodendron affine (Hook. &Arn.) Druce Anodendron axillare Merr. Anodendron benthamianum Hemsl. Anodendron borneense (King & Gamble) Mabb. Anodendron candolleanum Wight Anodendron coriaceum (Blume) Miq. Anodendron gracile (King & Gamble) Mabb. Anodendron howii Tsiang Anodendron nervosum Kerr Anodendron oblongifolium Hemsl. Anodendron paniculatum (Roxb.) A.DC. Anodendron pauciflorum Hook.f. Anodendron punctatum Tsiang Anodendron seramense Mabb. Anodendron tubulosum (Ridl. ex Burkill&M.R.Hend.) Mabb. Anodendron whitmorei Mabb. Anodendron wrayi King & Gamble

Đặc điểm thực vật và phân bố

Các loài trong chi Anodendron chủ yếu ở dạng dây leo gỗ. Lá mọc đối, nách

lá có nhiều tuyến nâu. Cụm hoa ở đầu cành, kiểu xim kép, ít khi ở nách kiểu xim

nhiều ngả, 5 lá đài bé và hẹp, gốc đài có nhiều tuyến mọc cách với lá đài, rất ít khi

không có tuyến (các loài ở Việt Nam đều có tuyến). Ống tràng dạng ống ngắn.

Họng tràng không có vảy và tràng phụ. Cánh tràng thường dạng lưỡi dài hơn rộng,

phủ nhau phải, dài hơn ống tràng, đối xứng hai bên, không có phần phụ và không

gặp trong nụ. Nhị đính nửa ống tràng phía dưới hoặc ở đáy. Chỉ nhị rất ngắn. Bao

phấn hình mũi tên, lưng nhẵn, triển hình vòng nguyên hoặc xẻ thùy nông, nhẵn. Bầu

trên gồm 2 lá noãn rời, đỉnh bầu nhẵn. Noãn nhiều. Vòi nhụy ngắn. Đầu nhụy hình

nón dài. Quả gồm 2 đại rời nhau, phình to ở gốc, đầu nhọn, mỗi đại không có cuống

riêng, vỏ quả nhẵn. Giá noãn hóa gỗ. Hạt nhiều dạng thuôn, đầu thu hẹp thành mỏ

dài mang chùm lông, vỏ hạt nhẵn, chùm lông tồn tại, khó rụng [3], [8], [79].

Theo Phạm Hoàng Hộ [3], chi Anodendron ở Việt Nam gồm 3 loài:

 A. affine (Hook. & Arn.) Druce.

 A. paniculatum (Roxb.) A.DC.

 A. nervosum Kerr

Năm 2004, Phan Kế Lộc và cộng sự bổ sung loài A. howii Tsiang vào hệ

thực vật Việt Nam [7].

Các loài thuộc chi Anodendron phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á: Ấn

Độ, Mianma, Nam Trung Quốc, Nhật Bản, Lào, Campuchia, Thái Lan, Malaysia,

Indonesia, Philippin, Việt Nam [3], [8], [79]. Ở Việt Nam, chi này phân bố rải rác khắp

cả nước. Dưới đây là bảng phân bố các loài thuộc chi Anodendron ở Việt Nam [8].

Bảng 1.2. Sự phân bố các loài thuộc chi Anodendron ở Việt Nam

Loài Tên Việt Nam

STT 1 A. paniculatum Tốc

Phân bố Quảng Trị, Thừa thiên Huế (Phú Lộc, Bạch Mã), Đắc Lắc, Khánh Hòa (Nha Trang), Đồng Nai (Biên Hòa), Bến Tre, Kiên Giang (Phú Quốc)

2 A. affine

thẳng, Tốc thằng cáng, Ngà voi, Dây duy tù, Đay nhui Ngà voi, Dây duy Hà Giang (Yên Minh), Bắc Giang, Hòa Bình (Lạc Thủy), Hải Dương (Chí Linh), Hà Nam (Ninh Thái), Ninh Bình (Cúc Phương) Hà Tây (Ba Vì) 3 A. howii

4 A. nervosum Đồng Nai (Biên Hòa)

Ngà voi sang, Dây duy sang Ngà voi thái, Dây duy thái

Các nghiên cứu về thành phần hóa học

Cho đến nay, các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Anodendron ở

trong nước còn khá hạn chế. Trong khi đó, nghiên cứu về hóa thực vật của chi này

trên thế giới đã được thực hiện lần đầu tiên vào năm 1969 bởi Sasaki và Hirata

[103]. Tính đến nay, chỉ có 3 loài của chi này là A. affine, A. paniculatum và A.

formicinum được nghiên cứu về thành phần hóa học với khoảng 88 hợp chất được

phân lập.

1.2.3.1. Thành phần hóa học loài A. affine

Hầu hết các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Anodendron chủ yếu

tập trung vào loài này và được thực hiện bởi các nhà hóa học Nhật Bản trong giai

đoạn 1969-1994. Tính đến nay, hơn 70 hợp chất đã được phân lập từ loài này trong

đó chủ yếu là các cardenolide glycoside.

Năm 1969, Sasaki và Hirata đã phân lập được 2 alkaloid mới khung

pyrrolizidine, anodendrine (1), alloanodendrine (2), cùng với một amine bậc bốn,

choline (3). Cả hai hợp chất mới (1–2) đều tồn tại ở dạng muối amoni bậc bốn

[103]. Cấu trúc hóa học của chúng được thiết lập thông qua các chuyển hóa hóa

học. Hydro hóa anodendrine (1), xúc tác Pd thu được (+)-laburninic acid trong khi

đó tiến hành tương tự với alloanodendrine (2) lại dẫn đến sản phẩm (+)-

isoretronecanolic acid (đồng phân C-1 epimer của (+)-laburninic acid). Các cấu trúc

này cũng được củng cố thông qua tổng hợp toàn phần [104].

Năm 1971, Shima và cộng sự đã phân lập 2 flavonoid là kaempferol (4),

astragalin (5) từ lá [108], [111] và một glycoside của syringic acid là glucosyringic

acid (6) từ thân cây A. affine. Hợp chất 6 cũng được tổng hợp từ syringic acid và -

acetobromo-D-glucose nhằm chứng minh cấu trúc [109]. Nhóm này tiếp tục phân

lập β-sitosterol (7), daucosterol (8), sucrose (9), dambonitol (10) và một cardenolide

mới chưa xác định được cấu trúc từ thân cây. Ngoài ra, các tác giả cũng thu được

ursolic acid (11) từ hoa của loài này [107], [111]. Tiếp đó, một benzopyran mới là

2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran-6-carboxylic (12) (hay còn được gọi là anofinic

acid) được xác định thông qua các dữ kiện phổ và tổng hợp hóa học [110]. Hợp chất

này sau đó được tìm thấy ở nhiều nguồn khác nhau như nấm Lactarius deliciosus

(Russulaceae), Curvularia fallax (Hyphomycetes), hoặc thân gỗ cây Bhesa

paniculata (Celastraceae) [115]. Một nghiên cứu khác của nhóm Shima dẫn đến

việc phân lập và xác định 2 hợp chất mới từ dịch chiết ether của thân cây gồm 4-

hydroxy-3-(3-methyl-2-butenyl)benzoic acid (13) và anodendroic acid (14) [112].

Năm 1979, Yamauchi và cộng sự tách được 4 steroid khung prenane chứa

nhóm chức 4,16-diene-3-one và 4,6,16-triene-3-one gồm 12β-hydroxyprena-4,6,16-

triene-3,20-dione (15), 12β-hydroxyprena-4,16-diene-3,20-dione (16), pregna-

4,6,16-triene-3,12,20-trione (17), pregna-4,16-diene-3,12,20-trione (18). Trong đó,

hợp chất 15 còn được gọi là nerolidone A cũng được tách ra từ thân rễ loài Nerium

indicum, các hợp chất 15–17 với nồng độ rất nhỏ (không quá 20 ppm) có tác dụng

làm ngưng chuyển động của cá vàng [133]. Cũng trong thời gian này, hai cardiac

glycoside mới gồm affinoside A (19), affinoside B (20) được xác định từ vỏ cây.

Đáng ghi nhận là cấu trúc của affinoside B (20) được xác định lại bằng phương

pháp nhiễu xạ tia X [134].

Các nghiên cứu của Abe, Hanada, Fukuyama và cộng sự trong những năm

1982-1994 đã đóng góp rất lớn trong việc hoàn thiện hóa thực vật của loài A. affine.

Năm 1982, Abe và cộng sự phân lập được 7 cardenolide glycoside mới, affinoside

C–H (21–26), affinoside J (27) cùng với affinoside A (19). Phần đường của các hợp

chất này giống với phần đường của affinoside B (20), đều là 4,6-dideoxy-3-O-

methyl-2-hexosulopyranose. Phần đường này liên kết với vòng A của nhân steroid

tại C-2 và C-3 [10]. Cũng trong năm này, Abe và cộng sự tiếp tục công bố một loạt

cardenolide aglycone gồm affinogenin C (28), affinogenin D-I–D-V (29–33), cùng

với affinoside S-I–S-IX (34–42) từ thân và lá [11]. Sự hiện diện của cả 3 dạng đồng

phân của 2,3-dihydroxy có thể được hiểu dưới góc độ sinh tổng hợp là do sự tồn tại

đồng thời các 2-oxo-3-hydroxy-cardenolide.

Năm 1985, hai cardenolide glycoside khác, có cấu trúc tương tự affinoside A

là affinoside M (43), affinoside K (44) đã được phát hiện từ hạt [13]. Cấu trúc của

hai hợp chất này giống với các glycoside được phân lập từ thân cây (có phần đường

là 4,6-dideoxy-3-O-methyl-2-hexosulopyranose) hơn so với các glycoside được

phân lập từ lá cây (có phần đường là 6-deoxy-3-O-methyl-2-hexosulopyranose).

Tiếp đó, các ester của p-O-glucosyl- và p-O-primverosylnervogenic acid với

carbohydrat (glucose, sucrose, dambonitol) được phân lập dưới tên gọi

anodendrosin A–I (45–53) [14]. Ngoài ra, affinoside La–Le (54–58) cũng được

nhóm nghiên cứu của Abe thông báo trong năm này [12]. Điểm nổi bật của chúng là

sự hiện diện của các nhóm chức mang oxy (oxo, hydroxyl, acetyl) tại C-11 hoặc C-

12 trong khi vẫn bảo lưu kiểu liên kết giữa nhóm 2,3-dihydroxy của aglycone với

phần đường như các cardenolide glycoside trước đó.

Năm 1986, ba glycoside lượng nhỏ là affinoside O (59), affinoside N (60),

affinoside I (61) được phân lập từ lá cây cùng với affinogenin D-VI (62) [16].

Trong cấu trúc của affinoside O (59), do sự tồn tại của liên kết đôi tại C-3 nên kiểu

liên kết qua 2 cầu oxy với C-2, C-3 của aglycone bị ngăn cản. Trong khi đó,

affinogenin D-VI (62) là 16-O-acetyl cardenolide duy nhất được phát hiện từ loài

này mặc dù 16 cardenolide hiện diện khá phổ biến ở dạng tự do cũng như dạng

glycoside. Năm 1992, Hanada công bố hai hợp chất diester của 4-O-glucosyl-3,5-

diprenyl-4-hydroxybenzoic acid với sucrose dưới tên thông thường là anodendrosin

J (63), anodendrosin K (64) [45]. Cấu trúc hóa học của chúng được thiết lập thông

qua các phương pháp phổ đồng thời kết hợp thủy phân từng phần với KHCO3 0,2%

trong MeOH. Các glycoside khác gồm affinoside S-X (65), affinoside S-XI (66),

affinoside P–T (67–71) cũng được thông báo trong năm này [46].

Năm 1993, Abe và Yamauchi tách được affinoside Lf (72), affinoside Lg (73)

có nhóm mang oxy tại C-11, C-12 từ lá cây tươi cùng với 11 hợp chất đã biết [15].

Sự đa dạng các cardenolide glycoside trong các nghiên cứu về loài A. affine được

giải thích là do sự khác biệt trong điều kiện thu thập mẫu và chiết xuất. Cùng năm

này, Fukuyama và cộng sự thông báo phân lập được các chất mới, 4,5-dehydro-12-

oxo-affinoside E (74), 12-oxo-affinoside E (75), 16β-hydroxyaffinoside A (76)

cùng với các affinoisde A, E, M đã biết [38]. Trong công trình này, các phổ 2D-

NMR (COSY, NOESY) đã được áp dụng để thiết lập cấu trúc cardenolide glycoside

thay cho các phương pháp chuyển hóa hóa học trước đây. Fukuyama và cộng sự còn

phát hiện thêm một cardenolide mới khác là 2α,3β,5,11α,14-pentahydroxy-12-oxo-

5β,14β-card-20(22)-enolide (77) khi nghiên cứu thân và vỏ cây A. affine [39].

1.2.3.2. Thành phần hóa học loài A. paniculatum

Trên thế giới hiện có rất ít nghiên cứu về thành phần hóa học của loài này.

Năm 1970, Polonia và cộng sự đã tách được 5 cardiac glycoside là anodendroside A

(78), E1 (79), E2 (80), F (81) và G (82) [94]. Tuy nhiên, với các dữ kiện phổ (UV,

IR) ít ỏi, các tác giả chỉ có thể dự đoán phần genin của anodendroside E1, F chứa

vòng D bão hòa và mạch nhánh butenolide có cấu trúc thông thường, anodendroside

A, E2, G có thể chứa nối đôi 16. Tín hiệu phổ IR cũng ghi nhận sự hiện diện nhóm

carbonyl trong phân tử các anodendroside. Cấu trúc của các chất này sau đó được

xác nhận bởi Lichtia và cộng sự vào năm 1972 dựa vào phổ NMR, HRMS [73].

Riêng nhóm methylendioxy bất thường trong cấu trúc của anodendroside A (78), E1

(79), E2 (80) được khẳng định thông qua sự giải phóng 1 đương lượng mol của

O OH

78 R = H 80 R = OH

OCH3

81 R1 = OH, R2 = H (R1 = H, R2 = OH)

82 R1 = OH, R2 = H (R1 = H, R2 = OH)

formaldehyde khi thủy phân trong môi trường acid.

1.2.3.3. Thành phần hóa học loài A. formicinum

Trong khoảng 20 năm (1994-2014), hầu như không có một nghiên cứu nào

về hóa thực vật của chi Anodendron. Cho đến gần đây, loài A. formicinum được

quan tâm nghiên cứu bởi các nhà hóa học Trung Quốc trong nỗ lực tìm kiếm các

chất có hoạt tính kháng khuẩn từ thực vật [96]. Theo đó, 8 dẫn xuất của

prenylbenzoic acid đã được tách ra, trong đó có 3 chất mới tại thời điểm công bố là

formicinuoside A–C (83–85) và 5 chất đã biết gồm 4-hydroxy-3-prenylbenzoic acid

(13), anodendrosin E (49) , 4-(O-β-D-glucopyranosyl)-3,5-diprenylbenzoic acid

methyl ester (86), 4-(O-β-glucopyranosyl)-3,5-diprenylbenzoic acid (87) và

canthoside C (88) [96].

Nhìn chung, lớp chất chính được tách ra từ chi này có khung cardenolide.

Đây là nhóm hợp chất có trong nhiều loài thực vật, chúng thường đóng vai trò là

chất độc giúp cây chống lại các loài sâu bọ và động vật ăn cỏ. Cardenolide có cấu

trúc hóa học rất đa dạng, hiện diện ở 12 họ thực vật. Riêng với họ Apocynaceae,

hơn 30 chi được phát hiện sở hữu các chất chuyển hóa thứ cấp khung cardenolide

với khoảng 109 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc [19], [127].

Về mặt cấu trúc, cardenolide là nhóm hợp chất có khung steroid C23 với các

nhóm methyl gắn ở C-10, C-13 và một vòng -lactone bất bão hòa gắn ở C-17. Sự

đa dạng của lớp chất này đến từ sự khác biệt cấu hình ở các trung tâm C-3, C-5, C-

17 cũng như sự có mặt, hoặc mất đi của các nhóm thế, nối đôi trong phân tử (Hình

1.1) [114]. Theo quan điểm sinh tổng hợp, cardenolide có nguồn gốc từ cholesterol.

Theo đó, mạch nhánh của cholesterol bị hydroxyl hóa dần ở C-20, C-22, sau đó

phân cắt liên kết C-20/22 tạo thành pregnenolone. Vòng A của pregnenolone bị

epoxy hóa thành progesterone. Sau quá trình khử hóa đặc thù lập thể, progesterone

chuyển thành 3β-hydroxy-5β-pregnan-20-one với kiểu ngưng tụ A/B cis. Quá trình

14β-hydroxyl hóa gây ra sự đảo ngược cấu hình C-14 và góp phần tạo nên kiểu

ngưng tụ C/D cis. Tiếp đó 3β,14β,21-trihydroxy-5β-pregnan-20-one phản ứng với

malonate ester theo sau bởi phản ứng cộng aldol cho phép xây dựng vòng -lactone

(Hình 1.2) [127].

Hình 1.1. Cấu trúc chung (a) và vị trí dễ bị oxy hóa (b) của cardenolide

Hình 1.2. Con đường sinh tổng hợp của cardenolide

Về mặt hóa lập thể, vòng lactone tại C-17 định hướng β trong hầu hết trường

hợp. Nhân steroid của phần aglycone có hệ thống vòng ngưng tụ khác biệt so với

các hệ thống vòng steroid nói chung. Cụ thể, có 2 dạng: vòng A/B và C/D ngưng tụ

dạng cis, vòng B/C ngưng tụ dạng trans (cis-trans-cis), kiểu vòng ngưng tụ này làm

cho phần aglycone có dạng chữ “U” (Hình 1.3), hoặc vòng A/B và B/C ngưng tụ

dạng trans, vòng C/D ngưng tụ dạng cis (trans-trans-cis). Trên thực tế, các

cardenolide có kiểu ngưng tụ trans-trans-cis thường không phổ biến, có thể được

tạo ra thông qua sự khử trực tiếp (xúc tác enzyme) của liên kết đôi 5 của

cholesterol. Kiểu ngưng tụ này chỉ có hoạt tính yếu hoặc thậm chí không có hoạt

tính.

Hình 1.3. Hệ thống vòng ngưng tụ kiểu cis-trans-cis của cardenolide aglycone

Đối với các cardenolide glycoside phân lập từ họ Apocynaceae, phần đường

thường có từ 1 đến 3 đơn vị monosaccharide liên kết với aglycone tại C-3, với cấu

hình β là chủ yếu. Khoảng 17 loại đường được tìm thấy gồm D-glucose,

gentiobiose, gentiotriose, 6-deoxy-hexose (ví dụ: 6-deoxyallose), 2,6-dideoxy-

hexose (ví dụ: L-oleandrose, D-sarmentose), các dẫn xuất 3-methyl ether (ví dụ: L-

D-digitalose), 2-acetyl ester (ví dụ: 2-O-acetyl-L-thevetose) [127] (Hình 1.4). Trật tự

acofriose, L-thevetose, D-digitalose, D-diginose), 2-methyl ether (ví dụ: 2-O-methyl-

liên kết của các đơn vị đường thường theo quy luật aglycone–(đường hiếm)m–

(glucose)n [114].

Cardenolide glycoside thuộc nhóm cardiac glycoside, thường được dùng để

chữa bệnh tim mạch. Các nghiên cứu gần đây cho thấy lớp chất này còn có hoạt tính

kháng ung thư. Trong tổng số 109 cardenolide glycoside từ họ Apocynaceae có

khoảng ¼ hợp chất thể hiện tác dụng ức chế sự tăng sinh, gây ra sự tự chết của

nhiều dòng tế bào ung thư [127]. Người ta nhận thấy, hoạt tính của cardenolide

glycoside thường mạnh hơn dạng aglycone tương ứng của chúng. Về cơ chế tác

dụng, cardenolide glycoside liên kết và ức chế enzyme Na+/K+-ATPase. Sự thay đổi

cấu dạng của Na+/K+-ATPase đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển, vận động

và tự chết của tế bào. Ngoài ra còn có một số cơ chế khác đã được ghi nhận như:

làm thay đổi tính lưu động của màng tế bào; giảm hoạt các yếu tố sao mã NF-B,

JNK, AP-1; tăng canxi nội bào; tăng sản sinh ROS, tổn thương ti thể; ức chế FGF-2;

làm suy yếu receptor IL-8…

Hình 1.4. Phần đường của các cardenolide glycoside phân lập từ họ Apocynaceae

Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học

1.2.4.1. Hoạt tính kháng ung thư

Một trong những con đường để tìm kiếm các tác nhân kháng ung thư đó là

sàng lọc theo định hướng tác dụng chỉnh sửa DNA của nấm men. Áp dụng phương

pháp này, Baldoqui và cộng sự đã phát hiện hợp chất 2,2-dimethyl-2H-1-

benzopyran-6-cacboxylic acid (12) (phân lập lần đầu tiên từ loài A. affine và cũng

được tìm thấy trong lá của loài Piper aduncum) có khả năng ức chế sự tăng trưởng

của chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae nhờ sự phá hủy cấu trúc DNA [24].

Cụ thể, hợp chất này ức chế các chủng đột biến RS 321N và RS 322YK với giá trị

IC12 tương ứng là 120 và 100 g/mL.

Năm 2007, Bai và cộng sự phân lập được hợp chất 12β-hydroxyprena-

4,6,16-triene-3,20-dione (15) với tên gọi neridienone A từ cây Trúc đào (Nerium

oleander – Apocynaceae) [23]. Hợp chất này có khả năng gây độc tế bào khối u ác

tính (VA-13) gây ra từ nguyên bào sợi WI-38 và tế bào ung thư gan ở người (Hep-

G2) với giá trị IC50 lần lượt là 0,68 và 2,5 g/mL. Đáng lưu ý là 12β-hydroxyprena-

4,6,16-triene-3,20-dione (15) ít độc hơn trên tế bào WI-38 bình thường (IC50 = 4,5

g/mL).

Hợp chất affinoside T (71) phân lập từ loài A. affine cũng được tìm thấy

trong loài Elaeodendron orientale và đã được tiến hành thử hoạt tính trên một số

dòng tế bào ung thư. Affinoside T (71) ức chế các dòng tế bào ung thư thử nghiệm

gồm ung thư cổ tử cung (HeLa), ung thư phổi (A-549), ung thư vú (MCF-7), ung

thư máu cấp tính (HL-60) với các giá trị IC50 lần lượt là 0,02; 0,02; 0,034 và 0,01

µM. Hoạt tính này được đánh giá tương đương đến mạnh hơn so với chất đối chứng

được sử dụng trong cùng thí nghiệm là digoxin và digitoxigenin. Đặc biệt, tác dụng

của affinoside T (71) trên dòng tế bào MCF-7 mạnh gấp 4 lần so với digoxin, gấp

29 lần so với digitoxigenin và có độ chọn lọc cao hơn so với chất đối chứng [91].

Ở Việt Nam, Nguyễn Thị Hoài và cộng sự đã tiến hành sàng lọc hoạt tính

gây độc tế bào in vitro của dịch chiết methanol cây Tốc thằng cáng (A.

paniculatum) trong khuôn khổ đề tài cấp Bộ “Nghiên cứ u các cây thuốc củ a đồ ng

bào dân tộc thiểu số Pako, Vân Kiều ở Miền Trung theo hướng tác dụng chống oxy

hoá, diệt tế bào ung thư”. Kết quả cho thấy dịch chiết methanol thể hiện hoạt tính ức

chế đối với 5/6 dòng tế bào thử nghiệm và có tính hướng đích tốt, với các giá trị

IC50 thấp, đặc biệt là trên các dòng tế bào ung thư phổi (LU-1, IC50 = 14,24 µg/mL),

ung thư gan (Hep-G2, IC50 = 11,78 µg/mL) và ung thư dạ dày (MKN-7, IC50 = 4,03

µg/mL) [5].

1.2.4.2. Hoạt tính kháng khuẩn

Năm 2014, các nhà hóa học Trung Quốc đã tiến hành phân lập và thử hoạt

tính kháng khuẩn của các chất phân lập được từ loài A. formicinum. Kết quả nghiên

cứu cho thấy 4-hydroxy-3-prenylbenzoic acid (13), anodendrosin E (49) và 4-(O-β-

glucopyranosyl)-3,5-diprenylbenzoic acid (87) có hoạt tính ức chế mạnh chủng vi

khuẩn Providensia smartii với các giá trị MIC đều bằng 0,781 µg/mL (Bảng 1.3)

[96]. Bên cạnh đó, anodendrosin E (49) còn cho thấy khả năng kháng khuẩn rất

mạnh đối với chủng Escherichia coli với giá trị MIC là 0,781 µg/mL, tương đương

với chất đối chiếu là gentamycin [96].

Bảng 1.3. Hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất phân lập từ A. formicinum

Hợp chất MIC (μg/mL)

S. aureus ATCC 25922 > 100 > 100 50 50 100 25 1,56 100 0,195 P. aeruginosa ATCC 27853 > 100 50 50 100 100 100 25 100 0,781 P. smartii ATCC 29916 0,781 0,781 25 > 100 25 100 0,781 12,5 0,195 E. coli ATCC 11775 3,125 0,781 50 100 25 100 6,25 1,56 0,781 13 49 83 84 85 86 87 88 Gentamycin

1.2.4.3. Hoạt tính kháng viêm

Hợp chất glucosyringic acid (6) phân lập từ loài A. affine cũng đã được

Wangensteen và cộng sự chứng minh khả năng ức chế enzyme 15-lipoxygenase

(15-LO), một loại enzyme xúc tác cho quá trình oxy hóa của lipoprotein tỉ trọng

thấp [126]. Sự ức chế 15-LO có ảnh hưởng đến quá trình viêm trong cơ thể. Theo

nghiên cứu này, tại nồng độ 167 M, glucosyringic acid (6) có tác dụng ức chế 15- LO ở mức 38±4%.

1.2.4.4. Hoạt tính khác

Hợp chất dambonitol (10) có trong lá của loài A. affine cũng được phân lập

từ mủ cây Dyera costulata (Apocynaceae). Theo Sakurai và cộng sự, dambonitol

(10) cho thấy khả năng chống dị ứng dựa trên phản ứng phản vệ thụ động da, một

mô hình cho phản ứng dị ứng loại I [101].

Các hợp chất phân lập được từ loài A. affine như affinoside A (19),

affinoside M (43) và 4,5-dehydro-12-oxo-affinoside E (74) đều cho thấy khả năng

ức chế sự phát triển ấu trùng loài tằm bướm (Bombyx mori) với các giá trị ED50 lần

lượt là 1,0; 7,5 và 3,0 ppm (Bảng 1.4) [38].

Bảng 1.4. Hoạt tính ức chế sự phát triển của ấu trùng Bombyx mori của cardenolide từ A. affine

Hợp chất Affinoside A (19) Affinoside E (23) Affinoside M (43) 4,5-Dehydro-12-oxo-affinoside E (74) 12-Oxo-affinoside E (75) 16β-Hydroxyaffinoside A (76) ED50 (ppm) 1 > 10 7,5 3 > 10 > 10

Hai hợp chất 2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran-6-cacboxylic acid (12), 4-

hydroxy-3-prenylbenzoic acid (13) được Elsebai và cộng sự nghiên cứu khả năng ức

chế enzyme HLE (Human Leukocyte Elastase) – enzyme chịu trách nhiệm cho sự

phân chia elastin (protein đàn hồi trong các mô liên kết). Enzyme này nằm trong bạch

cầu đa nhân và liên quan đến sự di chuyển của bạch cầu từ máu sang các mô khác

[85], [137]. Hoạt động quá mức của enzyme này có thể dẫn đến các bệnh như khí phế

thủng phổi, viêm khớp dạng thấp, và xơ nang [9], [66]. Kết quả nghiên cứu cho thấy

hợp chất 2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran-6-cacboxylic acid (12) thể hiện hoạt tính ức

chế yếu (IC50 = 22,9±4,4 µM) trong khi 4-hydroxy-3-prenylbenzoic acid (13) thể hiện

tác dụng ức chế rất mạnh đối với enzyme HLE (IC50 = 8,1 µM) [36].

Nhận xét chung: Hóa học của chi Anodendron còn khá sơ khai với chỉ 3

trong tổng số 17 loài được nghiên cứu, 88 hợp chất đã được phân lập và xác định

cấu trúc. Trong đó, cardenolide là thành phần hóa học chính, chiếm 2/3 tổng số chất

đã phân lập. Đây là lớp hợp chất thiên nhiên chứa nhiều đặc điểm lý thú về mặt cấu

trúc do sở hữu nhiều trung tâm lập thể, nhiều cấu dạng, nhiều loại nhóm thế khác

nhau trong cấu trúc khung steroid. Hơn nữa, chính sự phức tạp về hóa học của hợp

phần đường cũng góp phần mang lại tính đa dạng về cấu trúc của cardenolide

glycoside. Các nghiên cứu về hoạt tính cho thấy chi Anodendron có một số tác dụng

sinh học rất đáng quan tâm như kháng khuẩn, kháng viêm, ức chế ấu trùng, ức chế

enzyme HLE…, đặc biệt là kháng u và ung thư mạnh. Vì vậy, hoá thực vật và hoạt

tính sinh học của chi này cần được tiếp tục nghiên cứu nhằm khám phá các cấu trúc

và hoạt tính mới, làm sáng tỏ cơ chế tác dụng cũng như mối quan hệ cấu trúc - hoạt

tính của các hoạt chất; góp phần làm giàu tri thức về hợp chất thiên nhiên, cung cấp

các chất tiềm năng cho quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới từ tự nhiên.

1.3. Giới thiệu sơ lược về loài Tốc thằng cáng

Tên khoa học: Anodendron paniculatum (Roxb.) A.DC.

Tên đồng nghĩa: A. lanceolatum King & Gamble, A. moluccanum Miq., A.

rhinosporum Thwaites., A. manubriatum (Wall. ex Steud.) Merr, A. parviflorum

(Roxb) IM Turner, Echites paniculatus Roxb., E. manubriatus Wall. ex Steud.

[79], [86].

Tên Việt Nam: Tốc thẳng, Tốc thằng cáng, Ngà voi, Dây duy tù, Đay nhui

Đặc điểm thực vật: Dây leo dài 15m, thân to 5–7cm, chứa nhựa mủ màu

trắng, cành vuông, không lông. Lá có phiến dài 10–20cm, dai, không lông, gân bên

12–14 đôi, cuống dài 1–2cm, xim tam phân ở nách lá và ngọn nhánh. Hoa trắng hay

ngà; dài 1mm; vành có ống dài 2mm, có lông mặt trong, tai 3mm; tiểu nhụy gắn

dưới giữa ống; dĩa mật có 5 răng cao. Quả đại nhọn, dài 10–15cm, rộng 2cm, vỏ quả

dày 2–2,5mm, hạt dài 1,5–2cm, dẹp, mỏ dài mang lông mào dài đến 9cm. Ra hoa

quả từ tháng 2 đến tháng 8 [3], [8].

Phân bố và sinh thái: Ở nước ta loài Tốc thằng cáng chủ yếu phân bố ở

Quảng Trị, Thừa thiên Huế (Phú Lộc, Bạch Mã), Đắc Lắc, Khánh Hòa (Nha Trang),

Đồng Nai (Biên Hòa), Bến Tre, Kiên Giang (Phú Quốc) [8].

Thành phần hóa học: Tính đến nay, chỉ 5 cardenolide glycoside đã được

phân lập và xác định cấu trúc từ loài Tốc thằng cáng bao gồm anodendroside A

(78), E1 (79), E2 (80), F (81) và G (82) [94].

Công dụng: Theo “Từ điển cây thuốc Việt Nam”, rễ của loài Tốc thằng cáng

có tác dụng kích thích mạnh niêm mạc và da. Do đó, rễ cây được dùng làm thuốc gây

nôn và trị ho [1]. Theo tài liệu nghiên cứu cây thuốc bản địa của Pankaj Oudhia, loài

Tốc thằng cáng được Y học cổ truyền Ấn Độ xếp vào đông dược chữa các bệnh hầu

họng và miệng, cụ thể là chữa khó thở, khó nuốt, gây nôn, chỉ ho. Liều dùng với rễ và

vỏ cây khô khoảng 5g/ngày, dùng riêng, không phối hợp với các thuốc khác. Ngoài

ra, ở Ấn Độ người ta còn dùng loài này trong các phương thuốc phối hợp điều trị biến

chứng tiểu đường, teo tinh hoàn ở nam giới, các bệnh phù (họng, phổi và tim), chữa

rối loạn thần kinh [51]. Ở Andhra Pradesh, Ấn Độ, loài Tốc thằng cáng đã được tổ

chức quốc tế về bảo tồn thiên nhiên (IUCN) đưa vào danh sách các cây thuốc có nguy

cơ tuyệt chủng hoặc bị đe doạ [129]. Ở Papuasia, người dân sử dụng mủ cây để giải

độc rắn cắn [37]. Ngoài ra, cao chiết methanol từ phần trên mặt đất của cây Tốc thằng

cáng thu hái ở Việt Nam thể hiện hoạt tính ức chế từ trung bình đến mạnh đối với 5/6

dòng tế bào thử nghiệm và có tính hướng đích tốt [5].

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

Phần trên mặt đất của loài Tốc thằng cáng (A. paniculatum (Roxb.) A.DC.)

được thu hái tại huyện Đăkrông, tỉnh Quảng Trị vào tháng 6 năm 2014 (Hình 2.1).

Tên khoa học được xác định (Phụ lục 21) bởi TS Nguyễn Thế Cường, Viện Sinh

thái và tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam. Tiêu bản được lưu

giữ tại Khoa Dược, Trường Đại học Y Dược Huế.

Mẫu nguyên liê ̣u sau khi thu hái đươ ̣c rử a sa ̣ch, thái nhỏ , phơi, sấy khô ở 50-

60oC, sau đó xay thành bô ̣t thô và bảo quản ở nơi khô thoáng.

a b

d c

Hình 2.1. Loài Tốc thằng cáng: a. Phần trên mặt đất, b. Lá và quả,

c. Đại bổ đôi, d. Hạt mang chùm lông

2.2. Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp phân lập, tinh chế các hợp chất

Sắc ký bản mỏng (TLC) được thực hiện trên bản mỏng trắng sẵn DC-

Alufolien 60 F254 (Merck 1.05715) và RP-18 F254s (Merck). Các chất được phát hiện

bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc dùng thuốc thử H2SO4 10%

phun đều lên bản mỏng rồi sấy ở nhiệt độ cao trong vài phút cho đến khi hiện màu.

Sắc ký cột (CC) được thực hiện trên chất hấp phụ pha thường (Silica gel

(40–63 µm, Merck, Đức) và (40-50 µm, Kanto, Nhật Bản)); pha đảo Cosmosil

75C18-OPN (Nacalai Tesque Inc., Nhật Bản), YMC RP-18 (30–50 µm, Fuji Silysia

Chemical, Nhật Bản); Sephadex LH-20 (Sigma-Aldrich, Mỹ); nhựa trao đổi ion

Diaion HP-20 (Sigma-Aldrich, Mỹ).

Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất Phương pháp chung để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất là kết hợp

giữa các thông số vật lý, các dữ kiện phổ và các chuyển hóa hóa học cùng với việc

phân tích, so sánh với các tài liệu tham khảo.

a) Điểm nóng chảy (mp)

Điểm nóng chảy được đo trên máy Buchi B-545 tại Khoa Hóa học, Trường

Đại học Khoa học Huế.

b) Góc quay cực ([α]D)

Góc quay cực được đo trên máy Autopol III polarimeter tại Trung tâm kiểm

nghiệm thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm Thừa Thiên Huế và máy JASCO P-2100

polarimeter tại Đại học Toyama (Nhật Bản).

c) Phổ hồng ngoại (IR)

Phổ hồng ngoại được đo trên máy FT-IR Prestige spectrometer (Shimadzu,

Japan) tại Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm Huế.

d) Phổ tử ngoại (UV)

Phổ tử ngoại được đo trên máy UV-1800 spectrophotometer (Shimadzu,

Japan) tại Khoa Hóa, Trường Đại học Sư phạm Huế.

e) Phổ khối lượng (MS)

Phổ khối phun mù điện tử (ESIMS) được đo trên máy Agilent 6310 Ion Trap

tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ

Việt Nam.

Phổ khối phân giải cao (HRESIMS) được đo trên máy micrOTOF-Q 10187

tại Phòng thí nghiệm phân tích trung tâm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại

học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh; máy LTQ Orbitrap XL mass spectrometer

(Thermo Scientific, Massachusetts, USA) tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên,

Đại học Quốc gia Hà Nội và máy LCMS-IT-TOF (Shimadzu, Nhật Bản) tại Đại học

Toyama.

f) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và hai

chiều (HSQC, HMQC, HMBC, COSY, NOESY, ROESY) được đo trên máy Bruker

AM500 FT-NMR Spectrometer (với TMS là chất chuẩn nội) tại Viện Hoá học, Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và máy Varian Union 600 spectrometer

(Varian, California, Mỹ) (với TMS là chất chuẩn nội) tại Đại học Toyama.

Phương pháp xác định thành phần monosaccharide

Các dẫn xuất alditol per-acetate được điều chế theo phương pháp được mô tả

bởi Pettolino và cộng sự [93] với một vài chỉnh sửa nhỏ. Mẫu saponin được thủy

phân bằng dung dịch trifluoroactetic acid 4 M ở 105oC trong 4 giờ. Monosaccharide

sau đó được khử thành alditol bằng NaBH4 và được acetyl hóa bằng hỗn hợp acetic

anhydride–pyridine (1:1, v/v) ở 110oC trong 2 giờ. Các alditol per-acetate tạo thành

được phân tích bằng phương pháp GC-MS trên hệ thống GCMS-QP2010 Plus

(Shimadzu, Kyoto, Nhật) với cột mao quản DB-5 (30 m x 0,25 mm). Khí mang He

với tốc độ dòng 1,2 mL/phút. Chương trình nhiệt độ lò GC: nhiệt độ đầu 80oC trong

2 phút, tăng 10oC/phút đến 180oC và giữ ở 180oC trong 2 phút, , tăng 2oC/phút đến

220oC và giữ ở 220oC trong 5 phút, tiếp tục tăng 2oC/phút đến 240oC và giữ trong 5

phút ở nhiệt độ này. Nhiệt độ buồng tiêm, đầu dò được đặt lần lượt ở 220 và 230oC.

Thành phần monosaccharide được xác định thông qua việc so sánh thời gian lưu và

dữ kiện phổ EIMS của các dẫn xuất alditol per-acetate của chúng với các giá trị

tương ứng của monosaccharide chuẩn (Sigma-Aldrich, Mỹ) trong cùng điều kiện

phân tích.

Phương pháp xác định hợp phần acid béo của các glycolipid a) Methanol phân các glycolipid

Glycolipid được hòa tan trong toluene sau đó bổ sung thêm lần lượt MeOH,

dung dịch HCl 8% (pha trong MeOH). Hỗn hợp được ủ ở 45oC khoảng 2h (để thủy

phân một phần) hoặc qua đêm (để thủy phân hoàn toàn). Quá trình phản ứng được

kiểm tra bằng TLC. Sau khi làm lạnh đến nhiệt độ phòng, thêm n-hexane và nước

để chiết lấy dẫn xuất methyl ester của acid béo (FAME) tạo thành [55]. Các dẫn

xuất FAME được phân tích bằng phương pháp GC-MS.

b) Phân tích GC-MS đối với các FAME

Các dẫn xuất FAME được phân tích trên máy Shimadzu QP2010 Plus [Cột

Equity®-5 (Supelco) (0,25 mm x 30 m)] cùng với đầu dò khối phổ MS QP2010

Plus. Chế độ ion hóa va đập điện tử được sử dụng với năng lượng 70 eV. Khí mang

He với tốc độ dòng 1,5 mL/phút. Nhiệt độ buồng tiêm, giao diện MS, buồng ion hóa

lần lượt là 250, 250 và 300oC. Điện thế đầu dò 0,82 kV, dải quét 15÷350 amu.

Chương trình nhiệt độ lò GC: nhiệt độ đầu 100oC, tăng 5oC/phút đến 185oC (giữ

đẳng nhiệt trong 10 phút), tăng 5oC/phút đến 220oC (giữ đẳng nhiệt trong 5 phút)

(CT1) hoặc nhiệt độ đầu 80oC (giữ đẳng nhiệt trong 2 phút), tăng 5oC/phút đến

185oC (giữ đẳng nhiệt trong 10 phút), tăng 10oC/phút đến 250oC (giữ đẳng nhiệt

trong 5 phút) (CT2).

Việc nhận dạng các hợp chất được thực hiện bằng cách so sánh dữ kiện phổ

EIMS của chúng với giá trị tương ứng đã được liệt kê trong các thư viện NIST 11,

WILEY 7. Hàm lượng của các FAME được tính toán thông qua diện tích của píc

tương ứng trên sắc ký đồ GC.

Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

a) Vật liệu

+ Hóa chất: các hóa chất cần thiết khác của các hãng Sigma, Gibco,

Invitrogen bao gồm: L-glutamine, sodium bicarbonate, glucose, HEPES (4-(2-

hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid), sodium pyruvate, fetal bovine

serum, sulforhodamine B, DMSO 10%, trichloroacetic acid, 5% acetic acid,

tris(hydroxymethyl)aminomethane.

+ Mẫu thử: các chất tinh khiết được phân lập từ cây Tốc thằng cáng.

+ Các dòng tế bào thử nghiệm: HL-60 (ung thư máu cấp tính), LNCaP (ung

thư tiền liệt tuyến), MCF-7 (ung thư vú), LU-1 (ung thư phổi), Hep-G2 (ung thư

gan), KB (ung thư biểu mô), MKN-7 (ung thư dạ dày), SW-480 (ung thư ruột kết)

do GS. J. M. Pezzuto, Trường Đại học Hawaii (Mỹ) và GS. Jeanette Maier, Trường

Đại học Milan (Italia) cung cấp.

b) Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro

Các dòng tế bào ung thư được nuôi cấy dưới dạng đơn lớp trong môi trường

nuôi cấy DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) với thành phần kèm theo

gồm 2 mM L-glutamine, 1,5 g/L sodium bicarbonate, 4,5 g/L glucose, 10 mM

HEPES, và 1,0 mM sodium pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum-

FBS (Gibco). Tế bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ

ấm CO2 ở điều kiện 37oC, 5% CO2.

c) Phương pháp thử tác dụng gây độc tế bào ung thư

Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ

(National Cancer Institute - NCI) xác nhận là một trong những phép thử độ độc tế

bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển

hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo

phương pháp của Monks [81]. Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế

bào tổng số dựa vào mật độ quang học (Optical Density - OD) đo được khi thành

phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD

máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào

càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thực

hiện trong điều kiện cụ thể như sau:

- Chất thử (10 µL) pha trong DMSO 10% (trong nước cất vô trùng) được đưa

vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ sàng lọc là 100 µg/mL. Chất thử có

hoạt tính được xác định IC50 nhờ dải nồng độ 100, 20, 4, 0,8 và 0,16 µg/mL. Mỗi

nồng độ của mẫu thử được chuẩn bị thành 3 giếng.

- Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để

điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.

- Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp (trong 190 µL môi

trường) và để chúng phát triển trong vòng 3-5 ngày.

- Một khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng có tế bào ung thư (190 µL)

được chuẩn bị thành 3 cột để làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, đĩa đối chứng ngày 0

sẽ được cố định tế bào bằng Trichloroacetic acid - TCA.

- Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, tế bào được cố định vào đáy giếng

bằng TCA trong 30 phút, được nhuộm bằng SRB trong 1 giờ ở 37oC. Đổ bỏ SRB và

các giếng thí nghiệm được rửa 3 lần bằng 5% acetic acid rồi để khô trong không khí

ở nhiệt độ phòng.

- Cuối cùng, sử dụng dung dịch tris(hydroxymethyl)aminomethane 10 mM để

hòa tan lượng SRB đã bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc

nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về

hàm lượng màu của chất nhuộm SRB thông qua phổ hấp thụ ở bước sóng 515 nm.

Khả năng sống sót của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công

thức sau:

[OD (chất thử) – OD (ngày 0)] x 100

% Tế bào sống sót =

[OD (đối chứng âm) – OD (ngày 0)]

% Tế bào bị ức chế = 100 % - % Tế bào sống sót

Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine

(Sigma-Aldrich, Mỹ) luôn được sử dụng làm chất đối chứng dương và được thử

nghiệm ở các nồng độ 10, 2, 0,4 và 0,08 µg/mL. DMSO 10% luôn được sử dụng

như đối chứng âm. Giá trị IC50 sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính

TableCurve 2Dv4 (System software Inc., San Jose, California, Mỹ).

Chương 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1. Xử lý mẫu và chuẩn bị các cao chiết

Phần trên mặt đất của cây Tốc thằng cáng sau khi thu hái được loại bỏ phần

hư hỏng, rửa sạch, thái nhỏ, phơi trong bóng râm rồi sấy ở 50–60oC cho đến khô.

Bột nguyên liệu khô (2,5 kg) được chiết với MeOH (10,0 lít x 3 lần) ở nhiệt độ

phòng (72 giờ/lần), cất loại dung môi dưới áp suất thấp thu được cao chiết MeOH

(105 g). Cao chiết này được phân tán vào nước rồi lần lượt chiết với CHCl3 (2 lít x

3 lần), EtOAc (2 lít x 3 lần). Cất loại dung môi dưới áp suất thấp thu được các phân

đoạn tương ứng là phân đoạn CHCl3 (AC, 50,7 g), phân đoạn EtOAc (AE, 10,2 g)

và phân đoạn nước (AW, 27,5 g) (Hình 3.1).

Phần trên mặt đất của cây Tốc thằng cáng (2,5 kg)

1. Ngâm chiết bằng MeOH (10 lít x 3) 2. Cất loại dung môi dưới áp suất thấp Cao chiết MeOH (105 g)

1. Bổ sung nước (2 lít) 2. Chiết lần lượt với CHCl3 (2 lít x 3), EtOAc (2 lít x 3)

3. Cất loại dung môi dưới áp suất thấp

AC (50,7 g) Phân đoạn CHCl3 AE (10,2 g) Phân đoạn EtOAc AW (27,5 g) Phân đoạn nước

Hình 3.1. Sơ đồ chiết các phân đoạn từ phần trên mặt đất của cây Tốc thằng cáng

3.2. Quá trình phân lập các hợp chất

Phân đoạn AC được tách bằng cột pha thường, rửa giải theo gradient nồng

độ bằng hệ CHCl3–MeOH (100:0; 40:1; 20:1; 10:1; 5:1; 2:1; 1:1; 0:100, v/v) thu

được 8 phân đoạn tương ứng, AC1–AC8. Phân đoạn AC2 (8,3 g) được tách trên cột

pha thường, rửa giải theo gradient nồng độ bằng hệ n-hexane–acetone lần lượt với

các tỉ lệ 100:0; 60:1; 40:1; 20:1; 10:1; 4:1 (v/v) thu được 6 phân đoạn, AC2.1–

AC2.6. Phân đoạn AC2.2 (1,2 g) tiếp tục được tách trên cột pha thường, rửa giải

bằng hệ n-hexane–EtOAc (10:1, v/v) thu được hợp chất AP2 (4,5 mg) và AP3

(100,5 mg). Phân đoạn AC2.3 (0,75 g) được cho qua cột pha đảo với pha động là hệ

MeOH–acetone–H2O (10:5:1, v/v) thu được hợp chất AP1 (7,5 mg) và AP4 (45,7

mg). Phân đoạn AC2.4 (1,32 g) được tinh chế trên cột pha thường, rửa giải bằng hệ

n-hexane–acetone (5:1, v/v) thu được hợp chất AP5 (156,5 mg) và AP6 (15,8 mg).

Hợp chất AP7 (27,0 mg) thu được từ phân đoạn AC2.5 (0,64 g) bằng cột pha

thường với pha động là hệ CHCl3–MeOH (20:1, v/v) (Hình 3.2).

Phân đoạn AW được tách bằng cột diaion HP-20, rửa giải theo gradient nồng

độ bằng hệ MeOH–H2O (0:1, 1:3, 1:1, 3:1, 1:0, v/v) thu được 4 phân đoạn, AW1–

AW4. Phân đoạn AW1 (4,5 g) được tách trên cột pha đảo, rửa giải bằng hệ MeOH–

H2O (1:1, v/v) thu được 3 phân đoạn, AW1.1–AW1.3. Phân đoạn AW1.1 (1,05 g)

được tinh chế cột pha thường, rửa giải bằng hệ CHCl3–MeOH–H2O (4:1:0,1, v/v)

thu được hợp chất AP8 (20,5 mg), AP9 (38,6 mg).

Phân đoạn AW2 (10,5 g) được tách trên cột silica gel, rửa giải bằng hệ

CHCl3–MeOH–H2O (3:1:0,1, v/v) thu được 7 phân đoạn, AW2.1–AW2.7. Phân

đoạn AW2.4 (0,55 g) tiếp tục được tinh chế trên cột Sephadex LH-20, rửa giải bằng

hệ MeOH–H2O (4:1, v/v), theo sau bởi cột YMC RP-18 với dung môi giải ly là

MeOH–MeCN–H2O (3:2:3, v/v) thu được hợp chất AP10 (32,2 mg), AP11 (10,8

mg) và AP12 (25,6 mg).

Phân đoạn AW3 (1,25 g) được tách trên cột sephadex LH-20 với dung môi

rửa giải là MeOH, thu được 3 phân đoạn, AW3.1–AW3.3. Phân đoạn AW3.3 (0,6

g) được tách tiếp trên cột pha thường, rửa giải bằng hệ CHCl3–MeOH–H2O

(3:1:0,1, v/v) thu được 5 phân đoạn, AW3.3.1–AW3.3.5. Phân đoạn AW3.3.3 (230

mg) được tách tiếp trên cột pha thường, rửa giải bằng hệ CHCl3–MeOH–H2O

(3:1:0,1, v/v) thu được hợp chất AP13 (132 mg). Phân đoạn AW3.3.4 (104 mg)

được tách trên cột pha đảo, rửa giải bằng hệ MeOH–H2O (3:2, v/v) thu được hợp

chất AP14 (15,5 mg).

Phân đoạn AW4 (4.2 g) được tách trên cột silica gel, giải li bằng hệ CHCl3–

MeOH–H2O (5:1:0,1, v/v) thu được 4 phân đoạn, AW4.1–AW4.4. Phân đoạn

AW4.3 (0,7 g) được tinh chế trên cột YMC RP-18 với hệ dung môi rửa giải là

MeOH–H2O (6:1, v/v) thu được hợp chất AP15 (18,7 mg), AP16 (12,5 mg), AP17

(10,7 mg), AP18 (13,8 mg) và AP19 (9,6 mg). Phân đoạn AW4.4 (75 mg) được

tách trên cột pha thường, rửa giải bằng hệ EtOAc–MeOH–H2O (3:1:0,1, v/v) thu

được hợp chất AP20 (17,3 mg) (Hình 3.3).

(1)

AC Phân đoạn CHCl3 (50,7 g)

(2)

AC2 (8,3 g)

(4)

(5)

AC2.4 (1,32 g) AC2.3 (0,75 g) AC2.2 (1,2 g) (3) AC2.5 (0,64 g) (6)

(1) (2) (3) (4) (5) (6)

Pha tĩnh Silica gel Silica gel Silica gel YMC RP-18 Silica gel Silica gel

Pha động Gradient CHCl3–MeOH (100:00:100, v/v) Gradient n-hexan–acetone (100:04:1, v/v) n-hexan–EtOAc (10:1, v/v) MeOH–acetone–H2O (10:5:1, v/v) n-hexan–acetone (5:1, v/v) CHCl3–MeOH (20:1, v/v)

AP2 AP6 AP7 AP3 AP1 AP4 AP5

Hình 3.2. Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn chloroform của cây Tốc thằng cáng

(1)

AW Phân đoạn nước (27,5 g)

(5)

AW1 (4,5 g) AW4 (4,2 g) AW3 (1,25 g)

(2)

(4)

AW2 (10,5 g) (3)

(6)

(9)

AW1.1 (1,05 g) AW2.4 (0,55 g) AW3.3 (0,6 g) AW4.3 (0,7 g) AW4.4 (75 mg)

(13)

(12)

(7) (8)

AP8 AP9

(10)

AW3.3.3 (230 mg) AP10 AW3.3.4 (104 mg) (11)

AP13 AP14 AP20 AP11

AP12

AP15 AP16 AP17 AP18 AP19

Pha tĩnh Diaion HP-20 YMC RP-18 Silica gel Sephadex LH-20 Silica gel Silica gel Sephadex LH-20 YMC RP-18 Silica gel Silica gel YMC RP-18 YMC RP-18 Silica gel

Pha động Gradient MeOH−H2O (0:1, 1:3, 1:1, 3:1, 1:0, v/v) MeOH–H2O (1:1, v/v) CHCl3–MeOH–H2O (3:1:0,1, v/v) MeOH CHCl3–MeOH–H2O (5:1:0,1, v/v) CHCl3–MeOH–H2O (4:1:0,1, v/v) MeOH–H2O (4:1, v/v), MeOH–MeCN–H2O (3:2:3, v/v) CHCl3–MeOH–H2O (3:1:0,1, v/v) CHCl3–MeOH–H2O (3:1:0,1, v/v) MeOH–H2O (3:2, v/v) MeOH–H2O (6:1, v/v) EtOAc–MeOH–H2O (3:1:0,1, v/v)

(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13)

Hình 3.3. Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn nước của cây Tốc thằng cáng

3.3. Tính chất vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất đã phân lập

Hợp chất AP1: Cycloartenol Chất bột màu trắng; mp 101–103oC, IR (KBr) max (cm-1): 3418, 2928, 1670,

1443, 1377; CTPT C30H50O; M = 426; 1H- và 13C-NMR: xem Bảng 4.1 và Phụ lục 1.

Hợp chất AP2: Anopaniester (Chất mới) Chất dầu không màu; IR (KBr) max (cm-1): 3443, 2922, 2853, 1736, 1630,

1466, 1377, 1260, 1180, 1094; UV (MeOH) max (nm): 201, 231; HRESIMS: m/z

725,5805 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C48H78O3Na, 725,5849);

CTPT: C48H78O3; M = 702; 1H- và 13C-NMR: Bảng 4.2, 4.3 và Phụ lục 2.

Hợp chất AP3: (E)-Phytol Chất dầu không màu; IR (KBr) max (cm-1): 3449, 2932, 1636, 1462, 1381,

1003; HRESIMS: m/z 319,2931 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức

C20H40ONa, 319,2977); CTPT C20H40O; M = 296; 1H- và 13C-NMR: xem Bảng 4.4

và Phụ lục 3.

Hợp chất AP4: Desmosterol Chất bột màu trắng; mp 122–124oC; IR (KBr) max (cm-1): 3445, 2936, 1636,

1462, 1377, 1053; HRESIMS: m/z 385,3513 [M+H]+ (tính toán lý thuyết cho công

thức C27H45O, 385,3470); CTPT C27H44O; M = 384; 1H- và 13C-NMR: xem Bảng

4.5 và Phụ lục 4.

]D +65 (c 0,5, EtOH), mp 284–286oC, UV (MeOH) λmax [

Hợp chất AP5: Ursolic acid Chất bột màu trắng;

(nm): 201, 230; IR (KBr) νmax (cm-1): 3433, 2870, 1690; ESIMS: m/z 479,2 [M+Na]+,

455,2 [M-H]-; CTPT C30H48O3; M = 456; 1H-NMR và 13C-NMR: xem Bảng 4.6 và

Phụ lục 5.

Hợp chất AP6: Vanillin Chất bột màu trắng; mp 82–84oC, UV (MeOH) λmax (nm): 204, 231, 278, 309; IR

(KBr) νmax (cm-1): 3310, 1674, 1589, 1512, 1026, ESIMS: m/z 175,0 [M+Na]+; CTPT

C8H8O3; M = 152; 1H-NMR và 13C-NMR: xem Bảng 4.7 và Phụ lục 6.

Hợp chất AP7: Esculentic acid Chất bột màu trắng; mp 267–268oC; IR (KBr) νmax (cm-1): 3425, 2927, 2363,

1690, 1458, 1038; HRESIMS: m/z 511,3390 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công

thức C30H48O5Na, 511,3399); CTPT: C30H48O5; M = 488; 1H-NMR và 13C-NMR:

+11 (c 0,8, MeOH); mp 188–190oC, UV (MeOH)

xem Bảng 4.8 và Phụ lục 7.

Hợp chất AP8: Kaempferol-3-O-rutinoside Chất bột màu vàng; []

λmax (nm): 203, 267, 351; IR (KBr) νmax (cm-1): 3410, 1659, 1605, 1497, 1566, 1180,

1065; ESIMS: m/z 617,1 [M+Na]+, 593,1 [M-H]-; CTPT C27H30O15; M = 594; 1H-

+4 (c 0,5, MeOH), mp 193–195oC, UV (MeOH) λmax

NMR và 13C-NMR: xem Bảng 4.9 và Phụ lục 8.

Hợp chất AP9: Rutin Chất bột màu vàng; []

(nm): 204, 257, 357; IR (KBr) νmax (cm-1): 3418, 1651, 1605, 1504 , 1204, 1065;

13C-NMR: xem Bảng 4.10 và Phụ lục 9.

ESIMS: m/z 633,1 [M+Na]+, 609,1 [M-H]-; CTPT C27H30O16; M = 610; 1H-NMR và

]D -19,9 (c 0.1, MeOH); IR (KBr) max [

Hợp chất AP10: Anopanin A (Chất mới) Chất bột trắng; mp 213–215oC;

(cm-1): 3418, 2932, 1713, 1632, 145, 1383, 1265, 1070, 1030; HRESIMS: m/z

1H-NMR (600 MHz, C5D5N) và 13C NMR (150 MHz, C5D5N): xem Bảng 4.11,

1025,5294 [M+Na]+ (tính toán cho C50H82O20Na, 1025,5297); CTPT: C50H82O20;

4.12, Phụ lục 10.

Hợp chất AP11: Anopanin B (Chất mới)

]D +77,7 (c 0,1, MeOH); IR (KBr) max [

Chất bột trắng; mp 222–224oC;

(cm-1): 3443, 2930, 1730, 1647, 1460, 1377, 1252, 1074, 1028; HRESIMS: m/z

1HNMR (600 MHz, C5D5N) và 13C NMR (150 MHz, C5D5N): xem Bảng 4.13, 4.14,

1027,5452 [M+Na]+ (tính toán cho C50H84O20Na, 1027,5454); CTPT: C50H84O20;

Phụ lục 11.

]D +66,7 (c 0,1, MeOH); IR (KBr) max [

Hợp chất AP12: Anopanin C (Chất mới) Chất bột trắng; mp 218–219oC;

(cm-1): 3428, 2932, 1709, 1630, 1456, 1381, 1261, 1072, 1028; HRESIMS: m/z

1H-NMR (600 MHz, C5D5N) và 13C NMR (150 MHz, C5D5N): xem Bảng 4.15,

1025,5293 [M+Na]+ (tính toán cho C50H82O20Na, 1025,5297); CTPT: C50H82O20;

4.16, Phụ lục 12.

–70 (c 0,05, MeOH), mp 271–272oC, UV (MeOH)

Hợp chất AP13: Sargentol Chất bột màu trắng; []

λmax (nm): 207, 273; IR (KBr) νmax (cm-1): 3387, 1597, 1504, 1466, 1234, 1072; CTPT

C17H24O10, M = 388; 1H-NMR và 13C-NMR: xem Bảng 4.17 và Phụ lục 13.

Hợp chất AP14: 4-O-β-D-Glucopyranosyl-3-prenylbenzoic acid Chất bột màu trắng; UV (MeOH) λmax (nm): 250, 205; IR (KBr) νmax (cm-1):

3379, 2916, 1694, 1605, 1504, 1250, 1084, 1042; HRESIMS: m/z 391,1398 [M+Na]+

(tính toán lý thuyết cho công thức C18H24O8Na, 391,1369); CTPT C18H24O8, M =

368; 1H-NMR và 13C-NMR: xem Bảng 4.18 và Phụ lục 14.

Hợp chất AP15: Inugalactolipid A Chất bột màu trắng; HRESIMS: m/z 937,5842 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết

13C-NMR: xem Bảng 4.19 và Phụ lục 15.

cho công thức C49H86O15Na, 937,5864); CTPT C49H86O15; M = 914; 1H-NMR và

Hợp chất AP16: Gingerglycolipid A

]D +35,7 (c 0,1, MeOH); CTPT C33H56O14; M = 676; [

1H-NMR và 13C-NMR: xem Bảng 4.20 và Phụ lục 16.

Chất bột màu trắng;

Hợp chất AP17: Gingerglycolipid B

]D +57,0 (c 0,1, MeOH); HRESIMS: m/z 701,3721 [

Chất bột màu trắng;

[M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C33H58NaO14, 701,3724); CTPT

C33H58O14; M = 678; 1H-NMR và 13C-NMR: xem Bảng 4.21 và Phụ lục 17.

]D +29,4 (c 0,1, MeOH); HRESIMS: m/z 703,3878 [

Hợp chất AP18: Gingerglycolipid C Chất bột màu trắng;

[M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C33H60NaO14, 703,3881); CTPT

C33H60O14; M = 680; 1H-NMR và 13C-NMR: xem Bảng 4.22 và Phụ lục 18.

Hợp chất AP19: (2S)-1-O-Palmitoyl-3-O-[-D-galactopyranosyl-(1→6)-

]D +51,6 (c 0,1, MeOH); HRESIMS: m/z 677,3746 [

O-β-D-galactopyranosyl]glycerol Chất bột màu trắng;

[M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C31H58O14Na, 677,3724); CTPT

C31H58O14; M = 654; 1H-NMR và 13C-NMR: xem Bảng 4.23 và Phụ lục 19.

Hợp chất AP20: (2R)-1-O-Palmitoyl-3-O-α-D-(6-

sulfoquinovopyranosyl)glycerol

Chất bột màu trắng; IR (KBr) νmax (cm-1): 3418, 2932, 2367, 1713, 1383, 1265,

1070; HRESIMS: m/z 579,2797 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức

C25H48O11SNa, 579,2815); CTPT C25H48O11; M = 556; 1H-NMR và 13C-NMR: xem

Bảng 4.24 và Phụ lục 20.

3.4. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của một số chất tinh khiết

Hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các hợp chất tinh khiết được thử nghiệm

trên các dòng tế bào ung thư LU-1, Hep-G2, HL-60, KB, LNCaP, MKN-7, SW-480

và MCF-7 theo phương pháp được mô tả ở mục 2.2.3. Kết quả được trình bày ở

Bảng 3.1, Phụ lục 22.

Bảng 3.1. Hoạt tính gây độc của các hợp chất đã phân lập trên các dòng tế bào ung thư

STT Hợp chất

IC50 (µg/mL) KB – LU-1 >100 MKN-7 >100 SW-480 –

>100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100

HL-60 – – – – – – – – >100 – – – – – – – – LNCaP – – – – – – – – >100 – – – – – – – – AP3 AP4 AP5 AP7 AP8 AP9 AP10# AP11# AP12# AP13 AP14 AP15 AP16 AP17 AP18 AP19 AP20

Hep-G2 – 41,41±2,31 38,06±1,18 30,01±2,92 28,11±1,95 40,10±2,39 – 44,37±5,40 30,89±3,60 – – – >100 >100 >100 – – – >100 >100 >100 93,95±4,99 – 0,39±0,02 – – – – >100 >100 >100 – – – >100 >100 >100 >100 – 0,50± 0,04 – – – – >100 >100 >100 – – – >100 >100 >100 >100 – 0,44±0,07 66,66±5,85 72,42±8,05 0,39±0,02 0,31±0,07 MCF-7 – – – – – – – – >100 – – – – – – – – 0,47±0,03 0,33±0,04 0,48±0,05

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Ellipticine (-):Không thử nghiệm; #Chất mới.

Chương 4. BÀN LUẬN

4.1. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập

Hợp chất AP1: Cycloartenol Hợp chất AP1 được tách ở dạng bột trắng. Phổ 1H-NMR chỉ ra tín hiệu đặc

trưng của 1 proton olefin tại δH 5,10; proton của 1 nhóm oxymethine tại δH 3,38; 7

nhóm methyl tại δH 0,81 (s, H3-29), 0,88 (d, J = 6,5 Hz, H3-21), 0,89 (s, H3-30),

0,96 (s, H3-18 & H3-28), 1,60 (s, H3-27) và 1,68 (s, H3-26). Đặc biệt, tín hiệu của 2

proton thuộc nhóm methylene tại 0,33 (br.d, J = 3,5 Hz, H-19a), 0,55 (br.d, J = 3,5

Hz, H-19b) chứng minh sự hiện diện của vòng 3 cạnh.

Phổ 13C-NMR và HMQC chỉ ra tín hiệu của 30 carbon gồm 7 nhóm methyl,

11 nhóm methylene, 6 nhóm methine và 6 carbon không mang hydro. Trong đó, sự

hiện diện của 1 liên kết đôi 3 lần thế được thể hiện qua tín hiệu của 2 carbon olefin

tại δC 125,4 (C-24), 131,1 (C-25). Tín hiệu của carbon oxymethine được quan sát tại

δC 79,0. Sự định hướng của nhóm 3-OH được xác định là β thông qua việc so sánh

giá trị độ dịch chuyển hóa học của C-3 (δC 79,0), C-5 (δC 47,2) với giá trị tương ứng

ở các hợp chất có cấu trúc tương tự như 3-hydroxy-5-cycloart-24-en-23-one,

24(E)-3-hydroxy-5-cycloart-24-en-26-al, 24(E)-3-hydroxy-5-cycloart-24-en-

26-oic acid [3-OH: δC ~ 77 (C-3), ~ 41 (C-5)]; 3β-hydroxy-5-cycloart-24-en-21-

al, 5-cycloart-24-en-3β,21β-diol, 3β-hydroxy-5-cycloart-24-en-21-oic acid [3β-

OH: δC ~ 79 (C-3), ~ 47 (C-5)] [17], [59].

Hình 4.1. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP1

a, c (J, Hz)

Bảng 4.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP1 và hợp chất tham khảo

#, a δC 32,06

a, b δC 32,1

C 1

2 30,48 30,5

3 4 5 6 78,90 40,56 47,22 21,17 79,0 40,6 47,2 21,3

7 26,07 26,2

8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 48,00 20,12 26,25 26,60 33,02 45,40 48,91 35,65 28,18 52,38 18,05 29,90 48,1 20,1 26,2 26,6 33,0 45,4 48,9 35,7 28,3 52,4 18,2 30,0

δH 1,24*, 1,60* 1,55*, 1,76* 3,38 (m) – 1,30* 0,79*, 1,57* 1,08*, 1,32* 1,50 dd (12,5; 4,5) – – 1,06*, 1,98* 1,61* – – 1,28* 1,28*, 1,90* 1,58* 0,96 s 0,33 br.d (3,5) 0,55 br.d (3,5) 1,38* 0,88 d (6,5) 1,04*, 1,41* 1,86*, 2,03* 5,10 t (6,5) – 1,68 s 1,60 s 0,96 s 0,81 s 0,89 s 35,94 18,31 36,44 25,02 125,35 130,84 25,70 17,64 25,49 14,04 19,36 36,0 18,4 36,5 25,1 125,4 131,1 25,9 17,8 25,6 14,1 19,4 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 #δC của cycloartenol [80], ađo trong CDCl3, b125 MHz, c500 MHz, *tín hiệu chập.

Các dữ kiện phổ 1H-, 13C-NMR gợi ý hợp chất AP1 là một triterpene khung

cycloartane. Đối chiếu với chất tham khảo ở tài liệu [80], hợp chất AP1 được xác

định là cycloart-24-en-3β-ol (Hình 4.1). Hợp chất này còn được gọi tên là

cycloartenol.

Hợp chất AP2: Anopaniester (Chất mới)

Hợp chất AP2 được tách ở dạng dầu, không màu. Píc ion giả phân tử tại m/z

725,5805 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho C48H78O3Na là 725,5849) trên phổ

HRESIMS (Hình 4.5) đề nghị CTPT của hợp chất này là C48H78O3 (DBE = 10). Phổ

UV (MeOH) chỉ ra các cực đại hấp thụ tại λ 201 và 231 nm (Hình 4.6). Phổ IR

(KBr) (Hình 4.7) gợi ý sự hiện diện của nhóm hydroxyl (3443 cm-1), carbonyl (1736

cm-1) và liên kết đôi (1630 cm-1).

Phổ 1H-NMR (Hình 4.8) chỉ ra tín hiệu đặc trưng của 6 nhóm methyl bậc 3

(18H , δH 0,84, 0,89, 0,89, 0,96, 1,60, 1,68), một nhóm methyl bậc 2 [δH 0,88 (d, J =

7,0 Hz, H3-21)] và một nhóm methyl bậc 1 [δH 0,97 (t, J = 7,5 Hz, H3-18)]. Ngoài

ra các tín hiệu của 2 nhóm oxymethine [δH 4,20 (m, H-13); 4,56 (dd, J = 11,0, 4,5

Hz, H-3)] và 7 proton olefin [δH 5,10 (t, J = 6,0 Hz, H-24), 5,36 (td, J = 10,5, 8,0

Hz, H-15), 5,43 (td, J = 10,5, 8,0 Hz, H-9), 5,57 (td, J = 10,5, 7,5 Hz, H-16), 5,69

(dd, J = 15,0, 6,5 Hz, H-12), 5,97 (dd, J = 11,5, 10,5 Hz, H-10), 6,51 (dd, J = 15,0,

11,5 Hz, H-11)] cũng được ghi nhận. Mặc khác, tín hiệu của 2 proton methylene tại

δH 0,33 và 0,57 (br.d, J = 4,0 Hz, H-19) trên phổ 1H-NMR xác nhận sự tồn tại của

nhóm cyclopropyl trong cấu trúc của AP2.

Phổ 13C-NMR (Hình 4.9) và HMQC (Hình 4.10) chỉ ra tín hiệu của 48

carbon bao gồm 8 nhóm methyl, 20 nhóm methylene, 13 nhóm methine và 7 carbon

không mang hydro. Ngoài ra, trên phổ 13C-NMR cũng ghi nhận các tín hiệu tương

ứng của 1 carbon carbonyl [δC 173,1 (C-1)], 8 carbon olefin (δC 123,9–135,3) và 2

carbon oxymethine [δC 72,3 (C-13) và 80,5 (C-3)].

Các dữ kiện phổ 1H- và 13C-NMR gợi ý hợp chất AP2 là một ester, tạo thành

từ một triterpenoid khung cycloartane và acid béo không no [122]. Việc gán ghép

đầy đủ cho tất cả proton và carbon được thực hiện qua phân tích chi tiết phổ HMQC

(Hình 4.10), HMBC (Hình 4.11) và COSY (Hình 4.12).

Bảng 4.2. Số liệu phổ NMR hợp phần triterpenoid của hợp chất AP2

a, b δC 31,7 27,0 80,5 39,6 47,3 21,1 26,0 48,0 20,3 26,1 26,6 33,0 45,4 48,9 35,7 28,3 52,4 18,1 29,9

a, c (J, Hz) δH 1,22*, 1,60* 1,61*, 1,74* 4,56 dd (11,0; 4,5) – 1,42* 0,79*, 1,57* 1,08*, 1,31* 1,52 dd (12,0; 4,5) – – 1,11*, 1,98* 1,61* – – 1,28* 1,29*, 1,92* 1,58* 0,96 s 0,33 br.d (4,0); 0,57 br.d (4,0) 1,38* 0,88 d (7,0) 1,04*, 1,41* 1,86*, 2,03* 5,10 t (6,0) – 1,68 s 1,60 s 0,84 s 0,89 s 0,89 s

C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 HMBC (HC) 3, 5 1, 2, 28, 29 12, 13, 14, 17 5, 8

36,0 18,4 36,5 25,1 125,3 131,0 25,9 17,8 25,6 15,4 19,4 17, 20, 22 26, 27 24, 25, 27 24, 25, 26 3, 4 3, 4, 5 8, 13, 14, 15

20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 aĐo trong CDCl3, b125 MHz, c500 MHz, *tín hiệu chập.

a, c (J, Hz)

Bảng 4.3. Số liệu phổ NMR hợp phần acid béo của hợp chất AP2

a, b δC 173,8 35,0 25,2 29,1# 29,2# 29,6# 29,8 27,8 133,1 127,9 126,0 135,2 72,3 35,4 123,9 135,3 20,9 14,4

δH – 2,30* 1,61* 1,30* 1,30* 1,30* 1,36* 2,17 td (8,0; 7,0) 5,43 td (10,5; 8,0) 5,97 dd (11,5; 10,5) 6,51 dd (15,0; 11,5) 5,69 dd (15,0; 6,5) 4,20 m 2,33* 5,36 td (10,5; 8,0) 5,57 td (10,5; 7,5) 2,06 m 0,97 t (7,5) HMBC (HC) 1, 3, 4 9, 10 8, 11 8, 12 9, 13 10 13, 15, 16 17 14 15, 16 16, 17 C 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′ 7′ 8′ 9′ 10′ 11′ 12′ 13′ 14′ 15′ 16′ 17′ 18′ aĐo trong CDCl3, b125 MHz, c500 MHz, *tín hiệu chập; #giá trị có thể hoán đổi cho nhau.

Tín hiệu của nhóm oxymethine tại δC 80,5 được gán cho C-3 dựa trên tương

tác HMBC giữa H3-28 (δH 0,84)/H3-29 (δH 0,89) với C-3 (δC 80,5). Tương tự, tương

tác giữa H3-26 (δH 1,68)/H3-27 (δH 1,60) và C-24 (δC 125,4)/C-25 (δC 131,0) trên

phổ HMBC khẳng định vị trí của liên kết đôi tại C-24/C-25 trên mạch carbon. Dựa

vào phổ 1H-NMR và NOESY (Hình 4.13), cấu trúc tương đối của hợp phần

triterpene ở AP2 đã được xác định. Tương tác NOESY (Hình 4.4) giữa H-3 (δH

4,56) và H3-28 (δH 0,84)/H-5 (δH 1,42) cũng như hằng số tương tác giữa H-2 (δH

1,61, 1,74) và H-3 (J=11,0 Hz, 4,5 Hz) đề nghị định hướng  của H-3 và H-5. Từ

các dữ kiện trên cấu trúc của hợp phần triterpene của AP2 được xác định là

cycloartenol [80].

Dựa vào các tương tác trên phổ COSY và HMBC, vị trí của 3 liên kết đôi

cũng như nhóm hydroxyl của hợp phần acid béo được xác định lần lượt tại C-9/C-

10, C-11/C-12, C-15/C-16 và C-13 (Hình 4.3). Hằng số tương tác J = 10,5 Hz

giữa H-9 và H-10 đề nghị cấu hình Z của liên kết đôi tại C-9/C-10. Kết luận trên

được củng cố dựa vào tương tác chính giữa H-8 (δH 2,17) và H-11 cũng như sự

vắng mặt tương tác giữa H-8 và H-10, giữa H-9 và H-11 trên phổ NOESY.

Tương tự, hằng số tương tác J lớn (15,0 Hz) giữa H-11 và H-12 cùng với tương tác

H-10/H-12, H-11/H-13 và sự vắng mặt tương tác H-10/H-13 trên phổ NOESY

cho phép khẳng định cấu hình E của liên kết đôi tại C-11/C-12 (Hình 4.4). Ngoài

ra, cấu hình Z của liên kết đôi tại C-15/C-16 cũng được xác định dựa vào hằng số

tương tác 3JH-15/H-16 (10,5 Hz) cũng như sự vắng mặt tương tác giữa H-14 (δH 2,33)

và H-16, H-15 và H-17 (δH 2,06) trên phổ NOESY[122], [25]. Ngoài ra, tương tác

giữa H-3 với C-1 trên phổ HMBC chỉ ra nhóm chức ester gắn ở vị trí C-3 của hợp

phần triterpenoid. Điều này giải thích cho sự dịch chuyển của C-3 (δC 80,5) về phía

trường thấp so với giá trị tương ứng của cycloartenol (δC 78,9) [80]. Do sự khan

hiếm của mẫu nên cấu hình của C-13 chưa được thiết lập. Từ những lập luận trên,

cấu trúc hóa học của hợp chất AP2 được thiết lập là 3β-O-(13-hydroxy-

9Z,11E,15Z-octadecatrienoyl) cycloart-24-ene (Hình 4.2). Đây là một ester mới,

lần đầu tiên được phân lập từ tự nhiên. Hợp chất này được đặt tên là anopaniester.

Hình 4.2. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP2

Hình 4.3. Tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất AP2

Hình 4.4. Tương tác NOESY chính của hợp chất AP2

Hình 4.5. Phổ HRESIMS của hợp chất AP2

Hình 4.6. Phổ UV của hợp chất AP2

Hình 4.7. Phổ IR của hợp chất AP2

Hình 4.8. Phổ 1H-NMR của hợp chất AP2

Hình 4.9. Phổ 13C-NMR của hợp chất AP2

Hình 4.10. Phổ HMQC của hợp chất AP2

Hình 4.11. Phổ HMBC của hợp chất AP2

Hình 4.12. Phổ COSY của hợp chất AP2

Hình 4.13. Phổ NOESY của hợp chất AP2

Hợp chất AP3: (E)-Phytol

Hợp chất AP3 được tách ở dạng dầu, không màu. Píc ion giả phân tử tại m/z

319,2931 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho C20H40ONa là 319,2977) trên phổ

HRESIMS đề nghị CTPT của hợp chất này là C20H40O (DBE = 1).

Phổ 1H-NMR chỉ ra tín hiệu đặc trưng của 1 proton olefin tại δH 5,41; 1

nhóm oxymethylene tại δH 4,15; 5 nhóm methyl tại δH 0,86 (H3-16H3-19) và 1,67

(s, H3-20). Phổ 13C-NMR và HMQC chỉ ra tín hiệu của 20 carbon trong đó có một

số tín hiệu đặc trưng như 2 carbon olefin tại δC 123,2 (C-2), 140,4 (C-3); carbon

oxymethylene tại δC 59,5 (C-1). Các dữ kiện phổ HRESIMS, 1H-, 13C-NMR gợi ý

a, c

hợp chất AP3 là một diterpenoid.

a, b δC 59,5 123,2 140,4 40,0 25,3 36,8 32,8 37,6 24,6 37,5 32,9 37,4 24,9 39,5 28,1 22,9 22,8 19,9 19,8 16,3

#, a δC 59,4 123,1 140,3 39,9 25,1 36,7 32,7 37,4 24,5 37,4 32,8 37,3 24,8 39,4 28,0 22,7 22,6 19,7 19,7 16,2

Bảng 4.4. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP3 và hợp chất tham khảo HMBC (H→C) δH (J, Hz) 2, 3 4,15 d (7,0) 4, 20 5,41 t (7,0) – 2, 3, 5, 6, 20 1,99 1,20–1,55 1,35 1,43 1,11 1,20–1,55 1,11 1,43 1,11 1,20–1,55 1,19* 1,52 m 0,86 14, 15, 17 0,86 14, 15, 16 0,86 10, 11, 12 0,86 6, 7, 8 2, 3, 4 1,67 s C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 #δC của (E)-phytol [95], ađo trong CDCl3, b125 MHz, c500 MHz, *tín hiệu chập.

Phổ HMBC thể hiện các tương tác giữa H3-16/H3-17 và C-14 (δC 39,5)/C-15

(δC 28,1), giữa H3-18 và C-10 (δC 37,5)/C-11 (δC 32,9)/C-12 (δC 37,4), giữa H3-19

và C-6 (δC 36,8)/C-7 (δC 32,8)/C-8 (δC 37,6) cho phép định vị các methyl tại C-7, C-

11 và gem-dimethyl tại C-15. Tương tác HMBC giữa H-1 (δH 4,15)/H3-20 và C-

2/C-3 chứng tỏ nhóm hydroxyl tại C-1 và liên kết đôi -2 (Hình 4.15).

Cấu hình (E) của liên kết đôi được thiết lập thông qua việc so sánh giá trị độ

chuyển dịch hóa học của C-4 (δC 40,0), 3-Me (δC 16,3) với các giá trị tương ứng của

geraniol [(E): δC 39,7 (C-4), 16,0 (3-Me)] và nerol [(Z): δC 32,1 (C-4), 23,5 (3-Me)]

[27], [95].

Hình 4.14. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP3

Hình 4.15. Tương tác HMBC chính của hợp chất AP3

Từ các dữ kiện đã phân tích trên kết hợp việc đối chiếu với các giá trị tương

ứng của hợp chất tham khảo ở tài liệu [95], hợp chất AP3 được kết luận là (E)-phyt-

2-en-1-ol hay (E)-phytol (Hình 4.14).

Hợp chất AP4: Desmosterol Hợp chất AP4 được tách ở dạng bột trắng, mp 122–124oC. Píc ion giả phân

tử tại m/z 385,3513 [M+H]+ (tính toán lý thuyết cho C27H45O là 385,3470) trên phổ

HRESIMS đề nghị CTPT của hợp chất này là C27H44O (DBE = 6). Phổ 1H-NMR

chỉ ra tín hiệu đặc trưng của 2 proton olefin tại δH 5,06, 5,32; 1 nhóm oxymethine

tại δH 3,49; 5 nhóm methyl tại δH 0,65 (s, H3-18), 0,91 (d, J = 6,5 Hz, H3-21), 0,98

(s, H3-19), 1,57 (s, H3-27) và 1,65 (s, H3-26). Phổ 13C-NMR và HMQC chỉ ra tín

hiệu của 27 carbon gồm 5 nhóm methyl, 10 nhóm methylene, 8 nhóm methine và 4

carbon không mang hydro. Trong đó, sự hiện diện của 2 liên kết đôi được thể hiện

qua tín hiệu của 4 carbon olefin trong khoảng δC 121,7–140,9. Tín hiệu của carbon

oxymethine được quan sát tại δC 71,8. Các dữ kiện phổ 1H-, 13C-NMR gợi ý hợp

chất AP4 là một steroid khung cholestane.

#, a δC 37,20 31,62 71,78 42,26 140,71 121,70 31,86 31,86 50,06 36,47 21,05 39,72 40,26 56,71 24,27 28,19 56,01 11,83 19,38 36,06 18,60 35,58 24,67 125,19 130,94 25,72 17,63

a, c (J, Hz) δH 1,04*, 1,82* 1,47*, 1,81* 3,49 m 2,20*, 2,26*  5,32 1,92*, 1,98* 1,49*, 0,90*  1,41*, 1,48* 1,13*, 1,98*  0,97* 0,98*; 1,55* 1,24*; 1,83* 1,06* 0,65 s 0,98 s 1,38* 0,91 d (6,5) 1,34 m 1,82*; 1,98* 5,06 t (7,0) – 1,65 s 1,57 s

a, b δC 37,4 31,7 71,8 42,3 140,9 121,7 32,0 32,0 50,2 36,6 21,2 39,9 40,4 56,8 24,3 28,3 56,2 12,0 19,5 36,2 18,7 35,7 24,4 125,3 131,0 25,8 17,7

Bảng 4.5. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP4 và hợp chất tham khảo

HMBC (H→C) 3, 5 3 3, 5, 6  4, 8, 10  9, 14, 17  16 12, 13, 14, 17 1, 5, 9, 10 17, 20, 22 26, 27 – 24, 25, 27 24, 25, 26 C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 #δC của desmosterol [128], ađo trong CDCl3, b125 MHz, c500 MHz, *tín hiệu chập.

Phổ HMBC cho các tương tác giữa H3-18 (δH 0,65) và C-12 (δC 39,9)/C-13

(δC 42,4)/C-14 (δC 56,8)/C-17 (δC 56,2), giữa H3-19 (δH 0,98) và C-1 (δC 37,4)/C-5

(δC 140,9)/C-9 (δC 50,2)/C-10 (δC 36,6), giữa H3-21 (δH 0,91) và C-17/C-20 (δC

36,2)/C-22 (δC 35,7), giữa H3-26 (δH 1,65)/H3-27 (δH 1,57) và C-24 (δC 125,3)/C-25

(δC 131,0) xác nhận các nhóm methyl tại C-13, C-10, C-20, gem-dimethyl tại C-25

và liên kết đôi -5,24 (Hình 4.16b). Tương tác COSY giữa H-4 (δH 2,20, 2,26) và

H-3 (δH 3,49) cùng tương tác HMBC từ H-4 đến C-3 (δC 71,8)/C-5 (δC 140,9)/C-6

(δC 121,7) chứng tỏ nhóm hydroxyl định vị tại C-3. Do đó, hợp chất AP4 được xác

định sơ bộ là cholesta-5,24-dien-3-ol. Tương tác giữa H-3 và H-1a (δH 1,04) trên

phổ NOESY gợi ý định hướng -axial của chúng trong cấu dạng ghế của vòng A.

Cấu hình của C-20 được xác định là R thông qua việc so sánh giá trị độ chuyển dịch

hóa học của C-17 (δC 56,2), C-20 (δC 36,2), C-22 (δC 35,7), H3-21 (δH 0,91) với các

giá trị tương ứng của desmosterol [20R: C-17 (δC 56,01), C-20 (δC 36,06), C-22 (δC

35,57), H3-21 (δH 0,935)] và 20-epidesmosterol [20S: C-17 (δC 55,76), C-20 (δC

35,56), C-22 (δC 35,16), H3-21 (δH 0,838)] [128].

Các dữ liệu phổ NMR và hằng số vật lý cho phép thiết lập cấu trúc của hợp

chất AP4 là (3β,20R)-cholesta-5,24-dien-3-ol (desmosterol) (Hình 4.16a), hoàn toàn

phù hợp với các giá trị tương ứng đã được công bố trong công trình của Wen và

HMBC

COSY

cộng sự [128].

Hình 4.16. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC, COSY chính (b) của hợp chất AP4

Hợp chất AP5: Ursolic acid Hợp chất AP5 được tách ra ở dạng bột màu trắng, mp 284–286oC. Phổ ESIMS

cho các píc ion tại m/z 479,2 [M+Na]+, 455,2 [M-H]-. Kết hợp với dữ kiện phổ 13C-

NMR và DEPT, CTPT của AP5 được đề nghị là C30H48O3 (M = 456 g/mol). Phổ IR

gợi ý sự hiện diện của nhóm hydroxyl (3433 cm-1), carbonyl (1690 cm-1) và liên kết

đôi (1458 cm-1). Phổ 1H-NMR của hợp chất AP5 thể hiện tín hiệu của 5 nhóm

methyl bậc ba tại δH 0,78 s, 0,81 s, 0,93 s, 0,98 s, 1,09 s và 2 nhóm methyl bậc hai

tại δH 0,86 (d, J = 6,5 Hz), 0,95 (d, J = 6,0 Hz). Ngoài ra, tín hiệu 1 nhóm

oxymethine tại δH 3,20 (1H, dd, J = 10,0, 6,0 Hz, H-3) và 1 proton olefin tại δH 5,24

(1H, br.s, H-12) cũng được ghi nhận. Căn cứ vào hằng số tương tác của proton

thuộc nhóm oxymethine với 2 proton của nhóm methylene bên cạnh (J1 = Jae = 6,0

Hz; J2 = Jaa = 10,0 Hz) cho phép xác định định hướng -axial của proton này trong

cấu dạng ghế của vòng A thuộc khung triterpene. Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp

chất AP5 chỉ ra tín hiệu của 30 carbon gồm 7 nhóm methyl, 9 nhóm methylene, 7

nhóm methine và 7 carbon không mang hydro. Trong đó, tín hiệu tại δC 180,8 (C-

28) được gán cho nhóm carboxyl; tín hiệu tại δC 138,3 (C-13) và 125,6 (C-12) được

gán cho nối đôi 3 lần thế, tín hiệu tại δC 79,0 (C-3) thuộc về nhóm oxymethine.

a, c (J, Hz)

a, b δC 38,8 27,0 79,0 38,7 55,3 18,4 33,1 39,6 47,7 37,0 23,4 125,6 138,3 42,1 28,1 24,3 47,9 52,9 39,2 39,0 30,8 36,9 28,1 15,5 15,7 17,1 23,6 180,8 17,0 21,2

#, a δC 38,9 27,1 79,0 39,0 55,6 18,6 33,4 39,8 47,9 37,2 23,6 125,8 138,5 42,4 29,9 24,5 48,1 53,2 39,4 39,2 30,9 37,1 28,3 15,6 15,8 17,2 23,7 180,8 17,1 21,3

δH 3,20 dd (10,0; 6,0)    5,24 br.s    2,19 d (11,5) 0,98 s 0,81 s 0,78 s 0,93 s 1,09 s  0,95 d (6,5) 0,86 d (6,0)

DEPT CH2 CH2 CH C CH CH2 CH2 C CH C CH2 CH C C CH2 CH2 C CH CH CH CH2 CH2 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 C CH3 CH3

C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 #δC của ursolic acid [87], ađo trong CDCl3&CD3OD, b125 MHz, c500 MHz.

Bảng 4.6. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP5 và hợp chất tham khảo

COOH

Hình 4.17. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP5

Các dữ kiện phổ 1D-NMR (Bảng 4.6) cho phép dự đoán hợp chất AP5 là một

triterpene acid khung ursane. Kết hợp so sánh với hợp chất tham khảo ở tài liệu

[87], hợp chất AP5 được xác định là 3β-hydroxy-urs-12-en-28-oic acid (còn gọi là

ursolic acid) (Hình 4.17).

Hợp chất AP6: Vanillin Hợp chất AP6 được tách ra ở dạng bột màu trắng. Phổ ESIMS cho các píc ion

tại m/z 175,0 [M+Na]+. Kết hợp với dữ kiện phổ 13C-NMR và DEPT, CTPT của

AP6 được đề nghị là C8H8O3 (M = 152 g/mol). Phổ 1H-NMR của hợp chất AP6 chỉ

ra các tín hiệu proton đặc trưng sau: 1 nhóm formyl (-CHO) tại δH 9,77 (1H, s, H-7); 1

nhân benzene thế 1,3,4 tại δH 6,96 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5), 7,46 (1H, dd, J = 8,0,

2,0Hz, H-6), 7,47 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2) và một nhóm methoxy tại δH 3,94 (s, H3-8).

Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất này chỉ ra tín hiệu của 8 carbon: 1 nhóm

carbonyl tại δC 192,9 (C-7), 1 nhóm methoxy tại δC 56,4 (C-8), 6 carbon nhân benzene

H3CO

tại δC 130,7 (C-1), 111,4 (C-2), 149,7 (C-3), 154,7 (C-4), 116,3 (C-5) và 127,9 (C-6).

Hình Cấu trúc hóa học của hợp chất AP6 4.18.

b, d (J (Hz)

b, c δC 130,7 111,4 149,7 154,7 116,3 127,9 192,9 56,4

#, a δC 129,8 110,0 148,1 152,7 115,1 126,1 190,1 55,4

Bảng 4.7. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP6 và hợp chất tham khảo

DEPT C CH C C CH CH CH CH3 δH C 1  7,47 d (2,0) 2 3  4  6,96 d (8,0) 5 7,46 dd (8,0; 2,0) 6 9,77 s 7 8 3,94 s #δC của vanillin [131], ađo trong acetone-d6 ,bđo trong CD3OD, c125 MHz, d500 MHz

Các dữ liệu phổ đã nêu (Bảng 4.7) kết hợp với hợp chất tham khảo ở tài liệu

[131] cho phép khẳng định hợp chất AP6 là 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde

(còn gọi là vanillin) (Hình 4.18).

Hợp chất AP7: Esculentic acid Hợp chất AP7 được tách ở dạng bột trắng, mp 267–268oC. Píc ion giả phân

tử tại m/z 511,3390 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho C30H48O5Na là 511,3399) trên

phổ HRESIMS đề nghị CTPT của hợp chất này là C30H48O5 (DBE = 7).

Phổ 1H-NMR chỉ ra các tín hiệu đặc trưng của 1 proton olefin tại δH 5,47; 2

proton của nhóm carbinol tại δH 4,28 (br.d, J = 11,0 Hz, H-2), 4,16 (br.s, H-3); 2

proton của nhóm oxymethylene tại δH 3,76 (d, J = 10,5 Hz, H-23a) và 3,93 (d, J =

10,5 Hz, H-23b). Ngoài ra, tín hiệu của 4 nhóm methyl singlet tại δH 0,87, 1,00, 1,07,

1,14 và 2 nhóm methyl doublet (J = 6,5 Hz) tại δH 0,93 và 0,96 cũng được ghi nhận.

Phổ 13C-NMR và HMQC chỉ ra 30 tín hiệu carbon, thuộc về 6 nhóm methyl,

9 nhóm methylene, 8 nhóm methine và 7 carbon không mang hydro. Trong đó có

một số tín hiệu đặc trưng như carbon carboxyl tại δC 180,5 (C-28), 2 carbon olefin

tại δC 126,0 (C-12), 139,8 (C-13), 3 carbon sp3 liên kết với oxy tại δC 66,7 (C-2),

79,3 (C-3) và 71,7 (C-23). Các dữ kiện trên chứng tỏ AP7 là một ursenoic acid.

Các tương tác HMBC giữa H-18 (δH 2,61)/H3-27 (δH 1,14) và C-13, giữa H-

12 (δH 5,47) và C-14 (δC 43,1)/C-18 (δC 54,0) xác nhận vị trí của liên kết đôi -12.

Ngoài ra, tương tác HMBC giữa H-16 (δH 1,96, 2,08)/H-22 (δH 1,98)/H-18 và C-28

thiết lập vị trí của nhóm carboxyl tại C-17. Trong khi đó, tương tác HMBC giữa H-

23 (δH 3,76, 3,93)/H3-24 (δH 0,87) và C-3/C-4 (δC 40,6)/C-5 (δC 44,0) cho phép gán

vị trí của 2 nhóm hydroxyl tại C-3 và C-23. Tương tác COSY H-2/H-3 và tương tác

HMBC H-2/C-3 cho phép định vị nhóm hydroxyl còn lại tại C-2 (Hình 4.19b).

#,a

a,b

a,c (J, Hz)

Bảng 4.8. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP7 và hợp chất tham khảo

C 1 δC 42,7 δC 43,2 HMBC (HC) 2, 9, 25

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 66,1 78,7 40,0 43,9 18,2 33,1 41,8 47,9 38,3 23,7 125,5 139,3 42,5 28,6 24,8 47,9 53,5 66,7 79,3 40,6 44,0 18,8 33,7 42,4 48,5 38,9 24,4 126,0 139,8 43,1 29,1 25,4 48,5 54,0 δH 1,81 dd (12,0; 11,0) 1,95* 4,28 br.d (11,0) 4,16 br.s – 2,05* 1,37*, 1,59 m 1,35*, 1,73 m – 1,95* – 1,96*, 2,07* 5,47 br.s – – 1,18*, 2,33 m 1,96*, 2,08* – 2,61 d (11,0)

19 20 21 22 23 39,4 39,4 31,0 37,4 71,2 39,9 39,9 31,6 38,0 71,7

#δC

1,43 m 0,99* 1,47*, 2,03* 1,98* 3,76 d (10,5) 3,93 d (10,5) 0,87 s 1,00 s 1,07 s 1,14 s – 0,96 d (6,5) 0,93 d (6,5) 3 4, 5, 23, 24 – 8, 10 – – 12, 13 9, 11, 14, 18 – – 28 – 12, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 28, 29 28 3, 4, 5, 24 3, 4, 5, 24 3, 4, 5, 23 1, 5, 9, 10 7, 8, 9, 14 8, 13, 14, 15 – 18, 19, 20 19, 20, 21 17,7 18,0 18,0 24,2 180,5 18,3 21,9 17,1 17,4 17,5 23,8 179,8 17,7 21,3 24 25 26 27 28 29 30 của esculentic acid [89], ađo trong C5D5N, b125 MHz, c500 MHz, *tín hiệu chập.

Hóa lập thể của hợp chất AP7 được thiết lập dựa vào việc phân tích phổ

NOESY. Tương tác NOESY giữa H-2 và H-24/H-25 chứng tỏ định hướng β-axial

của cả H-2, Me-24, Me-25 trong cấu dạng ghế của vòng A. Tương tác giữa H-3 và

H3-24 chỉ rõ định hướng β-equatorial của H-3. Tương tự, tương tác NOESY giữa H-

18 và H3-29 cùng sự vắng mặt tương tác giữa H-18 và H3-27 cho phép thiết lập cấu

COOH

COOH HO

HMBC

COSY

hình β của H-18 (Hình 4.20).

29 CH3

COOH

CH3

24 CH3

H3C

CH3

HOH2C

Hình 4.19. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC, COSY chính (b) của hợp chất AP7

Hình 4.20. Tương tác NOESY chính của hợp chất AP7

Các dữ kiện trên cho phép kết luận cấu trúc của hợp chất AP7 là 2,3,23-

trihydroxyurs-12-en-28-oic acid [71]. Hợp chất này còn được gọi là esculentic acid.

Đáng lưu ý, esculentic acid cũng là tên của một hợp chất khác (3β,23-dihydroxy-olean-

12-en-28,30-dioic acid) được tách ra lần đầu tiên từ loài Phytolacca esculenta [130].

Hợp chất AP8: Kaempferol-3-O-rutinoside Hợp chất AP8 được tách ra ở dạng bột màu vàng, mp 188–190oC. Phổ UV

(MeOH) chỉ ra các cực đại hấp thụ đặc trưng cho các dẫn xuất kaempferol glycoside

tại λ 267 và 351 nm [123]. Phổ IR (KBr) gợi ý sự hiện diện của nhóm hydroxyl

(3410 cm-1), carbonyl (1659 cm-1), nhân thơm (1605, 1566, 1497 cm-1) và ether

(1180, 1065 cm-1). Phổ ESIMS của hợp chất này cho các píc cơ bản tại m/z 617,1

[M+Na]+, 593,1 [M-H]-. Kết hợp với các dữ kiện phổ 13C-NMR và DEPT, công

thức phân tử của AP8 được đề nghị là C27H30O15 (M = 594 g/mol). Phổ 1H-NMR

của hợp chất AP8 chỉ ra các tín hiệu đặc trưng của khung flavone: 2 proton meta

thuộc vòng A tại δH 6,40 (s, H-8), 6,22 (s, H-6); 4 proton thơm của vòng B thế 1,4

tại δH 8,07 (d, J = 8,5 Hz, H2-2/6) và 6,90 (d, J = 8,5 Hz, H2-3/5). Tín hiệu của 2

proton anomer tại δH 5,14 (d, J = 7,5 Hz, H-1), 4,54 (s, H-1‴) gợi ý sự hiện diện

của 2 đơn vị đường có cấu hình β, α tương ứng. Ngoài ra, tín hiệu 1 nhóm methyl

bậc hai tại δH 1,15 (d, J = 6,5 Hz, H3-6‴) cũng được ghi nhận.

a, c

#, a

(J, Hz)

Bảng 4.9. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP8 và hợp chất tham khảo

a, b δC 159,4d 135,5 179,4 162,9 100,0 165,9 94,9 158,5d 105,6 122,7 132,4 116,1 161,4 116,1 132,4 104,7 75,7 78,1 71,4 77,2 68,6 102,4 72,1 72,3 73,9 69,7 17,9

δC 158,5 135,5 179,4 163,0 100,0 166,0 94,9 159,4 105,6 122,7 132,3 116,1 161,4 116,1 132,3 104,6 75,7 78,1 71,4 77,2 68,5 102,4 72,3 72,1 73,9 69,7 17,9 δH – – – – 6,22 s – 6,40 s – – – 8,07 d (8,5) 6,90 d (8,5) – 6,90 d (8,5) 8,07 d (8,5) 5,14 d (7,5) 3,48* 3,46* 3,29* 3,38* 3,83 d (10,0); 3,41* 4,54 s 3,67 br.s 3,55 dd (9,5; 3,0) 3,33* 3,48* 1,15 d (6,5) HMBC (H→C) 5, 7, 8, 10 6, 7, 9, 10 2, 3′, 4′, 6′ 1′, 2′, 4′, 5′ 1′, 2′, 4′, 5′ 2, 3′, 4′, 6′ 3, 2′′, 3′′ 6′′, 5′′′, 3′′′ 4′′′ DEPT C C C C CH C CH C C C CH CH C CH CH CH CH CH CH CH CH2 CH CH CH CH CH CH3

C 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′ 1′′ 2′′ 3′′ 4′′ 5′′ 6′′ 1′′′ 2′′′ 3′′′ 4′′′ 5′′′ 6′′′ #δC của kaempferol-3-O-rutinoside [64], ađo trong CD3OD, b125 MHz, c500 MHz, dgiá trị được gán lại bằng phổ 2D-NMR, *tín hiệu chập.

Hình 4.21. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC, COSY chính (b) của hợp chất AP8

Phổ 13C-NMR và DEPT chỉ ra tín hiệu của 27 carbon, gồm 1 nhóm methyl, 1

nhóm methylene, 16 nhóm methine và 9 carbon không mang hydro. Trong đó, 15

carbon được gán cho khung flavone và 12 carbon còn lại được gán cho 2 đơn vị

đường hexose. Các tín hiệu carbon tại δC 104,7 (C-1), 75,7 (C-2), 78,1 (C-3),

71,4 (C-4), 77,2 (C-5) và 68,6 (C-6) chỉ ra sự có mặt của một đơn vị β-D-

glucopyranosyl. Trong khi đó, tín hiệu tại δC 102,4 (C-1‴), 72,3 (C-2‴), 72,1 (C-

3‴), 73,9 (C-4‴), 69,7 (C-5‴) và 17,9 (C-6‴) gợi ý đơn vị đường còn lại là α-L-

rhamnopyranosyl [75]. Các tín hiệu phần đường được xác nhận bằng việc phân tích

chi tiết phổ 2D-NMR. Ngoài ra, tương tác HMBC giữa H-1‴ (δH 4,54) với C-6 (δC

68,6) cùng với sự dịch chuyển về phía trường thấp của C-6 so với giá trị thông

thường của β-D-glucopyranose [99] chứng tỏ trật tự liên kết của mạch đường là α-L-

rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside.Các tương tác HMBC giữa H-6/H-8

và C-7 (δC 165,9)/C-10 (δC 105,6), giữa H-6 và C-5 (δC 162,9), giữa H-8 và C-9 (δC

158,5), giữa H-2/6 và C-4 (δC 161,4)/C-2 (δC 159,4), giữa H-3/5 và C-1 (δC

122,7), cùng các tương tác COSY H-2′/H-3′ và H-5′/H-6′ cho phép thiết lập cấu trúc

của phần aglycone là kaempferol [18]. Đặc biệt, tương tác HMBC giữa H-1 (δH

5,14) với C-3 (δC 135,5) khẳng định vị trí liên kết của phần đường tại C-3 của khung

flavone. Từ các dữ liệu phổ trên cùng với việc so sánh với hợp chất tham khảo [64],

cấu trúc hóa học của AP8 được kết luận là kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-

(1→6)-β-D-glucopyranoside (còn gọi là kaempferol-3-O-rutinoside) (Hình 4.21a).

Hợp chất AP9: Rutin Hợp chất AP9 được tách ra ở bột màu vàng, mp 193–195oC. Phổ UV

(MeOH) chỉ ra các cực đại hấp thụ tại λ 257 và 357 nm. Phổ IR (KBr) cho biết sự

hiện diện của nhóm hydroxyl (3418 cm-1), carbonyl (1651 cm-1), nhân thơm (1605,

1504 cm-1) và ether (1204, 1065 cm-1). Từ các píc cơ bản tại m/z 633,1 [M+Na]+,

609,1 [M-H]- trên phổ ESIMS và các dữ kiện phổ 13C-NMR, CTPT của AP9 được

xác định là C27H30O16 (M = 610 g/mol).

Phổ 1H-NMR đo trong CD3OD của hợp chất này chỉ ra các tín hiệu đặc trưng

của khung flavonoid: 2 proton meta của vòng A tại δH 6,42 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-8),

6,23 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6); 3 proton thơm của vòng B thế 1,3,4 tại δH 6,90 (1H,

d, J = 8,5 Hz, H-5′), 7,65 (1H, dd, J = 2,0, 8,5 Hz, H-6′) và 7,69 (1H, d, J = 2,0 Hz,

H-2′). Ngoài ra, tín hiệu của 2 proton anomer tại δH 5,13 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1′′)

và 4,54 (1H, s, H-1′′′) gợi ý sự hiện diện của 2 đơn vị monosaccharide với cấu hình

β, α tương ứng; 1 nhóm methyl bậc hai tại δH 1,15 (d, J = 6,5 Hz, H3-6′′′). Phổ 13C-

NMR và DEPT chỉ ra tín hiệu của 27 carbon, gồm 1 nhóm methyl, 1 nhóm

3' '

1''

5''

HMBC

1'''

6' ''

3'' '

COSY

methylene, 15 nhóm methine và 10 carbon không mang hydro.

Hình 4.22. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC, COSY chính (b) của hợp chất AP9

#, a

a, c

(J, Hz)

Bảng 4.10. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP9 và hợp chất tham khảo

a, b δC 159,3d 135,6 179,4 162,9 99,9 166,0 94,9 158,5d 105,6 123,1 117,7 145,8 149,8 116,1 123,1 104,7 75,7 78,2 71,4 77,2 68,5

C 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′ 1′′ 2′′ 3′′ 4′′ 5′′ 6′′ δC 158,2 134,5 178,4 162,5 99,7 166,6 94,9 158,9 105,3 122,8 117,4 144,3 150,2 115,5 122,5 103,6 74,6 77,8 71,1 78,1 68,4 HMBC (H→C) 5, 7, 8, 10 6, 7, 9, 10 2, 3′, 4′, 6′ 1′, 3′, 4′, 6′ 2, 1′, 2′, 4′, 5′ 3, 2′′, 3′′

DEPT δH – C – C – C – C 6,23 d (2,0) CH – C 6,42 d (1,5) CH – C – C – C 7,69 d (2,0) CH – C – C 6,90 d (8,5) CH 7,65 dd (8,5; 2,0) CH 5,13 d (7,5) CH 3,51* CH 3,42* CH 3,30* CH 3,34* CH 3,83 dd (10,5; 1,5); CH2 3,41* 4,54 br.s 3,66 dd (3,5; 1,5) 3,55 dd (9,5; 3,5) 3,33* 3,48* 1,15 d (6,5) 101,9 71,3 72,1 73,7 68,9 18,8 102,4 72,1 72,2 73,9 69,7 17,9 6′′, 5′′′, 3′′′ 4′′′ CH CH CH CH CH CH3

1′′′ 2′′′ 3′′′ 4′′′ 5′′′ 6′′′ #δC của quercetin-3-O-rutinoside [64], ađo trong CD3OD, b125 MHz, c500 MHz, dgiá trị được gán lại bằng phổ 2D-NMR, * tín hiệu chập. Nhìn chung, dữ kiện phổ 1H-, 13C-NMR của hợp chất AP9 (Bảng 4.10) rất

giống với các giá trị tương ứng của AP8, gợi ý sự tương đồng về cấu trúc giữa

chúng. So với AP8, hợp chất AP9 có nhóm hydroxyl tại C-3. Điều này được thể

hiện qua sự dịch chuyển mạnh về phía trường thấp của C-3 cũng như sự dịch

chuyển theo chiều ngược lại của C-2, C-4 và C-6. Sự xuất hiện tín hiệu của 3

proton thơm vòng B thế 1,3,4 tại δH 6,90 (d, J = 8,5 Hz, H-5), 7,65 (dd, J = 8,5, 2,0,

Hz, H-6) và 7,69 (d, J = 2,0 Hz, H-2) cũng phù hợp với đề nghị trên.

Việc gán ghép giá trị δH, δC cho toàn bộ phân tử và xác nhận lại cấu trúc của

AP9 được thực hiện bằng phổ 2D-NMR. Từ các lập luận trên, hợp chất AP9 được

xác định là quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside (còn

gọi là rutin) (Hình 4.22) [64].

Hợp chất AP10: Anopanin A (Chất mới) Hợp chất AP10 được tách ra dưới dạng bột trắng. Phổ HRESIMS (Hình 4.23)

của hợp chất này chỉ ra píc ion giả phân tử tại m/z 1025,5294 [M+Na]+ (tính toán cho

công thức C50H82O20Na là 1025,5297). Kết hợp với phân tích phổ NMR, CTPT của

hợp chất AP10 được xác định là C50H82O20. Phổ IR (Hình 4.24) chỉ ra các dải hấp thụ

mạnh ứng với nhóm carbonyl (1713 cm-1), liên kết đôi (1632 cm-1), ether (1010, 1070

cm-1) và hydroxyl (3418 cm-1). Phổ 1H-NMR (Hình 4.25) của AP10 trong C5D5N

cho thấy các tín hiệu đặc trưng của 7 nhóm methyl singlet tại δH 1,13 (H3-29), 1,25

(H3-30), 1,30 (H3-28), 1,57 (H3-18), 1,66 (H3-27), 1,67 (H3-26) và 1,69 (H3-21); 1

nhóm acetoxy tại δH 2,06 (3H, s); 3 proton anomer tại δH 4,86 (1H, d, J = 7,2 Hz),

5,16 (1H, d, J = 7,8 Hz) và 5,41 (1H, d, J = 7,8 Hz) đề nghị sự có mặt của ba đơn vị

đường. Ngoài ra, hai proton methylene của nhóm cyclopropyl tại δH 0,22 (1H, d, J =

4,2 Hz, H-19a) và 0,49 (1H, d, J = 4,2 Hz, H-19b) cũng được ghi nhận.

Phân tích phổ 13C-NMR (Hình 4.26), DEPT (Hình 4.27) và HMQC (Hình

4.28) chỉ ra 50 tín hiệu trong đó 30 tín hiệu carbon được gán cho hợp phần aglycone,

18 tín hiệu thuộc về 3 đơn vị đường hexose và 2 tín hiệu đặc trưng của nhóm acetoxy

(δC 171,2 và 22,0). Các dữ kiện phổ NMR gợi ý hợp phần aglycone sở hữu bộ khung

cycloartane với 2 carbon olefin của liên kết đôi ba lần thế (δC 125,1 và 132,5), 3

nhóm oxymethine (δC 77,2, 79,0 và 89,4), 1 carbon bậc ba mang oxy (δC 76,7), 7

nhóm methyl (δC 15,8, 18,6, 20,7, 21,2, 21,7, 26,2 và 26,4). Việc gán ghép đầy đủ

cho tất cả proton và carbon được thực hiện qua phân tích chi tiết phổ HMQC, HMBC

và COSY (Hình 4.28–Hình 4.30). Cụ thể, tương tác HMBC giữa H3-28 (δH 1,30)/H3-

29 (δH 1,13) và C-3 (δC 89,4)/C-4 (δC 41,7)/C-5 (δC 48,1) xác nhận vị trí của nhóm

oxymethine (C-3) và nhóm gem-dimethyl ở C-4 trong cấu trúc của vòng A. Tương tự,

tương tác HMBC giữa H3-21 (δH 1,69) và C-17 (δC 56,5)/C-20 (δC 76,7)/C-22 (δC

79,0), giữa H3-26 (δH 1,67)/H3-27 (δH 1,66) và C-24 (δC 125,1)/C-25 (δC 132,5) giúp

thiết lập vị trí của hai nhóm hydroxyl tại C-20, C-22 cũng như liên kết đôi tại C-24/C-

25 của mạch nhánh. Hơn nữa, nhóm acetoxy tại C-16 (δC 77,2) được xác nhận thông

qua tương tác HMBC giữa H-16 (δH 6,20) và carbon của nhóm carboxyl tại δC 171,2

(Hình 4.29). Từ các dữ kiện trên cấu trúc phần aglycone được xác định là 16-

acetoxy-3,20,22-trihydroxycycloart-24-ene.

Hình 4.23. Phổ HRESIMS của hợp chất AP10

Hình 4.24. Phổ IR của hợp chất AP10

Hình 4.25. Phổ 1H-NMR của hợp chất AP10

Hình 4.26. Phổ 13C-NMR của hợp chất AP10

Hình 4.27. Phổ DEPT của hợp chất AP10

Hình 4.28. Phổ HMQC của hợp chất AP10

Hình 4.29. Phổ HMBC của hợp chất AP10

Hình 4.30. Phổ COSY của hợp chất AP10

Hình 4.31. Phổ ROESY của hợp chất AP10

Hóa lập thể của hợp phần aglycone của AP10 được thiết lập chủ yếu dựa vào

dữ liệu phổ ROESY (Hình 4.31) cũng như phân tích hằng số tương tác J. Theo đó,

tương tác ROESY giữa H-3 (δH 3,38) với H-1 (δH 1,43)/H-5 (δH 1,26)/H3-28, giữa

H-2 (δH 1,84) và H3-29 đề nghị định hướng  cho H-3, H-5 và H3-28 cũng như cấu

dạng ghế của vòng A (Hình 4.34). Thêm vào đó, giá trị J (11,4 và 4,2 Hz) giữa H-3

và H-2 (δH 1,84, 2,27) là đặc trưng cho H-3/axial của các triterpenoid khung

cycloartane [56]. Tương tác ROESY giữa H-16 và H3-18/H-22 (δH 3,92), giữa H-17

(δH 3,19) và H3-30 (δH 1,25) và sự vắng mặt tương tác giữa H-16 và H3-30 (δH 1,25)

chứng tỏ định hướng của nhóm 16-OAc và H-17. Cấu hình tuyệt đối của C-20

được xác định là R dựa vào tương tác ROESY giữa H3-21 và H-12 (δH 1,91)/H-17,

giữa 20-OH (δH 5,61) và H-16/H3-18 cũng như sự vắng mặt tương tác giữa H3-21 và

H3-18, giữa 20-OH và H-17 [26]. Lập luận này cũng được củng cố thông qua việc

so sánh độ chuyển dịch hóa học của C-21 (δC 21,7) với các giá trị tương ứng của 4

đồng phân lập thể của 5-cholestane-3,20,22-triol [δC-21: 21,1 (20R,22R), 21,9

(20R,22S), 23,8 (20S,22S), 24,2 (20S,22R)] [98]. Cấu hình tuyệt đối của C-22 được

suy luận bằng cách so sánh các giá trị δC của C-20 và C-22 của AP10 với các dạng

20R,22R và 20R,22S (trong C5D5N) của một số chất có cấu trúc tương tự. Trên phổ

13C-NMR của các hợp chất có cấu hình 20R,22R như cholestane-3β,20R,22R-triol

[48], vitexirone [67], frondoside A7-3, frondoside A7-4 [113] và stachysterone C

[74], giá trị δC của C-20 và C-22 khá gần nhau (δC < 0,4 ppm). Trái lại, các giá trị

δC này khác nhau khoảng 2 ppm ở cấu hình 20R,22S [48], [113]. Giá trị δC của C-20

và C-22 trên phổ 13C-NMR của AP10 lần lượt là 76,7 và 79,0 ppm (δC=2,3 ppm)

cho phép đề nghị cấu hình 20R,22S của AP10. Điều này được củng cố nhờ tương

tác ROESY giữa 22-OH (δH 5,64) với H3-21/H-23 (δH 2,58), giữa H-22 với H-16

và sự vắng mặt tương tác giữa 22-OH với H-16/20-OH/H-23β (δH 2,93) [90], [120].

Hình 4.32. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP10

Hình 4.33. Tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất AP10

Hình 4.34. Tương tác ROESY chính của hợp chất AP10

Thành phần monosaccharide của hợp chất AP10 được xác định là D-glucose

theo phương pháp đã mô tả ở mục 2.2.2. Theo đó, sắc ký đồ GC-MS cho một píc

duy nhất với tR 26,65 phút (Hình 4.35) trùng với dẫn xuất alditol hexaacetate của D-

glucose chuẩn (Sigma-Aldrich). Kết luận này được củng cố nhờ vào sự tương đồng

các giá trị phổ 13C-NMR của phần đường với các giá trị tương ứng của hợp chất

shatavarin IX [3-O-{[-D-glucopyranosyl(1→2)][-D-glucopyranosyl(1→4)]--D-

glucopyranosyl}-(25S)-5-spirostan-3-ol] [47]. Hơn nữa, các tương tác HMBC từ

H-1 (δH 5,41) đến C-2 (δC 82,2), từ H-1′′′ (δH 5,16) đến C-4 (δC 81,6) cho phép

thiết lập trật tự liên kết của các đơn vị đường là [β-D-glucopyranosyl(1→2)][β-D-

glucopyranosyl(1→4)]-β-D-glucopyranosyl (Hình 4.33). Ngoài ra, các tương tác

HMBC giữa H-1′ (δH 4,86) với C-3 (δC 89,4) và giữa H-3 (δH 3,38) với C-1′ (δC

105,1) khẳng định vị trí của phần đường tại C-3 của khung cycloartane.

Hình 4.35. Sắc ký đồ GC-MS của dẫn xuất alditol hexaacetate của hợp chất AP10

Bảng 4.11. Số liệu phổ NMR phần aglycone của hợp chất AP10

a, b δC 32,5 30,3 89,4 41,7 48,1 21,5 26,9 47,9 19,6 26,8 27,5 34,2 48,2 48,2 46,2

C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 HMBC (H→C) 2, 5 5, 10 11, 13, 14, 18 13, 14, 16, 30 DEPT CH2 CH2 CH C CH CH2 CH2 CH C C CH2 CH2 C C CH2

16 16-OAc

a, c (J, Hz) δH 1,10 m; 1,43 m 1,84 m; 2,27 m 3,38 dd (11,4; 4,2) – 1,26* 0,68 q (12,6); 1,51* 1,07*; 1,23* 1,52* – 1,12*; 2,06* 1,91*; 1,92* – – 1,62 br.d (13,8) 2,17 dd (14,4; 8,4) 6,20 dd (7,8; 7,2) – 2,06 s 3,19 d (6,6) 1,57 s 0,22 d (4,2) 0,49 d (4,2) – 5,61 s 1,69 s 3,92* 5,64* 2,58 m; 2,93 m 5,65* – 1,67 s 1,66 s 1,30 s 1,13 s 1,25 s

17 18 19 77,2 171,2 22,0 56,5 21,2 30,7 CH C CH3 CH CH3 CH2

13, 14, CH3COO- CH3COO- 13, 14, 16 12, 13, 14, 17 1, 11 10, 11 17, 20 17, 20, 22 17, 23, 24 26, 27 24, 25, 27 24, 25, 26 3, 4, 29 3, 4, 5, 28 8, 13, 14, 15 76,7 – 21,7 79,0# – 31,0 125,1 132,5 26,4 18,6 26,2 15,8 20,7 C – CH3 CH – CH2 CH C CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 20 20-OH 21 22 22-OH 23 24 25 26 27 28 29 30 ađo trong C5D5N, b150 MHz, c600 MHz, *tín hiệu chập; #tín hiệu xác định bằng phổ HMQC.

Bảng 4.12. Số liệu phổ NMR phần đường của hợp chất AP10 và chất tham khảo

#,a

a,b

a,c (J, Hz)

C DEPT δC δC δH

HMBC (HC)

101,7 81,4 76,6 81,4 76,3 62,0 105,1 82,2 77,1 81,6 76,5 62,6 3 4,86 d (7,2) 4,29* 4,30* 4,25* 3,83 m 4,49*; 4,53* CH CH CH CH CH CH2

105,5 77,1 77,9 72,1 78,6 63,0 106,0 77,6 78,6 72,4 78,7 63,3 2, 2′′ 5,41 d (7,8) 4,10* 4,23* 4,32* 3,93* 4,48*; 4,52* CH CH CH CH CH CH2

# phần đường của shatavarin IX [47], ađo trong C5D5N, b150 MHz, c600 MHz, glc: -D-glucopyranosyl,

105,0 75,1 78,5 71,6 78,5 62,3 105,4 75,3 78,4 71,9 78,9 62,7 CH CH CH CH CH CH2 4 5,16 d (7,8) 4,09* 4,25* 4,24* 4,00 m 4,31*; 4,54*

3-Glc 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′ 2-Glc 1′′ 2′′ 3′′ 4′′ 5′′ 6′′ 4-Glc 1′′′ 2′′′ 3′′′ 4′′′ 5′′′ 6′′′ δC *tín hiệu chập Từ các bằng chứng trên, cấu trúc hóa học của hợp chất AP10 được thiết lập

là (3,16,20R,22S)-16-acetoxy-20,22-dihydroxycycloart-24-ene 3-O-[-D-

glucopyranosyl-(1→2)][-D-glucopyranosyl-(1→4)]--D-glucopyranoside (Hình

4.32). Đây là một saponin mới, được đặt tên là anopanin A.

Hợp chất AP11: Anopanin B (Chất mới) Hợp chất AP11 được tách ra dưới dạng bột trắng. Phổ HRESIMS (Hình 4.36)

của hợp chất này chỉ ra píc ion giả phân tử tại m/z 1027,5452 [M+Na]+ (tính toán cho

công thức C50H84O20Na là 1027,5454). Kết hợp với phân tích phổ NMR (Hình 4.39,

Hình 4.40), CTPT của hợp chất AP11 được xác định là C50H84O20. Phổ IR (Hình

4.37) chỉ ra các dải hấp thụ tương ứng với nhóm ester (1730 cm-1), liên kết đôi (1647

cm-1), ether (1028, 1074 cm-1) và hydroxyl (3443 cm-1).

Phổ 1H- (Hình 4.38) và 13C-NMR (Hình 4.39) của hợp chất AP11 nhìn

chung tương tự với hợp chất AP10, ngoại trừ các tín hiệu của mạch nhánh tại C-17.

Cấu trúc của mạch nhánh được gán trước hết bằng cách so sánh dữ kiện phổ 13C-

NMR của nó với các giá trị tương ứng của hợp chất cyclounifolioside A [70] và

cyclounifolioside D [69]. Điều này cũng được khẳng định thêm bằng các tương tác

trên phổ HMBC. Cụ thể, tương tác HMBC giữa H3-21 (δH 1,02) và C-17 (δC

58,1)/C-20 (δC 34,7)/C-22 (δC 33,7) xác nhận nhóm methyl bậc hai tại C-20, trong

khi tương tác giữa H3-26 (δH 1,52)/H3-27 (δH 1,55) và C-24 (δC 79,6)/C-25 (δC 73,2)

cho phép định vị hai nhóm hydroxyl lần lượt tại C-24 và C-25 (Hình 4.46).

Hình 4.36. Phổ HRESIMS của hợp chất AP11

Hình 4.37. Phổ IR của hợp chất AP11

Hình 4.38. Phổ 1H-NMR của hợp chất AP11

Hình 4.39. Phổ 13C-NMR của hợp chất AP11

Hình 4.40. Phổ DEPT của hợp chất AP11

Hình 4.41. Phổ HMQC của hợp chất AP11

Hình 4.42. Phổ HMBC của hợp chất AP11

Hình 4.43. Phổ COSY của hợp chất AP11

Hình 4.44. Phổ ROESY của hợp chất AP11

Hình 4.45. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP11

a, c (J, Hz)

Bảng 4.13. Số liệu phổ NMR phần aglycone của hợp chất AP11

a, b δC 32,5

C 1 HMBC (HC) 2, 5 DEPT δH CH2

2 30,3 CH2

3 4 5 6 89,4 41,7 48,2 21,5 5, 10 CH C CH CH2

7 26,8 CH2

8 9 10 11 12 13 14 15 48,0 19,8 26,8 27,1 33,5 47,0 48,0 46,2 11, 13, 14, 18 13, 14, 16, 30 CH C C CH2 CH2 C C CH2

CH 80,8

16 16-OAc 171,2 C 17 18 19 22,0 58,1 19,5 30,4 13, 14, 20, CH3COO- CH3COO- 16, 20 12, 13, 14, 17 1, 10, 11 CH3 CH CH3 CH2

34,7 19,1 33,7 28,5 79,6 73,2 26,6 26,4 26,2 15,8 20,3 C CH3 CH CH2 CH C CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 1,11*; 1,43* 1,84 m; 2,27 m 3,38 dd (11,4; 4,2) – 1,26* 0,68 q (12,6); 1,51* 1,03*; 1,22* 1,52* – 1,06*; 1,98* 1,60*; 1,66* – – 1,48*; 2,01* 5,27 dd (6,0; 6,0) – 2,15 s 2,08 dd (10,2; 6,6) 1,01 s 0,20 d (4,2); 0,46 d (4,2) 1,78* 1,02 d (6,0) 1,74* 1,88* 3,76 m – 1,52 s 1,55 s 1,30 s 1,14 s 1,13 s 17, 20, 22 22 24, 25 24, 25 3, 4, 5, 29 3, 4, 5 8, 13, 14, 15 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 ađo trong C5D5N, b150 MHz, c600 MHz, *tín hiệu chập.

a,b

Bảng 4.14. Số liệu phổ NMR phần đường của hợp chất AP11

a,c (J, Hz)

DEPT δC δH HMBC (HC)

C 3-Glc 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′ 105,1 82,2 77,1 81,6 76,5 62,6 3 CH CH CH CH CH CH2

4,86 d (7,2) 4,29* 4,30* 4,26* 3,84 ddd (9,6; 3,6; 3,0) 4,49* 4,53*

2-Glc 1′′ 2′′ 3′′ 4′′ 5′′ 6′′ 106,0 77,6 78,6 72,2 78,7 63,3 2 CH CH CH CH CH CH2 5,42 d (7,8) 4,10* 4,23* 4,34* 3,94 ddd (9,6; 3,6; 3,6) 4,48* 4,52*

ađo trong C5D5N, b150 MHz, c600 MHz; glc: -D-glucopyranosyl, *tín hiệu chập.

4-Glc 1′′′ 2′′′ 3′′′ 4′′′ 5′′′ 6′′′ 105,4 75,3 78,3 71,9 78,9 62,7 4 CH CH CH CH CH CH2 5,16 d (7,8) 4,09* 4,26* 4,24* 4,00 m 4,32* 4,51*

Hình 4.46. Tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất AP11

21 H3C

CH3

OAc

CH3

H3C 28

Hình 4.47. Tương tác ROESY chính của hợp chất AP11

Hóa lập thể tương đối của AP11 được xác định theo cách tương tự hợp chất

AP10 (Hình 4.44, Hình 4.47). Trong khi đó, cấu hình tuyệt đối của C-24 (δC 79,6)

được gán là R thông qua việc so sánh với giá trị δC của C-24 trong hợp chất

cyclounifolioside C (24R: δC 80,3) và cyclocantogenin (24S: δC 77,0) [68], [139].

Do vậy, cấu trúc của AP11 được thiết lập là (3,16,24R)-16-acetoxy-24,25-

dihydroxycycloartane 3-O-[-D-glucopyranosyl-(1→2)][-D-glucopyranosyl-

(1→4)]--D-glucopyranoside (Hình 4.45). Đây cũng là một hợp chất mới và được

đặt tên là anopanin B.

Hợp chất AP12: Anopanin C (Chất mới) Hợp chất AP12 được tách ra dưới dạng bột trắng. Công thức phân tử của nó

được xác định là C50H82O20 dựa trên các dữ kiện phổ 13C-NMR (Hình 4.51), DEPT

(Hình 4.52) và HRESIMS (Hình 4.48). Phổ IR (Hình 4.49) chỉ ra các dải hấp thụ

tương ứng với nhóm chức carbonyl (1730 cm-1), ether (1028, 1074 cm-1) và hydroxyl

(3443 cm-1). Dữ kiện phổ 1H- (Hình 4.50) và 13C-NMR (Hình 4.51) của AP12 đề

nghị hợp chất này có cấu trúc tương tự AP10 và AP11, ngoại trừ mạch nhánh.

Tương tác HMBC (Hình 4.54) từ H3-26 (δH 1,31)/H3-27 (δH 1,53) đến C-24 (δC

78,3)/C-25 (δC 82,8) cùng với các tương tác COSY (Hình 4.55) H3-21 (δH 1,21)/H-

20 (δH 1,68)/H-22 (δH 4,19)/H-23 (δH 2,10, 2,29)/H-24 (δH 4,28) đề nghị sự hiện

diện của hợp phần 5-ethyl-3-hydroxy-2,2-dimethyltetrahydrofuran trong phân tử.

Liên kết giữa C-17 và C-20 được khẳng định dựa vào tương tác HMBC giữa H-17

(δH 2,51) với C-20 (δC 38,3), giữa H-20 (δH 1,68) với C-17 (δC 56,2) và giữa H3-21

(δH 1,21) với C-17/C-20/C-22 (δC 76,3).

Hình 4.48. Phổ HRESIMS của hợp chất AP12

Hình 4.49. Phổ IR của hợp chất AP12

Hình 4.50. Phổ 1H-NMR của hợp chất AP12

Hình 4.51. Phổ 13C-NMR của hợp chất AP12

Hình 4.52. Phổ DEPT của hợp chất AP12

Hình 4.53. Phổ HMQC của hợp chất AP12

Hình 4.54. Phổ HMBC của hợp chất AP12

Hình 4.55. Phổ COSY của hợp chất AP12

a, b δC 32,5 30,3

Bảng 4.15. Số liệu phổ NMR phần aglycone của hợp chất AP12

C 1 2 HMBC (HC) 2, 5 DEPT CH2 CH2

89,4 41,7 48,2 21,5 3 4 5 6 5, 10 CH C CH CH2

26,7 48,0 19,8 26,8 27,1 7 8 9 10 11 CH2 CH C C CH2

33,5 11, 13, 14, 18 12 CH2

47,1 13 48,0 14 46,2 15 16 80,3 16-OAc 171,0 22,1 56,2 17 19,4 18 30,4 19 13, 14, 16, 30 13, 14, 20, CH3COO- CH3COO- 16, 20 12, 13, 14, 17 1, 10, 11 C C CH2 CH C CH3 CH CH3 CH2

a, c (J, Hz) δH 1,07*; 1,42* 1,84 m; 2,27* 3,38 dd (11,4; 4,2) – 1,25* 0,68 q (12,0); 1,51* 1,01*; 1,23* 1,52* – 1,04*; 1,92* 1,62*; 1,66* – – 1,48*; 2,01 m 5,33 dd (7,8; 7,2) – 2,21 s 2,51 dd (10,8; 6,0) 1,03 s 0,20 d (3,6); 0,46 d (3,6) 1,68 m 1,21 d (6,6) 4,19 m 2,10 m; 2,29 m 4,28* 6,41 d (4,8) – 1,31 s 1,53 s 1,30 s 1,14 s 1,06 s

38,3 12,8 76,3 39,6 78,3 – 82,8 27,1 24,2 26,2 15,8 20,2 C CH3 CH CH2 CH – C CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 17, 20, 22 24, 25 22 24, 25 24, 25 3, 4, 29 3, 4, 5, 28 8, 13, 14, 15 20 21 22 23 24 24-OH 25 26 27 28 29 30 ađo trong C5D5N, b150 MHz, c600 MHz, *tín hiệu chập.

a, b

a, c (J, Hz)

Bảng 4.16. Số liệu phổ NMR phần đường của hợp chất AP12

DEPT δC δH HMBC (HC)

105,1 82,2 77,1 81,6 76,5 62,6 4,86 d (7,8) 4,29* 4,30* 4,25* 3,83 ddd (9,6; 3,6; 3,0) 4,48*; 4,53* 3 CH CH CH CH CH CH2

5,42 d (7,2) 4,10* 4,23* 4,35* 3,94 ddd (9,6; 3,6; 3,6) 4,46*; 4,51* 105,9 77,6 78,6 72,2 78,7 63,3 CH CH CH CH CH CH2 2, 2′′ 1′′, 3′′

5,16 d (8,4) 4,09* 4,25* 4,24* 4,00 m 4,32*; 4,50* 105,4 75,3 78,3 71,9 78,9 62,7 4 1′′′, 3′′′ CH CH CH CH CH CH2 C 3-Glc 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′ 2-Glc 1′′ 2′′ 3′′ 4′′ 5′′ 6′′ 4-Glc 1′′′ 2′′′ 3′′′ 4′′′ 5′′′ 6′′′ ađo trong C5D5N, b150 MHz, c600 MHz , glc: -D-glucopyranosyl, *tín hiệu chập.

Hình 4.56. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP12

Hình 4.57. Tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất AP12

Hình 4.58. Phổ ROESY của hợp chất AP12

Hình 4.59. Tương tác ROESY chính của hợp chất AP12

Cấu hình tuyệt đối của hai trung tâm lập thể C-22, C-24 được làm sáng tỏ

thông qua kỹ thuật ROESY (Hình 4.58) và so sánh giá trị δC của mạch nhánh với

các hợp chất có cấu trúc tương tự. Cụ thể, tín hiệu C-24 tại δC 78,28 được gán là S

qua so sánh với cyclocanthoside B [24S: δC 77,1] và cycloasgenin B [24R: δC 80,5]

[20], [49]. Tiếp đó, tương tác ROESY mạnh từ H-22 (δH 4,19)/H-24 (δH 4,28) đến

H3-26 (δH 1,31), từ 24-OH (δH 6,41) đến H3-27 (δH 1,53) đề nghị cả H-22, H-24 ở

cùng phía so với mặt phẳng vòng tetrahydrofuran (Hình 4.59). Do đó, cấu hình của

C-22 được xác định rõ ràng là S. Từ các dữ kiện trên, hợp chất AP12 được xác định

là (3,16,22S,24S)-16-acetoxy-22,25-epoxy-24-hydroxy cycloartane 3-O-[-D-

glucopyranosyl-(1→2)][-D-glucopyranosyl-(1→4)]--D-glucopyranoside (Hình

4.56), và được đặt tên là anopanin C.

Hợp chất AP13: Sargentol Hợp chất AP13 được tách ra dưới dạng bột màu trắng. Phổ IR (KBr) chỉ ra các

dải hấp thụ của nhóm hydroxyl (3387 cm-1), nhân thơm (1597, 1504, 1466 cm-1),

ether và epoxy (1234, 1072 cm-1).

Phổ 1H-NMR (DMSO-d6) chỉ ra tín hiệu đặc trưng của 2 proton thơm [δH 6,66

(s, H2-3/5)], 2 nhóm methoxy [δH 3,76 (s, H-7/8)], 2 nhóm oxymethine [δH 4,67 (d, J

= 3,5 Hz, H-1) và 3,09 (m, H-2)], 1 nhóm oxymethylene [δH 4,20 (dd, J = 9,0, 6,5

Hz, H-3a) và 3,83 (dd, J = 9,0, 3,0 Hz, H-3b)]. Ngoài ra, tín hiệu của 1 proton

13C-NMR , DEPT và HSQC chỉ ra tín hiệu của 17 carbon, gồm 2 nhóm methyl, 2

anomer đặc trưng cho đường β được quan sát tại δH 4,88 (d, J = 7,0 Hz, H-1). Phổ

nhóm methylene, 9 nhóm methine và 4 carbon không mang hydro. Trong đó, 11

carbon được gán cho phần aglycone và 6 carbon còn lại thuộc về phần đường. Phân

tích phổ 13C-NMR cho thấy các tín hiệu đặc trưng của nhóm methoxy tại δC 56,4 (x2,

C-7/8), 2 nhóm oxymethine tại δC 53,6 (C-2) và 85,1 (C-1), 1 nhóm oxymethylene

tại δC 71,3 (C-3). Tín hiệu của 6 carbon thơm [δC 152,6 (x2), 133,8, 137,1 và 104,3

(x2)] cùng với tín hiệu chập của 2 proton thơm [δH 6,66 (s, H-3/5)] chứng tỏ sự hiện

diện của nhân benzene thế đối xứng qua trục C-1/C-4. Ngoài ra, các tín hiệu của phần

đường tại δC 102,7 (C-1), 74,2 (C-2), 76,5 (C-3), 69,9 (C-4), 77,2 (C-5) và 60,9

(C-6) gợi ý sự hiện diện của hợp phần β-D-glucopyranosyl [99].

a, c (J, Hz)

Bảng 4.17. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP13 và hợp chất tham khảo

#, a δC 137,2 152,7 104,2 133,7 104,2 152,7 56,4 56,4 85,0 53,5 71,3

a, b δC 133,8d 152,6 104,3 137,1d 104,3 152,6 56,4 56,4 85,1 53,6 71,3

C 1 2 3 4 5 6 7 8 1′ 2′ 3′ HMBC (H→C) 1, 3, 4, 5, 1′ 1, 3, 4, 5, 1′ 3, 5, 2, 6 3, 5, 2, 6 1, 2, 6, 2′, 3′ 1 1′, 2′ DEPT C C CH C CH C CH3 CH3 CH CH CH2

#δC của sargentol [34], ađo trong DMSO-d6, b125 MHz, c500 MHz, dgiá trị được gán lại bằng phổ 2D-NMR, *tín hiệu chập.

1′′ 2′′ 3′′ 4′′ 5′′ 6′′ 102,6 74,1 76,4 69,9 77,1 60,9 102,7 74,2 76,5 69,9 77,2 60,9 4, 2′′, 3′′, 5′′ 4′′ CH CH CH CH CH CH2 δH – – 6,66 s – 6,66 s – 3,76 s 3,76 s 4,67 d (3,5) 3,09 m 4,20 dd (9,0; 6,5) 3,83 dd (9,0; 3,0) 4,88 d (7,0) 3,20* 3,20* 3,12* 3,04 m 3,60 dd (12,0; 5,0) 3,41 dd (12,0; 5,5)

Hình 4.60. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC, COSY (b) chính của hợp chất AP13

Các tương tác giữa H-1 (δH 4,67)/H-2 (δH 3,09)/H-3 (δH 4,20 và 3,83) trên

phổ COSY cho phép thiết lập trật tự liên kết C-1/C-2/C-3. Tương tác HMBC H3-

7/C-2, H3-8/C-6 đề nghị vị trí của nhóm 2 methoxy lần lượt tại C-2 và C-6. Tương

tác HMBC giữa H-3/H-5 và C-1, giữa H-2 và C-4 (δC 137,1) cho thấy mảnh cấu

trúc 1,2-epoxy-propan-3-ol liên kết với nhân thơm tại C-4. Đặc biệt, tương tác

HMBC giữa H-1 và C-1 (δC 133,8) khẳng định phần đường liên kết với aglycone

tại C-1. Từ các dữ liệu phổ trên cùng với việc so sánh với hợp chất tham khảo [34]

cho phép khẳng định hợp chất AP13 là [4-(1,2-epoxy-3-hydroxypropyl)-2,6-

dimethoxyphenyl]-O-β-D-glucopyranoside (còn gọi là sargentol) (Hình 4.60).

Hợp chất AP14: 4-O-β-D-Glucopyranosyl-3-prenylbenzoic acid

Hợp chất AP14 được tách ở dạng bột trắng. Píc ion giả phân tử tại m/z

391,1398 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho C18H24O8Na là 391,1369) trên phổ

HRESIMS đề nghị CTPT của hợp chất này là C18H24O8 (DBE = 7). Phổ 1H-NMR

gợi ý sự hiện diện của nhân benzene thế 1,3,4 với 3 proton thơm tại δH 7,77 (s, H-

2), 7,14 (d, J = 8,4 Hz, H-5), 7,81 (d, J = 8,4 Hz, H-6). Hơn nữa, tương tác HMBC

giữa H-2 với C-1 (δC 170,1)/C-4 (δC 160,3)/C-6 (δC 130,4)/C-1 (δC 29,1) chứng tỏ

AP14 là dẫn xuất thế 3,4 của benzoic acid. Ngoài ra, tương tác COSY giữa H-1 (δH

3,37, 3,45) và H-2 (δH 5,32) cùng với tương tác HMBC từ H-4 (δH 1,70)/H-5 (δH

1,72) đến C-2 (δC 123,1)/C-3 (δC 134,0) khẳng định sự hiện diện của nhóm prenyl

(3-methylbut-2-enyl) trong phân tử. Nhóm này được định vị tại C-3 thông qua

1'''

HMBC COSY

6''

5''

1''

3''

tương tác HMBC giữa H-1 và C-2 (δC 132,0)/C-3 (δC 132,1).

Hình 4.61. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC, COSY chính (b) của hợp chất AP14

Trên phổ 1H-NMR, tín hiệu của 1 proton anomer tại δH 5,01 (d, J = 7,2 Hz)

cũng được ghi nhận. Hằng số tương tác của proton này (J = 7,2 Hz) chứng tỏ cấu

hình β của đơn vị đường. Các tín hiệu carbon khác tại δC 101,7 (C-1), 74,9 (C-2),

78,2 (C-3), 71,2 (C-4), 78,2 (C-5) và 62,4 (C-6) đề nghị sự có mặt của 1 đơn vị

β-D-glucopyranosyl [99]. Phần đường nối với C-4 (δC 160,3) của nhân thơm qua

liên kết glycoside dựa trên tương tác HMBC giữa H-1 và C-4 cũng như sự dịch

chuyển mạnh về phía trường thấp của C-4 so với các vị trí khác trong vòng thơm.

#, a

a, b

a, c (J, Hz)

Bảng 4.18. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP14 và hợp chất tham khảo

7,77 s

HMBC (H→C) – 4, 6, 1, 1 – – 3, 6 2, 4, 1 2, 3, 2 1 – 2, 3, 5 2, 3, 4 4 C 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6

δC δH δC 132,1 125,5** – 132,0 132,0 125,5 132,1** – – 160,4 160,3 7,14 d (8,4) 115,0 115,0 7,81 d (8,4) 130,4 130,4 3,37*, 3,45* 29,1 29,1 5,32 m 123,1 123,1 – 134,0 134,0 1,70 s 17,9 17,9 1,72 s 25,9 25,9 5,01 d (7,2) 101,8 101,7 3,50* 74,9 74,9 3,48* 78,2 78,2 3,43* 71,2 71,3 3,48* 78,2 78,2 3,69 dd (11,2; 5,6); 62,4 62,5 3,88 br.d (11,2) – 170,2 170,1 –

1 #δC của 3-prenyl-4-O-β-D-glucopyranosyloxy-4-hydroxylbenzoic acid [102], ađo trong CD3OD, b100 MHz, c400 MHz, *tín hiệu chập, **tín hiệu được gán lại bằng phổ HMBC.

Các phân tích trên cho phép thiết lập cấu trúc của hợp chất AP14 là 4-O-β-D-

glucopyranosyl-3-prenylbenzoic acid (Hình 4.61). Hợp chất này được tách ra lần

đầu tiên từ loài Prunua amygdalus dưới tên gọi không chính xác là 4-O-β-D-

glucopyranosyloxy-4-hydroxylbenzoic acid [102].

Hợp chất AP15: Inugalactolipid A Hợp chất AP15 được tách ra dưới dạng bột trắng. Phổ HRESIMS của hợp

chất AP15 cho píc ion giả phân tử tại m/z 937,5842 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết

cho công thức C49H86O15Na là 937,5864). Kết hợp với dữ kiện phổ 13C-NMR và

DEPT cho phép thiết lập CTPT của AP15 là C49H86O15 (DBE = 7).

Phổ 1H-NMR của hợp chất AP15 gợi ý sự hiện diện của 3 liên kết đôi với 6

proton olefin tại δH 5,37; 2 đơn vị đường hexose với các proton anomer tương ứng

tại δH 4,89 (d, J = 4,0 Hz), 4,27 (d, J = 7,0 Hz). Ngoài ra các cụm tín hiệu chập ở

vùng trường cao của các nhóm methylene [δH 2,83 (4H), 2,35 (4H), 2,10 (4H), 1,62

(4H), 1,32 (32H)], 2 nhóm methyl triplet [δH 1,00, 0,92] đề nghị sự có mặt của 2

mạch hydrocarbon không phân nhánh.

Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất này thể hiện các tín hiệu của 2 carbon

carboxyl (δC 174,7, 175,1), 6 carbon olefin [δC 128,2, 128,9, 129,2, 129,2, 131,1,

132,8], 2 carbon anomer (δC 100,6, 105,3), 9 carbon oxymethine và 4 carbon

oxymethylene (δC 62,8–74,7), 24 carbon methylene (δC 21,5–35,1) và 2 carbon

methyl (δC 14,7, 14,5) (Bảng 4.19). Các dữ kiện phổ 1D-NMR gợi ý hợp chất AP15

là một digalactosyldiacylglycerol. Các tương tác HMBC (Hình 4.63) giữa H-1 (δH

4,89) và C-6 (δC 67,8), giữa H-1 (δH 4,27) và C-3 (δC 68,8) khẳng định phần đường

-D-galactopyranosyl-(1→6)-O-β-D-galactopyranosyl nối với hợp phần glycerol tại

C-3.

Tín hiệu proton tại δH 2,83 (4H) được gán cho 2 nhóm methylene ở vị trí bis-

allylic (xen kẽ giữa 2 liên kết đôi). Tín hiệu tại δH 2,10 (4H) được gán cho 2 nhóm

methylene ở vị trí allylic (vị trí  so với liên kết đôi) [65]. Như vậy, một trong hai

nhánh acyl chứa cả 3 liên kết đôi trong khi nhánh còn lại bão hòa. Việc so sánh các

giá trị δC 28,2, 26,4, 26,6 của carbon allylic với các giá trị tương ứng của 2 dạng cấu

hình [(Z): δC 27–28; (E): δC 32–33] cho phép gán cấu hình Z cho các liên kết đôi

[60]. Các hợp phần acyl tiếp tục được xác định là palmitoyl và linolenoyl theo

phương pháp mô tả ở mục 2.2.2 với chương trình nhiệt độ CT1. Theo đó, sắc ký đồ

GC-MS (Phụ lục 15) chỉ ra tín hiệu của 2 dẫn xuất methyl palmitate, methyl

linolenoate với thời gian lưu tương ứng là 26,11 và 33,38 phút. Hơn nữa, căn cứ

vào sự chênh lệch giá trị độ chuyển dịch hóa học giữa 2 carbon carbonyl (δC =

0,35), nhóm palmitoyl được đề nghị tại C-1 trong khi nhóm linolenoyl tại C-2 của

hợp phần glycerol [78]. Lập luận này được củng cố thông qua kết quả thủy phân

không hoàn toàn của hợp chất AP15 trong dung dịch HCl 8%. Theo đó, methyl

palmitate là cấu tử chính (chiếm 83%) thu được sau khi thủy phân khoảng 2h gợi ý

palmitoyl liên kết với C-1 [28].

a, c (J, Hz)

a, b δC 64,0

Bảng 4.19. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP15

C 1 DEPT CH2

71,8 68,8 105,3 72,4 74,6 70,1 74,7 67,8 2 3 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′ CH CH2 CH CH CH CH CH CH2

CH CH CH CH CH CH2 C δH 4,25 dd (12,0; 6,5) 4,46 dd (12,0; 2,5) 5,27 m 3,76*, 3,96 dd (11,0; 5,5) 4,27 d (7,0) 3,52* 3,75* 3,90* 3,50* 3,70 dd (12,0; 5,5) 3,92* 4,89 d (4,0) 3,81 dd (10,0; 3,5) 3,75* 3,92* 3,87 t (6,0) 3,73* – 1 2 3 4 5 6 1‴, 1

2‴, 2

100,6 70,2 71,5 71,1 72,5 62,8 174,7, 175,1 35,0, 35,1 26,0 (x2) 30,2–30,8 28,2 2,35 t (7,5) 1,62 m 1,32* 2,10 m

128,2–132,8 5,37*

26,4, 26,6 21,5 14,7 33,1 23,7 14,5 2,83 t (6,0) 2,10 m 1,00 t (7,5) 1,32* 1,32* 0,92 t (7,0) CH2 CH2 CH2 (x2) CH2 (x14) CH2 CH (x6) CH2 CH2 CH3 CH2 CH2 CH3 3‴, 3 4‴–7‴, 4–13 8‴ 9‴/10‴ 12‴/13‴ 15‴/16‴ 11‴, 14‴ 17‴ 18‴ 14 15 16 aĐo trong CD3OD, b125 MHz, c500 MHz, *tín hiệu chập.

Hình 4.62. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP15

Hình 4.63. Tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất AP15

Từ các lập luận trên, hợp chất AP15 được đề nghị là 1-O-hexadecanoyl-2-O-

octadeca-9Z,12Z,15Z-trienoyl-3-O-[-D-galactopyranosyl-(1→6)-O-β-D-

galactopyranosyl]glycerol hay còn được gọi là inugalactolipid A (Hình 4.62) [78].

Dù inugalactolipid A đã được phân lập trước đó [60], [78], đây là lần đầu tiên số

liệu phổ của hợp chất này được gán ghép dựa trên các phổ 2D-NMR.

]D +35,7 (c 0,1, [

Hợp chất AP16: Gingerglycolipid A Hợp chất AP16 được tách ra dưới dạng bột trắng,

MeOH). Phổ 1H-NMR của hợp chất AP16 chỉ ra các tín hiệu cộng hưởng của 6

proton olefin tại δH 5,34 (m), 2 proton anomer tại δH 4,24 (1H, d, J = 7,0 Hz), 4,86.

Các cụm tín hiệu chập ở vùng trường cao của mạch carbon [δH 2,81 (4H), 2,35

(2H), 2,08 (4H), 1,61 (2H), 1,33 (8H)]. Tín hiệu của 1 nhóm methyl ở cuối mạch

cũng được ghi nhận tại δH 0,97 (3H, d, J = 7,0 Hz). Phổ 13C-NMR của hợp chất này

chỉ ra 33 tín hiệu carbon gồm 1 carbon carboxyl (δC 175,5), 6 carbon olefin (δC

128,2–132,7), 2 carbon anomer (δC 105,3, 100,5), 13 carbon oxymethine và

oxymethylene (δC 62,7–74,6), 10 carbon methylene (δC 21,5–34,9) và 1 carbon

methyl (δC 14,7) (Bảng 4.20). Các dữ kiện phổ nêu trên gợi ý hợp chất AP16 là một

glycolipid, được cấu thành từ 1 đơn vị glycerol, 2 đơn vị monosaccharide, 1 đơn vị

acid béo. Tín hiệu carbon của phần đường cho biết sự có mặt của 2 đơn vị galactose

trong phân tử [30], [136]. Trật tự liên kết phần đường được đề nghị là -D-

galactopyranosyl-(1→6)-O-β-D-galactopyranose thông qua việc so sánh dữ kiện

phổ 13C-NMR với các giá trị tương ứng của các monoacyldigalactosylglycerol được

tìm thấy trong tự nhiên [78]. Các tín hiệu tại δH 2,35 (2H), 1,61 (2H) lần lượt được

gán cho các nhóm methylene ở vị trí , β của nhóm carboxyl. Trong khi tín hiệu tại

δH 2,81 (4H) thuộc về các proton bis-allylic. Tín hiệu tại δH 2,08 (4H) chứng tỏ sự

có mặt của các proton allylic [65]. Sự dịch chuyển về trường thấp của tín hiệu

methyl (δH 0,97) đề nghị sự hiện diện của liên kết đôi tại C-15‴/C-16‴ [65]. Theo

Uzawa và cộng sự, 2 proton của H-1 ở dạng 2S có độ dịch chuyển hóa học (δH 4,18,

4,19) gần nhau hơn so với dạng R (δH 4,08, 4,19) [97]. Tín hiệu của hai proton của

nhóm methylene (C-1) được quan sát tại δH 4,14 (2H, m) đề nghị cấu hình S cho C*-2.

Từ các dữ kiện phổ 1H-, 13C-NMR,cùng với việc so sánh với hợp chất tham

khảo ở tài liệu [62], [136], cấu trúc của hợp chất AP16 được thiết lập là (2S)-1-O-

linolenoyl-3-O-[-D-galactopyranosyl-(1→6)-O-β-D-galactopyranosyl]glycerol, còn

được gọi là gingerglycolipid A (Hình 4.64). Gingerglycolipid A cũng được tìm thấy

ở một số loài như Zingiber officinale [135], [136], Sideroxylon obtusifolium [92].

,  (J, Hz)

Bảng 4.20. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP16 và hợp chất tham khảo

δH 4,14 m 3,98 m 3,66 dd (10,0; 6,0); 3,84* 4,24 d (7,0) 3,53* 3,48* 3,84* 3,74* 3,65*; 3,88* 4,86* 3,88* 3,74* 3,88* 3,83* 3,70* – 2,35 t (7,0) 1,61 m

1,33*

2,08 m

2,81 m

2,08 m

5,34*

#,  δC 67,4 70,4 72,9 106,1 73,4a 75,4 70,9b 75,4 68,6 101,3 71,0b 72,2 71,8 73,3a 63,5 176,2 35,7 26,8c 31,5c 31,1c 31,0c 31,0c 28,9c 27,2c 27,3c 22,2c 129,0d 129,6d 129,9d 129,9d 131,6d 133,5d 15,4

, β δC 66,6 70,2 72,1 105,3 72,6a 74,6 70,1 74,6 67,8 100,5 69,6 71,4 71,0 72,5a 62,7 175,5 34,9 26,0b 30,7c 30,3c 30,2c 30,2c 28,2 26,4b 26,5b 21,5 128,2d 128,9d 129,2d 129,2d 131,1d 132,7d 14,7

#δC của gingerglycolipid A [136], đo trong CD3OD, β125 MHz, 500 MHz, *tín hiệu chập, a–dgiá trị có thể hoán đổi cho nhau trong cùng cột.

Vị trí 1 2 3 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′ 1 2 3 4 5 6 1‴ 2‴ 3‴ 4‴ 5‴ 6‴ 7‴ 8‴ 11‴ 14‴ 17‴ 9‴ 10‴ 12‴ 13‴ 15‴ 16‴ 18‴ 0,97 t (7,0)

Hình 4.64. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP16

Đáng lưu ý, hợp phần linolenoyl của AP16 dễ bị oxy hóa bởi oxy triplet

(3O2) theo cơ chế gốc tự do [32]. Các nguyên tử hydro ở vị trí allylic đặc biệt là bis-

allylic dễ dàng bị thay thế ở giai đoạn khơi mào phản ứng. Nghiên cứu trước đây đã

chỉ ra sự hydroperoxide hóa của linolenoyl thường xảy ra ở C-9, C-12, C-13, C-16.

Trong đó, các gốc 12-, 13-peroxyl dễ bị vòng hóa để hình thành endoperoxide. Điều

này giải thích cho sự xuất hiện píc ion tại m/z 763,3423 [M+4xO+Na]+ (tính toán lý

thuyết cho công thức C33H56O18Na, 763,3364) trên phổ HRESIMS. Quá trình oxy

OOH

m/z 763,3423 [M + 4xO + Na]+

+3O2 + H

3O2

hóa hợp phần linolenoyl của AP16 được minh họa bằng sơ đồ sau (Hình 4.65) [43].

Hình 4.65. Sự tạo thành sản phẩm oxy hóa sơ cấp của hợp chất AP16

]D +57,0 (c 0,1, [

Hợp chất AP17: Gingerglycolipid B Hợp chất AP17 được tách ra dưới dạng bột trắng,

MeOH). Phổ HRESIMS của hợp chất này cho píc ion giả phân tử tại m/z 701,3721

[M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C33H58NaO14 là 701,3724) cho phép

thiết lập CTPT của AP17 là C33H58O14 (DBE = 5).

,  (J, Hz)

Bảng 4.21. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP17 và hợp chất tham khảo

#,  δC 66,6 70,2 72,1 105,3 72,5 74,7 70,1 74,6 67,8 100,5 69,7 71,5 71,1 72,5 62,7 175,5 34,9 26,0 30,3

δH 4,14 m 3,98 m 3,66 dd (10,5; 5,5); 3,84* 4,24 d (8,0) 3,53* 3,48* 3,84* 3,74* 3,65*; 3,88* 4,86* 3,88* 3,74* 3,88* 3,83* 3,70* – 2,35 t (7,5) 1,60 m

1,32* 30,1~30,3

2,06 m 2,76 m

5,34*

, β δC 66,6 70,2 72,1 105,3 72,5 74,6a 70,1 74,5a 67,7 100,5 69,6 71,4 71,0 72,5 62,7 175,5 34,9 26,0b 30,7c 30,3c 30,2c 30,2c 28,1 26,5b 130,9d 129,1d 129,0d 130,9d 28,1 30,5c 32,6 23,6 14,4

#δC của gingerglycolipid B [62], đo trong CD3OD, β125 MHz, 500 MHz, *tín hiệu chập, a-dgiá trị có thể hoán đổi cho nhau trong cùng cột.

Vị trí 1 2 3 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′ 1 2 3 4 5 6 1‴ 2‴ 3‴ 4‴ 5‴ 6‴ 7‴ 8‴ 11‴ 9‴ 10‴ 12‴ 13‴ 14‴ 15‴ 16‴ 17‴ 18‴ 30,5 26,5 130,9 129,1 129,1 130,9 30,5 30,7 32,7 23,6 14,4 2,06 m 1,28* 1,32* 1,28* 0,89 t (7,0)

Phổ 1H-NMR của hợp chất AP17 chỉ ra các tín hiệu cộng hưởng của 4 proton

olefin tại δH 5,34 (m), 2 proton anomer tại δH 4,24 (d, J = 8,0 Hz), 4,86. Các cụm tín

hiệu chập ở vùng trường cao của mạch carbon [δH 2,76 (2H), 2,35 (2H), 2,06 (4H),

1,60 (2H), 1,28-1,32 (14H)] và tín hiệu của 1 nhóm methyl ở cuối mạch cũng được

ghi nhận tại δH 0,89 (3H, J = 7,0 Hz). Phổ 13C-NMR của hợp chất này thể hiện các

tín hiệu của 1 carbon carboxyl (δC 175,5), 4 carbon olefin (δC 129,0–130,9), 2

carbon anomer (δC 105,3, 100,5), 13 carbon oxymethine và oxymethylene (δC 62,7–

74,6), 12 carbon methylene (δC 23,6–34,9), 1 carbon methyl (δC 14,4) (Bảng 4.21).

Các dữ kiện phổ nêu trên gợi ý hợp chất AP17 là một

monoacyldigalactosylglycerol tương tự AP16, ngoại trừ tín hiệu của phần acid béo.

Để phù hợp với các dữ kiện phổ HRESIMS, 1H-, 13C-NMR, hợp phần acid béo

được đề nghị là octadecadienoyl. Các tín hiệu của 2 proton bis-allylic (δH 2,76), 4

proton allylic (δH 2,06) trên phổ 1H-NMR chứng tỏ 2 liên kết đôi phân bố trên mạch

acid béo cách nhau bởi 1 nhóm methylene. Kết hợp các dữ kiện phổ và so sánh với

chất tham khảo ở tài liệu [62], cấu trúc của hợp chất AP17 được xác định là (2S)-1-

O-linoleoyl-3-O-[-D-galactopyranosyl-(1→6)-O-β-D-galactopyranosyl]glycerol,

còn được gọi là gingerglycolipid B (Hình 4.66).

Hình 4.66. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP17

Tương tự AP16, hợp chất AP17 cũng dễ dàng chuyển hóa thành các sản

phẩm 9-, 13-hydroperoxide hóa liên hợp theo sơ đồ dưới đây (Hình 4.67) [32]. Điều

này được kiểm chứng bằng píc tại m/z 733,3650 [M+2xO+Na] (tính toán lý thuyết

- H

+3O2 + H

OOH

m/z 733,3650 [M + 2xO + Na]+

cho công thức C33H58O16Na là 733,3623).

Hình 4.67. Sự tạo thành sản phẩm oxy hóa sơ cấp của hợp chất AP17

]D +29,4 (c 0,1, [

Hợp chất AP18: Gingerglycolipid C Hợp chất AP18 được tách ra dưới dạng bột trắng,

MeOH). Phổ HRESIMS của hợp chất này cho píc ion giả phân tử tại m/z 703,3878

[M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C33H60NaO14 là 703,3881) cho phép

thiết lập CTPT của AP18 là C33H60O14 (DBE = 4). Phổ 1H-NMR của hợp chất

AP18 chỉ ra các tín hiệu cộng hưởng của 2 proton olefin [δH 5,34 (m)], 2 proton

anomer [δH 4,24 (d, J = 7,0 Hz), 4,86], các proton của mạch carbon no [δH 2,35 (2H,

t, J = 7,0 Hz), 2,02 (4H, m), 1,61 (2H, m), 1,28-1,32 (20H), 0,89 (3H, J = 6,5 Hz)].

Phổ 13C-NMR của hợp chất này thể hiện 33 tín hiệu carbon gồm 1 carbon carboxyl

(δC 175,5), 2 carbon olefin (δC 130,8, 130,9), 2 carbon anomer (δC 105,3, 100,5), 13

carbon oxymethine và oxymethylene (δC 62,7–74,6), 14 carbon methylene (δC 23,7–

34,9) và 1 carbon methyl (δC 14,5).

,  (J, Hz)

#,  δC 67,3 70,4 72,9 106,1 73,3 75,3 70,8 75,3 68,5 101,3 71,0 72,2 71,8 73,3 63,5 176,2 35,7 27,0 31,0–31,6

, β δC 66,6 70,2 72,1 105,3 72,5 74,6a 70,1 74,5a 67,7 100,5 69,6 71,4 71,0 72,5 62,7 175,5 34,9 26,0 30,2–30,8

Bảng 4.22. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP18 và hợp chất tham khảo

δH 4,14 m 3,98 m 3,66 dd (10,5; 5,5); 3,84* 4,24 d (8,0) 3,53* 3,48* 3,84* 3,74* 3,65*; 3,88* 4,86* 3,88* 3,74* 3,88* 3,83* 3,70* – 2,35 t (7,0) 1,61 m 1,28–1,32*

1,28–1,32* 1,28–1,32* 2,02 m 5,34*

#δC của gingerglycolipid C [136], đo trong CD3OD, β125 MHz, 500 MHz, *tín hiệu chập, a-bgiá trị có thể hoán đổi cho nhau trong cùng cột.

Vị trí 1 2 3 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′ 1 2 3 4 5 6 1‴ 2‴ 3‴ 4‴–7‴ 12‴–15‴ 16‴ 17‴ 8‴, 11‴ 9‴ 10‴ 18‴ 33,8 24,7 29,0 131,7 131,7 15,3 33,1 23,7 28,1 130,8b 130,9b 14,5 0,89 t (6,5)

100

Hình 4.68. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP18

Các dữ kiện phổ nêu trên gợi ý hợp chất AP18 là một

monoacylglycerolgalatoside có cấu trúc tương tự AP16 với hợp phần acid béo là

octadecenoyl. So sánh dữ kiện phổ của AP18 với chất tham khảo ở tài liệu [136]

cho phép xác định cấu trúc của hợp chất AP18 là (2S)-1-O-oleoyl-3-O-[-D-

galactopyranosyl-(1→6)-O-β-D-galactopyranosyl]glycerol, còn được gọi là

gingerglycolipid C (Hình 4.68).

Hợp chất AP19: (2S)-1-O-Palmitoyl-3-O-[-D-galactopyranosyl-(1→6)-

O-β-D-galactopyranosyl]glycerol

]D +51,6 (c 0,1, MeOH). [

Hợp chất AP19 được tách ra dưới dạng bột trắng,

HRESIMS của hợp chất cho píc ion giả phân tử tại 677,3746 [M+Na]+ Phổ này m/z

(tính toán lý thuyết cho công thức là 677,3724) cho phép thiết lập C31H58O14Na

1H-NMR của hợp chất Phổ

CTPT của AP19 (DBE = 3). là C31H58O14

AP19 chỉ ra các tín hiệu cộng hưởng của 2 proton

4,24 (1H, d, J = 7,0 Hz), 4,86], các proton của hợp phần palmitoyl anomer [δH [δH

13C-NMR của hợp

2,35 (2H), 1,60 (2H), 1,28 (24H), 0,90 (3H, d, = 6,5 Hz)]. Phổ J

chất này thể 175,5), 2 carbon anomer hiện các tín hiệu của 1 carbon carboxyl (δC

105,3, 100,5), 13 carbon oxymethine và oxymethylene 62,7–74,6), 14 (δC (δC

14,4) (Bảng 4.23). carbon methylene (δC 23,7–34,9) và 1 carbon methyl (δC

101

Hình 4.69. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP19

,  (J, Hz)

#,  δC 66,6 69,7 72,1 105,3 72,6 74,7 70,1 74,6 67,8 100,5 71,5 70,2 71,0 72,5 62,7 175,5 34,9 26,0 30,2–30,8 33,1 23,7 14,4

, β δC 66,6 70,2 72,1 105,3 72,5 74,6a 70,1 74,5a 67,8 100,5 69,6 71,4 71,0 72,5 62,7 175,5 34,9 26,0 30,2–30,8 33,1 23,7 14,5

δH 4,14 m 3,98 m 3,66 dd (10,5; 4,5); 3,87* 4,24 d (7,0) 3,56* 3,48* 3,84* 3,74* 3,66*; 3,87* 4,86* 3,72* 3,75* 3,86* 3,84* 3,66*; 3,70* – 2,35 t (7,0) 1,60 br.s 1,28* 1,28* 1,28* 0,90 t (6,5)

Vị trí 1 2 3 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′ 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4–13 14 15 16

#δC của 1-O-palmitoyl-3-O-[α-D-galactopyranosyl(1→6)-β-D-galactopyranosyl]-sn-glycerol [63], đo trong CD3OD, β125 MHz, 500 MHz, *tín hiệu chập, agiá trị có thể hoán đổi cho nhau trong cùng cột.

Các dữ kiện phổ NMR, MS cho phép thiết lập cấu trúc của hợp chất AP19 là (2S)-

1-O-palmitoyl-3-O-[-D-galactopyranosyl-(1→6)-O-β-D-galactopyranosyl]glycerol (Hình

Bảng 4.23. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP19 và hợp chất tham khảo

Fusetani và Hashimoto [40]. Gần đây, các nhà khoa học Việt Nam cũng đã phân lập được

chất này từ cây Cẩu tích (Cibotium barometz) [6].

4.69) [63]. Hợp chất này được phân lập lần đầu tiên từ loài tảo lục Ulva pertusa bởi

Hợp chất AP20: (2R)-1-O-Palmitoyl-3-O-α-D-(6-

sulfoquinovopyranosyl)glycerol

Hợp chất AP20 được tách ở dạng bột trắng. Công thức phân tử của hợp chất

này được xác định là C25H48O11S dựa vào các píc ion giả phân tử tại m/z 579,2797

[M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho C25H48O11SNa là 579,2815) trên phổ HRESIMS.

Phổ 1H-NMR của AP20 chỉ ra tín hiệu của 1 proton anomer tại δH 4,82 (d, J = 4,0

102

Hz) ứng với 1 đơn vị đường có cấu hình . Ngoài ra, các tín hiệu carbon tại δC

100,1 (C-1), 73,5 (C-2), 75,0 (C-3), 74,8 (C-4), 69,8 (C-5), 54,2 (C-6) kết hợp

với các hằng số tương tác vicinal lớn [JH-2/H-3 = 9,5 Hz, JH-3/H-4 = 9,5 Hz, JH-4/H-5 =

9,5 Hz] đề nghị phần đường là -D-6-sulfoquinovopyranosyl. Hợp phần đường liên

kết với hợp phần glycerol tại C-3 (δC 70,4) thông qua tương tác HMBC giữa proton

anomer H-1 (δH 4,82) và C-3, giữa H-3a (δH 3,43) và C-1 (Hình 4.71).

Trên phổ 1H-NMR của AP20 còn có tín hiệu của một nhóm methyl tại δH

0,92 (3H, t, J = 7,5 Hz), nhiều nhóm methylene trong khoảng δH 1,31-2,39 gợi ý sự

hiện diện của hợp phần acid béo no. Việc xác định hợp phần acid béo tiếp tục được

thực hiện tương tự như đối với hợp chất AP15 với chương trình nhiệt độ CT2 (mục

2.2.2). Theo đó, hợp phần acid béo được xác định là palmitoyl với thời gian lưu của

dẫn xuất FAME tương ứng là 30,098 phút trên sắc ký đồ GC-MS. Hợp phần này

được định vị tại C-1 (δC 66,5) nhờ tương tác HMBC giữa H-1 (δH 4,12, 4,23) và C-

1 (δC 175,6).

Hình 4.70. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP20

103

Hình 4.71. Tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất AP20

a, c (J, Hz)

Bảng 4.24. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP20 và hợp chất tham khảo

# δC 66,4

a, b DEPT δH CH2

δC 66,5 C 1

2 3 69,2 70,0 69,8 70,4 CH CH2

99,6 72,5 73,9 73,5 69,2 53,3 100,1 CH CH 73,5 CH 75,0 CH 74,8 CH 69,8 CH2 54,2 1 2 3 4 5 6 HMBC H→C) 1, 2, 3 1, 2, 3 3 1, 2, 1 1 3, 3, 5 1, 3, 4 2, 4 3, 5, 6 4, 6 4, 5

4,12* 4,23 ddd (7,0; 7,0; 6,5) 4,12* 3,43 dd (10,0; 6,5) (H-3a) 4,07 dd (10,0; 3,0) (H-3b) 4,82 d (4,0) 3,45 dd (9,5; 4,0) 3,69 dd (9,5; 9,0) 3,13 dd (9,5; 9,0) 4,12* 2,96 dd (14,0; 9,0) 3,38* – 2,39 t (7,0) 1,64 quin (7,0) 1,31* – 1, 3, 4 1, 2, 4 CH2 CH2 CH2

#δC của (2R)-1-O-(palmitoyl)-3-O-α-D-(6-sulfoquinovosyl)-sn-glycerol đo trong CDCl3/CD3OD [118], ađo trong CD3OD, b125 MHz, c500 MHz, *tín hiệu chập.

176,1 34,9 25,7 30,3- 31,0 32,9 23,6 14,8 175,6 C 34,9 26,0 30,2- 30,7 33,0 23,7 14,4 1,31* 1,31* 0,92 t (7,5) CH2 CH2 CH3 1 2 3 4- 13 14 15 16 14, 15

Cấu hình tuyệt đối của C-2 được xác định thông qua việc so sánh độ dịch

(2R)- và (2S)-1-O-acyl-3-O-β-D-galactopyranosylglycerol. Uzawa và cộng sự quan

chuyển hóa học của H-1 và hằng số tương tác của H-3 với các giá trị tương ứng của

sát thấy 2 proton của H-1 ở dạng 2S có độ dịch chuyển hóa học (δH 4,18, 4,19) gần

nhau hơn so với dạng R (δH 4,08, 4,19). Ngoài ra, JH-2/H-3a (4,5 Hz) < JH-2/H-3b (5,2

Hz) (đối với dạng 2S), JH-2/H-3a (6,5 Hz) > JH-2/H-3b (4,3 Hz) (đối với dạng 2R). Tín

hiệu của H-1 và hằng số tương tác của H-3 của AP20 (Bảng 4.24) phù hợp với dạng

R, do đó, cấu hình tuyệt đối của C-2 được thiết lập là R [97]. Các phân tích trên cho

phép thiết lập cấu trúc của hợp chất AP20 là (2R)-1-O-palmitoyl-3-O-α-D-(6-

sulfoquinovopyranosyl)glycerol (Hình 4.70) [118].

Như vậy, trong tổng số 20 chất được phân lập và xác định cấu trúc từ cây

104

Tốc thằng cáng có 4 chất mới và 14 chất lần đầu tiên được phân lập từ chi

Anodendron. Đáng lưu ý, tất cả các chất này đều lần đầu tiên được công bố từ loài

này (Bảng 4.25).

STT Ký hiệu

Hợp chất

Lớp chất

Cycloartenol Anopaniester (E)-Phytol Desmosterol Ursolic acid Vanillin Esculentic acid Kaempferol-3-O-rutinoside

Tính mới # Mới # # # #

1 AP1 2 AP2 3 AP3 4 AP4 5 AP5 6 AP6 7 AP7 8 AP8

Rutin

9 AP9

Anopanin A Anopanin B Anopanin C Sargentol

Mới Mới Mới #

10 AP10 11 AP11 12 AP12 13 AP13

14 AP14

Triterpene Triterpene ester Diterpene Sterol Triterpene Hợp chất thơm Triterpene Flavonoid glycoside Flavonoid glycoside Saponin Saponin Saponin Phenylpropanoid glycoside Dẫn xuất của prenylbenzoic acid Glycoglycerolipid Glycoglycerolipid Glycoglycerolipid Glycoglycerolipid Glycoglycerolipid

# # # # #

15 AP15 16 AP16 17 AP17 18 AP18 19 AP19

Glycoglycerolipid

20 AP20

4-O-β-D-Glucopyranosyl-3- prenylbenzoic acid Inugalactolipid A Gingerglycolipid A Gingerglycolipid B Gingerglycolipid C (2S)-1-O-Palmitoyl-3-O-[-D- galactopyranosyl-(1→6)-O-β-D- galactopyranosyl]glycerol (2R)-1-O-Palmitoyl-3-O-α-D-(6- sulfoquinovopyranosyl)glycerol

#Phân lập lần đầu tiên từ chi Anodendron.

Bảng 4.25. Thống kê các hợp chất phân lập từ cây Tốc thằng cáng

4.2. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các hợp chất tinh khiết

Hoạt tính gây độc tế bào in vitro của 17/20 hợp chất tinh khiết đã phân lập

được thử nghiệm trước với hai dòng tế bào LU-1 và MKN-7. Việc lựa chọn hai

dòng tế bào này dựa trên các kết quả sàng lọc sơ bộ đối với cao chiết MeOH [5].

Những hợp chất còn lại do lượng mẫu không đủ (AP1, AP2) và do cấu trúc quen

thuộc và đã được nghiên cứu nhiều (AP6) nên không đưa vào thử nghiệm. Các

105

saponin mới (AP10–AP12) được ưu tiên thử trên nhiều dòng tế bào nhằm phát hiện

hoạt tính mới của chúng. Trong khi các hợp chất (AP16–AP19) cũng được thử trên

cả 5 dòng tế bào ung thư (LU-1, Hep-G2, KB, MKN-7, SW-480) nhằm nghiên cứu

hoạt tính kháng ung thư của lớp chất glycolipid. Kết quả thử nghiệm được trình bày

ở Bảng 3.1.

Kết quả thu được cho thấy các chất phân lập được thể hiện hoạt tính yếu hơn

so với cao chiết MeOH tổng (IC50: 4,03–17,47 µg/ml). Cụ thể, hợp chất desmosterol

(AP4) có tác dụng ức chế ở mức trung bình với cả 5 dòng tế bào ung thư (LU-1,

MKN-7, Hep-G2, KB, SW-480) với giá trị IC50 trong khoảng 28,11±1,95 đến

41,41±2,31 µg/mL. Đây là lần đầu tiên hoạt tính ức chế của desmosterol đối với các

dòng tế bào trên được nghiên cứu. Hợp chất ursolic acid (AP5) thể hiện hoạt tính ức

chế trung bình với hai dòng tế bào LU-1, MKN-7 với giá trị IC50 lần lượt là

D-(6-sulfoquinovopyranosyl)glycerol (AP20) lần đầu tiên cho thấy tác dụng ức chế

44,37±5,40, 30,89±3,60 µg/mL. Trong khi đó, hợp chất (2R)-1-O-palmitoyl-3-O-α-

yếu đối với hai dòng tế bào trên (IC50: 66,66±5,85 µg/mL đối với dòng tế bào LU-1;

72,42±8,05 µg/mL đối với dòng tế bào MKN-7). Các hợp chất còn lại hầu như

không thể hiện hoạt tính với giá trị IC50 > 100 µg/mL.

Các nghiên cứu trước đây cũng cho thấy desmosterol (AP4) ức chế có ý

nghĩa đối với dòng tế bào ung thư bàng quang (NBT-T2) ở chuột [121]. Ursolic

acid (AP5) thể hiện tác dụng ức chế đối với rất nhiều dòng tế bào ung thư như ung

thư phổi tế bào lớn (H460), ung thư cổ tử cung (ME-180), ung thư tuyến tiền liệt di

căn (DU 145), ung thư vú (MCF-7), khối u ác tính (M-14), ung thư ruột kết (HT-

29), ung thư tuyến tiền liệt (PC-3), ung thư bạch cầu tủy (K562) [84]; ung thư máu

(HL-60), ung thư dạ dày (BGC), ung thư gan (Bel-7402) và ung thư cổ tử cung

(HeLa) [77]; ung thư dạ dày (MGC-803) và ung thư vú (Bcap-37) [76]; ung thư

biểu mô (KB), ung thư gan (Hep-G2), ung thư phổi (LU-1) [119]. Hợp chất này gây

ra sự tự chết của tế bào ung thư ruột kết (SW-480) thông qua sự kích hoạt p53 [82].

Ursolic acid thể hiện tác dụng ức chế trên in vivo đối với khối u thần kinh đệm,

nhiều tế bào ung thư khác nhau (gan, bàng quang, da, tuyến tiền liệt…). Hiện nay,

ursolic acid đang được thử nghiệm pha I nhằm xem xét độ an toàn cũng như các tác

106

dụng phụ của nó [53].

Các nghiên cứu gần đây về mối quan hệ cấu trúc – hoạt tính của ursolic acid

và các dẫn xuất đã đi đến kết luận hai nhóm có khả năng tạo liên kết hydro tại vị trí

3 và 28 của khung ursane đóng vai trò then chốt trong việc quyết định hoạt tính gây

độc tế bào. Hơn nữa, định hướng  của nhóm thế tại C-3 thường có hoạt tính mạnh

hơn định hướng  [77]. Điều này cũng phù hợp với kết quả thử nghiệm hợp chất

esculentic acid (AP7) (cấu hình 3-OH) có hoạt tính yếu hơn rất nhiều so với

ursolic acid (AP5) (cấu hình 3-OH).

Hợp chất (2R)-1-O-palmitoyl-3-O-α-D-(6-sulfoquinovopyranosyl)glycerol

(AP20) trước đây đã được chứng minh có tác dụng ức chế tế bào W14 (tế bào được

tạo ra bằng cách gây nhiễm tế bào WFB bởi gen đột biến 6.6-kb EJ-ras) và dòng tế

bào A-549 với giá trị IC50 lần lượt là 33 và 35 µg/mL. Không những vậy, hợp chất

này còn có khả năng kìm hãm sự phát triển khối u rắn A-549 trong mô hình thử

nghiệm trên chuột (BALB/cAJcl-nu) mà không gây giảm cân cũng như biến đổi

hình thái của các bộ phận trong cơ thể [100]. Người ta còn phát hiện hợp chất AP20

khả năng ức chế enzyme tổng hợp DNA (DNA polymerase) dạng , β trong tế bào

ung thư ruột kết (DLD-1), ung thư dạ dày (NUGC-3) và khóa sự sao mã DNA [88].

Ngoài các chất trên, qua tổng quan tài liệu một số hợp chất khác phân lập từ

loài trong nghiên cứu này cũng cho thấy hoạt tính gây độc trên nhiều dòng tế bào

ung thư khác nhau. Hợp chất (E)-phytol (AP3) ức chế các dòng tế bào ung thư như

MCF-7, PC-3, HeLa, HT-29, A-549, Hs294T và MDA-MB-231 với IC50 từ 15,51

đến 69,67 μM. (E)-Phytol còn cho thấy khả năng kháng khối u trong ung thư biểu

mô tế bào gan. Theo một số nghiên cứu khác, mặc dù estrogen đóng vai trò quan

trọng trong sinh lý bình thường, tuy nhiên việc tăng quá mức hoóc môn này có thể

gây ra ung thư vú, ung thư buồng trứng, và ung thư nội mạc tử cung. Hợp chất (E)-

phytol có tác dụng ức chế enzyme aromatase, enzyme xúc tác cho quá trình sinh

tổng hợp estrogen, do đó được xem là chất tiềm năng trong kháng ung thư [57].

Nghiên cứu gần đây của Zeng và cộng sự đã chỉ ra khả năng gây độc tế bào của

sargentol (AP13) trên dòng ung thư cổ tử cung SiHa và HeLa với giá trị IC50 tương

107

ứng là 16,07 và 16,16 µg/mL, tác dụng ức chế này được so sánh mạnh hơn cả

cisplatin [138]. Hợp chất inugalactolipid A (AP15) cũng cho thấy khả năng ức chế

dòng tế bào ung thư P388 (ung thư bạch cầu ở chuột) và DLD-1 (ung thư tuyến giáp

ở người) [60].

Bên cạnh tác dụng kháng u và ung thư, nhiều hoạt tính khác của các hợp chất

phân lập từ loài Tốc thằng cáng cũng đã được báo cáo. (E)-Phytol (AP3) có nhiều

hoạt tính sinh học khác như kháng khuẩn, kháng viêm, chống oxi hóa, gây độc tế

bào, chống lại sự biến đổi gen, tăng cường hệ miễn dịch… Hoạt tính kháng khuẩn

của (E)-phytol đã được chứng minh trên các chủng Staphylococcus typhimurium và

Staphylococcus aureus, tiếp đó một nghiên cứu khác của Saikia và cộng sự cho thấy

các dẫn xuất ethyl crotonate, oxime, aldehyde của phytol có tác dụng chống vi

khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis với giá trị MIC lần lượt là 15,6, 25,0 và 50,0

g/mL. Ngoài ra, (E)-phytol còn cho thấy tác dụng chống ký sinh trùng

Trypanosoma brucei với IC50 = 19,1 g/mL và loài sán máng Schistosoma mansoni

(liều nhạy cảm: 50, 75 và 100 g/mL). Mới đây, một nghiên cứu của Pejin và cộng

sự đã chứng minh hoạt tính kháng khuẩn của (E)-phytol trên 8 loài vi khuẩn (với

MIC từ 0,003 đến 0,038 mg/mL; MBC từ 0,013 đến 0,052 mg/mL) và 8 loài nấm

(với MIC từ 0,008 đến 0,016 mg/mL; MFC từ 0,090 đến 0,520 mg/mL). Bên cạnh

hoạt tính kháng khuẩn và gây độc tế bào, (E)-phytol còn cho thấy khả năng chống

–), methoxy

oxi hóa (liều tiêm tĩnh mạch trên mô hình chuột thí nghiệm là 25, 50, 100 và 200

–), nitric-oxide (NO) và 2,2-diphenyl-1-

mg/kg), khả năng bắt gốc tự do hydroxyl (OH), superoxide anion (O2

(CH2O), carbon-dioxide anion (CO2

picrylhydrazyl (DPPH), hay hoạt tính kháng viêm (với liều tiêm tĩnh mạch trên mô

hình chuột thí nghiệm là 7,5; 25,0; 50,0 và 75,0 mg/kg) [57].

Nghiên cứu được tiến hành bởi Baricevic và cộng sự (2001) cho thấy ursolic

acid (AP5) làm giảm viêm trên mô hình gây phù tai chuột, tác dụng này được đánh

giá mạnh hơn gấp hai lần so với chất chống viêm kinh điển indomethacin [22].

Trong nghiên cứu của Nascimento và cộng sự (2013), ursolic acid thể hiện hoạt tính

chống lại 6 chủng vi khuẩn, đặc biệt với S. aureus (ATCC 6538) với giá trị MIC 32

mg/mL. Nghiên cứu này còn cho thấy kết quả tương đương giữa ursolic acid với

108

các kháng sinh aminoglycoside trên hầu hết các vi khuẩn thử nghiệm [83]. Ngoài ra,

hợp chất này còn có khả năng ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn lao Mycobaterium

tuberculosis H37Rv với giá trị MIC 41,9 μg/mL [31]. Ursolic acid được coi là một

thành phần có hoạt tính quan trọng trong các cây thuốc được sử dụng trong điều trị

bệnh tiểu đường và các biến chứng của bệnh tiểu đường như Gymnema sylvestre,

Cornus officinalis, Crataegus sp., Aegle marmelos [21]. Tác dụng chống đái tháo

đường của ursolic acid đã được chứng minh ở một số mô hình in vivo. Nghiên cứu

của Jang và cộng sự (2009) trên mô hình chuột bị tiểu đường do tiêm streptozocin

có kèm chế độ ăn nhiều chất béo cho thấy ursolic acid khi được dùng ở liều 0,05%

khối lượng cơ thể trong 4 tuần đã làm giảm đáng kể nồng độ glucose trong máu,

tăng dung nạp glucose và giảm đề kháng với insulin, đồng thời duy trì được đáng kể

nồng độ insulin và bảo tồn chức năng tế bào tuyến tụy [58]. Đáng lưu ý, ursolic acid

còn có khả năng bảo vệ gan do hoạt tính chống oxy hóa mạnh [33], [42]. Khả năng

chống kết tập tiểu cầu của ursolic acid cũng đã được chứng minh qua sự ức chế các

thành phần tham gia quá trình đông máu như thrombin, adenosine diphosphatevà

epinephrine [54]. Hoạt tính chống virus HIV của ursolic acid cũng đã được xác định

với giá trị EC50 là 4,4µM [61].

Hợp chất esculentic acid (AP7) đã được biết có tác dụng ức chế sự kích hoạt

virus EBV, một loại virus khá phổ biến ở người và được biết đến như là nguyên

nhân của bệnh bạch cầu đơn nhân. Virus EBV cũng liên quan với một số dạng đặc

biệt của ung thư, chẳng hạn như u lympho Hodgkin, u lympho Burkitt, ung thư dạ

dày, ung thư biểu mô vòm họng và các tình trạng liên quan đến virus gây suy giảm

miễn dịch ở người (HIV) và u lympho của hệ thần kinh trung ương [89]. Ngoài ra

acid này còn cho thấy tác dụng chống lão hoá và kháng viêm, có thể dùng để điều

trị viêm phế quản, viêm gan và viêm khớp dạng thấp [86], [140].

Kaempferol-3-O-rutinoside (AP8) đã được chứng minh là tác nhân có khả

năng loại bỏ tốt các gốc tự do peroxyl (ROO) [41]. Tác dụng bảo vệ gan của

kaempferol-3-O-rutinoside cũng đã được chứng minh qua mô hình chuột bị gây độc

bởi carbon tetrachloride (CCl4) bởi khả năng làm tăng protein toàn phần, ức chế sự

tăng lên của enzyme aspartate aminotransferase (AST), alkaline phosphatase (ALP)

109

trong huyết thanh và giảm nhẹ các tổn thương mô bệnh học ở gan do CCl4 gây ra

[125]. Nghiên cứu gần đây của nhóm tác giả Trung Quốc đã chỉ ra rằng kaempferol-

3-O-rutinoside ở cả 3 mức liều 150, 300 và 600 mg/kg có khả năng ức chế đau thụ

cảm trên mô hình chuột gây đau quặn bằng acetic acid và gây đau bằng formalin,

hiệu quả này vượt trội so với chứng dương aspirin [124]. Ngoài ra, kaempferol-3-O-

rutinoside đã được chứng minh hiệu quả bảo vệ tế bào thần kinh trong trường hợp

tổn thương não cục bộ vĩnh viễn do tắc nghẽn, nó làm giảm kích thước vùng nhồi

máu ở cả 3 mức liều 2,5; 5,0; 10,0 mg/kg [72]. Kaempferol-3-O-rutinoside còn cho

thấy khả năng ức chế hoạt tính của enzyme α-glucosidase, là enzyme làm tăng

đường máu, có vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh đái tháo đường với giá trị

IC50 là 365,4 1,05 µM trong khi chất đối chiếu acarbose là 780,2 1,04 µM [50].

Rutin (AP9) là một flavonoid khá quen thuộc được tìm thấy trong nhiều loài

thực vật, rutin có khả năng chống oxy hóa tốt [29], thể hiện tác dụng chống dị ứng,

chống viêm, giãn mạch, kháng khối u, kháng khuẩn, kháng virus, bảo vệ thành

mạch [105], chống huyết khối [106] và một số bệnh tim mạch [141]. Gần đây nhất,

theo Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) rutin có thể được sử

dụng như một loại thuốc an toàn làm giảm cục máu đông, để phòng ngừa và điều trị

các cơn đau tim, đột quỵ [35]. Ngoài ra rutin còn có khả năng hạ lipid máu, chống

ung thư và điều trị đái tháo đường [105]. Các thử nghiệm lâm sàng khác nhau đã

được thực hiện trong nhiều năm nhằm giải thích tác dụng dược lý của rutin.

Sargentol (AP13) có cấu trúc phenylpropanoid glycoside, được phân lập lần

đầu vào năm 2003 từ loài Sargentodoxa cuneata [34]. Năm 2012, nhóm tác giả

Trung Quốc đã chỉ ra hoạt tính kháng viêm in vivo của sargentol trên mô hình gây

phù tai chuột bằng xylene với phần trăm ức chế quá trình viêm là 47,2 và 29,1 %

tương ứng với mức liều 100 và 50 mg/kg [117].

Các glycolipid phân lập từ loài này cũng sở hữu nhiều hoạt tính đáng quan

tâm. Chẳng hạn, hợp chất inugalactolipid A (AP15) ức chế tác nhân gây viêm 12-O-

tetradecanoylphorbol-13-acetate trong thử nghiệm trên chuột [78]. Hợp chất

gingerglycolipid C (AP18) thể hiện hoạt tính chống oxi hóa trên mô hình FRAP với

giá trị FRAP là 88,6±5,2 μmol Fe (II)/g, thấp hơn nhiều so với chất đối chứng là -

110

tocopherol (3250,5±167,7 μmol Fe (II)/g) [132]. Ngoài ra gingerglycolipid A–C

(AP16–AP18) còn cho thấy khả năng chống loét dạ dày trong mô hình chuột thí

nghiệm [136].

Như vậy, nhiều hợp chất phân lập từ loài Tốc thằng cáng thể hiện các hoạt

tính quý giá như kháng khuẩn, kháng nấm, kháng oxy hóa, kháng viêm, kháng

virus, chống ký sinh trùng, chống đái tháo đường, chống tập kết tiểu cầu, chống lão

hóa, chống loét dạ dày, bảo vệ gan, tăng cường hệ miễn dịch và nổi bật nhất là hoạt

tính ức chế tế bào ung thư. Các kết quả thu được góp phần giải thích hoạt tính gây

độc tế bào đã được quan sát trước đó của cao chiết methanol cũng như khả năng

chữa bệnh theo kinh nghiệm dân gian của loài Tốc thằng cáng. Đặc biệt, các hợp

chất desmosterol (AP4), ursolic acid (AP5) và (2R)-1-O-palmitoyl-3-O-α-D-(6-

sulfoquinovopyranosyl)glycerol (AP20) có thể là những tác nhân tiềm năng trong

111

việc nghiên cứu và phát triển thuốc chữa ung thư trong tương lai.

KẾT LUẬN

Sau quá trình thực hiện, đề tài đã đạt được hai mục tiêu đề ra, cụ thể:

1. Thành phần hóa học

Từ phần trên mặt đất loài Anodendron paniculatum, 20 hợp chất đã được phân

lập và xác định cấu trúc hóa học. Trong đó có 4 hợp chất mới, 14 hợp chất lần

đầu tiên phân lập từ chi Anodendron.

- Bốn hợp chất mới bao gồm: anopaniester, anopanin A–C.

- Mười bốn hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ chi Anodendron bao gồm:

cycloartenol, (E)-phytol, desmosterol, esculentic acid, kaempferol-3-O-rutinoside,

rutin, sargentol, 4-O-β-D-glucopyranosyl-3-prenylbenzoic acid, inugalactolipid A,

D-galactopyranosyl]glycerol,

gingerglycolipid A–C, (2S)-1-O-palmitoyl-3-O-[-D-galactopyranosyl-(1→6)-O-β-

(2R)-1-O-palmitoyl-3-O-α-D-(6-

sulfoquinovopyranosyl)glycerol.

- Hai hợp chất đã biết còn lại là ursolic acid và vanillin.

2. Hoạt tính sinh học

- 17/20 hợp chất phân lập đã được thử nghiệm hoạt tính gây độc trên các dòng tế

bào ung thư (LU-1, MKN-7, Hep-G2, KB, SW-480, HL-60, LNCaP, MCF-7).

- Hợp chất desmosterol có tác dụng ức chế ở mức trung bình với 5 dòng tế bào

LU-1, MKN-7, Hep-G2, KB, SW-480 với giá trị IC50 trong khoảng 28,11±1,95 đến

41,41±2,31 µg/mL.

- Hợp chất ursolic acid thể hiện hoạt tính ức chế trung bình với dòng tế bào LU-1

và MKN-7 với giá trị IC50 lần lượt là 44,37±5,40, 30,89±3,60 µg/mL.

- Hợp chất (2R)-1-O-palmitoyl-3-O-α-D-(6-sulfoquinovopyranosyl)glycerol cho

tác dụng yếu trên hai dòng tế bào LU-1 và MKN-7 với giá trị IC50 lần lượt là

112

66,66±5,85 µg/mL, 72,42±8,05 µg/mL.

KIẾN NGHỊ

Từ các kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của

loài Anodendron paniculatum ở Việt Nam, chúng tôi kiến nghị:

- Cần tiếp tục tìm kiếm các chất có hoạt tính kháng ung thư từ các phân đoạn

khác của loài này.

- Đối với các hợp chất đã phân lập, cần nghiên cứu thêm các hoạt tính sinh

113

học khác, góp phần tạo ra các sản phẩm phục vụ chăm sóc sức khỏe cộng đồng.

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1. Duc Viet Ho, Hanh Nhu Thi Hoang, Hung Quoc Vo, Hien Minh Nguyen, Ain

Raal, Hoai Thi Nguyen (2018), A new triterpene ester and other chemical

constituents from the aerial parts of Anodendron paniculatum and their cytotoxic

activity, Journal of Asian Natural Products Research, 20 (2), 188-194.

2. Viet Duc Ho, Thi Nhu Hanh Hoang, Quoc Hung Vo, Van Kiem Phan, Tuan

Anh Le, Viet Ty Pham, Minh Hien Nguyen, Takeshi Kodama, Takuya Ito, Hiroyuki

Morita, Ain Raal, Thi Hoai Nguyen (2017), Cycloartane-type triterpene glycosides

anopanins A–C with monoacyldigalactosylglycerols from Anodendron paniculatum,

Phytochemistry, 144, 113-118.

3. Hoang Thi Nhu Hanh, Ho Viet Duc, Tran Thi Thuy Linh, Vo Quoc Hung,

Nguyen Thi Hoai (2016), Flavonoid and phenylpropanoid glycoside compounds

isolated from Anodendron paniculatum (Roxb.) A.DC., Vietnam Journal of Medicinal Materials, 21 (5), 304-309.

4. Hoang Thi Nhu Hanh, Vu Duc Canh, Ho Viet Duc, Nguyen Thi Hoai (2017),

Triterpene and sterol compounds isolated from Anodendron paniculatum (Roxb.)

A.DC., Hue University Journal of Science: Natural Science, 126 (1B), 155-163.

5. Hoàng Thị Như Hạnh, Hồ Việt Đức, Phạm Việt Tý, Nguyễn Thị Hồng Anh,

Nguyễn Chí Bảo, Nguyễn Thị Hoài (2017), Các hợp chất glycoglycerolipid và dẫn

xuất của prenylbenzoic acid từ cây Tốc thằng cáng, Tạp chí Khoa học và Công nghệ

114

Đại học Khoa học, Đại học Huế, 10 (1), 85-96.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT: [1]. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội, 2,

1014.

[2]. Trương Thị Đẹp (2007), Thực vật dược, NXB Giáo dục Hà Nội, 273–274. [3]. Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ. Tp Hồ Chí Minh, 2,

720–721.

[4]. Nguyễn Thị Hoài (2012-2013), Nghiên cứ u các cây thuốc củ a đồ ng bào dân tộc thiểu số Pako, Vân Kiều ở Miền Trung theo hướng tác dụng chống oxy hoá, diệt tế bào ung thư, Đề tài cấp Bộ GD&ĐT, Mã số: B2012-ĐHH-56.

[5]. Nguyễn Thị Hoài, Trịnh Thị Điệp, Đỗ Thị Thảo, Nguyễn Khánh Thuỳ Linh, Nguyễn Bích Hiền và Hoàng Thị Diệu Hương (2012), Sàng lọc hoạt tính diệt tế bào ung thư một số cây thuốc của đồng bào Pako, Vân Kiều ở Quảng Trị, Tạp chí Dược liệu, 17 (2), 95–100.

[6]. Hoàng Thanh Hương và cộng sự (2011), Nghiên cứu sàng lọc một số dược liệu đế phân lập các chất mới có tác dụng diệt tế bào ung thư, Báo cáo tổng hợp kết quả khoa học công nghệ đề tài, Mã số: KC10.20/06-10, 182–184.

[7]. Phan Kế Lộc, Nguyễn Tiến Hiệp, Soejarto, D. D., Nguyễn Mạnh Cường (2004), Tính đa dạng của hệ thực vật Việt Nam 17. Anodendron howii Tsiang (Apocynaceae Trúc đào), loài bổ sung cho hệ thực vật, Di truyền học và ứng dụng, 3, 36–39. [8]. Trần Đình Lý (2007), Thực vật chí Việt Nam quyển 5, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 7–21, 33–34, 247–253.

TIẾNG ANH: [9]. Abbenante, G., and Fairlie, D. P. (2005), Protease inhibitors in the clinic, Medicinal Chemistry, 1, 71–104.

[10]. Abe, F., and Yamauchi, T. (1982), Affinoside A and companion glycoside from the stem and bark of Anodendron affine (Anodendron. II), Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 30 (4), 1183–1193.

[11]. Abe, F., and Yamauchi, T. (1982), Structures of affinogenin C and affinogenin D-I–D-V from Anodendron affine (Anodendron. III), Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 30 (11), 3897–3905.

[12]. Abe, F., and Yamauchi, T. (1985), Affinosides La–Le, major cardenolide glycosides from the leaves of Anodendron affine (Anodendron. VII), Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 33 (9), 3662–3669.

[13]. Abe, F., and Yamauchi, T. (1985), Affinosides M and K, cardenolide glycosides from the seeds of Anodendron affine (Anodendron. V), Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 33 (2), 847–852.

115

[14]. Abe, F., and Yamauchi, T. (1985), Glycosyl nervogenic acid esters of carbohydrates from Anodendron affine (Anodendron. VI), Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 33 (7), 2712–2720.

[15]. Abe, F., and Yamauchi, T. (1993), Reinvestigation of cardenolides from fresh leaves of Anodendron affine, Phytochemistry, 33 (2), 457–459. [16]. Abe, F., Yamauchi, T., Fujioka, T., and Mihashi, K. (1986), Minor cardenolide glycosides and a cardenolide from the leaves of Anodendron affine (Anodendron. VIII), Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 34 (7), 2774–2779.

[17]. Achenbach, H., and Frey, D. (1992), Cycloartanes and other terpenoids and phenylpropanoids from Monocyclanthus vignei, Phytochemistry, 31 (12), 4263–4274.

[18]. Adebayo, A. H., Tan, N. H., Akindahunsi, A. A., Zeng, G. Z., and Zhang, Y. M. (2010), Anticancer and antiradical scavenging activity of Ageratum conyzoides L. (Asteraceae), Pharmacognosy Magazine, 6 (21), 62–66. [19]. Agrawal, A. A., Petschenk, G., Bingham, R. A., Weber, M. G., and Rasmann, S. (2012), Toxic cardenolides: chemical ecology and coevolution of specialized plant-herbivore interactions, New Phytologist, 194 (1), 28–45. [20]. Ahmad, V.U., Ali, A., Ali, Z., Baqai, F.T., and Zafar, F.N. (1998), depressus, glucosides from Corchorus triterpene Cycloartane Phytochemistry, 49, 829–834.

[21]. Alqahtani, A., Hamid, K., Kam, A., Wong, K. H., Abdelhak, Z., Razmovski, N. V., Chan, K., Li, K. M., Groundwater, P. W., and Li, G. Q. (2013), The pentacyclic triterpenoids in herbal medicines and their pharmacological activities in diabetes and diabetic complications, Current Medicinal Chemistry, 20 (7), 908–931.

[22]. Babalola, I. T., and Shode, F. O. (2013), Ubiquitous ursolic acid: A potential pentacyclic triterpene natural product, Pharmacognosy and Phytochemistry, 2 (2), 214–222.

[23]. Bai, L., Wang, L., Zhao, M., Toki, A., Hasegawa, T., Ogura, H., Kataoka, T., Hirose, K., Sakai, J., Bai, J., and Ando, M. (2007), Bioactive pregnanes from Nerium oleander, Journal of Natural Products, 70, 14–18.

[24]. Baldoqui, D. C., Kato, M. J., Cavalheiro, A. J., Bolzani, V. S., Young, M. C. M., and Furlan, M. (1999), A chromene and prenylated benzoic acid from Piper aduncum, Phytochemistry, 51, 899-902.

[25]. Bang, M.H., Han, J.T., Kim, H.Y., Park, Y.D., Park, C.H., Lee, K.R., and Baek, N.I. (2002), 13-Hydroxy-9Z,11E,15E-octadecatrienoic acid from the leaves of Cucurbita moschata, Archives of Pharmacal Research, 25 (4), 438–440.

[26]. Bedir, E., Toyang, N.J., Khan, I.A., Walker, L.A., and Clark, A.M., (2001), A new dammarane-type triterpene glycoside from Polyscias fulva, Journal of Natural Products, 64, 95–97. [27]. Bohlmann, F., Zeisberg, R., and Klein, E. (1975), 13C-NMR-Spektren von monoterpenen, Organic Magnetic Resonance, 7, 426–432.

116

[28]. Bourne, D. J., Pilchowski, S. E., and Murphy, P. T. (1999), A novel sulfonoglycolipid from the brown alga Dictyota ciliolata, Australian Journal of Chemistry, 52.

[29]. Boyle, S. P., Dobson, V. L., Duthie, S. J., Hinselwood, D. C., Kyle, J. A., and Collins, A. R. (2000), Bioavailability and efficiency of rutin as an antioxidant: a human supplementation study, European Journal of Clinical Nutrition, 54 (10), 774–782.

[30]. Bubb, W. A. (2003), NMR spectroscopy in the study of carbohydrates: Characterizing the structural complexity, Concepts in Magnetic Resonance Part A, 19A (1), 1–19.

[31]. Cantrell, C.L., Franzblau, S.G., and Fischer, NH. (2001), Antimycobacterial plant terpenoids, Planta Medica, 68 (7), 685–694.

[32]. Choe, E., and Min, D. B. (2006), Mechanisms and factors for edible oil oxidation, Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 5 (4), 169–186.

[33]. D'Abrosca, B., Fiorentino, A., Monaco, P., and Pacifico, S. (2005), Radical- scavenging activities of new hydroxylated ursane triterpenoids from cv. Annurca apples, Chemistry & Biodiversity, 2 (7), 953–958.

[34]. Damu, A. G., Kuo, P. C., Shi, L. S., Hu, C. Q., and Wu, T. S. (2003), Chemical constituents of the stem of Sargentodoxa Cuneata, Heterocycles, 60 (7), 1645–1652.

[35]. Dar, M. A., and Nahida, T. (2012), Rutin - potent natural thrombolytic agent, International Current Pharmaceutical Journal, 1 (12), 431–435.

[36]. Elsebai, M. F., Kehraus, S., Gütschow, M., and König, G. M. (2010), Spartinoxide, a new enantiomer of A82775C with inhibitory activity toward HLE from the marine-derived fungus Phaeosphaeria spartinae, Natural Product Communications, 5 (7), 1071–1076.

[37]. Forster, P. I. (1993), The synonymy of Anodendron paniculatum (Apocynaceae) with notes on distribution and ethnobotany in Papuasia, Kew Bulletin, 48, 139–142.

[38]. Fukuyama, Y., Ochi, M., Kasai, H., and Kodama, M. (1993), Insect growth inhibitory cardenolide glycosides from Anodendron affine, Phytochemistry, 32 (2), 297–301. [39]. Fukuyama, Y., Ochi, M., Kasai, H., and Kodama, M. (1994 ), A cardenolide

from Anodendron affine, Phytochemistry, 35 (4), 1077–1079.

[40]. Fusetani, N., and Hashimoto, K. (1975), Structures of two water soluble hemolysins isolated from the green alga Ova pertusa, Agricultural and Biological Chemistry, 39 (10), 2021–2025.

[41]. Gamal-Eldeen, A. M., Kawashty, S. A., Ibrahim, L. F., Shabana, M. M., and El- Negoumy, S. I. (2004), Evaluation of antioxidant, anti-inflammatory, and antinociceptive properties of aerial parts of Vicia sativa and its flavonoids, Journal of Natural Remedies, 4 (1), 81–96.

117

[42]. Gao, J., Tang, X., Dou, H., Fan, Y., Zhao, X., and Xu, Q. (2004), Hepatoprotective activity of Terminalia catappa L. leaves and its two triterpenoids, Pharmacy and Pharmacology, 56 (11), 1449–1455. [43]. Gardner, H. W. (1989), Oxygen radical chemistry of polyunsaturated fatty acids, Free Radical Biology & Medicine, 7 (1), 65–86.

[44]. Giuseppe, G., Davide, B., Claudia, G., Ugo, L., and Corrado, C. (2007), Flavonoid composition of Citrus juices, Molecules, 12, 1641–1673.

[45]. Hanada, R., Abe, F., Mori, Y., and Yamauchi, T. (1992), Anodendrosins J and K, two sucrose bisglycosylnervogenates from the seeds of Anodendron affine (Anodendron. IX), Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 40 (9), 2292–2294.

[46]. Hanada, R., Abe, F., Mori, Y., and Yamauchi, T. (1992), Reinvestigation of cardenolide glycosides from seeds of Anodendron affine, Phytochemistry, 31 (10), 3547–3551.

[47]. Hayes, P.Y., Jahidin, A.H., Lehmann, R., Penman, K., Kitching, W., and De Voss, J.J. (2008), Steroidal saponins from the roots of Asparagus racemosus, Phytochemistry, 69, 796–804.

[48]. Hikino, H., Okuyama, T., Arihara, S., Hikino, Y., Takemoto, T., Mori, H., and Shibata, K. (1975), Shidasterone, an insect metamorphosing substance from Blechnum niponicum: Structure, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 23, 1458–1479.

[49]. Hirotani, M., Zhou, Y., Lui, H., and Furuya, T. (1994), Astragalosides from hairy root cultures of Astragalus membranaceus, Phytochemistry, 36, 665– 670.

[50]. Hong, H. C., Li, S. L., Zhang, X. Q., Ye, W. C., and Zhang, Q. W. (2013), Flavonoids with α-glucosidase inhibitory activities and their contents in the leaves of Morus atropurpurea, Chinese Medicine, 8 (1), 19.

[51]. http://www.pankajoudhia.com. [52]. http://www.theplantlist.org/browse/A/Apocynaceae/Anodendron/. [53]. Hussain, H., Green, I. R., Ali, I., Khan, I. A., Ali, Z., Al-Sadi, A. M., and Ahmed, I. (2017), Ursolic acid derivatives for pharmaceutical use: a patent review (2012-2016), Expert Opinion on Therapeutic Patents, 27 (9), 1061– 1072.

[54]. Ibrahim, T.B., Francis, O.S., Adelakun, E.A., Andy, R.O., and Rebamang, A.M. (2013), Platelet-aggregation inhibitory activity of oleanolic acid, ursolic acid, betulinic acid, and maslinic acid, Pharmacognosy and Phytochemistry, 1 (6), 54–60.

[55]. Ichihara, K., and Fukubayashi, Y. (2010), Preparation of fatty acid methyl esters for gas-liquid chromatography, Journal of Lipid Research, 51 (3), 635–640.

[56]. Inada, A., Ohtsuki, S., Sorano, T., Murata, H., Inatomi, Y., Darnaedi, D., and Nakanishi, T. (1997), Cycloartane triterpenoids from Aglaia harmsiana, Phytochemistry, 46, 379–381.

[57]. Islam, M. T., de Alencar, M. V., da Conceição, M. KA., da Conceição M. KE., de Carvalho Melo-Cavalcante, A. A., de Sousa, D. P., and de Freitas, R. M. in a pharma-medico-stance, Chemico-Biological (2015), Phytol Interactions, 240, 60–73.

118

[58]. Jang, S. M., Yee, S. T., Choi, J., Choi, M. S., Do, G. M., Jeon, S. M., Yeo, J., Kim, M. J., Seo, K. I., and Lee, M. K. (2009), Ursolic acid enhances the

high-fat diet, fed cellular immune system and pancreatic beta-cell function in streptozotocin- induced International a diabetic mice Immunopharmacology, 9 (1), 113–119.

[59]. Januário, A. H., Das, M. F., Silva, G. F. D., Vieira, P. C., and Fernandes, J. B. (1992), Dammarane and cycloartane triterpenoids from three Rapanea species, Phytochemistry, 31 (4), 1251–1253. [60]. Jung, J. H., Lee, H., and Kang, S. S. (1996), Diacylglycerylgalactosides from

Arisaema amurense, Phytochemistry, 42 (2), 447–452.

[61]. Kashiwada, Y., Wang, H.K., Nagao, T., Kitanaka, S., Yasuda, I., and Fujioka, T. (1998), Anti-AIDS agents. 30. Anti-HIV activity of oleanolic acid, pomolic acid, and structurally related triterpenoids, Journal of Natural Products, 61 (9), 1090–1095.

[62]. Kiem, P. V., Minh, C. V., Nhiem, N. X., Cuong, N. X., Tai, B. H., Quang, T. H., Anh, H. le. T., Yen, P. H., Ban, N. K., Kim, S. H., Xin, M., Cha, J. Y., Lee, Y. M., and Kim, Y. H. (2012), Inhibitory effect on TNF-α-induced IL-8 secretion in HT-29 cell line by glyceroglycolipids from the leaves of Ficus microcarpa, Archives of Pharmacal Research, 35 (12), 2135–2142.

[63]. Kim, J. S., Lee, Y. S., Shim, S. H., Lee, S. H., Chae, S. W., Han, S. J., Kang, S. S., Jung, S. H., and Shin, K. H. (2004), A monoacyldigalactosyl glycerol from the green alga Enteromorpha prolifera, Natural Product Sciences, 10 (6), 341–343.

[64]. Kim S. Y., Gao, J. J., Lee, W. C., Ryu, K. S., Lee, K. R., and Kim, Y. C. (1999), Antioxidative flavonoids from the leaves of Morus alba, Archives of Pharmacal Research, 22 (1), 81–85.

[65]. Knothe, G., and Kenar, J. A. (2004), Determination of the fatty acid profile by 1H-NMR spectroscopy, European Journal of Lipid Science and Technology, 106, 88–96.

[66]. Korkmaz, B., Moreau, T., and Gauthier, F. (2008), Neutrophil elastase, proteinase 3 and cathepsin G: physicochemical properties, activity and pathophysiological functions, Biochimie, 90, 227–242.

phytoecdysteroid, isolation efficient and

[67]. Kubo, I., Asaka, Y., Stout, M. J., and Nakatsu, T. (1990), Structure of a novel of vitexirone, phytoecdysteroids from Vitex fisherii, Journal of Chemical Ecology, 16, 2581–2588.

[68]. Kucherbaev, K. Dzh., Uteniyazov, K. K., Kachala, V. V., Saatov, Z., and Shashkov, A. S. (2002), Triterpene glycosides from plants of the Astragalus genus. Structure of cyclounifolioside C from Astragalus unifoliolatus, Chemistry of Natural Compounds, 38, 447–449.

[69]. Kucherbaev, K. Dzh., Uteniyazov, K. K., Kachala, V. V., Saatov, Z., and Shashkov, A. S. ( 2002), Triterpene glycosides from plants of the Astragalus genus. Structure of cyclounifolioside D from Astragalus unifoliolatus., Chemistry of Natural Compounds, 38, 574–576.

119

[70]. Kucherbaev, K. J., Uteniyazov, K. K., Kachala, V. V., Saatov, Z., and Shashkov, A. S. (2002), Triterpene glycosides from plants of the Astragalus

genus. Structure of cyclounifolioside A from Astragalus unifoliolatus, Chemistry of Natural Compounds, 38, 175–178.

[71]. Lee, I. K., Kim, D. H., Lee, S. Y., Kim, K. R., Choi, S. U., Hong, J. K., Lee, J. H., Park, Y. H., and Lee, K. R. (2008), Triterpenoic acids of Prunella vulgaris var. lilacina and their cytotoxic activities in vitro, Archives of Pharmacal Research, 31 (12), 1578–1583.

[72]. Li, R., Guo, M., Zhang, G., Xu, X., and Li, Q. (2006), Neuroprotection of nicotiflorin in permanent focal cerebral ischemia and in neuronal cultures, Biological and Pharmaceutical Bulletin, 29 (9), 1868–1872.

[73]. Lichtia, H., Euw, J. V., Stockel, K., Polonia, J., and Reichstein, T. (1972), Die verrnutliche struktur der anodendroside, Helvetica Chimica Acta, 53, 16961728. [74]. Ling, T., Zhang, Z., Xia, T., Ling, W., and Wan, X.

(2009), Phytoecdysteroids and other constituents from the roots of Klaseopsis chinensis, Biochemical Systematics and Ecology, 37, 49–51.

[75]. Lipkind, G. M., Shashkov, A. S., Knlrel, Y. A., Vinogudov, E. V., and Kochetko, N. K. (1988), A computer-assisted structural analysis of regular polysaccharides on the basis of 13C-N.M.R data, Carbohydrate Research, 175, 5975.

[76]. Liu, M. C., Yang, S. J., Jin, L. H., Hu, D. Y., Xue, W., Song, B. A., and Yang, S. (2012), Synthesis and cytotoxicity of novel ursolic acid derivatives containing an acyl piperazine moiety, European Journal of Medicinal Chemistry, 58, 128–135.

[77]. Ma, C. M., Cai, S. Q., Cui, J. R., Wang, R. Q., Tu, P. F., Hattori, M., and Daneshtalab, M. (2005), The cytotoxic activity of ursolic acid derivatives, European Journal of Medicinal Chemistry, 40, 582–589.

[78]. Máñez, S., Recio, M.C., Gil, I., Gómez, C., Giner, R. M., Waterman, P. G., and Ríos, J. L. (1999), A glycosyl analogue of diacylglycerol and other antiinflammatory constituents from Inula viscosa, Journal of Natural Products, 62, 601–604. [79]. Middleton, D. J. (1996), A revision of Anodendron A.DC. (Apocynaceae), Blumea, 41 (1), 37–68.

[80]. Milon, A., Nakatani, Y., Kintzinger, J. P., and Ourisson, G. (1989), The investigated by NMR and molecular conformation of cycloartenol mechanics, Helvetica Chimica Acta, 72 (1), 1–13.

[81]. Monks, A., Scudiero, D., Skehan, P., Shoemake, R., Paull, K., Vistica, D., Hose, C., Langley, J., Cronise, P., Campbell, H., Mayo, J., and Boyd, M. (1991), Feasibility of a high-flux anticancer drug screen using a diverse panel of cultured human tumor cell lines, Journal of National Cancer Institute, 83 (11), 757–766.

120

[82]. Nam, H., and Kim, M. M. (2013), Ursolic acid induces apoptosis of SW480 cells via p53 activation, Food and Chemical Toxicology, 62, 579–583. [83]. Nascimento, P. G., Lemos, T. L., Bizerra, A. M., Arriaga, A. M., Ferreira, D. A., Santiago, G. M., Braz-Filho, R., and Costa, J. G. (2013), Antibacterial

and antioxidant activities of ursolic acid and derivatives, Molecules, 19 (1), 1317–1327.

[84]. Neto, C. C., Vaisberg, A. J., Zhou, B. N., Kingston, D. G., and Hammond, G. B. (2000), Cytotoxic triterpene acids from the Peruvian medicinal plant Polylepis racemosa, Planta Medica, 66 (5), 483–484.

[85]. Neumann, K., Kehraus, S., Gütschow, M., and König, G. M. (2009), Cytotoxic and HLE-inhibitory tetramic acid derivatives from marine-derived fungi, Natural Product Communications, 4, 347–354.

[86]. Niu, X. F., Mu, Q. L., Li, W. F., Yao, H., Li, H. N., and Huang, H. M. (2014), Esculentic acid, a novel and selective COX-2 inhibitor with antiinflammatory effect in vivo and in vitro, European Journal of Pharmacology, 740, 532–538.

[87]. Nthambeleni, R. (2008), Isolation and characterisation of cytotoxic compounds from Anthospermum hispidulum and Eriocephalus tenuifolius, MSc. Thesis. Pietermaritzburg, SA: University of KwaZulu-Natal.

inhibitor group,

[88]. Ohta, K., Hanashima, S., Mizushina, Y., Yamazaki, T., Saneyoshi, M., Sugawara, F., and Sakaguchi, K. (2000), Studies on a novel DNA polymerase sulfoquinovosylacylglycerols: synthetic inhibitory action on cell proliferation, Mutat Res, 467, 139–152.

[89]. Okada, N., Takebayashi, K., Kawashima, J., Niwano, M., Mimura, A., Takahara, Y., and Tokuda, H. (1994), Inhibition of Epstein-Barr Virus (EBV) activation by triterpenes in Sesamum indicum L. callus, Plant Tissue Culture Letters, 11 (2), 145–149.

[90]. Omobuwajo, O. R., Martin, M. T., Perromat, G., Sevenet, T., Awang, K., and from Aglaia argentea, (1996), Cytotoxic cycloartanes Païs, M. Phytochemistry, 41, 1325–1328.

[91]. Osorio, A. A., Lopez M. R., Jimenez I. A., Moujir L. M., Rodriguez, M. L., and Bazzocchi, I. L. (2014), Elaeodendron orientale as a source of cytotoxic cardenolides, Phytochemistry, 105, 60–67.

[92]. Passos Oliveira, A., Raith, M., Kuster, R. M., Rocha, L. M., Hamburger, M., and Potterat, O. (2012), Metabolite profiling of the leaves of the Brazilian folk medicine Sideroxylon obtusifolium, Planta Medica, 78, 703–710. [93]. Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B., and Bacic, A. (2012), Determining the polysaccharide composition of plant cell walls., Nature Protocols, 7, 1590–1607.

[94]. Polonia, J., Jiiger, H., Euw, J. V., and Reichstein, T. (1970), Die cardenolide von Anodendron paniculatum (Roxb.) A.DC., Helvetica Chimica Acta, 53, 12531271.

[95]. Pongprayoon, U., Baeckström, P., Jacobsson, U., Lindström, M., and Bohlin, L. (1992), Antispasmodic activity of beta-damascenone and E-phytol isolated from Ipomoea pes-caprae, Planta Medica, 58 (1), 19–21.

121

[96]. Qin, X. J., Lunga, P. K., Zhao, Y. L., Li, J. L., Yang, X. W., Liu, Y. P., and Luo, X. D. (2014), Antibacterial prenylbenzoic acid derivatives from Anodendron formicinum, Fitoterapia, 92, 238–243.

[97]. Rho, M. C., Matsunaga, K., Yasuda, K., and Ohizumi, Y. (1996), A novel monogalactosylacylglycerol with inhibitory effect on platelet aggregation from the Cyanophyceae Oscillatoria rosea, Journal of Natural Products, 59, 308–309.

[98]. Riccio, R., Zollo, F., Finamore, E., Minale, L., Laurent, D., Bargibant, G., and Pusset, J. (1985), Starfish saponins, 19. A novel steroidal glycoside the starfishes Protoreaster nodosus and Pentaceraster sulfate from alveolatus, Journal of Natural Products, 48, 266–272.

[99]. Roslund, M. U., Tähtinen, P., Niemitz, M., and Sjöholm, R. (2008), Complete assignments of the 1H and 13C chemical shifts and JH,H coupling constants in NMR spectra of D-glucopyranose and all D-glucopyranosyl-D- glucopyranosides, Carbohydrate Research, 343 (1), 101–112.

isolated from

[100]. Sahara, H., Ishikawa, M., Takahashi, N., Ohtani, S., Sato, N., Gasa, S., Akino, T., and Kikuchi, K. (1997), In vivo antitumour effect of 3'- sulphonoquinovosyl 1'-monoacylglyceride sea urchin (Strongylocentrotus intermedius) intestine, British Journal of Cancer, 75, 324–332.

[101]. Sakurai, K., Hosomi, K., Arakawa, T., Uzawa, M., Ito, Y., and Saburi, Y. (1992), Isolation and Characterization of an Allergy Inhibitor from the Jelutong, Dyera costulata Hook. f., Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 56 (6), 975.

[102]. Sang, S., Lapsley, K., Rosen, R. T., and Ho, C. T. (2002), New prenylated benzoic acid and other constituents from almond hulls (Prunus amygdalus Batsch), Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50, 607−609.

[103]. Sasaki, K., and Hirata, Y. (1969), The structures of two new zwitterionic alkaloids from Anodendron affine Druce., Tetrahedron Letters, 46, 4065– 4067. [104]. Sasaki, K., and Hirata, Y. (1970), The alkaloids of Anodendron affine Druce,

Tetrahedron, 26, 2119–2126.

[105]. Sharma, S., Ali, A., Ali, J., Sahni, J. K., and Baboota, S. (2013), Rutin : therapeutic potential and recent advances in drug delivery, Expert Opinion on Investigational Drugs, 22 (8), 1063–1079.

[106]. Sheu, J. R., Hsiao, G., Chou, P. H., Shen, M. Y., and Chou, D. S. (2004), Mechanisms involved in the antiplatelet activity of rutin, a glycoside of the ﬂavonol quercetin, in human platelets, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52 (14), 4414–4418. [107]. Shima, K., Hisada, S., and Inagaki, I. (1971), Constituents of Anodendron

affine, Phytochemistry, 10, 11631164. [108]. Shima, K., Hisada, S., and Inagaki, I. (1971), Flavonoids of Anodendron

affine, Phytochemistry, 10, 893894.

122

[109]. Shima, K., Hisada, S., and Inagaki, S. (1971), Isolation of glucosyringic acid from Anodendron affine, Phytochemistry, 10, 894–895.

[110]. Shima, S., Hisada, S., and Inagaki, I. (1971), Studies on the constituents of Anodendron affine Drurce. III. Structure of a new benzopyran compound, Yakugaku Zasshi, 91 (10), 11241126.

[111]. Shima, S., Hisada, S., and Inagaki, I. (1972), Studies on the constituents of Anodendron affine Drurce. IV. Isolation of kaempferol, astragalin and dambonitol from leaves, Yakugaku Zasshi, 92 (4), 507509.

[112]. Shima, S., Hisada, S., and Inagaki, I. (1972), Studies on the constituents of Anodendron affine Drurce. V. Structure of a two new constituents, Yakugaku Zasshi, 92 (11), 14101414.

trisulfated

[113]. Silchenko, A. S., Avilov, S. A., Kalinovsky, A. I., Dmitrenok, P. S., Kalinin, V. I., Morre, J., Deinzer, M. L., Woodward, C., and Collin, P. D. (2007), Glycosides from the North Atlantic sea cucumber Cucumaria frondosa V – triterpene oligoglycosides, Structures of five new minor frondosides A7-1, A7-2, A7-3, A7-4, and isofrondoside C, Canadian Journal of Chemistry, 85, 626–636. [114]. Singh, B., and Rastogi, R. P. (1970), Cardenolides—glycosides and genins, Phytochemistry, 9 (2), 315–331.

[115]. Smith, L. R., Mahoney, N., and Molyneux, R. J. (2003), Synthesis and structure-phytotoxicity relationships of acetylenic phenols and chromene metabolites, and their analogues, from the grapevine pathogen Eutypa lata, Journal of Natural Products, 66, 169–176.

[116]. Takhtajan (2009), Flowering Plants, Springer Verlag, 521. [117]. Tang, J., Ma, R. L., Ouyang, Z., and Chen, H. S. (2012), Chemical constituents from the water-soluble fraction of wild Sargentodoxa cuneat, Chinese Journal of Natural Medicines, 10 (2), 115-118.

[118]. Tebben, J., Motti, C. A., Siboni, N., Tapiolas, D. M., Negri, A. P., Schupp,P. J., Kitamura, M., Hatta, M., Steinberg, P. D., and Harder, T. (2015), Chemical mediation of coral larval settlement by crustose coralline algae, Scientific Reports, 5 (10803).

[119]. Thien, D. D, Tam, N. T., Thien, D. G., Anh, N. T. H., and Sung, T. V. (2013), Synthesis and cytotoxic activity of ursolic acid derivatives, Zeitschrift für Naturforschung B, 68b, 201–206.

[120]. Tigoufack, I. B., Ngnokam, D., Tapondjou, L. A., Harakat, D., and Voutquenne, L. (2010), Cycloartane glycosides from leaves of Oxyanthus pallidus, Phytochemistry, 71, 2182–2186.

[121]. Uddin, M.H., Roy, M.C., and Tanaka, J. (2011), Cytotoxic cholic acid type sterones from a marine soft coral Paraminabea sp., Chem. Nat. Compd., 47, 64-67.

[122]. Wakana, D., Kawahara, N., and Goda, Y. (2011), Three new triterpenyl esters, codonopilates A–C, isolated from Codonopsis pilosula, Journal of Natural Medicines, 65, 18–23.

123

[123]. Wan, C., Yu, Y., Zhou, S., Tian, S., and Cao, S. (2011), Isolation and identification of phenolic compounds from Gynura divaricata leaves, Pharmacognosy Magazine, 7 (26), 101108.

[124]. Wang, Y., Chen, P., Tang, C., Wang, Y., Li, Y., and Zhang, H. (2014), Antinociceptive and anti-inflammatory activities of extract and two isolated flavonoids of Carthamus tinctorius L, Journal of Ethnopharmacology, 151 (2), 944–950.

[125]. Wang, Y., Tang, C., and Zhang, H. (2015), Hepatoprotective effects of kaempferol 3-O-rutinoside and kaempferol 3-O-glucoside from Carthamus tinctorius L. on CCl4-induced oxidative liver injury in mice, Journal of Food and Drug Analysis, 23 (2), 310–317.

[126]. Wangensteen, H., Miron, A., Alamgir, M., Rajia, S., Samuelsen, A., and Malterud, K. (2006), Antioxidant and 15-lipoxygenase inhibitory activity of rotenoids, isoflavones and phenolic glycosides from Sarcolobus globosus, Fitoterapia, 77, 290–295.

[127]. Wen, S., Chen, Y., Lu, Y., Wang, Y., Ding, L., and Jiang, M. (2016), Cardenolides from the Apocynaceae family and their anticancer activity, Fitoterapia, 112, 74–84.

[128]. Wen, Z. (1998), Synthesis of sterol biosynthesis inhibitors and metabolism of isotopically labeled sterols by Saccharomyces cerevisiae, A doctoral dissertation in chemistry -Texas Tech University, 85.

[129]. Widodo and Luthfi, M. J. (2017), Characteristic of Anodendron paniculatum (Apocynaceae) in Mount Nglanggeran, Yogyakarta, Indonesia, Biodiversitas, 18 (2), 645–651.

[130]. Woo, W. S. (1975), The structure of esculentic acid: A new triterpene from Phytolacca esculenta, Phytochemistry, 14, 1885–1888.

[131]. Xiang, M., Su, H., Hu, J., and Yan, Y. (2011), Isolation, identification and determination of methyl caffeate, ethyl caffeate and other phenolic compounds from Polygonum amplexicaule var. sinense, Journal of Medicinal Plants Research, 5 (9), 1685-1691.

[132]. Xu, X., Xie, H., Xu, L., and Wei, X. (2011), A novel cyclopropyl-containing fatty acid glucoside from the seeds of Litchi chinensis, Fitoterapia, 82, 485– 488. [133]. Yamauchi, T., Abe, F., Nishishita, Y., Okabe, H., Shima, K., and Nishibe, S.

(1979), Pregnanes of Anodendron affine, Phytochemistry, 18, 1240–1241.

[134]. Yamauchi T., Miyahara, K., Abe, F., and Kawazaki, T. (1979), Affinoside B, a cardiac glycoside with a diosphenol system in the aglycone, from Anodendron affine (Anodendron. I), Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 27 (10), 2463–2467.

rhizoma originating [135]. Yoshikawa, M., Hatakeyama, S., Taniguchi, K., Matuda, S., and Yamahara, J. (1992), 6-Gingesulfonic acid, a new anti-ulcer principle, and gingerglycolipids A, B and C, three new monoacyldigalactosylglycerols, in Taiwan, Chemical and from Zingiberis Pharmaceutical Bulletin, 40, 2239–2241.

124

[136]. Yoshikawa, M., Yamaguchi, S., Kunimi, K., Matsuda, K., Okuno, Y., Yamahara, J., and Murakami, N. (1994), Stomachic principles in ginger. III. three An 6-gingesulfonic anti-ulcer principle, acid, and

monoacyldigalactosylglycerols, gingerglycolipids A, B, and C, from Zingiberis rhizoma originating in Taiwan, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 42, 1226–1230.

[137]. Young, R. E., Thompson, R. D., Larbi, K. Y., La, M., Roberts, C. E., Shapiro, S. D., Perretti, M., and Nourshargh, S. (2004), Neutrophil elastase (NE)-deficient mice demonstrate a nonredundant role for NE in neutrophil migration, generation of proinflammatory mediators, and phagocytosis in response to zymosan particles in vivo, Journal of Immunology, 172, 4493– 4502.

[138]. Zeng, X., Wang, H., Gong, Z., Huang, J., Pei, W., Wang, X., Zhang, J., and Tang, X. (2015), Antimicrobial and cytotoxic phenolics and phenolic glycosides from Sargentodoxa cuneata, Fitoterapia, 101, 153–161.

[139]. Zhao, Z., Matsunami, K., Otsaka, H., Shinzato, T., and Takeda, Y. (2008), Tareciliosides A-G: cycloartane glycosides from leaves of Tarenna gracilipes (Hay.) Ohwi, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 56, 1153– 1158.

[140]. Zhu, W. J., Yu, D. H., Zhao, M., Lin, M. G., Lu, Q., Wang, Q., Wei, Guan, Y. Y., Li, G. X., Luan, X., Yang, Y. F., Qin, X.M., Fang, C., Yang, G. H., and Chen, H. Z. (2013), Antiangiogenic triterpenes isolated from Chinese in herbal medicine Actinidia chinensis Planch, Anti-Cancer Agents Medicinal Chemistry, 13, 195–198.

125

[141]. Ziaee, A., Zamansoltani, F., Nassiri-Asl, M., and Abbasi, E. (2009), Effects of rutin on lipid proﬁle in hypercholesterolemic rats, Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology, 104, 253–258.

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Các phổ của hợp chất AP1

Phổ IR của hợp chất AP1

Phổ 1H-NMR của hợp chất AP1

PL1

Phổ 13C-NMR của hợp chất AP1

Phổ HMQC của hợp chất AP1

PL2

Phụ lục 2. Các phổ của hợp chất AP2

Phổ 1H-NMR giãn (a) của hợp chất AP2

PL3

Phổ 1H-NMR giãn (b) của hợp chất AP2

Phổ 13C-NMR giãn (a) của hợp chất AP2

PL4

Phổ 13C-NMR giãn (b) của hợp chất AP2

PL5

Phụ lục 3. Các phổ của hợp chất AP3

Phổ HRESIMS của hợp chất AP3

Phổ IR của hợp chất AP3

PL6

Phổ 1H-NMR của hợp chất AP3

Phổ 13C-NMR của hợp chất AP3

PL7

Phổ HMQC của hợp chất AP3

Phổ HMBC của hợp chất AP3

PL8

Phụ lục 4. Các phổ của hợp chất AP4

Phổ HRESIMS của hợp chất AP4

Phổ IR của hợp chất AP4

PL9

Phổ 1H-NMR của hợp chất AP4

Phổ 13C-NMR của hợp chất AP4

PL10

Phổ HMQC của hợp chất AP4

Phổ HMBC của hợp chất AP4

PL11

Phổ COSY của hợp chất AP4

Phổ NOESY của hợp chất AP4

PL12

Phụ lục 5. Các phổ của hợp chất AP5

Phổ ESIMS (+) của hợp chất AP5

PL13

Phổ ESIMS (-) của hợp chất AP5

Phổ UV của hợp chất AP5

PL14

Phổ IR của hợp chất AP5

Phổ 1H-NMR của hợp chất AP5

PL15

Phổ 13C-NMR của hợp chất AP5

Phổ DEPT của hợp chất AP5

PL16

Phụ lục 6. Các phổ của hợp chất AP6

Phổ ESIMS của hợp chất AP6

Phổ UV của hợp chất AP6

PL17

Phổ IR của hợp chất AP6

Phổ 1H-NMR của hợp chất AP6

PL18

Phổ 13C-NMR của hợp chất AP6

Phổ DEPT của hợp chất AP6

PL19

Phụ lục 7. Các phổ của hợp chất AP7

Phổ HRESIMS của hợp chất AP7

Phổ IR của hợp chất AP7

PL20

Phổ 1H-NMR của hợp chất AP7

Phổ 13C-NMR của hợp chất AP7

PL21

Phổ HMQC của hợp chất AP7

Phổ HMBC của hợp chất AP7

PL22

Phổ COSY của hợp chất AP7

Phổ NOESY của hợp chất AP7

PL23

Phụ lục 8. Các phổ của hợp chất AP8

Phổ ESIMS () của hợp chất AP8

Phổ ESIMS (+) của hợp chất AP8

PL24

Phổ UV của hợp chất AP8

Phổ IR của hợp chất AP8

PL25

Phổ 1H-NMR của hợp chất AP8

Phổ 13C-NMR của hợp chất AP8

PL26

Phổ DEPT của hợp chất AP8

Phổ HSQC của hợp chất AP8

PL27

Phổ HMBC của hợp chất AP8

Phổ COSY của hợp chất AP8

PL28

Phụ lục 9. Các phổ của hợp chất AP9

Phổ ESIMS (+) của hợp chất AP9

Phổ ESIMS () của hợp chất AP9

PL29

Phổ UV của hợp chất AP9

Phổ IR của hợp chất AP9

PL30

Phổ 1H-NMR của hợp chất AP9

Phổ 13C-NMR của hợp chất AP9

PL31

Phổ DEPT của hợp chất AP9

Phổ HSQC của hợp chất AP9

PL32

Phổ HMBC của hợp chất AP9

Phổ COSY của hợp chất AP9

PL33

Phụ lục 10. Các phổ của hợp chất AP10

Phổ 1H-NMR giãn (a) của hợp chất AP10

PL34

Phổ 1H-NMR giãn (b) của hợp chất AP10

Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất AP10

PL35

Phổ EIMS của dẫn xuất alditol hexaacetate của hợp chất AP10

PL36

Phụ lục 11. Các phổ của hợp chất AP11

Phổ 1H-NMR giãn (a) của hợp chất AP11

PL37

Phổ 1H-NMR giãn (b) của hợp chất AP11

Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất AP11

PL38

Phụ lục 12. Các phổ của hợp chất AP12

Phổ 1H-NMR giãn (a) của hợp chất AP12

PL39

Phổ 1H-NMR giãn (b) của hợp chất AP12

Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất AP12

PL40

Phụ lục 13. Các phổ của hợp chất AP13

Phổ ESI-MS của hợp chất AP13

Phổ UV của hợp chất AP13

PL41

Phổ IR của hợp chất AP13

Phổ 1H-NMR của hợp chất AP13

PL42

Phổ 13C-NMR của hợp chất AP13

Phổ DEPT của hợp chất AP13

PL43

Phổ HSQC của hợp chất AP13

Phổ HMBC của hợp chất AP13

PL44

Phổ COSY của hợp chất AP13

PL45

Phụ lục 14. Các phổ của hợp chất AP14

Phổ HRESIMS của hợp chất AP14

Phổ IR của hợp chất AP14

PL46

Phổ UV của hợp chất AP14

Phổ 1H-NMR của hợp chất AP14

PL47

Phổ 13C-NMR của hợp chất AP14

Phổ HSQC của hợp chất AP14

PL48

Phổ HMBC của hợp chất AP14

Phổ COSY của hợp chất AP14

PL49

Phụ lục 15. Các phổ của hợp chất AP15

Phổ HRESIMS của hợp chất AP15

Phổ 1H-NMR của hợp chất AP15

PL50

Phổ 1H-NMR giãn (a) của hợp chất AP15

Phổ 1H-NMR giãn (b) của hợp chất AP15

PL51

Phổ 13C-NMR của hợp chất AP15

Phổ 13C-NMR giãn (a) của hợp chất AP15

PL52

Phổ 13C-NMR giãn (b) của hợp chất AP15

Phổ DEPT của hợp chất AP15

PL53

Phổ HSQC của hợp chất AP15

Phổ HMBC của hợp chất AP15

PL54

Phổ COSY của hợp chất AP15

Sắc ký đồ GC-MS của dẫn xuất methyl ester của hợp chất AP15

PL55

Phụ lục 16. Các phổ của hợp chất AP16

Phổ HRESIMS của hợp chất AP16

Phổ 1H-NMR của hợp chất AP16

PL56

Phổ 13C-NMR của hợp chất AP16

Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất AP16

PL57

Phụ lục 17. Các phổ của hợp chất AP17

Phổ HRESIMS của hợp chất AP17

Phổ 1H-NMR của hợp chất AP17

PL58

Phổ 13C-NMR của hợp chất AP17

Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất AP17

PL59

Phụ lục 18. Các phổ của hợp chất AP18

Phổ HRESIMS của hợp chất AP18

Phổ 1H-NMR của hợp chất AP18

PL60

Phổ 13C-NMR của hợp chất AP18

Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất AP18

PL61

Phụ lục 19. Các phổ của hợp chất AP19

Phổ HRESIMS của hợp chất AP19

Phổ 1H-NMR của hợp chất AP19

PL62

Phổ 13C-NMR của hợp chất AP19

Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất AP19

PL63

SO3H

1''

16''

Phụ lục 20. Các phổ của hợp chất AP20

Phổ HRESIMS của hợp chất AP20

Phổ 1H-NMR của hợp chất AP20

PL64

Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất AP20

Phổ 13C-NMR của hợp chất AP20

PL65

Phổ DEPT của hợp chất AP20

Phổ HSQC của hợp chất AP20

PL66

Phổ HMBC của hợp chất AP20

Phổ COSY của hợp chất AP20

PL67

Phổ NOESY của hợp chất AP20

Sắc ký đồ GC-MS của dẫn xuất methyl ester của hợp chất AP20

PL68

Phụ lục 21. Biên bản giám định tên khoa học của cây Tốc thằng cáng

PL69

Phụ lục 22. Biên bản thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư các chất phân lập từ cây Tốc thằng cáng

PL70

PL71

Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của cây tốc thằng cáng (Anodendron paniculatum (Wall. ex Roxb.) A.DC.)

ĐẠI HỌC HUẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

…………***…………

HOÀNG THỊ NHƯ HẠNH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT

TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÂY TỐC

THẰNG CÁNG (ANODENDRON PANICULATUM

(WALL. EX ROXB.) A.DC.)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

HUẾ, NĂM 2018

ĐẠI HỌC HUẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

…………***…………

HOÀNG THỊ NHƯ HẠNH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT

TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÂY TỐC

THẰNG CÁNG (ANODENDRON PANICULATUM

(WALL. EX ROXB.) A.DC.)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Chuyên ngành: Hóa học hữu cơ

Mã số: 62.44.01.14

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Thị Hoài

HUẾ, NĂM 2018

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC MỤC LỤC ............................................................................................................... i

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Các tên loài thuộc chi Anodendron đã được chấp nhận ....................... 4

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc chung (a) và vị trí dễ bị oxy hóa (b) của cardenolide ........... 15

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC Phụ lục 1. Các phổ của hợp chất AP1 ............................................................... PL1

MỞ ĐẦU

Roxb.) (Wall. ex

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Phương pháp xác định hợp phần acid béo của các glycolipid a) Methanol phân các glycolipid

Chương 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

Chương 4. BÀN LUẬN

KẾT LUẬN

KIẾN NGHỊ

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Có thể bạn quan tâm

Tài liêu mới

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Giới thiệu

Về chúng tôi

Việc làm

Quảng cáo

Liên hệ

Chính sách

Thoả thuận sử dụng

Chính sách bảo mật

Chính sách hoàn tiền

DMCA

Hỗ trợ

Hướng dẫn sử dụng

Đăng ký tài khoản VIP

093 303 0098

support@tailieu.vn

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi

Facebook

Youtube

TikTok