Nghiên cứu sự phát sinh cơ quan từ lớp mỏng tế bào cây đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba) nuôi cấy in vitro

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 196-204<br /> <br /> NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN TỪ LỚP MỎNG TẾ BÀO<br /> CÂY ĐƯƠNG QUY NHẬT BẢN (Angelica acutiloba) NUÔI CẤY IN VITRO<br /> <br /> Hoàng Ngọc Nhung1, Nguyễn Thị Quỳnh1*, Nguyễn Vũ Ngọc Anh1,<br /> Nguyễn Lê Anh Thư1, Toyoki Kozai2<br /> (1)<br /> Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (*)qtnguyen_vn@yahoo.com<br /> (2)<br /> Trường đại học Chiba, Nhật Bản<br /> <br /> TÓM TẮT: Cây đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba) có giá trị dược liệu cao hơn các loài đương<br /> quy khác thuộc chi Angelica. Bộ rễ của cây được sử dụng lâu đời trong việc chữa bệnh cũng như trong<br /> nhiều đơn thuốc bổ theo y học cổ truyền ở nhiều nước châu Á. Trong nghiên cứu này, sự phát sinh cơ<br /> quan ở cây đương quy Nhật Bản từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào của chồi ngọn và từ nuôi cấy phiến lá đã<br /> được thực hiện. Lớp mỏng (bề dày từ 1-1,5 mm) cắt từ chồi in vitro được nuôi cấy trên môi trường MS có<br /> bổ sung NAA (0; 0,1; 0,2 mg/l) kết hợp với TDZ (0,1; 0,5; 1mg/l). Số chồi lớn nhất (8,9 chồi/mẫu) xuất<br /> phát từ lớp mỏng chồi nuôi cấy trên môi trường có 0,1 mg/l NAA và 1 mg/l TDZ. Khi thay vitamin Morel<br /> bằng vitamin Gamborg B5, bổ sung 10% (v/v) nước dừa và 40 mg/l adenine, số chồi tăng rõ rệt. Phiến lá<br /> cây đương quy Nhật Bản in vitro cũng đã được chứng minh là nguồn nguyên liệu tốt cho việc sản xuất rễ<br /> bất định. Trên môi trường MS có bổ sung kinetin (0 hoặc 1 mg/l) kết hợp với NAA (4, 6, 8, 10, 12 mg/l),<br /> hoặc IBA (4, 6, 8, 10, 12 mg/l), phiến lá mở thứ nhất (tính từ ngọn) nuôi cấy trong điều kiện tối đã có đáp<br /> ứng tạo rễ khác biệt. Sự thay đổi thành phần khoáng và vitamin cũng ảnh hưởng rõ rệt đến sự hình thành<br /> rễ. Phần trăm mẫu tạo rễ, số rễ/mẫu, trọng lượng tươi và khô của rễ lớn nhất khi phiến lá được nuôi trên<br /> môi trường khoáng Gamborg B5, vitamin Gamborg B5.<br /> Từ khóa: Angelica acutiloba, chất điều hòa sinh trưởng thực vật, phát sinh cơ quan, rễ bất định.<br /> <br /> MỞ ĐẦU trồng phải đáp ứng các tiêu chuẩn nghiêm ngặt,<br /> bảo đảm được tính sạch và sự ổn định về chất<br /> Cây đương quy Nhật Bản (Angelica<br /> lượng của hợp chất thứ cấp có trong cây,<br /> acutiloba) thuộc họ Hoa tán (Apiaceae), là loài<br /> phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật là một<br /> thân thảo lớn, có chiều cao trung bình 40-80 cm,<br /> trong những phương pháp nhân giống hữu hiệu<br /> được du nhập vào Việt Nam từ năm 1996 và<br /> nhất để tạo một lượng lớn cây đương quy đồng<br /> trồng ở các tỉnh Hà Giang, Lào Cai, xung quanh<br /> nhất, sạch bệnh trong một thời gian nhất định và<br /> Hà Nội. Rễ của cây đương quy 3 năm tuổi được<br /> không phụ thuộc vào điều kiện thời tiết.<br /> đào vào mùa thu, rồi sấy than, cắt thành lát<br /> mỏng dùng làm thuốc. Những lá non có thể ăn Trong bài này, chúng tôi trình bày kết quả<br /> sống hoặc làm trà tươi uống. Trong y học cổ tạo chồi và rễ bất định từ nuôi cấy lớp mỏng<br /> truyền của Trung Quốc, đương quy là thuốc đầu chồi ngọn và phiến lá cây đương quy Nhật Bản<br /> vị, dùng rất phổ biến trong thuốc chữa bệnh phụ in vitro dưới ảnh hưởng của thành phần hóa học<br /> nữ, thiếu máu, suy nhược cơ thể, đồng thời và một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật<br /> được chỉ định trong nhiều đơn thuốc bổ dựa vào (ĐHSTTV) bổ sung trong môi trường nuôi cấy,<br /> các hợp chất chính như ligustilide, nhằm hướng đến việc xây dựng hệ thống nhân<br /> butylidenephthalide và acid ferulic. Các chồi và rễ in vitro hữu hiệu để phục vụ cho nhu<br /> polysaccharide có mặt trong rễ của cây đương cầu dược liệu trong nước.<br /> quy Nhật Bản còn có khả năng kích thích hệ<br /> thống miễn dịch của cơ thể [6]. Trong dân gian, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> cây đương quy thường được trồng bằng hạt, tuy<br /> nhiên, hạt chỉ có thể thu được vào một thời gian Vật liệu<br /> nhất định trong năm, thường vào năm thứ 3 sau Chồi in vitro và phiến lá cây đương quy<br /> khi trồng, và sức nảy mầm giảm nhanh chóng Nhật Bản (Angelica acutiloba) lấy từ cây mầm<br /> sau một thời gian ngắn. Do nhu cầu về giống phát triển từ hạt được nuôi cấy trên môi trường<br /> cây ngày càng tăng, đồng thời đòi hỏi việc nuôi MS [9].<br /> <br /> <br /> 196<br />  Ngoc Nhung Hoang et al.<br /> <br /> Môi trường nuôi cấy in vitro Nhật Bản in vitro<br /> Môi trường khoáng MS hoặc khoáng Mẫu cấy là phiến lá mở thứ nhất từ chồi in<br /> Gamborg B5 [3], có bổ sung vitamin Morel vitro của cây đương quy Nhật Bản, mỗi mẫu<br /> hoặc Gamborg B5, 30 g/l đường sucrose (công được rạch 9 đường ngẫu nhiên để tạo vết<br /> ty Đường Biên Hòa), 7,3 g/l agar (công ty Cổ thương. Mẫu được nuôi cấy trên môi trường<br /> phần Đồ hộp Hạ Long). pH của môi trường khoáng MS, vitamin Morel, có bổ sung NAA<br /> trước khi khử trùng là 5,8. Môi trường được hoặc IBA ở các nồng độ 4, 6, 8, 10, và 12 mg/l<br /> khử trùng ở nhiệt độ 121oC, 1 atm trong 20 phút. và kinetin ở các nồng độ 0 và 1 mg/l. Mỗi công<br /> Các thí nghiệm đều được lặp lại 3 lần, thời gian thức có 2 bình (V = 130 ml), mỗi bình có 2 mẫu<br /> thí nghiệm 6 tuần (42 ngày). và chứa 20 ml môi trường. Mẫu nuôi cấy được<br /> Phương pháp đặt hoàn toàn trong tối, nhiệt độ phòng nuôi là<br /> Ảnh hưởng của NAA và TDZ lên sự tạo chồi từ 25oC. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Tỷ lệ (%)<br /> nuôi cấy lớp mỏng chồi của cây đương quy mẫu tạo mô sẹo và tạo rễ được xác định sau 42<br /> Nhật Bản ngày nuôi cấy.<br /> Chồi (đã loại bỏ hết lá) được cắt ngang thành Ảnh hưởng của loại môi trường khoáng và<br /> 3 lớp mỏng (chiều dày khoảng 1 mm) và được đặt vitamin lên sự tạo rễ từ phiến lá cây đương quy<br /> vào môi trường MS, vitamin Morel, bổ sung 30 Nhật Bản in vitro<br /> g/l đường sucrose, 7,3 g/l agar, chất ĐHSTTV là Phiến lá được nuôi cấy trên môi trường<br /> NAA (0; 0,1; 0,2 mg/l) và TDZ (0,1; 0,5; 1 mg/l). khoáng MS hoặc Gamborg B5, và vitamin<br /> Thí nghiệm gồm 9 công thức, mỗi công thức 3 Morel hoặc Gamborg B5, có bổ sung 10 mg/l<br /> bình (V = 130 ml), mỗi bình có 1 chồi cắt thành 3 NAA. Mỗi công thức có 7 bình (V = 130 ml),<br /> lớp và chứa 20 ml môi trường. Thí nghiệm được mỗi bình có 1 mẫu và chứa 20 ml môi trường.<br /> đặt trong tủ vi khí hậu (công ty Sanyo, Japan) Điều kiện nuôi cấy như thí nghiệm trên. Thí<br /> dưới cường độ ánh sáng 50 µmol m-2 s-1 (30 µmol nghiệm được lặp lại 3 lần. Tỷ lệ (%) mẫu tạo<br /> m-2 s-1 trong 3 tuần đầu), thời gian chiếu sáng 16 mô sẹo và tạo rễ, số rễ/mẫu, khối lượng tươi,<br /> giờ/ngày, nhiệt độ nuôi cấy là 25oC. Thí nghiệm trọng lương khô của rễ được xác định ở ngày<br /> được lặp lại 3 lần. Chỉ tiêu theo dõi là số chồi/mẫu thứ 42.<br /> hình thành theo thời gian nuôi cấy (chồi ≥ 1 mm).<br /> Các số liệu được phân tích thống kê bằng<br /> Vai trò của vitamin, nước dừa và adenine lên sự<br /> phần mềm MSTATC phiên bản 2.10 của Đại<br /> tạo chồi từ nuôi cấy lớp mỏng chồi<br /> học bang Michigan, Mỹ.<br /> Chồi sau khi loại bỏ lá được cắt ngang thành<br /> 2 lớp mỏng (chiều dày khoảng 1 mm) và đặt vào KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> môi trường thí nghiệm với thành phần khoáng đa<br /> lượng MS, vi lượng MS, bổ sung 30 g/l đường Ảnh hưởng của NAA và TDZ lên sự tạo chồi<br /> sucrose, 7,3 g/l agar, 0,1 mg/l NAA và 1 mg/l từ nuôi cấy lớp mỏng chồi của cây đương quy<br /> TDZ. Thí nghiệm được bố trí với 6 công thức Nhật Bản<br /> nhằm khảo sát ảnh hưởng của vitamin Morel Số lượng chồi hình thành tăng dần ở các<br /> hoặc vitamin Gamborg B5 trong môi trường nuôi công thức theo thời gian nuôi cấy (bảng 1). Ảnh<br /> cấy lớp mỏng, không hoặc có bổ sung nước dừa hưởng của NAA ở nồng độ thấp (0,1 mg/l) hay<br /> (10%, v/v), không hoặc có bổ sung adenine cao (0,2 mg/l) lên sự tạo chồi mới của mẫu ban<br /> sulphate (40 mg/l). Mỗi công thức có 3 bình (V = đầu chưa rõ rệt so với mẫu nuôi cấy trên môi<br /> 130 ml), mỗi bình có 1 chồi được cắt thành 2 lớp trường không có NAA, cho dù nồng độ của<br /> và chứa 20 ml môi trường. Thí nghiệm được lặp TDZ cao (1 mg/l) hay thấp (0,1 mg/l). Tuy<br /> lại 3 lần. Điều kiện nuôi cấy và chỉ tiêu theo dõi nhiên, việc bổ sung 0,1 mg/l NAA và 1 mg/l<br /> kế thừa từ thí nghiệm trên. TDZ (công thức L6) vào môi trường đã kích<br /> Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thích mẫu cấy lớp mỏng chồi và làm gia tăng số<br /> thực vật lên sự tạo rễ từ phiến lá cây đương quy chồi hình thành/mẫu cấy so với các công thức<br /> khác ngay sau 2 tuần nuôi cấy (bảng 1).<br /> <br /> 197<br />  TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 196-204<br /> <br /> Bảng 1. Ảnh hưởng của NAA và TDZ lên sự hình thành chồi của cây đương quy Nhật Bản theo<br /> thời gian nuôi cấy<br /> Công thức thí nghiệm Số chồi (chồi/mẫu cấy)<br /> Ký hiệu NAA (mg/l) TDZ (mg/l) Tuần 2 Tuần 4 Tuần 6<br /> L1 0 0,1 1,4 bcx 1,7 e 2,2 f<br /> L2 0 0,5 1,4 bc 2,7 d 3,9 cd<br /> L3 0 1 0,9 c 1,4 e 2,0 f<br /> L4 0,1 0,1 1,4 bc 3,3 bc 4,3 c<br /> L5 0,1 0,5 1,6 d 2,1 de 4,3 c<br /> L6 0,1 1 4,1 a 6,3 a 8,9 a<br /> L7 0,2 0,1 1,1 bc 1,7 e 3,2 e<br /> L8 0,2 0,5 0,9 c 2,7 cd 3,7 de<br /> L9 0,2 1 1,4 bc 3,4 b 7,8 b<br /> ANOVAy<br /> Nồng độ NAA (A) ** ** **<br /> Nồng độ TDZ (B) ** ** **<br /> A×B ** ** **<br /> CV (%) 14,28 10,28 5,86<br /> y<br /> **: khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,01; x Các số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự<br /> khác biệt theo phân hạng Duncan’s Multiple Range Test.<br /> <br /> Sau 6 tuần, số chồi hình thành ở các công thức L3 (1 mg/l TDZ và không có NAA)<br /> thức tiếp tục gia tăng và sự khác biệt trở nên rất (hình 1). Ngoài ra, chồi xuất hiện tập trung trên<br /> có ý nghĩa (bảng 1). Số lượng chồi cao nhất ở lớp mỏng 1 và 2 tính từ ngọn và hầu như không<br /> công thức L6 (8,9 chồi/mẫu) và thấp nhất ở công thấy xuất hiện trên lớp mỏng thứ 3.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. Cụm chồi cây đương quy Nhật bản sau 6 tuần nuôi cấy<br /> (ký hiệu tên nghiệm thức theo bảng 1)<br /> <br /> <br /> 198<br />  Ngoc Nhung Hoang et al.<br /> <br /> TDZ được biết đến như một cytokinin loại giữa 0,1 mg/l NAA và 1 mg/l TDZ có lẽ đã đạt<br /> phenylurea và được sử dụng thay thế cho BA được thế cân bằng phù hợp cho sự hình thành<br /> trong nhiều nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào thực chồi từ nuôi cấy lớp mỏng chồi cây đương quy.<br /> vật trong thời gian gần đây. Sự có mặt của TDZ Vai trò của vitamin, nước dừa và adenine<br /> trong môi trường, ở nồng độ thấp hoặc vừa phải, lên sự tạo chồi từ nuôi cấy lớp mỏng chồi<br /> đã thúc đẩy sự sinh tổng hợp cytokinin nội sinh<br /> ở mô thực vật nuôi cấy [7]. Bên cạnh đó, tỷ lệ Ảnh hưởng của loại vitamin, nước dừa và<br /> giữa auxin và cytokinin đóng vai trò hết sức adenine lên sự tạo chồi từ nuôi cấy lớp mỏng<br /> quan trọng đối với sự phát sinh hình thái cơ của cây đương quy diễn ra chậm. Số chồi hình<br /> quan trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Vì vậy, thành ở các công thức không có sự khác biệt về<br /> sự vắng mặt của NAA trong môi trường nuôi mặt thống kê sau 2 tuần nuôi cấy. Tuy nhiên, ở<br /> cấy có thể đã gây nên sự mất cân bằng về tỷ lệ tuần nuôi cấy thứ 4, sự thay đổi loại vitamin<br /> giữa auxin và cytokinin, hoặc dẫn đến sự dư cũng như sự bổ sung thêm nước dừa và adenine<br /> thừa cytokinin và tạo phản ứng ngược lên sự đã gây các phản ứng khác nhau đối với mô nuôi<br /> sinh tổng hợp cytokinin của tế bào. Tỷ lệ 1:10 cấy (bảng 2).<br /> <br /> Bảng 2. Ảnh hưởng của loại vitamin, nước dừa và adenine lên sự hình thành chồi của cây đương<br /> quy theo thời gian nuôi cấy<br /> Số chồi (chồi/ mẫu cấy)<br /> Tên công thức thí nghiệm<br /> Tuần 2 Tuần 4 Tuần 6<br /> M (Vitamin Morel) 0,25 2,71 ex 9,83 d<br /> MC (Vitamin Morel + 10% nước dừa) 0,08 3,67 c 10,67 c<br /> MCA (Vitamin Morel + 10% nước dừa + 40 mg/l<br /> 0,42 1,92 f 7,17 f<br /> adenine)<br /> B (Vitamin Gamborg B5 ) 0,13 3,42 d 7,96 e<br /> BC (Vitamin Gamborg B5 + 10% nước dừa) 1,08 6,08 b 14,29 b<br /> BCA (Vitamin Gamborg B5 + 10% nước dừa + 40<br /> 1,21 9,88 a 16,33 a<br /> mg/l adenine)<br /> ANOVAy<br /> Vitamin (A) * ** **<br /> Nước dừa và adenine (B) * ** **<br /> AxB NS ** **<br /> CV(%) 89,5 2,12 0,65<br /> y<br /> NS, *, **: không khác biệt hoặc khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05 hoặc 0,0; x Các số có chữ cái giống<br /> nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo phân hạng Duncan’s Multiple Range Test.<br /> <br /> Khi thay vitamin Morel bằng vitamin vitamin của môi trường Gamborg B5 được sử<br /> Gamborg B5, số chồi/mẫu gia tăng rõ rệt sau 4 dụng (bảng 2).<br /> tuần nuôi cấy ở cả 3 công thức B, BC và BCA. Vai trò kích thích tăng trưởng của nước dừa<br /> Số chồi/mẫu trên môi trường BC hơn gần hai đã được đề cập đến trong nhiều công trình vi<br /> lần so với số chồi/mẫu trên môi trường MC nhân giống lan. Nước dừa có chứa nhiều loại<br /> (bảng 2). Ở tất cả các công thức, sồ chồi đều gia cytokinin như kinetin, trans-zeatin và một số<br /> tăng sau 6 tuần nuôi cấy. Số chồi/mẫu lớn nhất chất kích thích tố sinh trưởng thực vật khác<br /> thu nhận được ở công thức BCA (16,33 chưa được định danh thuộc nhóm gibberellin và<br /> chồi/mẫu) và nhỏ nhất ở nghiệm thức MCA auxin [13]. Ngoài ra, nước dừa còn có các vi<br /> (7,17 chồi/mẫu). Sự hiện diện của nước dừa làm lượng như sắt và vitamin, các acic amin,<br /> gia tăng đáng kể số chồi/mẫu, tuy nhiên, sự bổ đường... có thể được đưa vào hệ thống<br /> sung thêm adenine chỉ có ảnh hưởng rõ rệt khi antioxidant của cơ thể người. Trong nuôi cấy<br /> <br /> <br /> 199<br />  TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 196-204<br /> <br /> tạo chồi cây oliu, nước dừa đã thành công trong từ phiến lá cây đương quy Nhật Bản<br /> việc thay thế zeatin trong môi trường nuôi cấy Tỷ lệ (%) mẫu tạo rễ ở các công thức vào<br /> và trong các giai đoạn tiếp theo của quy trình ngày thứ 42 có sự khác biệt rất ý nghĩa khi kết<br /> nhân giống [11]. Ảnh hưởng của adenine lên sự hợp cả 2 yếu tố. Khi khảo sát ảnh hưởng của<br /> tăng sinh chồi được mô tả trong thí nghiệm này NAA có hoặc không có kết hợp với kinetin, tỷ lệ<br /> khi môi trường khoáng MS kết hợp với vitamin mẫu tạo rễ cao khi mẫu được nuôi cấy trên môi<br /> Gamborg B5. Nandagopal & Kumari (2006) trường chỉ có NAA ở các nồng độ 6, 8, 10 hoặc<br /> [10] cũng đã chứng minh trên cây 12 mg/l (bảng 3A). Khi khảo sát ảnh hưởng của<br /> Cichorium intybus về sự hình thành mô sẹo và IBA có hoặc không có kết hợp với kinetin, trên<br /> tái sinh chồi đạt hiệu quả cao nhất khi bổ sung môi trường chỉ có 6 hay 8 mg/l IBA, hoặc trên<br /> 1,36 µM adenine vào môi trường MS có môi trường IBA kết hợp với 1 mg/l kinetin, ở<br /> vitamin Gamborg B5. nồng độ 10 hay 12 mg/l, tỷ lệ mẫu tạo rễ cao hơn<br /> Ảnh hưởng của chất ĐHSTTV lên sự tạo rễ các nghiệm thức còn lại (bảng 3B).<br /> <br /> Bảng 3. (A) Ảnh hưởng của NAA, kinetin hoặc (B) IBA, kinetin lên % mẫu tạo mô sẹo, % mẫu tạo<br /> rễ từ phiến lá cây đương quy Nhật Bản nuôi cấy in vitro ngày thứ 42<br /> <br /> A B<br /> Tên công % mẫu tạo Tên công % mẫu tạo % mẫu tạo<br /> % mẫu tạo rễ<br /> thứcz mô sẹo thứcz mô sẹo rễ<br /> N4K1 88,89 33,33 cx I4K1 77,78 ab 55,56 abcx<br /> N4K0 77,78 33,33 c I4K0 22,21 d 55,56 abc<br /> N6K1 66,67 77,78 ab I6K1 66,67 abc 66,67 abc<br /> N6K0 55,56 66,67 ab I6K0 66,67 abc 88,89 a<br /> N8K1 55,56 55,56 bc I8K1 66,67 abc 33,33 c<br /> N8K0 33,33 88,89 a I8K0 33,33 cd 66,67 abc<br /> N10K1 100 0d I10K1 100 a 77,77 ab<br /> N10K0 77,77 77,77 ab I10K0 33,33 cd 33,33 c<br /> N12K1 83,33 0d I12K1 53,33 bcd 55,56 abc<br /> N12K0 72,22 72,22 ab I12K0 44,44 bcd 44,44 bc<br /> ANOVAy ANOVAy<br /> NAA (A) ** ** IBA (A) * *<br /> KINETIN (B) ** ** KINETIN (B) ** NS<br /> AxB NS ** AxB ** **<br /> CV (%) 19,61 24,82 CV (%) 28,5 24,14<br /> z<br /> N tượng trưng NAA, I tượng trưng IBA; K tượng trưng cho kinetin; các số đi kèm với N hoặc K hoặc I là<br /> nồng độ của NAA hoặc IBA hoặc kinetin được sử dụng trong nghiệm thức; y NS, *, **: không khác biệt hoặc<br /> khác biệt có ý nghĩa ở p ≤ 0,05 và 0,01; x Các trị số có chữ cái giống nhau trên cùng một cột thì không có sự<br /> khác biệt theo phân hạng Duncan’s Multiple Range Test.<br /> <br /> Các loại tế bào khác nhau đáp ứng với chất ứng lại bằng cách phản biệt hóa tạo khối mô<br /> ĐHSTTV khác nhau. Các tế bào vùng nhu mô sẹo. Tuy nhiên, mô sẹo hình thành là những<br /> là những tế bào có chức năng hoàn chỉnh. Do khối có dạng tròn, xốp, màu nâu nhạt, khả năng<br /> đó, khi bị thương và dưới tác động của tổ hợp tái biệt hóa rất thấp. Khác với tế bào vùng nhu<br /> chất ĐHSTTV, các tế bào vùng nhu mô sẽ đáp mô, các tế bào vùng tượng tầng libe-mộc là<br /> <br /> 200<br />  Ngoc Nhung Hoang et al.<br /> <br /> những tế bào mô phân sinh cấp hai. Vì vậy, phản biệt hóa mà được hoạt hóa trực tiếp để<br /> dưới tác động của các chất điều hòa sinh trưởng hình thành vùng tế bào mô phân sinh, tạo sơ<br /> thực vật, các tế bào này không trải qua quá trình khởi rễ (hình 2a).<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2. Sự hình thành rễ bất định từ phiến lá cây đương quy Nhật bản<br /> a. Sơ khởi rễ hình thành từ vùng tượng tầng libe-mộc (thanh ngang = 10 µm);<br /> b. Rễ bất định hình thành trên môi trường có bổ sung 10 mg/l NAA (thanh ngang = 5 mm).<br /> <br /> Auxin làm giảm tích lũy của cytokinin và môi trường có bổ sung IBA ở nồng độ 6 mg/l<br /> ngược lại cytokinin ức chế một số hoạt tính của hoặc IBA nồng độ 10 mg/l , 1 mg/l kinetin cho<br /> auxin [4]. Chẳng hạn như, ở nồng độ 10 mg/l kết quả tạo rễ khá cao, nhưng rễ tạo ra lại mảnh,<br /> NAA, tỷ lệ mẫu tạo rễ là 77,77% (nghiệm thức ngắn so với rễ tạo từ phiến lá trên môi trường có<br /> N10K0). Tuy nhiên, khi bổ sung 1 mg/l kinetin, bổ sung 10 mg/l NAA (hình 2b). Phản ứng khác<br /> mẫu không đáp ứng tạo rễ (nghiệm thức N10K1), nhau của mẫu cấy phiến lá đối với hai loại auxin<br /> nhưng tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo lại tăng (bảng 3a). này có thể do sự nhận biết tín hiệu dẫn đến sự<br /> Yang & Chuang (1995) [12] khi khảo sát sự tạo đáp ứng của mẫu cấy đối với hai loại auxin này<br /> rễ từ nuôi cấy tạo mô sẹo của cây đương quy là khác nhau.<br /> Trung Quốc - Angelica sinensis cũng đã chứng Ảnh hưởng của loại môi trường khoáng<br /> minh, đối với vật liệu là cuống lá ex vitro, mô và vitamin lên sự tạo mô sẹo và rễ từ phiến lá<br /> sẹo được hình thành trên môi trường MS có nuôi cấy in vitro của cây đương quy<br /> chứa 15 mg/l NAA và 2 mg/l kinetin, trong khi Nhật Bản<br /> môi trường MS có chứa 15 mg/l NAA và 4 mg/l<br /> kinetin lại thích hợp cho sự hình thành rễ. Ở ngày thứ 42, tỷ lệ (%) mẫu tạo mô sẹo và<br /> tạo rễ trong các công thức nuôi cấy có sự khác<br /> Bên cạnh đó, loại auxin khác nhau cũng tác biệt rất ý nghĩa khi xét cả hai yếu tố là loại môi<br /> động lên mẫu cấy khác nhau. Mẫu nuôi cấy trên trường và vitamin (hình 3).<br /> <br /> <br /> Hình 3. Mô sẹo, rễ hình thành từ phiến lá<br /> cây đương quy Nhật Bản dưới ảnh hưởng<br /> của môi trường khoáng MS, Gamborg B5<br /> và vitamin Morel, vitamin Gamborg B5<br /> ngày thứ 42 (thanh ngang = 5 mm)<br /> <br /> M hay B bên trái tượng trưng cho môi trường<br /> khoáng MS hay khoáng Gamborg B5; M hay B<br /> bên phải tượng trưng cho vitamin Morel hay<br /> Gamborg B5.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 201<br />  TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 196-204<br /> <br /> Mẫu nuôi cấy trên môi trường khoáng và hầu hết các loại cây do giàu và cân bằng về mặt<br /> vitamin Gamborg B5 (công thức BB) có tỷ lệ mẫu hàm lượng khoáng. Tuy nhiên, môi trường<br /> tạo mô sẹo và rễ đạt cao nhất (100%) (bảng 4). Gamborg B5 cũng được sử dụng trong nuôi cấy<br /> Nghiệm thức BB có số rễ hình thành/mẫu, tạo mô sẹo và rễ ở một số loại cây như sâm<br /> khối lượng tươi và khối lượng khô cao nhất, Ngọc Linh (Panax vietnamensis) [7]. Quá trình<br /> trong khi nghiệm thức MB có số rễ hình phiến lá tạo rễ bất định có thể chia làm hai giai<br /> thành/mẫu, khối lượng tươi và khối lượng khô đoạn: giai đoạn đầu là các tế bào tượng tầng<br /> của rễ thấp nhất (bảng 4). libe-mộc được cảm ứng tạo sơ khởi rễ, giai<br /> đoạn sau là sự phát triển thành cơ quan rễ hoàn<br /> Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, môi chỉnh. Dưới tác động của nồng độ 10 mg/l<br /> trường khoáng MS được sử dụng phổ biến cho NAA, sơ khởi rễ được hình thành.<br /> <br /> Bảng 4. Ảnh hưởng của thành phần môi trường khoáng và loại vitamin lên tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo, tỷ<br /> lệ mẫu tạo rễ, số rễ hình thành/mẫu, khối lượng tươi (KLT), khối lượng khô (KLK) của rễ từ phiến<br /> lá cây đương quy Nhật Bản ngày thứ 42<br /> % mẫu tạo mô Số rễ hình KLT KLK<br /> Tên công thứcz % mẫu tạo rễ<br /> sẹo thành/mẫu (mg/mẫu) (mg/mẫu)<br /> MM 57,1 cx 57,1 c 8c 19,7 c 2,8 c<br /> MB 33,4 d 33,4 d 2d 5,7 c 0,9 d<br /> BM 71,4 b 71,4 b 17 b 44,3 b 4,7 b<br /> BB 100,0 a 100,0 a 31 a 86,5 a 9,9 a<br /> ANOVAy<br /> KHOÁNG (A) ** ** ** ** **<br /> VITAMIN (B) NS NS ** ** **<br /> AxB ** ** ** ** **<br /> CV (%) 6,3 6,3 3,5 14,8 13,9<br /> z<br /> M hay B (bên trái): môi trường khoáng MS hay khoáng Gamborg B5; M hay B (bên phải): vitamin Morel<br /> hay Gamborg B5; y NS, **: không khác biệt hoặc khác biệt có ý nghĩa ở p ≤ 0,01; x Các trị số có chữ cái<br /> giống nhau trên cùng một cột thì không có sự khác biệt theo phân hạng LSD Test.<br /> <br /> Tùy vào từng giai đoạn phát triển, nhu cầu lần trong thành phần khoáng Gamborg B5, có<br /> dinh dưỡng ở các loại tế bào cũng khác nhau. thể gây cản trở sự đồng hóa đạm của rễ và sự<br /> Theo George & Davies (2003) [5], sự phát triển hấp thu các ion K+, Ca2+ hay Mg2+. Trong khi<br /> của tế bào rễ sẽ bị kìm hãm nếu môi trường NO3- giúp cho sự thấm cation, K+ có vai trò<br /> chứa nhiều amonium (NH4+), nhưng ngược lại trong sự cân bằng ion (điều hòa thế thẩm thấu<br /> rễ tăng trưởng cần nitrate (NO3-). Điều này liên của tế bào), sự đóng mở của khí khổng, hoạt<br /> quan mật thiết đến sự đồng hóa đạm của rễ. Giai hóa enzyme và tổng hợp protein. Như vậy, kết<br /> đoạn đầu tiên của sự đồng hóa đạm là sự khử quả thí nghiệm đã cho thấy, nồng độ khoáng đa<br /> nitrate, thường xảy ra ở rễ, trong tối. Tiếp theo lượng của môi trường Gamborg B5 thích hợp<br /> là sự tổng hợp acid amin có vai trò quan trọng hơn cho việc tạo rễ từ nuôi cấy phiến lá cây<br /> trong sự tổng hợp protein của tế bào. Đặc biệt, đương quy Nhật Bản.<br /> sự đồng hóa đạm có những đặc điểm sau: mô<br /> non thích NH4+, NH4+ đối kháng với K+, Ca2+ Vitamin tác động rõ rệt lên số rễ/mẫu và<br /> hay Mg2+. Do đó nếu dùng NH4+ quá nhiều sẽ khối lượng tươi, khối lượng khô của rễ (bảng 4).<br /> gây thiếu K+, Ca2+ hay Mg2+ [1]. Ở môi trường Vitamin là hợp chất cần thiết cho nhiều phản<br /> khoáng MS, có tỷ lệ KNO3/NH4NO3 = 1,15; ứng sinh hóa, trong đó thiamine (B1), nicotinic<br /> trong khi ở môi trường Gamborg B5 tỷ lệ acid (B3), myo-inositol, pyridoxine (B6) là<br /> KNO3/(NH4)2SO4 = 18,65. Như vậy, nồng độ những vitamin thường dùng trong nuôi cấy mô<br /> NH4+ trong thành phần khoáng MS cao gấp 10 thực vật. Trong thành phần vitamin Gamborg<br /> <br /> <br /> 202<br />  Ngoc Nhung Hoang et al.<br /> <br /> B5 nồng độ thiamine cao gấp 10 lần so với nồng 5. George E. F., Davies W., 2003. Effects of<br /> độ thiamine trong vitamin Morel. Thiamine the Physical Environment. Plant<br /> được xem là chất cần thiết cho quá trình cảm Propagation by Tissue Culture, 3rd Edition<br /> ứng tạo rễ bất định ở cây Taxus sp. [2]. Cơ chế 1: The Background. George EF, Hall MA,<br /> này chưa được biết rõ trên cây đương quy Nhật Klerk GJ De (eds.) Springer, Dordrecht,<br /> Bản, nhưng số lượng rễ hình thành trên mẫu Netherlands: 245-246.<br /> nuôi ở môi trường khoáng và vitamin Gamborg 6. Kumazawa Y., Mizunoe K., Otsuka Y.,<br /> B5 cao hơn so với các công thức khác có thể là 1982. Immunostimultaing polysacchride<br /> do tác động của thiamine. separated from hot water extract of Angelica<br /> acutiloba Kitagawa (Yamato tohki). Pub.<br /> KẾT LUẬN<br /> Med. Immunology, 47(1): 75-83.<br /> Sự tạo chồi trực tiếp của cây đương quy 7. Nguyễn Thị Liễu, Nguyễn Trung Thành và<br /> Nhật Bản có thể được thực hiện bằng phương Nguyễn Văn Kết, 2010. Nghiên cứu khả<br /> pháp nuôi cấy lớp mỏng chồi ngọn trên môi năng tạo rễ bất định của sâm Ngọc Linh<br /> trường khoáng MS, vitamin Gamborg B5, bổ (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) trong<br /> sung 0,1 mg/l NAA, 1 mg/1 TDZ, 30 g/l đường nuôi cấy in vitro. Tạp chí khoa học ĐHQG<br /> sucrose, 10% (v/v) nước dừa và 40 mg/l adenine. Hà Nội, Khoa học tự nhiên và Công Nghệ,<br /> Tỷ lệ mẫu tạo rễ từ phiến lá cũng như số rễ 27: 30-36.<br /> hình thành/mẫu, khối lượng tươi, khối lượng 8. Mok C., Mok S., Turner E., Mujer V., 1987.<br /> khô của rễ cao nhất khi phiến lá được nuôi cấy Biological and biochemical effects of<br /> trên môi trường khoáng và vitamin Gamborg B5, cytokinin-active phenylurea derivatives in<br /> có bổ sung 10 mg/l NAA. tissue culture systems. Hort. Sci., 22: 1194-<br /> Lời cảm ơn: Đề tài thuộc chương trình hợp tác 1197.<br /> nghiên cứu giữa Trường đại học Chiba, Nhật 9. Murashige T., Skoog F., 1962. A revised<br /> Bản và phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện medium for rapid growth and bioassays with<br /> Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học và Công tobacco tissue cultures. Physiol. Plant,<br /> nghệ Việt Nam. 15(3): 473-497.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO 10. Nandagopal S. and Kumari D., 2006.<br /> Adenine sulphate induced high frequency<br /> 1. Avilla A., Pereira M. and Arguello A., shoot organogenesis in callus and in vitro<br /> 1998. Nitrogen concentration and flowering of Cichorium intybus L. cv. Focus<br /> proportion of NH4+-N affect potato cultivar - a potent medicinal plant. Acta agriculturae<br /> response in solid and liquid media. Hort. Slovenica, 87(2): 415-425.<br /> Sci., 33: 336-338.<br /> 11. Peixe A., Raposo A., Lourenço R., Cardoso<br /> 2. Chee P., 1995. Stimulation of adventitious H. and Macedo E., 2007. Coconut water and<br /> rooting of Taxus species by thiamine. Plant BAP successfully replaced zeatin in olive<br /> Cell Rep., 14: 753-757. (Olea europaea L.) micropropagation.<br /> 3. Gamborg L., Miller A. and Ojima K., 1968. Scientia Horticulturae, 113: 1-7.<br /> Nutrient requirements of suspension 12. Yang J. S. and Chuang S. H., 1995. Callus<br /> cultures of soybean root cells. Exp. Cell formation and plant regeneration from<br /> Res., 50: 151-158. petiole - derived calli of Angelica sinensis.<br /> 4. Gaspar T., Kevers C., Greppin H., Reid M. Plant Tis. Cul. Lett., 12(1): 91-93.<br /> and Thrope A., 1996. Plant hormones and 13. Yong H., Ge L., Yan N., Tan N., 2009. The<br /> plant growth regulators in plant tissue chemical composition and biological<br /> culture. In Vitro Cell Dev. Biol. Plant, 32: properties of coconut (Cocos nucifera L.)<br /> 272-289. water. Molecules, 14: 5144-5164.<br /> <br /> <br /> <br /> 203<br />  TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 196-204<br /> <br /> A STUDY ON ORGANOGENESIS FROM THIN CELL LAYER CULTURE<br /> OF Angelica acutiloba<br /> <br /> Hoang Ngoc Nhung1, Nguyen Thi Quynh1,<br /> Nguyen Vu Ngoc Anh1, Nguyen Le Anh Thu1, Toyoki Kozai2<br /> (1)<br /> Institute of Tropical Biology, VAST<br /> (2)<br /> Chiba University, Japan<br /> <br /> SUMMARY<br /> <br /> Angelica (Angelica acutiloba) plants originating in Japan were considered as of higher value than other<br /> varieties of the genus Angelica. Angelica’s roots have been used historically to treat health disorders and in<br /> many supplemental remedies in Asian traditional medicine. In this study, organogenesis from thin cell layer<br /> culture of japanese Angelica shoot tips and leaf blades was shown. Thin layers (1-1.5 mm thick) of shoot tips<br /> of Angelica were cultured on MS medium supplemented with NAA (0, 0.1, or 0.2 mg/l) and/or TDZ (0.1, 0.5<br /> or 1 mg/l). The numbe of shoots was the largest (8.9 shoots/explant) when explants were cultured on the<br /> medium supplemented with 0.1 mg/l NAA and 1 mg/l TDZ. When Morel vitamins were replaced by<br /> Gamborg’s B5 vitamins together with the addition of 10% (v/v) coconut water and 40 mg/l adenine to the<br /> culture medium, the number of shoots per explants was remarkably increased after 6 weeks of culture.<br /> In vitro Angelica leaves also proved a potential source for adventitious root production. On MS medium<br /> supplemented with kinetin (0 or 1 mg/l), NAA (4, 6, 8, 10 or 12 mg/l), IBA (4, 6, 8, 10 or 12 mg/l), the first<br /> open leaves from the shoot tip, when cultured in dark period, had a different response to the root formation.<br /> The root formation from japanese Angelica’s leaf culture significantly varied with the change of medium<br /> elements (minerals and vitamins). Percent of leaf explants having roots, number of roots per explant, root<br /> fresh and dry weights were the largest when leaf blades were cultured on the medium containing minerals and<br /> vitamins of Gamborg’s B5.<br /> Keywords: Angelica acutiloba, Adventitios root, organogenesis, plant growth substances.<br /> <br /> Ngày nhận bài: 21-6-2012<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 204<br />