Nhận dạng các mẫu đậu tương dựa trên đặc điểm hình thái và mã vạch ADN

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:9

Thêm vào BST

Báo xấu

2
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích của nghiên cứu này là đánh giá sự khác biệt về hình thái và nhận dạng di truyền của bốn dòng/giống đậu tương, bao gồm DT84 (đối chứng), đậu tương đen (135544), cúc Võ Nhai, và DT2008ĐB, nhằm cung cấp cơ sở khoa học cho việc chọn lọc và phát triển giống đậu tương mới. Hạt của các giống đậu tương có màu vàng đậm (cúc Võ Nhai), đen (135544 và DT2008DB), vàng nhạt (DT84).

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nhận dạng các mẫu đậu tương dựa trên đặc điểm hình thái và mã vạch ADN

TNU Journal of Science and Technology 230(05): 123 - 131 IDENTIFICATION OF SOYBEAN SAMPLES BASED ON MORPHOLOGICAL AND DNA BARCODING Tran Trong Dai1, Tran Dinh Ha1, La Thi Thao2, Tran Anh Tuan2, La Van Hien1* 1TNU – University of Agriculture and Forestry, 2Vietnam National University of Agriculture ARTICLE INFO ABSTRACT Received: 12/8/2024 The current soybean is faces the risk of degeneration and loss of genetic resources. Soybean research mainly focuses on assessing Revised: 21/01/2025 genetic diversity based on external morphological characteristics. Published: 22/01/2025 Genetic identification is one of the tools for soybean improvement. This study aims to evaluate the morphological differences and genetic KEYWORDS identification of four soybean lines/varieties, including DT84 (control), black soybean (135544), Cuc Vo Nhai, and DT2008DB, to provide a Black soybean scientific basis for the selection and development of new soybean Glycine max varieties. The seeds color of soybean cultivars is dark yellow (cuc Vo Nhai), black (135544 and DT2008ĐB), and light yellow (DT84). In Soybean cultivars addition, the matK gene and ITS2 sequences, were amplified, ITS1 and matK sequenced, and identified. Comparison of the matK gene and ITS2 DT84 sequences of four soybean lines/cultivars with sequences in the NCBI gene bank showed that the matK gene sequence had a similarity level of 98.25-100.00% with Glycine max and 91.7% with Glycine soja. The ITS2 gene sequence had a 98.88-99.45% similarity with Glycine max species. These results provide a scientific basis for identifying and classifying soybean lines/cultivars to conserve this gene source. NHẬN DẠNG CÁC MẪU ĐẬU TƯƠNG DỰA TRÊN ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ MÃ VẠCH ADN Trần Trọng Đại1, Trần Đình Hà1, Lã Thị Thảo2, Trần Anh Tuấn2, Lã Văn Hiền1* 1Trường Đại học Nông Lâm – ĐH Thái Nguyên, 2Học viện Nông nghiệp Việt Nam THÔNG TIN BÀI BÁO TÓM TẮT Ngày nhận bài: 12/8/2024 Hiện nay, cây đậu tương đang phải đối mặt với nguy cơ thoái hóa giống và mất dần nguồn gene. Hình thái bên ngoài là yếu tố chính được sử Ngày hoàn thiện: 21/01/2025 dụng trong các nghiên cứu về cây đậu tương để đánh giá đa dạng di Ngày đăng: 22/01/2025 truyền. Nhận dạng di truyền đang được sử dụng phổ biến như một công cụ chính để cải thiện giống đậu tương. Mục đích của nghiên cứu này là TỪ KHÓA đánh giá sự khác biệt về hình thái và nhận dạng di truyền của bốn dòng/giống đậu tương, bao gồm DT84 (đối chứng), đậu tương đen Đậu tương đen (135544), cúc Võ Nhai, và DT2008ĐB, nhằm cung cấp cơ sở khoa học Glycine max cho việc chọn lọc và phát triển giống đậu tương mới. Hạt của các giống đậu tương có màu vàng đậm (cúc Võ Nhai), đen (135544 và Định danh DT2008DB), vàng nhạt (DT84). Bên cạnh đó, hai vùng gene matK và ITS1 và matK ITS2 được khuếch đại, giải trình tự và xác định loài. So sánh trình tự gen DT84 matK và ITS2 của bốn dòng/giống đậu tương với các trình tự trên ngân hàng gene NCBI cho thấy trình tự gene matK có mức độ tương đồng 98,25-100,00% với loài Glycine max, 91,7% với loài Glycine soja. Trình tự gene ITS2 có mức tương đồng 98,88-99,45% với loài Glycine max. Những kết quả này cung cấp cơ sở khoa học để nhận dạng và phân loại dòng/giống đậu tương nhằm bảo tồn nguồn gene này. DOI: https://doi.org/10.34238/tnu-jst.10925 * Corresponding author. Email: lavanhien@tuaf.edu.vn http://jst.tnu.edu.vn 123 Email: jst@tnu.edu.vn
TNU Journal of Science and Technology 230(05): 123 - 131 1. Giới thiệu Đậu tương (Glycine max) là cây trồng họ đậu Fabaceae, loài bản địa có nguồn gốc từ Đông Á. Trong hệ thống phân loại chi đậu tương dại (Glycine Willd) bao gồm hai phân chi Glycine và Soja. Phân chi Soja (Moench) F.J. Herm bao gồm cây đậu tương chọn tạo Glycine max (L.) Merr., và cây đậu dại Glycine soja Sieb. & Zucc. Glycine soja là tổ tiên hoang dại của Glycine max, phân bố chủ yếu tại khu vực Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Đài Loan [1]. Phân chi Glycine bao gồm ít nhất 25 loài cây dại, tiêu biểu như Glycine canescens F.J.Hem. và Glycine tomentella Hayata. Đậu tương được thuần hóa trong thời gian lâu dài, dẫn đến sự phát sinh đa dạng và phức tạp. Bởi vậy, các dấu vết về sự liên hệ giữa các loài đậu tương hiện đại và loài hoang có thể không còn. Việc nhận diện và phân loại đậu tương ở cấp độ loài sử dụng kết hợp dựa trên đặc điểm hình thái và định danh phân tử bằng mã vạch DNA (DNA barcode). Mã vạch DNA sử dụng hỗ trợ định danh loài dựa trên một vùng DNA đặc hiệu [2], [3]. Mã vạch DNA đã được chứng minh là một phương pháp hữu hiệu để định danh loài mới [2]. Thông qua so sánh trình tự nucleotide của đoạn DNA được khuếch đại bằng chỉ thị DNA từ các mẫu nghiên cứu với cơ sở dữ liệu trên ngân hàng gene (GenBank), sự khác biệt về trình tự nucleotide trên đoạn DNA đặc hiệu sẽ là cơ sở để phân biệt các loài với nhau. Hầu hết các mã vạch DNA được sử dụng trong định danh thực vật nằm trong hệ gene lục lạp điển hình là các trình tự mã hóa (như rbcL và matK), hoặc được lấy từ các vùng liên gene (như trnH-psbA) [4], một số locus DNA nhân được sử dụng làm mã vạch DNA (DNA ribosome (ITS)) [5], [6]. Hiện nay, các nghiên cứu ở Việt Nam chủ yếu tập trung đánh giá đa dạng di truyền của các giống đậu tương [7], [8], mà chưa có nhiều nghiên cứu nhận dạng loài đậu tương. Tập đoàn giống đậu tương của Việt Nam bao gồm nhiều giống khác nhau thể hiện sự đa dạng về kiểu hình và kiểu gene. Thêm vào đó, sự phân tán giống do tập quán canh tác, cùng với quá trình lai tạo phát triển các giống đậu tương mới góp phần tạo nên sự đa dạng của các giống đậu tương, tuy nhiên cũng là nguyên nhân khiến các giống đậu tương bản địa dần biến mất. Từ thực tế trên cho thấy quá trình phân loại và bảo tồn nguồn gene bản địa còn gặp nhiều khó khăn. Do vậy, việc nhận dạng các giống đậu tương bằng các đặc điểm hình thái và kiểu gene là rất cần thiết và là nguồn thông tin cơ sở để phân loại và lưu giữ nguồn gene hiệu quả. Nghiên cứu này trình bày kết quả nhận dạng loài đậu tương dựa trên đặc điểm hình thái và sự hỗ trợ của mã vạch DNA từ bốn mẫu đậu tương DT84, đậu tương đen (135544), cúc Võ Nhai, DT2008ĐB. 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. Vật liệu Các mẫu dòng/giống đậu tương thu thập tại Thái Nguyên và cung cấp bởi Trung tâm tài nguyên Thực vật [9]. Bốn dòng/giống đậu tương bao gồm: DT84, cúc Võ Nhai, đậu tương đen (135544), và DT2008ĐB. Các mẫu giống được trồng tại vườn thực nghiệm Khoa Nông học (21°34′46″B 105°47′18″Đ) ở cùng một điều kiện canh tác, theo QCVN 01- 58:2011/BNNPTNT “Về khảo nghiệm giá trị canh tác và sử dụng giống đậu tương” [10]. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phân loại hình thái Để phân loại các dòng/giống đậu tương nghiên cứu, các bộ phận gồm có hạt, quả, hoa, lá, rễ, và cây được mô tả dựa trên quy trình phân loại hình thái cây đậu tương của Ngô Thế Dân [11]. 2.2.2. Tách chiết DNA tổng số Lá đậu tương được thu thập ở giai đoạn cây non (6 lá) và được bảo quản ở -80oC. Nghiền lá tươi trong nitrogen lỏng thành bột mịn. Sử dụng 50 mg bột để tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp CTAB [12]. DNA tổng số được kiểm tra sơ bộ bằng phương pháp điện di trong gel http://jst.tnu.edu.vn 124 Email: jst@tnu.edu.vn
TNU Journal of Science and Technology 230(05): 123 - 131 agarose 1%, bổ sung thuốc nhuộm RedSafe. DNA được kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch bằng máy NanoDrop One (Thermo Scientific). 2.2.3. Định danh loài bằng mã vạch DNA Chỉ thị khuếch đại đoạn DNA thuộc vùng ITS-rDNA (internal transcribed spacer-ribosome DNA) và gene lục lạp matK (maturase K) nhằm xác định loài cho các giống đậu tương thu thập. Trình tự mRNA của vùng ITS2 (U60551.1) và gene matK (NC_007942.1) từ ngân hàng gene NCBI [13] Các cặp mồi đặc hiệu ITS2 và matK được thiết kế bằng phần mềm primer3 Plus [14] và trình bày ở Bảng 1. Bảng 1. Thông tin mồi sử dụng để nhận diện loài Tên mồi Trình tự nucleotide (5’-3’) Kích thước dự kiến (bp) ITS2-F AATTGCAGAATCCCGTGAAC 216 ITS2-R ACCATTTTATCACGGCGAAG matK-F TATTCGGCCCAATCTTTCAG 213 matK-R CGCAAAAACCGGTCAATAAT Phản ứng PCR thực hiện trên máy Gradient Analytik Jena-Đức với tổng thể tích 15 µL (gồm 5 µL DiH2O; 7 µL đệm Dream Taq Mastermix 2X; 1 µL mồi xuôi và 1 µL mồi ngược 10 pmol/µL; 1 µL DNA 50 ng/µL và chu kỳ nhiệt như sau: 94oC trong 3 phút, sau đó lặp lại 35 chu kỳ bao gồm các bước: 94oC trong 30 giây, 52-53oC trong 30 giây, 72oC trong 1 phút, giữ nhiệt độ ở 72oC trong 5 phút. Sản phẩm PCR đạt yêu cầu được tinh sạch bằng bộ kit của Thermo Scientific-Mỹ và giải trình tự trên hệ thống ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer (Công ty 1st BASE Singapore). Kết quả giải trình tự được phân tích bằng phần mềm Sequence Scanner v1.0, BioEdit và MEGA 11, công cụ BLAST trên NCBI. 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Sự đa dạng về hình thái của bốn dòng/giống đậu tương Bốn dòng/giống đậu tương DT84, đậu tương đen (DTD, 135544), cúc Võ Nhai, và DT2008ĐB có sự khác biệt rõ ràng về hình thái, cũng như đặc điểm sinh trưởng (Hình 1 và Bảng 2). 3.1.1. Giống DT84 - Rễ: gồm rễ chính và rễ phụ. Trên cả rễ chính và rễ phụ đều có nhiều nốt sần. - Thân: thân thảo, có hình tròn, đặc, có màu xanh đậm, cứng cây. Thân có trung bình 7 – 8 lóng, mức độ phân cành thấp 2-3 cành/cây, cao trung bình 50 – 60 cm. Sinh trưởng hữu hạn. - Lá: đơn nguyên, mọc cách. Lá mầm, lá đơn và lá kép có 3 lá chét. Cuống mảnh. Lá có hình bầu dục, hai mặt có lông (chiều dài biến động từ 8,0 – 10,0 cm và chiều rộng biến động từ 7,0 – 8,2 cm). - Hoa: to, loại cánh bướm, có màu trắng. Hoa phát sinh ở nách lá, đầu cành và đầu thân thành từng chùm có từ 3-5 hoa. Hoa thuộc loại hoa đồng chu lưỡng tính, nhị và nhụy cùng tồn tại trên một hoa. Mỗi hoa có 5 lá đài, 5 cánh hóa, 10 nhị và một nhụy. - Quả: thuộc loại quả nang, hơi dẹp, dài 2 – 7 cm, có 1 – 3 ô, mang 1 – 3 hạt. Quả mọc ra từ đốt cây, từ đốt thứ 5 – 6 trở lên tỷ lệ đậu quả cao và quả chắc nhiều. Tỷ lệ quả chắc đạt 98%. - Hạt: hạt có hình tròn, màu vàng. Rốn hạt có màu đen. Khối lượng 100 hạt là 18,3 g. 3.1.2. Dòng đậu tương đen (135544) - Rễ: gồm rễ chính và rễ phụ. Trên rễ chính phát sinh nhiều rễ phụ. Các rễ phụ cấp 2 và cấp 3 tập trung chủ yếu tại tầng đất 9 – 10 cm. - Thân: thân thảo, có hình tròn, đặc, có màu xanh hoặc tím, có lông thô ráp rặm. Thân khi còn non có màu xanh hoặc màu tím khi về già chuyển sang màu nâu nhạt. Thân có trung bình 8 – 10 lóng, ít phân cành, cao trung bình 40 – 60 cm. http://jst.tnu.edu.vn 125 Email: jst@tnu.edu.vn
TNU Journal of Science and Technology 230(05): 123 - 131 Bảng 2. Đặc điểm sinh trưởng của 4 giống đậu tương Giống Đặc điểm Hình ảnh - TGST: 95 ngày - Chiều cao cây: 75 cm - Số cành quả/cây: 6,5 DT84 cành/cây - Tổng số quả/cây: 66 quả - Khối lượng 100 hạt: 16,5 g - TGST: 105 ngày - Chiều cao cây: 51 cm DTD - Số cành quả/cây: 4,5 (135544) cành/cây - Tổng số quả/cây: 41 quả - Khối lượng 100 hạt: 7,5 g - TGST: 90 ngày - Chiều cao cây: 50 cm Cúc Võ - Số cành quả/cây: 2,6 Nhai cành/cây - Tổng số quả/cây: 39 quả - Khối lượng 100 hạt: 8,4 g - TGST: 110 ngày - Chiều cao cây: 80 cm - Số cành quả/cây: 4,0 DT2008ĐB cành/cây - Tổng số quả/cây: 80 quả - Khối lượng 100 hạt: 20,8 g Hình 1. Hình thái bốn giống đậu tương. (a) Chú thích: TGST: thời gian sinh trưởng cây trưởng thành; (b) lá cây; (c) hoa; (d) cây đậu tương thu hoạch; (e) hạt đậu tương khô. DTD: đậu tương đen. - Lá: lá đơn, mọc cách. Lá mầm, lá đơn và lá kép có 3 lá chét. Cuống mảnh, có lông giống thân. Lá có hình bầu dục, xoan, hình mác; chót phiến nhọn, 2 mặt có lông rặm, kích thước: chiều dài biến động từ 7 - 9,0 cm và chiều rộng biến động từ 6,3 – 8,1 cm. - Hoa: nhỏ, thuộc loại cánh bướm, màu tím. Hoa phát sinh ở nách lá, đầu cành và đầu thân. Hoa mọc thành từng chùm, mỗi chùm có từ 1 – 10 hoa và thường có 3 – 5 hoa. Hoa lưỡng tính trong hoa có nhị và nhụy, mỗi hoa gồm 5 lá đài, 5 cánh hoa có 8-10 nhị và 1 nhụy. - Quả: Thuộc loại quả nang, hơi dẹp, dài 2 – 5 cm, chia 1 – 3 ô, mang 1 – 3 hạt. Mỗi quả trung bình có từ 2 – 3 hạt. Số lượng quả dao động 35 – 42 quả/cây. - Hạt: hạt có hình tròn dẹp; màu đen. Rốn hạt màu đen. Khối lượng 100 hạt 7,5 g. 3.1.3. Giống cúc Võ Nhai - Rễ: có rễ chính và rễ phụ. Trên rễ chính có nhiều nốt sần. - Thân: thân thảo, có hình tròn, có màu xanh nhạt. Trên thân thường có 14 – 15 lóng, các lóng ở gần gốc thường ngắn, các lóng ở bên trên thường dài, ít phân cành, cao trung bình 40 – 55 cm. - Lá: đơn nguyên, lá mầm mọc đối xứng. Các lá đơn sinh trưởng đối xứng. Lá kép có 3 lá chét. Cuống mảnh, kích cỡ: (1,0 – 2,0) x 0,1 cm. Lá có hình bầu dục nhọn 2 mặt có lông (chiều dài biến động từ 10 - 11,0 cm và chiều rộng biến động từ 7,7 – 8,6 cm). - Hoa: nhỏ, thuộc loại cánh bướm, màu tím. Hoa mọc theo từng chùm, mỗi chùm bao gồm 3 – 5 hoa. Hoa đồng chu lưỡng tính, mỗi hoa gồm 5 lá đài, 5 cánh hoa có 10 nhị và 1 nhụy. http://jst.tnu.edu.vn 126 Email: jst@tnu.edu.vn
TNU Journal of Science and Technology 230(05): 123 - 131 - Quả: thuộc loại quả nang tròn, dài khoảng 5 cm. Mỗi quả trung bình có từ 2 – 3 hạt. Hạt có màu sắc vàng sẫm. Rốn hạt màu hồng nhạt. - Hạt: hạt có hình tròn, màu vàng đậm. Rốn hạt có màu vàng nhạt, phớt hồng. 3.1.4. Giống DT2008ĐB - Rễ: gồm rễ chính và rễ phụ có nhiều nốt sần. Rễ chính dài khoảng 20- 30 cm. - Thân: thân thảo, hình tròn, có màu xanh đậm. Mức độ phân cành cao, cao trung bình 80 cm. - Lá: đơn nguyên, lá mầm mọc đối xứng. Lá đơn mọc đối xứng. Lá có hình bầu dục nhọn 2 mặt có lông, (chiều dài 10 - 11,0 cm và chiều rộng từ 7,7 – 8,6 cm. Khối lượng 100 hạt 8,4 g. - Hoa: nhỏ, thuộc loại cánh bướm. Hoa có màu tím nhạt, sinh trưởng tại nách lá, đầu cành và đầu thân. Hoa mọc từng chùm, mỗi chùm từ 3 – 5 hoa. Hoa là loại hoa đồng chu lưỡng tính trong hoa tồn tại cả nhị và nhụy, mỗi hoa có 5 lá đài, 5 cánh hoa, 10 nhị và 1 nhụy. - Quả: Thuộc loại quả nang tròn, dài khoảng 5 cm. Mỗi quả trung bình có từ 2 – 3 hạt. Quả có màu sắc biến động từ vàng đậm đến đen. - Hạt: hạt có hình tròn, bầu dục, màu đen. Rốn hạt có màu đen. Khối lượng 100 hạt 20,8 g. 3.2. Xác định mối quan hệ di truyền và định danh loài các giống đậu tương 3.2.1. Kết quả khuếch đại gene Hàm lượng và giá trị OD của DNA tổng số tách chiết từ bốn mẫu lá đậu tương được xác định bằng máy NanoDrop One. Kết quả cho thấy, DNA tách chiết có độ tinh sạch OD260/OD280 nằm trong khoảng 2,10-2,14, hàm lượng DNA nằm trong khoảng 708,2-1530,8 ng/µL (dữ liệu không trình bày). Mẫu DNA tiếp tục được kiểm tra bằng điện di gel agarose 1% (Hình 2.a) và pha loãng đến nồng độ 50 ng/µL để sử dụng trong phản ứng PCR. Kết quả PCR cho thấy trình tự gene matK và vùng ITS2 được khuếch đại với kích thước dự kiến 213 bp và 216 bp khi so với thang chuẩn DNA (Hình 2.b và 2.c). Hình 2. Kết quả khuếch đại gene chỉ thị matK và ITS2 ở bốn dòng/giống đậu tương. (a) DNA tổng số điện di trên gel agarose 1%. (b) và (c) gene chỉ thị matK và ITS2 hiển thị trên gel agarose 2%. (d), (e), và (f) phân tích Blast gene ITS2 ở ba giống đậu tương đen (135544), cúc Võ Nhai, và DT2008ĐB http://jst.tnu.edu.vn 127 Email: jst@tnu.edu.vn
TNU Journal of Science and Technology 230(05): 123 - 131 Các trình tự được khuếch đại bởi chỉ thị matK và ITS2 từ các mẫu nghiên cứu sau khi giải trình tự sẽ được hiệu chỉnh loại bỏ các nucleotide bị nhiễu ở hai đầu đã cho kích thước đoạn nghiên cứu lần lượt là 213 bp và 216 bp. Trình tự nucleotide đồng nhất (consensus) của vùng trình tự gene matK và ITS2 được so sánh bằng BLAST trên NCBI để kiểm tra sự tương đồng với cơ sở dữ liệu trên ngân hàng gene NCBI. Kết quả tìm kiếm trình tự nghiên cứu có mức độ tương đồng với các loài thuộc chi Glycine như sau: 98,25-100,00% đối với chỉ thị matK và 98,88- 99,45% đối với chỉ thị ITS2. Theo tổ chức BOLD (ngân hàng mã vạch) khuyến nghị rằng khi có khả năng hình thành loài mới khi độ sai khác lớn hơn 2% [15]. Dựa vào kết quả tìm kiếm trên NCBI chúng tôi nhận thấy rằng trình tự matK và ITS2 của bốn giống đậu tương có sự sai khác lớn và nhỏ hơn 2% so với trình tự các loài thuộc chi Glycine đã được công bố trước đó. Trên đây là cơ sở ban đầu để xác định rằng mẫu đậu tương nghiên cứu thuộc chi Glycine, họ Fabaceae. Để xác định được chính xác tên khoa học đầy đủ của loài cần kết hợp với dữ liệu về cây phát sinh chủng loại và đặc điểm hình thái. So sánh các trình tự gene ITS2 và matK trên cơ sở dữ liệu NCBI nhằm mục đích cung cấp kết quả tham chiếu với các loài có trình tự tương đồng nhất trên ngân hàng gene với trình tự nucleotide cần so sánh. Tuy nhiên, không thể đưa ra kết luận chính xác về loài chỉ dựa trên kết quả BLAST. Ngay cả khi BLAST cho kết quả có mức độ tương đồng cao (trên 99%), cũng không thể suy ngược ra tên loài vì kết quả BLAST chỉ hiển thị những trình tự tương đồng nhất hiện tại đang có trong ngân hàng gene [16]. Do đó, kết quả BLAST chưa đủ căn cứ để xác định chính xác tên khoa học của loài cây trồng đánh giá. Hình 3. So sánh trình tự chỉ thị matK và ITS2 của ba giống đậu tương đen (135544), cúc Võ Nhai và DT2008ĐB với giống DT84 thuộc loài Glycine max http://jst.tnu.edu.vn 128 Email: jst@tnu.edu.vn
TNU Journal of Science and Technology 230(05): 123 - 131 Phần mềm BioEdit được sử dụng để so sánh độ tương quan về trình tự gene chỉ thị matK của bốn giống đậu tương. Qua so sánh không tìm thấy sự sai khác trong trình tự matK. Phân tích BLAST so sánh bốn giống đậu tương được nghiên cứu với loài Glycine max, và loài Glycine soja cho thấy độ tương đồng cao lên đến 98,25-100%. Độ tương đồng của bốn giống đậu tương được nghiên cứu đạt trên 99%. 3.3.2. Phân tích gene chỉ thị matK Cây tương đồng (Bootrap consensus tree) của bốn giống đậu tương cho biết hệ số tương đồng của bốn dòng/giống đậu tương nghiên cứu với các loài Glycine max, Glycine soja, và Glycine tomentella có sự khác biệt rõ rệt. Mỗi dòng/giống đậu tương phân tích đều nằm trên một nhánh riêng biệt có độ tin cậy 59%. Cách phân nhánh và mối quan hệ của giống DT84 với loài Glycine max đã được Nguyễn Thanh Hoàn và cộng sự [17] báo cáo, do đó ba dòng/giống đậu tương DT2008ĐB, đậu tương đen 135544, và cúc Võ Nhai nằm chung nhánh với giống DT84 và loài Glycine max (MN167202.1; MH659986.1; PP712901.1) theo Hình 4 với mức độ tin cậy 61% (boostrap đạt 61%) và tách biệt với các loài còn lại. Theo Hillis và Bull (1993) [18] báo cáo rằng giá trị boostrap lớn hơn 70% có độ tin cậy cao (P ≥ 95%) và nhỏ hơn 70% được coi là không có ý nghĩa khi tác giả nghiên cứu về phát sinh loài. Dựa trên cơ sở này có thể đưa ra kết luận, việc so sánh trình tự đoạn gene chỉ thị matK chưa cung cấp đủ cơ sở để định danh đến cấp độ loài. Tuy nhiên, kết quả của nghiên cứu này nhận định rằng dựa trên chỉ thị matK để xác định bốn dòng/giống đậu tương DT84, 135544, cúc Võ Nhai, và DT2008ĐB thuộc chi Glycine. Số liệu cho thấy rằng việc sử dụng một chỉ thị matK rất khó phân biệt được các loài có quan hệ gần, nhưng có thể phân biệt được đến cấp độ chi [17], [19]. Kết quả nghiên cứu của Kuzmina và cộng sự [19] cho thấy đánh giá thành công 100% ở mức độ chi, trong khi chỉ thành công 54% ở cấp độ loài khi sử dụng matK, và khả năng nhận dạng loài tăng lên 92% khi kết hợp với một hoặc nhiều chỉ thị khác ở lục lạp (trnH-psbA, atpBatpH, rpoC1) và nhân (ITS). Hình 4. Cây tương đồng các loài thuộc chi Glycine xây dựng dựa trên trình tự nucleotide của chỉ thị matK 3.3.3. Phân tích gene chỉ thị ITS2 Đánh giá về trình tự vùng ITS2 cho thấy bốn giống DT84 (4), cúc Võ Nhai (12), DT2008ĐB (15) và đậu tương đen (135544) có sự phân biệt rõ rệt, với độ tin cậy cao (boostrap = 87 – 100%). Hơn nữa, kết quả này có phần tương đồng với Kollipara và cộng sự [6] cho rằng ITS1/ITS2 biểu hiện quá nhiều sự tương tự để được sử dụng làm dấu hiệu mã vạch DNA, khả năng phân biệt được 99,7% trong một nghiên cứu gần đây ở đậu tương Cúc Bóng [17] và 99,8% ở đậu nho nhe [8]. Mối quan hệ phát sinh loài giữa tất cả 18 loài thuộc chi Glycine được suy ra từ trình tự nucleotide biến thể trong vùng phân cách phiên mã nội bộ (ITS) của DNA ribosome nhân. So sánh trình tự và cây phát sinh phân loại cho thấy bốn giống đậu tương có đoạn gene ITS2 không có sự khác biệt (tương đồng 100%) (Hình 3.c), độ đa hình thấp, cho thấy độ bảo thủ loài cao. Do đó, chỉ thị ITS2 là vật liệu phù hợp để định danh các loài thuộc chi Glycine. Nhiều nghiên cứu http://jst.tnu.edu.vn 129 Email: jst@tnu.edu.vn
TNU Journal of Science and Technology 230(05): 123 - 131 trước đây chỉ ra rằng, chỉ thị ITS1/ITS2 là vùng gene hữu hiệu sử dụng để phân loại đến cấp độ loài ở cây đậu tương [8], [18], [19]. Kết quả của Hillis và Bull [18] cho thấy giá trị boostrap ≥ 70% có mức độ tin cậy cao trong việc xác định phát sinh loài (P ≥ 95%), phân tích bốn dòng/giống đậu tương cho giá trị boostrap 84% khi so với loài Glycine max MN167202.1, và 51% so với loài Glycine tomentella AY433844.1 và Glycine soja MN718380.1. Trong đó, giống cúc Võ Nhai (12), DT2008ĐB (15) và đậu tương đen (135544) nằm cùng phân nhánh với giống DT84 (boostrap 87-100%) và 84% với loài Glycine max MN167202.1, và tách biệt với các loài còn lại. Hơn nữa, giống đậu tương DT84 được nhận biết đến là loài Glycine max [7], [8], [17]. Hình 5. Cây phát sinh chủng loại các loài thuộc chi Glycine xây dựng dựa trên trình tự nucleotide của chỉ thị ITS2 Kết quả phân tích cây tương đồng ở Hình 5 thể hiện rằng bốn giống được nghiên cứu có mối quan hệ họ hàng gần gũi với các giống đậu tương của MN224216.1 và MK087915.1, thuộc loài Glycine max (boostrap 84%). Kết hợp với kết quả đánh giá hình thái cho thấy 4 dòng/giống đậu tương DT84, cúc Võ Nhai, DT2008ĐB và đậu tương đen (135544) có kiểu dáng cây thẳng đứng, điển hình cho loài Glycine max, và có sự khác biệt với loài đậu tương hoang dã Glycine soja với dạng cây thân bò hoặc leo. Từ kết quả phân tích đặc điểm hình thái và mã vạch DNA có thể đưa ra kết luận bốn dòng/giống đậu tương DT84, cúc Võ Nhai, DT2008ĐB và đậu tương đen (135544) thuộc loài Glycine max. 4. Kết luận Bốn mẫu dòng/giống đậu tương DT84, đậu tương đen (135544), cúc Võ Nhai, và DT2008ĐB đã được xác định đều thuộc chi Glycine dựa trên kết quả so sánh hình thái và trình tự nucleotide của hai gene matK và ITS2. Vùng gene ITS2 của bốn dòng/giống đậu tương DT84, đậu tương đen (135544), cúc Võ Nhai, và DT2008ĐB có mức tương đồng lên đến 84% so với các giống Glycine max MN224216.1 và MK087915.1. Dựa trên đặc điểm hình thái kết hợp với kết quả phân tích mã vạch DNA có thể kết luận rằng bốn mẫu dòng/giống đậu tương nghiên cứu thuộc loài Glycine max. Nghiên cứu đã cung cấp nguồn thông tin gen chỉ thị ITS2 đáng tin cậy để xác định loài ở các dòng/giống đậu tương nghiên cứu và làm cơ sở cho các nghiên cứu xác định loài các giống đậu tương thiếp theo của Việt Nam. Lời cảm ơn Công trình này được hỗ trợ bởi kinh phí đề tài từ Bộ Giáo dục và Đào tạo Việt Nam (mã số tài trợ B2022-TNA-42). TÀI LIỆU THAM KHẢO/ REFERENCES [1] R. J. Singh, R. L. Nelson, and G. Chung, "Soybean (Glycine max (L.) Merr.). Genetic resources, chromosome engineering, and crop improvement," Oilseed crops, vol. 4, pp. 13-50, 2007. http://jst.tnu.edu.vn 130 Email: jst@tnu.edu.vn
TNU Journal of Science and Technology 230(05): 123 - 131 [2] P. D. Hebert, A. Cywinska, S. L. Ball, and J. R. deWaard, “Biological identifications through DNA barcodes,” Proc Biol Sci, vol. 270, pp. 313-321, 2003. [3] CBOL Plant Working Group, "A DNA barcode for land plants," Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 106, pp. 12794-12797, 2009. [4] W. J. Kress and D. L. Erickson, "A two locus global DNA barcode for land plants: the coding rbcL gene complements the non-coding trnH-psbA spacer region," PLoS ONE, vol. 2, no. 6, pp. 1-10, 2007. [5] M. Bolson, E. Smidt, M. L. Brotto, and V. Silva Pereira, "ITS and trnH psbA as efficient DNA Barcodes to identify threatened commercial woody angiosperms from southern Brazilian Atlantic rainforests," PLoS ONE, vol. 10, pp. 1-18, 2015. [6] K. P. Kollipara, R. J. Singh, and T. Hymowitz, "Phylogenetic and genomic relationships in the genus Glycine Willd based on sequences from the ITS region of nuclear rDNA," Genome, vol. 40, no. 1, pp. 57-68, 1997. [7] T. T. H. Vu, T. Q. Nguyen, T. A. Vu, T. V. A. Vu, T. N. L. Le, T. T. T. Tran, and T. T. Tran, "The genetic diversity of soybean varieties based on morphology, SSR molecular markers, and protein content," Can Tho University Journal of Science, vol. 55, no. 6, pp. 13-22, 2019. [8] T. H. Tran, T. K. O. Do, T. T. G. Kieu, T. T. Nguyen, and H. Q. Nguyen, "Morphological, anatomical, biochemical characteristics, and DNA barcoding of two Nho nhe bean samples collected in Yen Bai and Ha Giang," Vietnam Journal of Science and Technology, vol. 180, no. 04, pp. 187-192, 2018. [9] Plant Resource Center (PRC), "Vietnam soybean species," 2022. [Online]. Available: https://prc.org.vn/. [Accessed Mar. 10, 2022]. [10] Ministry of Agriculture and Rural Development, "National technical standards on testing the cultivation value and utilization value of peanut varieties (QCVN 01 57:2011/BNNPTNT)", 2011. [11] T. D. Ngo, D. L. Tran, V. L. Tran, T. D. Do, and T. D. Pham, Soybean Textbook. Agriculture Publishing House, 1999. [12] J. J. Doyl and J. L. Doyle, "Isolation of plant DNA from fresh tissue," Focus, vol. 12, pp. 13-15, 1990. [13] National Center for Biotechnology Information, "DNA barcode in soybean," 2024. [Online]. Available: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/. [Accessed Jan. 10, 2024]. [14] Wageningen University, "Primer3plus, pick primers from a DNA sequence," 2024. [Online]. Available: https://www.primer3plus.com/index.html.[Accessed Jan. 18, 2024]. [15] S. Ratnasingham and P. D. N. Hebert, "BARCODING BOLD: The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org)," Molecular Ecology Notes, vol. 7, no. 3, pp. 355-364, 2007. [16] D. V. Dinh, T. T. Nguyen, T. T. H. Vu, T. P. Luu, and Q. N. Vu, "Using ITS-rDNA nuclear barcode to identify yen tu egg-flower (Magnolia sp.) species," Biotechnology & Plant Varieties, no. 2, pp. 42-48, 2021. [17] T. H. Nguyen, H. N. Vu, T. T. Ma, T. H. T. Hoang, M. Q. Tran, and V. C. Duong, "Evaluation of the genetic resources of Cuc Bong soybean varieties in Vo Nhai District, Thai Nguyen Province," TNU Journal of Science and Technology, vol. 207, no. 04, pp. 179-186, 2019. [18] D. M. Hillis and J. J. Bull, "An empirical test of bootstrapping as a method for assessing confidence in phylogenetic analysis," Systematic Biology, no. 02, pp. 182-192, 1993. [19] M. L. Kuzmina, K. L. Johnson, H. R. Barron, and P. D. N. Hebert, "Identification of the vascular plants of Churchill, Manitoba, using a DNA barcode library," BMC Ecology, vol. 12, pp. 1-11, 2012. http://jst.tnu.edu.vn 131 Email: jst@tnu.edu.vn