intTypePromotion=1
ADSENSE

Nghiên cứu sự phát sinh cơ quan từ lớp mỏng tế bào cây đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba) nuôi cấy in vitro

Chia sẻ: Trinhthamhodang Trinhthamhodang | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:9

35
lượt xem
2
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Cây đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba) có giá trị dược liệu cao hơn các loài đương quy khác thuộc chi Angelica. Bộ rễ của cây được sử dụng lâu đời trong việc chữa bệnh cũng như trong nhiều đơn thuốc bổ theo y học cổ truyền ở nhiều nước châu Á. Trong nghiên cứu này, sự phát sinh cơ quan ở cây đương quy Nhật Bản từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào của chồi ngọn và từ nuôi cấy phiến lá đã được thực hiện. Lớp mỏng (bề dày từ 1-1,5 mm) cắt từ chồi in vitro được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung NAA (0; 0,1; 0,2 mg/l) kết hợp với TDZ (0,1; 0,5; 1mg/l). Số chồi lớn nhất (8,9 chồi/mẫu) xuất phát từ lớp mỏng chồi nuôi cấy trên môi trường có 0,1 mg/l NAA và 1 mg/l TDZ. Khi thay vitamin Morel bằng vitamin Gamborg B5, bổ sung 10% (v/v) nước dừa và 40 mg/l adenine, số chồi tăng rõ rệt. Phiến lá cây đương quy Nhật Bản in vitro cũng đã được chứng minh là nguồn nguyên liệu tốt cho việc sản xuất rễ bất định. Trên môi trường MS có bổ sung kinetin (0 hoặc 1 mg/l) kết hợp với NAA (4, 6, 8, 10, 12 mg/l), hoặc IBA (4, 6, 8, 10, 12 mg/l), phiến lá mở thứ nhất (tính từ ngọn) nuôi cấy trong điều kiện tối đã có đáp ứng tạo rễ khác biệt. Sự thay đổi thành phần khoáng và vitamin cũng ảnh hưởng rõ rệt đến sự hình thành rễ. Phần trăm mẫu tạo rễ, số rễ/mẫu, trọng lượng tươi và khô của rễ lớn nhất khi phiến lá được nuôi trên môi trường khoáng Gamborg B5, vitamin Gamborg B5.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu sự phát sinh cơ quan từ lớp mỏng tế bào cây đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba) nuôi cấy in vitro

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 196-204<br /> <br /> NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN TỪ LỚP MỎNG TẾ BÀO<br /> CÂY ĐƯƠNG QUY NHẬT BẢN (Angelica acutiloba) NUÔI CẤY IN VITRO<br /> <br /> Hoàng Ngọc Nhung1, Nguyễn Thị Quỳnh1*, Nguyễn Vũ Ngọc Anh1,<br /> Nguyễn Lê Anh Thư1, Toyoki Kozai2<br /> (1)<br /> Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (*)qtnguyen_vn@yahoo.com<br /> (2)<br /> Trường đại học Chiba, Nhật Bản<br /> <br /> TÓM TẮT: Cây đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba) có giá trị dược liệu cao hơn các loài đương<br /> quy khác thuộc chi Angelica. Bộ rễ của cây được sử dụng lâu đời trong việc chữa bệnh cũng như trong<br /> nhiều đơn thuốc bổ theo y học cổ truyền ở nhiều nước châu Á. Trong nghiên cứu này, sự phát sinh cơ<br /> quan ở cây đương quy Nhật Bản từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào của chồi ngọn và từ nuôi cấy phiến lá đã<br /> được thực hiện. Lớp mỏng (bề dày từ 1-1,5 mm) cắt từ chồi in vitro được nuôi cấy trên môi trường MS có<br /> bổ sung NAA (0; 0,1; 0,2 mg/l) kết hợp với TDZ (0,1; 0,5; 1mg/l). Số chồi lớn nhất (8,9 chồi/mẫu) xuất<br /> phát từ lớp mỏng chồi nuôi cấy trên môi trường có 0,1 mg/l NAA và 1 mg/l TDZ. Khi thay vitamin Morel<br /> bằng vitamin Gamborg B5, bổ sung 10% (v/v) nước dừa và 40 mg/l adenine, số chồi tăng rõ rệt. Phiến lá<br /> cây đương quy Nhật Bản in vitro cũng đã được chứng minh là nguồn nguyên liệu tốt cho việc sản xuất rễ<br /> bất định. Trên môi trường MS có bổ sung kinetin (0 hoặc 1 mg/l) kết hợp với NAA (4, 6, 8, 10, 12 mg/l),<br /> hoặc IBA (4, 6, 8, 10, 12 mg/l), phiến lá mở thứ nhất (tính từ ngọn) nuôi cấy trong điều kiện tối đã có đáp<br /> ứng tạo rễ khác biệt. Sự thay đổi thành phần khoáng và vitamin cũng ảnh hưởng rõ rệt đến sự hình thành<br /> rễ. Phần trăm mẫu tạo rễ, số rễ/mẫu, trọng lượng tươi và khô của rễ lớn nhất khi phiến lá được nuôi trên<br /> môi trường khoáng Gamborg B5, vitamin Gamborg B5.<br /> Từ khóa: Angelica acutiloba, chất điều hòa sinh trưởng thực vật, phát sinh cơ quan, rễ bất định.<br /> <br /> MỞ ĐẦU trồng phải đáp ứng các tiêu chuẩn nghiêm ngặt,<br /> bảo đảm được tính sạch và sự ổn định về chất<br /> Cây đương quy Nhật Bản (Angelica<br /> lượng của hợp chất thứ cấp có trong cây,<br /> acutiloba) thuộc họ Hoa tán (Apiaceae), là loài<br /> phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật là một<br /> thân thảo lớn, có chiều cao trung bình 40-80 cm,<br /> trong những phương pháp nhân giống hữu hiệu<br /> được du nhập vào Việt Nam từ năm 1996 và<br /> nhất để tạo một lượng lớn cây đương quy đồng<br /> trồng ở các tỉnh Hà Giang, Lào Cai, xung quanh<br /> nhất, sạch bệnh trong một thời gian nhất định và<br /> Hà Nội. Rễ của cây đương quy 3 năm tuổi được<br /> không phụ thuộc vào điều kiện thời tiết.<br /> đào vào mùa thu, rồi sấy than, cắt thành lát<br /> mỏng dùng làm thuốc. Những lá non có thể ăn Trong bài này, chúng tôi trình bày kết quả<br /> sống hoặc làm trà tươi uống. Trong y học cổ tạo chồi và rễ bất định từ nuôi cấy lớp mỏng<br /> truyền của Trung Quốc, đương quy là thuốc đầu chồi ngọn và phiến lá cây đương quy Nhật Bản<br /> vị, dùng rất phổ biến trong thuốc chữa bệnh phụ in vitro dưới ảnh hưởng của thành phần hóa học<br /> nữ, thiếu máu, suy nhược cơ thể, đồng thời và một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật<br /> được chỉ định trong nhiều đơn thuốc bổ dựa vào (ĐHSTTV) bổ sung trong môi trường nuôi cấy,<br /> các hợp chất chính như ligustilide, nhằm hướng đến việc xây dựng hệ thống nhân<br /> butylidenephthalide và acid ferulic. Các chồi và rễ in vitro hữu hiệu để phục vụ cho nhu<br /> polysaccharide có mặt trong rễ của cây đương cầu dược liệu trong nước.<br /> quy Nhật Bản còn có khả năng kích thích hệ<br /> thống miễn dịch của cơ thể [6]. Trong dân gian, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> cây đương quy thường được trồng bằng hạt, tuy<br /> nhiên, hạt chỉ có thể thu được vào một thời gian Vật liệu<br /> nhất định trong năm, thường vào năm thứ 3 sau Chồi in vitro và phiến lá cây đương quy<br /> khi trồng, và sức nảy mầm giảm nhanh chóng Nhật Bản (Angelica acutiloba) lấy từ cây mầm<br /> sau một thời gian ngắn. Do nhu cầu về giống phát triển từ hạt được nuôi cấy trên môi trường<br /> cây ngày càng tăng, đồng thời đòi hỏi việc nuôi MS [9].<br /> <br /> <br /> 196<br /> Ngoc Nhung Hoang et al.<br /> <br /> Môi trường nuôi cấy in vitro Nhật Bản in vitro<br /> Môi trường khoáng MS hoặc khoáng Mẫu cấy là phiến lá mở thứ nhất từ chồi in<br /> Gamborg B5 [3], có bổ sung vitamin Morel vitro của cây đương quy Nhật Bản, mỗi mẫu<br /> hoặc Gamborg B5, 30 g/l đường sucrose (công được rạch 9 đường ngẫu nhiên để tạo vết<br /> ty Đường Biên Hòa), 7,3 g/l agar (công ty Cổ thương. Mẫu được nuôi cấy trên môi trường<br /> phần Đồ hộp Hạ Long). pH của môi trường khoáng MS, vitamin Morel, có bổ sung NAA<br /> trước khi khử trùng là 5,8. Môi trường được hoặc IBA ở các nồng độ 4, 6, 8, 10, và 12 mg/l<br /> khử trùng ở nhiệt độ 121oC, 1 atm trong 20 phút. và kinetin ở các nồng độ 0 và 1 mg/l. Mỗi công<br /> Các thí nghiệm đều được lặp lại 3 lần, thời gian thức có 2 bình (V = 130 ml), mỗi bình có 2 mẫu<br /> thí nghiệm 6 tuần (42 ngày). và chứa 20 ml môi trường. Mẫu nuôi cấy được<br /> Phương pháp đặt hoàn toàn trong tối, nhiệt độ phòng nuôi là<br /> Ảnh hưởng của NAA và TDZ lên sự tạo chồi từ 25oC. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Tỷ lệ (%)<br /> nuôi cấy lớp mỏng chồi của cây đương quy mẫu tạo mô sẹo và tạo rễ được xác định sau 42<br /> Nhật Bản ngày nuôi cấy.<br /> Chồi (đã loại bỏ hết lá) được cắt ngang thành Ảnh hưởng của loại môi trường khoáng và<br /> 3 lớp mỏng (chiều dày khoảng 1 mm) và được đặt vitamin lên sự tạo rễ từ phiến lá cây đương quy<br /> vào môi trường MS, vitamin Morel, bổ sung 30 Nhật Bản in vitro<br /> g/l đường sucrose, 7,3 g/l agar, chất ĐHSTTV là Phiến lá được nuôi cấy trên môi trường<br /> NAA (0; 0,1; 0,2 mg/l) và TDZ (0,1; 0,5; 1 mg/l). khoáng MS hoặc Gamborg B5, và vitamin<br /> Thí nghiệm gồm 9 công thức, mỗi công thức 3 Morel hoặc Gamborg B5, có bổ sung 10 mg/l<br /> bình (V = 130 ml), mỗi bình có 1 chồi cắt thành 3 NAA. Mỗi công thức có 7 bình (V = 130 ml),<br /> lớp và chứa 20 ml môi trường. Thí nghiệm được mỗi bình có 1 mẫu và chứa 20 ml môi trường.<br /> đặt trong tủ vi khí hậu (công ty Sanyo, Japan) Điều kiện nuôi cấy như thí nghiệm trên. Thí<br /> dưới cường độ ánh sáng 50 µmol m-2 s-1 (30 µmol nghiệm được lặp lại 3 lần. Tỷ lệ (%) mẫu tạo<br /> m-2 s-1 trong 3 tuần đầu), thời gian chiếu sáng 16 mô sẹo và tạo rễ, số rễ/mẫu, khối lượng tươi,<br /> giờ/ngày, nhiệt độ nuôi cấy là 25oC. Thí nghiệm trọng lương khô của rễ được xác định ở ngày<br /> được lặp lại 3 lần. Chỉ tiêu theo dõi là số chồi/mẫu thứ 42.<br /> hình thành theo thời gian nuôi cấy (chồi ≥ 1 mm).<br /> Các số liệu được phân tích thống kê bằng<br /> Vai trò của vitamin, nước dừa và adenine lên sự<br /> phần mềm MSTATC phiên bản 2.10 của Đại<br /> tạo chồi từ nuôi cấy lớp mỏng chồi<br /> học bang Michigan, Mỹ.<br /> Chồi sau khi loại bỏ lá được cắt ngang thành<br /> 2 lớp mỏng (chiều dày khoảng 1 mm) và đặt vào KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> môi trường thí nghiệm với thành phần khoáng đa<br /> lượng MS, vi lượng MS, bổ sung 30 g/l đường Ảnh hưởng của NAA và TDZ lên sự tạo chồi<br /> sucrose, 7,3 g/l agar, 0,1 mg/l NAA và 1 mg/l từ nuôi cấy lớp mỏng chồi của cây đương quy<br /> TDZ. Thí nghiệm được bố trí với 6 công thức Nhật Bản<br /> nhằm khảo sát ảnh hưởng của vitamin Morel Số lượng chồi hình thành tăng dần ở các<br /> hoặc vitamin Gamborg B5 trong môi trường nuôi công thức theo thời gian nuôi cấy (bảng 1). Ảnh<br /> cấy lớp mỏng, không hoặc có bổ sung nước dừa hưởng của NAA ở nồng độ thấp (0,1 mg/l) hay<br /> (10%, v/v), không hoặc có bổ sung adenine cao (0,2 mg/l) lên sự tạo chồi mới của mẫu ban<br /> sulphate (40 mg/l). Mỗi công thức có 3 bình (V = đầu chưa rõ rệt so với mẫu nuôi cấy trên môi<br /> 130 ml), mỗi bình có 1 chồi được cắt thành 2 lớp trường không có NAA, cho dù nồng độ của<br /> và chứa 20 ml môi trường. Thí nghiệm được lặp TDZ cao (1 mg/l) hay thấp (0,1 mg/l). Tuy<br /> lại 3 lần. Điều kiện nuôi cấy và chỉ tiêu theo dõi nhiên, việc bổ sung 0,1 mg/l NAA và 1 mg/l<br /> kế thừa từ thí nghiệm trên. TDZ (công thức L6) vào môi trường đã kích<br /> Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thích mẫu cấy lớp mỏng chồi và làm gia tăng số<br /> thực vật lên sự tạo rễ từ phiến lá cây đương quy chồi hình thành/mẫu cấy so với các công thức<br /> khác ngay sau 2 tuần nuôi cấy (bảng 1).<br /> <br /> 197<br /> TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 196-204<br /> <br /> Bảng 1. Ảnh hưởng của NAA và TDZ lên sự hình thành chồi của cây đương quy Nhật Bản theo<br /> thời gian nuôi cấy<br /> Công thức thí nghiệm Số chồi (chồi/mẫu cấy)<br /> Ký hiệu NAA (mg/l) TDZ (mg/l) Tuần 2 Tuần 4 Tuần 6<br /> L1 0 0,1 1,4 bcx 1,7 e 2,2 f<br /> L2 0 0,5 1,4 bc 2,7 d 3,9 cd<br /> L3 0 1 0,9 c 1,4 e 2,0 f<br /> L4 0,1 0,1 1,4 bc 3,3 bc 4,3 c<br /> L5 0,1 0,5 1,6 d 2,1 de 4,3 c<br /> L6 0,1 1 4,1 a 6,3 a 8,9 a<br /> L7 0,2 0,1 1,1 bc 1,7 e 3,2 e<br /> L8 0,2 0,5 0,9 c 2,7 cd 3,7 de<br /> L9 0,2 1 1,4 bc 3,4 b 7,8 b<br /> ANOVAy<br /> Nồng độ NAA (A) ** ** **<br /> Nồng độ TDZ (B) ** ** **<br /> A×B ** ** **<br /> CV (%) 14,28 10,28 5,86<br /> y<br /> **: khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,01; x Các số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự<br /> khác biệt theo phân hạng Duncan’s Multiple Range Test.<br /> <br /> Sau 6 tuần, số chồi hình thành ở các công thức L3 (1 mg/l TDZ và không có NAA)<br /> thức tiếp tục gia tăng và sự khác biệt trở nên rất (hình 1). Ngoài ra, chồi xuất hiện tập trung trên<br /> có ý nghĩa (bảng 1). Số lượng chồi cao nhất ở lớp mỏng 1 và 2 tính từ ngọn và hầu như không<br /> công thức L6 (8,9 chồi/mẫu) và thấp nhất ở công thấy xuất hiện trên lớp mỏng thứ 3.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. Cụm chồi cây đương quy Nhật bản sau 6 tuần nuôi cấy<br /> (ký hiệu tên nghiệm thức theo bảng 1)<br /> <br /> <br /> 198<br /> Ngoc Nhung Hoang et al.<br /> <br /> TDZ được biết đến như một cytokinin loại giữa 0,1 mg/l NAA và 1 mg/l TDZ có lẽ đã đạt<br /> phenylurea và được sử dụng thay thế cho BA được thế cân bằng phù hợp cho sự hình thành<br /> trong nhiều nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào thực chồi từ nuôi cấy lớp mỏng chồi cây đương quy.<br /> vật trong thời gian gần đây. Sự có mặt của TDZ Vai trò của vitamin, nước dừa và adenine<br /> trong môi trường, ở nồng độ thấp hoặc vừa phải, lên sự tạo chồi từ nuôi cấy lớp mỏng chồi<br /> đã thúc đẩy sự sinh tổng hợp cytokinin nội sinh<br /> ở mô thực vật nuôi cấy [7]. Bên cạnh đó, tỷ lệ Ảnh hưởng của loại vitamin, nước dừa và<br /> giữa auxin và cytokinin đóng vai trò hết sức adenine lên sự tạo chồi từ nuôi cấy lớp mỏng<br /> quan trọng đối với sự phát sinh hình thái cơ của cây đương quy diễn ra chậm. Số chồi hình<br /> quan trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Vì vậy, thành ở các công thức không có sự khác biệt về<br /> sự vắng mặt của NAA trong môi trường nuôi mặt thống kê sau 2 tuần nuôi cấy. Tuy nhiên, ở<br /> cấy có thể đã gây nên sự mất cân bằng về tỷ lệ tuần nuôi cấy thứ 4, sự thay đổi loại vitamin<br /> giữa auxin và cytokinin, hoặc dẫn đến sự dư cũng như sự bổ sung thêm nước dừa và adenine<br /> thừa cytokinin và tạo phản ứng ngược lên sự đã gây các phản ứng khác nhau đối với mô nuôi<br /> sinh tổng hợp cytokinin của tế bào. Tỷ lệ 1:10 cấy (bảng 2).<br /> <br /> Bảng 2. Ảnh hưởng của loại vitamin, nước dừa và adenine lên sự hình thành chồi của cây đương<br /> quy theo thời gian nuôi cấy<br /> Số chồi (chồi/ mẫu cấy)<br /> Tên công thức thí nghiệm<br /> Tuần 2 Tuần 4 Tuần 6<br /> M (Vitamin Morel) 0,25 2,71 ex 9,83 d<br /> MC (Vitamin Morel + 10% nước dừa) 0,08 3,67 c 10,67 c<br /> MCA (Vitamin Morel + 10% nước dừa + 40 mg/l<br /> 0,42 1,92 f 7,17 f<br /> adenine)<br /> B (Vitamin Gamborg B5 ) 0,13 3,42 d 7,96 e<br /> BC (Vitamin Gamborg B5 + 10% nước dừa) 1,08 6,08 b 14,29 b<br /> BCA (Vitamin Gamborg B5 + 10% nước dừa + 40<br /> 1,21 9,88 a 16,33 a<br /> mg/l adenine)<br /> ANOVAy<br /> Vitamin (A) * ** **<br /> Nước dừa và adenine (B) * ** **<br /> AxB NS ** **<br /> CV(%) 89,5 2,12 0,65<br /> y<br /> NS, *, **: không khác biệt hoặc khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05 hoặc 0,0; x Các số có chữ cái giống<br /> nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo phân hạng Duncan’s Multiple Range Test.<br /> <br /> Khi thay vitamin Morel bằng vitamin vitamin của môi trường Gamborg B5 được sử<br /> Gamborg B5, số chồi/mẫu gia tăng rõ rệt sau 4 dụng (bảng 2).<br /> tuần nuôi cấy ở cả 3 công thức B, BC và BCA. Vai trò kích thích tăng trưởng của nước dừa<br /> Số chồi/mẫu trên môi trường BC hơn gần hai đã được đề cập đến trong nhiều công trình vi<br /> lần so với số chồi/mẫu trên môi trường MC nhân giống lan. Nước dừa có chứa nhiều loại<br /> (bảng 2). Ở tất cả các công thức, sồ chồi đều gia cytokinin như kinetin, trans-zeatin và một số<br /> tăng sau 6 tuần nuôi cấy. Số chồi/mẫu lớn nhất chất kích thích tố sinh trưởng thực vật khác<br /> thu nhận được ở công thức BCA (16,33 chưa được định danh thuộc nhóm gibberellin và<br /> chồi/mẫu) và nhỏ nhất ở nghiệm thức MCA auxin [13]. Ngoài ra, nước dừa còn có các vi<br /> (7,17 chồi/mẫu). Sự hiện diện của nước dừa làm lượng như sắt và vitamin, các acic amin,<br /> gia tăng đáng kể số chồi/mẫu, tuy nhiên, sự bổ đường... có thể được đưa vào hệ thống<br /> sung thêm adenine chỉ có ảnh hưởng rõ rệt khi antioxidant của cơ thể người. Trong nuôi cấy<br /> <br /> <br /> 199<br /> TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 196-204<br /> <br /> tạo chồi cây oliu, nước dừa đã thành công trong từ phiến lá cây đương quy Nhật Bản<br /> việc thay thế zeatin trong môi trường nuôi cấy Tỷ lệ (%) mẫu tạo rễ ở các công thức vào<br /> và trong các giai đoạn tiếp theo của quy trình ngày thứ 42 có sự khác biệt rất ý nghĩa khi kết<br /> nhân giống [11]. Ảnh hưởng của adenine lên sự hợp cả 2 yếu tố. Khi khảo sát ảnh hưởng của<br /> tăng sinh chồi được mô tả trong thí nghiệm này NAA có hoặc không có kết hợp với kinetin, tỷ lệ<br /> khi môi trường khoáng MS kết hợp với vitamin mẫu tạo rễ cao khi mẫu được nuôi cấy trên môi<br /> Gamborg B5. Nandagopal & Kumari (2006) trường chỉ có NAA ở các nồng độ 6, 8, 10 hoặc<br /> [10] cũng đã chứng minh trên cây 12 mg/l (bảng 3A). Khi khảo sát ảnh hưởng của<br /> Cichorium intybus về sự hình thành mô sẹo và IBA có hoặc không có kết hợp với kinetin, trên<br /> tái sinh chồi đạt hiệu quả cao nhất khi bổ sung môi trường chỉ có 6 hay 8 mg/l IBA, hoặc trên<br /> 1,36 µM adenine vào môi trường MS có môi trường IBA kết hợp với 1 mg/l kinetin, ở<br /> vitamin Gamborg B5. nồng độ 10 hay 12 mg/l, tỷ lệ mẫu tạo rễ cao hơn<br /> Ảnh hưởng của chất ĐHSTTV lên sự tạo rễ các nghiệm thức còn lại (bảng 3B).<br /> <br /> Bảng 3. (A) Ảnh hưởng của NAA, kinetin hoặc (B) IBA, kinetin lên % mẫu tạo mô sẹo, % mẫu tạo<br /> rễ từ phiến lá cây đương quy Nhật Bản nuôi cấy in vitro ngày thứ 42<br /> <br /> A B<br /> Tên công % mẫu tạo Tên công % mẫu tạo % mẫu tạo<br /> % mẫu tạo rễ<br /> thứcz mô sẹo thứcz mô sẹo rễ<br /> N4K1 88,89 33,33 cx I4K1 77,78 ab 55,56 abcx<br /> N4K0 77,78 33,33 c I4K0 22,21 d 55,56 abc<br /> N6K1 66,67 77,78 ab I6K1 66,67 abc 66,67 abc<br /> N6K0 55,56 66,67 ab I6K0 66,67 abc 88,89 a<br /> N8K1 55,56 55,56 bc I8K1 66,67 abc 33,33 c<br /> N8K0 33,33 88,89 a I8K0 33,33 cd 66,67 abc<br /> N10K1 100 0d I10K1 100 a 77,77 ab<br /> N10K0 77,77 77,77 ab I10K0 33,33 cd 33,33 c<br /> N12K1 83,33 0d I12K1 53,33 bcd 55,56 abc<br /> N12K0 72,22 72,22 ab I12K0 44,44 bcd 44,44 bc<br /> ANOVAy ANOVAy<br /> NAA (A) ** ** IBA (A) * *<br /> KINETIN (B) ** ** KINETIN (B) ** NS<br /> AxB NS ** AxB ** **<br /> CV (%) 19,61 24,82 CV (%) 28,5 24,14<br /> z<br /> N tượng trưng NAA, I tượng trưng IBA; K tượng trưng cho kinetin; các số đi kèm với N hoặc K hoặc I là<br /> nồng độ của NAA hoặc IBA hoặc kinetin được sử dụng trong nghiệm thức; y NS, *, **: không khác biệt hoặc<br /> khác biệt có ý nghĩa ở p ≤ 0,05 và 0,01; x Các trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự<br /> khác biệt theo phân hạng Duncan’s Multiple Range Test.<br /> <br /> Các loại tế bào khác nhau đáp ứng với chất ứng lại bằng cách phản biệt hóa tạo khối mô<br /> ĐHSTTV khác nhau. Các tế bào vùng nhu mô sẹo. Tuy nhiên, mô sẹo hình thành là những<br /> là những tế bào có chức năng hoàn chỉnh. Do khối có dạng tròn, xốp, màu nâu nhạt, khả năng<br /> đó, khi bị thương và dưới tác động của tổ hợp tái biệt hóa rất thấp. Khác với tế bào vùng nhu<br /> chất ĐHSTTV, các tế bào vùng nhu mô sẽ đáp mô, các tế bào vùng tượng tầng libe-mộc là<br /> <br /> 200<br /> Ngoc Nhung Hoang et al.<br /> <br /> những tế bào mô phân sinh cấp hai. Vì vậy, phản biệt hóa mà được hoạt hóa trực tiếp để<br /> dưới tác động của các chất điều hòa sinh trưởng hình thành vùng tế bào mô phân sinh, tạo sơ<br /> thực vật, các tế bào này không trải qua quá trình khởi rễ (hình 2a).<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2. Sự hình thành rễ bất định từ phiến lá cây đương quy Nhật bản<br /> a. Sơ khởi rễ hình thành từ vùng tượng tầng libe-mộc (thanh ngang = 10 µm);<br /> b. Rễ bất định hình thành trên môi trường có bổ sung 10 mg/l NAA (thanh ngang = 5 mm).<br /> <br /> Auxin làm giảm tích lũy của cytokinin và môi trường có bổ sung IBA ở nồng độ 6 mg/l<br /> ngược lại cytokinin ức chế một số hoạt tính của hoặc IBA nồng độ 10 mg/l , 1 mg/l kinetin cho<br /> auxin [4]. Chẳng hạn như, ở nồng độ 10 mg/l kết quả tạo rễ khá cao, nhưng rễ tạo ra lại mảnh,<br /> NAA, tỷ lệ mẫu tạo rễ là 77,77% (nghiệm thức ngắn so với rễ tạo từ phiến lá trên môi trường có<br /> N10K0). Tuy nhiên, khi bổ sung 1 mg/l kinetin, bổ sung 10 mg/l NAA (hình 2b). Phản ứng khác<br /> mẫu không đáp ứng tạo rễ (nghiệm thức N10K1), nhau của mẫu cấy phiến lá đối với hai loại auxin<br /> nhưng tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo lại tăng (bảng 3a). này có thể do sự nhận biết tín hiệu dẫn đến sự<br /> Yang & Chuang (1995) [12] khi khảo sát sự tạo đáp ứng của mẫu cấy đối với hai loại auxin này<br /> rễ từ nuôi cấy tạo mô sẹo của cây đương quy là khác nhau.<br /> Trung Quốc - Angelica sinensis cũng đã chứng Ảnh hưởng của loại môi trường khoáng<br /> minh, đối với vật liệu là cuống lá ex vitro, mô và vitamin lên sự tạo mô sẹo và rễ từ phiến lá<br /> sẹo được hình thành trên môi trường MS có nuôi cấy in vitro của cây đương quy<br /> chứa 15 mg/l NAA và 2 mg/l kinetin, trong khi Nhật Bản<br /> môi trường MS có chứa 15 mg/l NAA và 4 mg/l<br /> kinetin lại thích hợp cho sự hình thành rễ. Ở ngày thứ 42, tỷ lệ (%) mẫu tạo mô sẹo và<br /> tạo rễ trong các công thức nuôi cấy có sự khác<br /> Bên cạnh đó, loại auxin khác nhau cũng tác biệt rất ý nghĩa khi xét cả hai yếu tố là loại môi<br /> động lên mẫu cấy khác nhau. Mẫu nuôi cấy trên trường và vitamin (hình 3).<br /> <br /> <br /> Hình 3. Mô sẹo, rễ hình thành từ phiến lá<br /> cây đương quy Nhật Bản dưới ảnh hưởng<br /> của môi trường khoáng MS, Gamborg B5<br /> và vitamin Morel, vitamin Gamborg B5<br /> ngày thứ 42 (thanh ngang = 5 mm)<br /> <br /> M hay B bên trái tượng trưng cho môi trường<br /> khoáng MS hay khoáng Gamborg B5; M hay B<br /> bên phải tượng trưng cho vitamin Morel hay<br /> Gamborg B5.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 201<br /> TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 196-204<br /> <br /> Mẫu nuôi cấy trên môi trường khoáng và hầu hết các loại cây do giàu và cân bằng về mặt<br /> vitamin Gamborg B5 (công thức BB) có tỷ lệ mẫu hàm lượng khoáng. Tuy nhiên, môi trường<br /> tạo mô sẹo và rễ đạt cao nhất (100%) (bảng 4). Gamborg B5 cũng được sử dụng trong nuôi cấy<br /> Nghiệm thức BB có số rễ hình thành/mẫu, tạo mô sẹo và rễ ở một số loại cây như sâm<br /> khối lượng tươi và khối lượng khô cao nhất, Ngọc Linh (Panax vietnamensis) [7]. Quá trình<br /> trong khi nghiệm thức MB có số rễ hình phiến lá tạo rễ bất định có thể chia làm hai giai<br /> thành/mẫu, khối lượng tươi và khối lượng khô đoạn: giai đoạn đầu là các tế bào tượng tầng<br /> của rễ thấp nhất (bảng 4). libe-mộc được cảm ứng tạo sơ khởi rễ, giai<br /> đoạn sau là sự phát triển thành cơ quan rễ hoàn<br /> Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, môi chỉnh. Dưới tác động của nồng độ 10 mg/l<br /> trường khoáng MS được sử dụng phổ biến cho NAA, sơ khởi rễ được hình thành.<br /> <br /> Bảng 4. Ảnh hưởng của thành phần môi trường khoáng và loại vitamin lên tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo, tỷ<br /> lệ mẫu tạo rễ, số rễ hình thành/mẫu, khối lượng tươi (KLT), khối lượng khô (KLK) của rễ từ phiến<br /> lá cây đương quy Nhật Bản ngày thứ 42<br /> % mẫu tạo mô Số rễ hình KLT KLK<br /> Tên công thứcz % mẫu tạo rễ<br /> sẹo thành/mẫu (mg/mẫu) (mg/mẫu)<br /> MM 57,1 cx 57,1 c 8c 19,7 c 2,8 c<br /> MB 33,4 d 33,4 d 2d 5,7 c 0,9 d<br /> BM 71,4 b 71,4 b 17 b 44,3 b 4,7 b<br /> BB 100,0 a 100,0 a 31 a 86,5 a 9,9 a<br /> ANOVAy<br /> KHOÁNG (A) ** ** ** ** **<br /> VITAMIN (B) NS NS ** ** **<br /> AxB ** ** ** ** **<br /> CV (%) 6,3 6,3 3,5 14,8 13,9<br /> z<br /> M hay B (bên trái): môi trường khoáng MS hay khoáng Gamborg B5; M hay B (bên phải): vitamin Morel<br /> hay Gamborg B5; y NS, **: không khác biệt hoặc khác biệt có ý nghĩa ở p ≤ 0,01; x Các trị số có chữ cái<br /> giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo phân hạng LSD Test.<br /> <br /> Tùy vào từng giai đoạn phát triển, nhu cầu lần trong thành phần khoáng Gamborg B5, có<br /> dinh dưỡng ở các loại tế bào cũng khác nhau. thể gây cản trở sự đồng hóa đạm của rễ và sự<br /> Theo George & Davies (2003) [5], sự phát triển hấp thu các ion K+, Ca2+ hay Mg2+. Trong khi<br /> của tế bào rễ sẽ bị kìm hãm nếu môi trường NO3- giúp cho sự thấm cation, K+ có vai trò<br /> chứa nhiều amonium (NH4+), nhưng ngược lại trong sự cân bằng ion (điều hòa thế thẩm thấu<br /> rễ tăng trưởng cần nitrate (NO3-). Điều này liên của tế bào), sự đóng mở của khí khổng, hoạt<br /> quan mật thiết đến sự đồng hóa đạm của rễ. Giai hóa enzyme và tổng hợp protein. Như vậy, kết<br /> đoạn đầu tiên của sự đồng hóa đạm là sự khử quả thí nghiệm đã cho thấy, nồng độ khoáng đa<br /> nitrate, thường xảy ra ở rễ, trong tối. Tiếp theo lượng của môi trường Gamborg B5 thích hợp<br /> là sự tổng hợp acid amin có vai trò quan trọng hơn cho việc tạo rễ từ nuôi cấy phiến lá cây<br /> trong sự tổng hợp protein của tế bào. Đặc biệt, đương quy Nhật Bản.<br /> sự đồng hóa đạm có những đặc điểm sau: mô<br /> non thích NH4+, NH4+ đối kháng với K+, Ca2+ Vitamin tác động rõ rệt lên số rễ/mẫu và<br /> hay Mg2+. Do đó nếu dùng NH4+ quá nhiều sẽ khối lượng tươi, khối lượng khô của rễ (bảng 4).<br /> gây thiếu K+, Ca2+ hay Mg2+ [1]. Ở môi trường Vitamin là hợp chất cần thiết cho nhiều phản<br /> khoáng MS, có tỷ lệ KNO3/NH4NO3 = 1,15; ứng sinh hóa, trong đó thiamine (B1), nicotinic<br /> trong khi ở môi trường Gamborg B5 tỷ lệ acid (B3), myo-inositol, pyridoxine (B6) là<br /> KNO3/(NH4)2SO4 = 18,65. Như vậy, nồng độ những vitamin thường dùng trong nuôi cấy mô<br /> NH4+ trong thành phần khoáng MS cao gấp 10 thực vật. Trong thành phần vitamin Gamborg<br /> <br /> <br /> 202<br /> Ngoc Nhung Hoang et al.<br /> <br /> B5 nồng độ thiamine cao gấp 10 lần so với nồng 5. George E. F., Davies W., 2003. Effects of<br /> độ thiamine trong vitamin Morel. Thiamine the Physical Environment. Plant<br /> được xem là chất cần thiết cho quá trình cảm Propagation by Tissue Culture, 3rd Edition<br /> ứng tạo rễ bất định ở cây Taxus sp. [2]. Cơ chế 1: The Background. George EF, Hall MA,<br /> này chưa được biết rõ trên cây đương quy Nhật Klerk GJ De (eds.) Springer, Dordrecht,<br /> Bản, nhưng số lượng rễ hình thành trên mẫu Netherlands: 245-246.<br /> nuôi ở môi trường khoáng và vitamin Gamborg 6. Kumazawa Y., Mizunoe K., Otsuka Y.,<br /> B5 cao hơn so với các công thức khác có thể là 1982. Immunostimultaing polysacchride<br /> do tác động của thiamine. separated from hot water extract of Angelica<br /> acutiloba Kitagawa (Yamato tohki). Pub.<br /> KẾT LUẬN<br /> Med. Immunology, 47(1): 75-83.<br /> Sự tạo chồi trực tiếp của cây đương quy 7. Nguyễn Thị Liễu, Nguyễn Trung Thành và<br /> Nhật Bản có thể được thực hiện bằng phương Nguyễn Văn Kết, 2010. Nghiên cứu khả<br /> pháp nuôi cấy lớp mỏng chồi ngọn trên môi năng tạo rễ bất định của sâm Ngọc Linh<br /> trường khoáng MS, vitamin Gamborg B5, bổ (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) trong<br /> sung 0,1 mg/l NAA, 1 mg/1 TDZ, 30 g/l đường nuôi cấy in vitro. Tạp chí khoa học ĐHQG<br /> sucrose, 10% (v/v) nước dừa và 40 mg/l adenine. Hà Nội, Khoa học tự nhiên và Công Nghệ,<br /> Tỷ lệ mẫu tạo rễ từ phiến lá cũng như số rễ 27: 30-36.<br /> hình thành/mẫu, khối lượng tươi, khối lượng 8. Mok C., Mok S., Turner E., Mujer V., 1987.<br /> khô của rễ cao nhất khi phiến lá được nuôi cấy Biological and biochemical effects of<br /> trên môi trường khoáng và vitamin Gamborg B5, cytokinin-active phenylurea derivatives in<br /> có bổ sung 10 mg/l NAA. tissue culture systems. Hort. Sci., 22: 1194-<br /> Lời cảm ơn: Đề tài thuộc chương trình hợp tác 1197.<br /> nghiên cứu giữa Trường đại học Chiba, Nhật 9. Murashige T., Skoog F., 1962. A revised<br /> Bản và phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện medium for rapid growth and bioassays with<br /> Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công tobacco tissue cultures. Physiol. Plant,<br /> nghệ Việt Nam. 15(3): 473-497.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO 10. Nandagopal S. and Kumari D., 2006.<br /> Adenine sulphate induced high frequency<br /> 1. Avilla A., Pereira M. and Arguello A., shoot organogenesis in callus and in vitro<br /> 1998. Nitrogen concentration and flowering of Cichorium intybus L. cv. Focus<br /> proportion of NH4+-N affect potato cultivar - a potent medicinal plant. Acta agriculturae<br /> response in solid and liquid media. Hort. Slovenica, 87(2): 415-425.<br /> Sci., 33: 336-338.<br /> 11. Peixe A., Raposo A., Lourenço R., Cardoso<br /> 2. Chee P., 1995. Stimulation of adventitious H. and Macedo E., 2007. Coconut water and<br /> rooting of Taxus species by thiamine. Plant BAP successfully replaced zeatin in olive<br /> Cell Rep., 14: 753-757. (Olea europaea L.) micropropagation.<br /> 3. Gamborg L., Miller A. and Ojima K., 1968. Scientia Horticulturae, 113: 1-7.<br /> Nutrient requirements of suspension 12. Yang J. S. and Chuang S. H., 1995. Callus<br /> cultures of soybean root cells. Exp. Cell formation and plant regeneration from<br /> Res., 50: 151-158. petiole - derived calli of Angelica sinensis.<br /> 4. Gaspar T., Kevers C., Greppin H., Reid M. Plant Tis. Cul. Lett., 12(1): 91-93.<br /> and Thrope A., 1996. Plant hormones and 13. Yong H., Ge L., Yan N., Tan N., 2009. The<br /> plant growth regulators in plant tissue chemical composition and biological<br /> culture. In Vitro Cell Dev. Biol. Plant, 32: properties of coconut (Cocos nucifera L.)<br /> 272-289. water. Molecules, 14: 5144-5164.<br /> <br /> <br /> <br /> 203<br /> TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 196-204<br /> <br /> A STUDY ON ORGANOGENESIS FROM THIN CELL LAYER CULTURE<br /> OF Angelica acutiloba<br /> <br /> Hoang Ngoc Nhung1, Nguyen Thi Quynh1,<br /> Nguyen Vu Ngoc Anh1, Nguyen Le Anh Thu1, Toyoki Kozai2<br /> (1)<br /> Institute of Tropical Biology, VAST<br /> (2)<br /> Chiba University, Japan<br /> <br /> SUMMARY<br /> <br /> Angelica (Angelica acutiloba) plants originating in Japan were considered as of higher value than other<br /> varieties of the genus Angelica. Angelica’s roots have been used historically to treat health disorders and in<br /> many supplemental remedies in Asian traditional medicine. In this study, organogenesis from thin cell layer<br /> culture of japanese Angelica shoot tips and leaf blades was shown. Thin layers (1-1.5 mm thick) of shoot tips<br /> of Angelica were cultured on MS medium supplemented with NAA (0, 0.1, or 0.2 mg/l) and/or TDZ (0.1, 0.5<br /> or 1 mg/l). The numbe of shoots was the largest (8.9 shoots/explant) when explants were cultured on the<br /> medium supplemented with 0.1 mg/l NAA and 1 mg/l TDZ. When Morel vitamins were replaced by<br /> Gamborg’s B5 vitamins together with the addition of 10% (v/v) coconut water and 40 mg/l adenine to the<br /> culture medium, the number of shoots per explants was remarkably increased after 6 weeks of culture.<br /> In vitro Angelica leaves also proved a potential source for adventitious root production. On MS medium<br /> supplemented with kinetin (0 or 1 mg/l), NAA (4, 6, 8, 10 or 12 mg/l), IBA (4, 6, 8, 10 or 12 mg/l), the first<br /> open leaves from the shoot tip, when cultured in dark period, had a different response to the root formation.<br /> The root formation from japanese Angelica’s leaf culture significantly varied with the change of medium<br /> elements (minerals and vitamins). Percent of leaf explants having roots, number of roots per explant, root<br /> fresh and dry weights were the largest when leaf blades were cultured on the medium containing minerals and<br /> vitamins of Gamborg’s B5.<br /> Keywords: Angelica acutiloba, Adventitios root, organogenesis, plant growth substances.<br /> <br /> Ngày nhận bài: 21-6-2012<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 204<br />
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2