-----(cid:1)(cid:2)(cid:3)(cid:1)(cid:2)-----

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Đề tài: “So sánh hai phương pháp định lượng

Berberin nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển

Trung Quốc (2005) và bằng đo quang phổ hấp thụ

UV-VIS theo dược điển Việt Nam III.”

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Berberin là một alcaloid thực vật thuộc nhóm isoquinolin có trong

nhiều loại cây thuốc ở Việt Nam, khoảng 150 loài thuộc nhiều họ thực vật

khác nhau. Berberin chủ yếu ở trong thân và rễ cây vàng đắng với tỷ lệ 1,5-

3%[1].

Berberin được biết đến với tác dụng nổi bật là kìm khuẩn tả và E.coli,

điều trị bệnh lỵ. Thuốc được sử dụng phổ biến do giá thành thấp và khá an

toàn, không ảnh hưởng tới sự phát triển bình thường của vi khuẩn có ích ở

ruột.

Hiện nay trên thị trường có các dạng bào chế của Berberin như: thuốc

nhỏ mắt, viên nén, viên bao…. Vì vậy vấn đề kiểm tra chất lượng nguyên liệu

làm thuốc cũng như thành phẩm là rất quan trọng.

Dược điển Việt Nam III (DĐVN III) có chuyên luận kiểm nghiệm

nguyên liệu và chế phẩm viên nén Berberin bằng phương pháp đo quang phổ

hấp thụ tử ngoại UV- VIS, dược điển Trung Quốc (2005) định lượng Berberin

bằng HPLC. Để có cơ sở lựa chọn phương pháp định lượng Berberin thích

hợp, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài : “ So sánh hai phương pháp

định lượng Berberin nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc

(2005) và bằng đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo dược điển Việt Nam

III” với những mục tiêu sau:

 Đánh giá phương pháp định lượng Berberin nguyên liệu bằng

HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005)

 Đánh giá phương pháp định lượng Berberin nguyên liệu bằng đo

quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III

2

 So sánh hai phương pháp định lượng trên để tìm phương pháp

thích hợp cho việc định lượng berberin trong các cơ sở kiểm tra

chất lượng thuốc trong nước.

PHẦN I. TỔNG QUAN

1.1. VÀI NÉT VỀ BERBERIN:

1.1.1. Cấu trúc:

Beberin là một alcaloid thực vật thuộc nhóm isoquinolin có khung

protoberberin[1]. Isoquinolin còn được gọi là benzo[c] pyridin hay 2-

This image cannot currently be display ed.

benzamin là một hợp chất hữu cơ thơm heterocyclic[18]

Cấu trúc của isoquinolin

This image cannot currently be display ed.

Công thức cấu tạo:

Công thức phân tử: C20H18NO4+ PTL: 336.36

Tên khoa học : 5,6 dihydro – 8,9 – dimethoxy – 1,3 – dioxa – 6a –

azoniaindeno (5,6-a) anthracen [6]

1.1.2. Nguồn gốc:

3

Berberin thường có trong rễ, thân rễ, thân, vỏ cây những cây thuộc chi

Berberis, Hydrastis candensis, Coptis chinensis [18]. Berberin có nhiều trong

thân và rễ cây vàng đắng với tỷ lệ 1,5-3%, berberin chiếm ít nhất là 82% so với

alcaloid toàn phần [9].

Berberin thường có lẫn các tạp chất alcaloid khác như: palmatin,

jatrorrhizin. Giới hạn tạp chất palmatin không quá 2%, jatrorrhizin không quá 5

% [6],[13].

1.1.3. Tính chất

- Bột kết tinh màu vàng, không mùi, có vị rất đắng. Tan trong nước

nóng, khó tan trong ethanol và nước lạnh, rất khó tan trong cloroform, không

tan trong ether.[6]

1.5. Tác dụng dược lý:

- Berberin có tác dụng kháng vi trùng như: vi khuẩn ( shigella, tụ cầu

và liên cầu khuẩn), thể protozoal, vi nấm, candida, virus, nấm men, kí sinh

trùng gây bệnh (kí sinh trùng sốt rét, kí sinh trùng đường ruột) [12], [17].

- Berberin có tác dụng kìm khuẩn tả và E.coli, đặc biệt khi dùng sẽ

không ảnh hưởng tới sự phát triển bình thường của hệ vi khuẩn có ích ở ruột,

khi dùng phối hợp với một số thuốc kháng sinh sẽ hạn chế tác dụng phụ gây

ra bởi các thuốc kháng sinh đối với hệ sinh vật đường ruột [17].

- Berberin có tác dụng ức chế sự bài tiết ion trong lòng ruột, ức chế co

cơ, giảm cholesterol và trigycerid, chống tiểu đường, ức chế cơn nhịp nhanh

thất, giảm viêm cho người bị viêm khớp, tăng tiểu cầu của bệnh nhân xuất

huyết, giảm tiểu cầu tiên phát và thứ phát, kích thích sự bài tiết mật và thải trừ

bilirubin[17]. Chỉ định: [9],[12],[17]

- Bệnh lỵ trực khuẩn, hội chứng lỵ, viêm ruột, tiêu chảy, viêm ống mật

và đặc biệt là bệnh sỏi mật, vàng da, sốt, sốt rét, mụn nhọt.

4

- Điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ do kích thích bên ngoài( do nắng,

gió, lạnh, bụi, khói…) và điều trị bệnh đau mắt hột.

- Điều trị bệnh Leishmania, Trichomonas.

1.1.6. Chống chỉ định: [17]

- Phụ nữ có thai vì khả năng gây co bóp tử cung của berberin

- Người dị ứng với berberin ( rất hiếm gặp)

1.1.7. Dạng thuốc và hàm lượng: [11]

- Dạng viên nén, viên bao, viên nang với hàm lượng 10 mg, hoặc 50-

100 mg/ viên

- Dạng thuốc nhỏ mắt điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ do kích thích

bên ngoài (gió, nắng, lạnh, bụi, khói)

1.2. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BERBERIN:

1.2.1. Phương pháp thể tích: [5], [13]

Hòa tan 0,3g chế phẩm (chính xác) vào trong cốc với 150ml nước đang

sôi. Làm nguội, chuyển dung dịch vào bình định mức 250ml. Lấy chính xác

50ml dung dịch kali dicromat 0,1N rồi thêm nước tới vạch. Lắc đều trong 5

phút, lọc qua giấy lọc khô, bỏ 20ml dịch lọc đầu. Lấy chính xác 100ml dịch

lọc cho vào bình nón nút mài 250 ml, thêm 2g kali iodid, lắc cho tan, sau đó

thêm 10 ml dung dịch acid hydrochloric 16%, đậy kín, lắc đều, để vào bóng

tối trong 10 phút. Chuẩn độ bằng dung dịch natri thiosulfat 0,1N, gần điểm

tương đương thêm 2ml dung dịch hồ tinh bột và tiếp tục chuẩn độ cho đến khi

màu xanh biến mất thì dừng.

Song song tiến hành làm mẫu trắng trong cùng điều kiện.

1ml dung dịch kali dicromat 0,1N tương ứng với 12,39 mg C20

H18NO4Cl.

1.2.2. Phương pháp đo UV-VIS

 Phương pháp 1:[6].

5

* Dung dịch thử: Cân 0.200 g chế phẩm và hòa tan trong 200ml nước

bằng cách đun nóng. Sau đó làm lạnh và thêm nước đến 1000ml. Lấy 10ml

dung dịch này pha loãng với nước đến 100ml.

* Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,200 g Kali dicromat thuốc thử chuẩn đã sấy khô ở 1100C trong 4 giờ, hòa tan trong nước. Thêm 10ml

dung dịch acid sulfuric 1N và thêm nước vừa đủ 1000ml.

* Đo độ hấp thụ: Đo At và As của dunh dịch thử và dung dịch chuẩn ở

bước sóng 421 nm.

P

a

=

×

×

At As

1 006,1

* Cách tính: Lượng ( mg) của C20H18NO4Cl được tính bằng công thức sau:

a: khối lượng ( mg) kali dichromat.

 Phương pháp 2 [6]

Xác định hàm lượng berberin clorid trong viên nén.

* Dung dịch thử: Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình và nghiền thành

bột mịn. Cân chính xác một lượng bột viên tương đương với khoảng 80 mg

berberin clorid, thêm 10ml nước để thấm đều bột viên, sau đó thêm khoảng

200ml nước sôi, khuấy kĩ 5 phút, để nguội rồi chuyển vào bình định mức

500ml, thêm nước tới vạch, lắc đều. Để lắng tự nhiên hoặc đem ly tâm. Lấy

chính xác 5ml dung dịch trong ở trên đem pha loãng với nước cất vừa đủ

100ml.

* Dung dịch chuẩn : pha tương tự dung dịch thử, dùng chất đối chiếu

berberin clorid.

* Mẫu trắng: nước cất.

* Tiến hành đo độ hấp thụ của dung dịch thử và chuẩn trong cùng điều

kiện tại bước sóng cực đại 345 nm, cốc đo dầy 1 cm.

1.2.3. Phương pháp cân [5]

6

Áp dụng để định lượng viên nén berberin clorid, dựa trên khả năng tạo

tủa của berberin với acid picric.

Cân 20 viên và nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lượng bột viên

tương ứng với khoảng 0.50g berberin clorid, cho vào bình định mức 250ml,

thêm khoảng 200 ml methanol (TT), lắc kỹ để hòa tan berberin, rồi thêm

methanol đến ngấn. Lắc đều, lọc qua giấy lọc khô, bỏ 20ml dịch lọc ban đầu.

Lấy đúng 100ml dịch lọc. Làm bay hơi cho đến khô trên cách thủy, thêm

150ml dung dịch NaOH 0,1N và 90ml nước, đun nóng. Lắc kỹ để hòa tan. Để

nguội rồi lọc qua giấy lọc đã thấm ướt. Rửa phễu và giấy lọc 3 lần, mỗi lần

10ml nước.

Gộp dịch lọc và nước rửa, thêm 10ml dung dịch acid hydroclorid 0,1N

rồi tiếp tục cho ngay và từ từ 30ml dung dịch bão hòa acid picric ( TT). Lắc

đều.

Để yên qua một đêm, lọc qua phễu thủy tinh xốp có đường kính lỗ xốp

10 – 16 µm ( đã cân bì) để lấy tủa. Rửa tủa 3 lần với nước cất ở khoảng 150C, mỗi lần 15ml nước, hút kiệt nước rồi sấy khô phễu và tủa ở 1000C đến khối

lượng không đổi. Khối lượng tủa xác định là P (g).

1 g tủa tương ứng với 0,6586 g C20H18NO4Cl.

1.2.4. Phương pháp HPLC

 Phương pháp 1:[14], [15].

* Điều kiện sắc ký:

- Cột sắc ký: Cột thép không gỉ ( 25cm x 4 mm) được nhồi bởi hạt silicagel đã

được octadecylsilan hóa có đường kính 5 µm. - Nhiệt độ cột: 400C.

- Pha động: Hòa tan 3,4g kali dihydrophosphat và 1,7g natri laurylsulfat trong

1000 ml hỗn hợp dung môi nước và acetonitril (1:1).

7

- Tốc độ dòng: Điều chỉnh tốc độ dòng sao cho thời gian lưu của berberin

khoảng 10 phút.

- Detector UV ở bước sóng 345 nm.

- Thể tích tiêm: 10 µl.

- Nồng độ dung dịch thử và chuẩn: 0,1mg/ml và cách tiến hành pha 2 dung

dịch này giống nhau.

* Tiến hành:

Lần lượt tiêm các dung dịch thử và chuẩn. Dựa vào đáp ứng của pic

berberin trong các dung dịch thử , chuẩn và hàm lượng dung dịch chuẩn, tính

lượng berberin trong chế phẩm.

* Cách tính: Lượng Wt (mg) của berberin clorid (C20H18ClNO4).

Wt = Ws x (At / As)

Ws = Lượng (mg) của berberin chuẩn, tính theo lượng khan.

 Phương pháp 2: [13]

* Điều kiện sắc ký:

- Cột sắc ký: Cột được nhồi bởi các hạt silicagel đã được octadecylsilan hóa.

- Pha động: Hỗn hợp dung dịch đệm phosphate [ 0,05 mol/L kali

dihydrophosphat với 0,05 mol/L natri heptan sulfonat (1:1) chứa 0,2%

triethylamin, điều chỉnh tới pH 3,0 bằng acid phosphoric] và acetonitril

(60:40).

- Tốc độ dòng: 1,5 ml/ phút.

- Detector UV ở bước sóng 263 nm.

- Thể tích tiêm: 20 µl

- Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: 32 µg/ml

* Tiến hành:

8

Lần lượt tiêm các dung dịch thử và chuẩn. Dựa vào đáp ứng của pic

berberin trong dung dịch thử, chuẩn và hàm lượng dung dịch chuẩn, tính

lượng berberin có trong chế phẩm.

 Phương pháp 3: [16]

* Điều kiện sắc ký:

- Cột sắc ký: Cột Hypersil C18 ( 5 µm, 25 cm x 4,6 mm)

- Pha động: Acid phosphoric 0,04 mol/l – acetonitril ( 58: 42).

- Tốc độ dòng: 1ml/phút.

- Detector UV ở bước sóng 349 nm.

* Tiến hành: Tương tự như 2 phương pháp HPLC đã trình bày ở trên.

1.3. TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP HPLC

1.3.1. Nguyên tắc

Phương pháp HPLC là 1 phương pháp phân tích hóa lý, dùng để tách

và định lượng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa

các chất với 2 pha luôn tiếp xúc nhưng không hòa lẫn vào nhau: Pha tĩnh

(trong cột hiệu năng cao) và pha động (dung môi rửa giải). Khi dung dịch của

hỗn hợp các chất cần phân tích đưa vào cột, chúng sẽ được hấp phụ hoặc phân

bố vào pha tĩnh tùy thuộc vào bản chất của cột và của chất cần phân tích. Khi

ta bơm dung môi pha động bằng bơm với áp suất cao thì tùy thuộc vào ái lực

của các chất với hai pha, chúng sẽ di chuyển qua cột với vận tốc khác nhau

dẫn đến sự phân tách.

Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi bộ phận phát hiện

gọi là detector và được chuyển qua bộ xử lý kết quả. Kết quả cuối cùng được

hiển thị trên màn hình hoặc đưa ra máy in. [8]

1.3.2. Cơ sở lý thuyết

Quá trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và

phân bố của các chất tan giữa 2 pha khác nhau. Khi pha động di chuyển với

9

một tốc độ nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lưu giữ ra

khỏi cột. Tùy theo bản chất pha tĩnh, chất tan và dung môi mà quá trình rửa

giải tách được các chất khi ra khỏi cột sắc ký. Nếu ghi quá trình tách sắc ký,

chúng ta có sắc đồ. [8], [11]

1.3.3. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký:

Kết quả của quá trình sắc kí được detector phát hiện, phóng đại và ghi

t

R2

R1t

t

o

0.5-1W

0.5-2W

t'R1

b1W

Wb2

R2t'

thành sắc ký đồ( hình 1):

Hình 1: sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trưng

Trong đó :

to (thời gian chết): Là thời gian cần thiết để pha động chảy qua cột tách

tR (thời gian lưu): thời gian kể từ khi chất cần phân tích được bơm vào

cột cho đến khi xuất hiện đỉnh của pic chất cần phân tích.

tR’ (thời gian lưu thực ) = tR- to.

W0,5: Độ rộng pic ở nửa chiều cao

Wb: Độ rộng đáy pic.

1.3.2.1. Hệ số dung lượng k’

R

0

R

R

t

t

1

=

=

=

−

'k

0

0

0

't t

− t

t t

[8]

10

Nếu k' nhỏ thì tR cũng nhỏ và sự tách kém. Trong thực tế k' nằm trong

khoảng 2 - 5 là tốt nhất. Hai chất chỉ được tách ra khỏi nhau nếu chúng có giá

trị khác nhau.

−

2

2R

0

=

' ) [4], [8]

1.3.2.2 Độ chọn lọc α (selectivity - factor)

' > k1

−

1

1R

0

t t

t t

'k 'k

α= (k2

α khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng, tối ưu từ 1,5 đến 2.

1.3.2.3. Độ phân giải (resolution)

Đặc trưng cho mức độ tách hai chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc

)

)

1

B,R

A,R

A,R

B

( t

=R

ký. Độ phân giải của 2 pic ở cạnh nhau được tính theo công thức:

=

=

  

  

N 4

−α α

B,R +

   

   

B

B

A

B2/1

A2/1

( t t 2 − ww +

18,1 w

t − w

'k + 'k1

[4], [8]

Độ phân giải cơ bản đạt được khi R = 1,5

1.3.2.4. Hệ số bất đối AF

Cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, nó được tính theo công thức:

AF w 20/1 = a2

[4], [8]

Trong đó:

W1/20: là chiều rộng của pic được đo ở 1/20 chiều cao của pic

a: khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép

đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic.

Khi AF nằm trong khoảng 0,5-2,5 thì phép định lượng được chấp

nhận, nếu AF càng tăng lên thì hiện tượng kéo đuôi càng rõ. Hiện tượng đỉnh

kéo đuôi (tailing peak) có thể là do tương tác giữa chất cần phân tích và pha

tĩnh hoặc cột sắc ký bẩn. Đỉnh kéo tuyến trước (fronting peak) có thể do

lượng mẫu đưa vào quá lớn so với năng lực cột [7].

1.3.2.5. Số đĩa lý thuyết N

Đặc trưng cho hiệu lực cột.

11

2

2

R

  

  

  

  

t R w

t w

B

B2/1

N = 16 hay N=5,54 [4], [8]

=H

Nếu gọi L là chiều cao cột sắc ký, thì chiều cao của đĩa lý thuyết H

L N

được tính bằng công thức:

1.3.4. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC [4],[8]

Hệ thống HPLC đơn giản và đủ để làm việc theo kỹ thuật HPLC bao

gồm 6 bộ phận chính sau:

a/Hệ thống bơm

Để bơm pha động vào cột tách. Bơm này phải điều chỉnh được áp suất

(0 - 400 bar)

a/ Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi

Bình chứa dung môi thường bằng thủy tinh hoặc thép không gỉ. Dung

môi chạy sắc ký được lọc qua màng lọc (thường màng lọc cỡ lỗ 0,45 µm ) và

đuổi khí hòa tan.

c/ Hệ tiêm mẫu

Để đưa mẫu phân tích vào cột.

Có nhiều phương pháp tiêm mẫu khác nhau, đơn giản nhất là sử dụng

một van tiêm. Trong các hệ thống sắc ký hiện đại là hệ tiêm mẫu tự động.

Trong sắc ký lỏng, mẫu lỏng có thể được tiêm ngay sau khi lọc loại tạp

qua màng lọc 0,45 µm, còn mẫu rắn cần hòa tan trong 1 dung môi

thích hợp.

d/ Cột sắc ký lỏng HPLC

Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hóa chất, chịu được với áp

suất cao đến vài trăm bar.

- Chiều dài cột: 10, 15, hoặc 25 cm; thích hợp với các tiểu phân pha

tĩnh có đường kính rất nhỏ (3, 5, 10 µm).

- Đường kính cột: 4 hoặc 4,6 mm.

12

e/ Detector trong HPLC

Là bộ phận phát hiện chất phân tích, tùy theo bản chất của chất cần

phân tích mà sử dụng detector thích hợp. Detector hay sử dụng là detector hấp

thụ UV - VIS. Ngoài ra còn có detector khúc xạ, huỳnh quang, điện hóa.

f/ Thiết bị hiển thị kết quả

Có nhiều loại nhưng đơn giản và phổ biến nhất là máy tự ghi để tín

hiệu đo dưới dạng pic.

Van tiêm mẫu

Bơm

Binh chứa pha động

Cột

Detector

Bộ phận tự ghi

Sơ đồ khối hệ thống HPLC được tổng quát ở hình 2

Hình 2: Sơ đồ khối tổng quát hệ thống HPLC 1.3.5. Cách đánh giá pic[7]

* Đánh giá diện tích pic: Diện tích của một chất tương ứng với tổng

lượng chất đó. Để tính diện tích pic, hiện nay người ta thường dùng máy tích

phân điện tử gắn với máy vi tính (sai số khoảng 0,5 %) hoặc máy phân tích cơ

học (sai số 1,3 %). Phương pháp này có thể dùng cho các pic không bị trôi

đường nền và cả pic có đường nền bị trôi. Phương pháp này chỉ cần điểm đầu

13

điểm cuối của pic được nhận ra chính xác và cho kết quả tốt với nồng độ vừa,

trung bình và cao.

* Đánh giá chiều cao pic: Khi pic có dạng không đổi thì chiều cao pic

(khoảng cách giữa đường nền và đỉnh pic) là một đại lượng tỷ lệ với diện tích

pic và nó cũng có thể dùng để đánh giá phổ. Phương pháp chỉ áp dụng khi các chỉ số k' là hằng định.

* Với pic có đường nền bị nhiễu hoặc bị hẹp thì việc xác định chiều cao

pic sẽ dễ dàng và chính xác hơn việc xác định diện tích pic.

1.4.TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ UV-VIS

1.4.1. Cơ sở lý thuyết[2],[3],[4],[6]

1.4.1.1. Định luật Lambert-Beer

Chiếu một chùm tia sáng đơn sắc có bước sóng ở và cường độ Io qua

dung dịch đồng nhất có nồng độ C, bề dày lớp dung dịch là l. Khi đi qua dung

dịch ,một phần ánh sáng bị hấp thụ, một phần bị phản xạ, phần còn lại (I) thì

đi qua dung dịch .

Mối quan hệ giữa I và Io được thể hiện bằng định luật Lambert-Beer. I = Io × 10 -ồCl

Với ồ là hệ số hấp thụ riêng của dung dịch. Hệ số này không phụ thuộc

vào nồng độ, chỉ phụ thuộc vào bản chất chất tan, vào bước sóng của ánh sáng

chiếu vào dung dịch.

1.4.1.2. Điều kiện ứng dụng định luật Lambert – beer

+ Chùm tia sáng phải đơn sắc

+ Dung dịch phải loãng (nằm trong khoảng nồng độ thích hợp)

+ Dung dịch phải trong suốt (trừ chuẩn độ đo quang).

+ Chất thử phải bền trong dung dịch và phải bền duới tác dụng của ánh

sáng (UV-VIS).

1.4.1.3. Sự sai lệch đối với định lật Lambert-beer

14

+ Sự sai lệch do máy:(do bộ phận đơn sắc ,bộ phận khuếch đại kém) như

do tế bào quang điện, nhân quang quá già, độ nhạy kém.

+ Sai lệch do hoá học:

- Do sự phân ly (ion hoá): thường gặp khi pha loãng dung dịch, phân tử

chất tan bị phân ly, mà độ hấp thụ của dạng phân tử và dạng ion phân ly

không như nhau.

- Do tạo dimer, trimer: sản phẩm trùng hợp này lại có độ hấp thụ khác

dạng đơn phân tử.

+ Do phản ứng các chất lạ:

- Chất lạ có thể tạo phức với các ion trong dung dịch: để đề phòng hiện

tượng này xảy ra, người ta dùng mẫu trắng có thành phần như dung dịch, chỉ

thiếu chất cần định lượng.

- Sự hấp thụ của chất lạ, thuốc thử cũng có thể ảnh hưởng tới kết quả định

lượng. Vì vậy trong quá trình làm phản ứng ″tạo màu″, phải chú ý tới điều

kiện phản ứng và các thành phần tham gia phản ứng.

1.4.1.4. Một số đại lượng thông dụng[

a/ Độ truyền qua (T-Transmittance):

Độ truyền qua (hay còn gọi là độ thấu quang) đặc trưng cho độ trong suốt

(về mặt quang học) của dung dịch, được định nghĩa:

0

tI I

T = = 10-ồCl

Thường T tính ra phần trăm (%). Một chất có T=1(hay100%), nghĩa là

hoàn toàn không có hấp thụ ánh sáng, người ta nói chất đó hoàn toàn trong

suốt.

b/ Độ hấp thụ (A-Absorbance):

Độ hấp thụ (hay còn gọi là mật độ quang) được định nghĩa :

= ồ.C.l A = lg 1 T

15

Đối với một chất xác định (có ồ xác định), thường đo trên một loại cốc

đo (có bề dày thông thường là l=1 cm), như vậy độ hấp thụ tỷ lệ thuận với

nồng độ dung dịch:

1

A=K.C (K=ồ.l)

1%

cmE ):

c/ Hệ số hâp thụ phần trăm (

1

Theo công thức A =ồ.C.l, nếu l=1 cm, C=1% thì :

1%

cmE

1

A = ồ =

1%

cmE chính là độ hấp thụ của dung dịch có nồng độ 1%, dùng cốc đo

1

Vậy

1%

cmE là một

có bề dày 1cm. Với một chất tan xác định, tại một ở xác định,

hằng số.

d/ Hệ số hấp thụ phân tử (ồỡ):

Hệ số hấp thụ phân tử, hay còn gọi là hệ số tắt mol là độ hấp thụ của

1

dung dịch có nồng độ 1M/l, dùng cốc đo có bề dày1cm.

1%

cmE , với một chất xác định, trong những điều kiện đo xác

Cũng như

1

1

định (ở, dung môi, nhiệt độ,...) ồỡ là một hằng số.

cmE × M

1%

cmE và ồỡ có mối liên hệ ồỡ =

1% 10

Giữa

ở đây M là phân tử gam của chất tan.

1.4.2. Một số kỹ thuật định lượng bằng phương pháp quang phổ UV-

VIS.[2],[4],[8]

1.4.2.1. Phương pháp đo phổ trực tiếp:

1

Đo độ hấp thụ của dung dịch, tính nồng độ C của dung dịch dựa vào giá

1%

cmE biết trước (tra cứu).

1

trị

1%

cmE .C.l → C =

1%

A cm 1 E

A = (với l =1 cm)

16

Trong phương pháp này, phải chú ý kiểm tra máy đo về bước sóng (ở) và

mật độ quang A bằng cách:

 Dùng đèn thuỷ ngân, đèn D2 (cho một vạch sáng có bước sóng xác

định).

 Dùng một mẫu chuẩn, đo và điều chỉnh để tìm sai số.

 Dùng một kính lọc Holmium (có các giá trị ởmax xác định cho trong

tài liệu )để kiểm tra lại máy.

 Dùng dung dịch K2CrO4, K2Cr2O7 tinh khiết quang phổ pha thành

dung dịch có nồng độ chính xác. Đo phổ tìm các giá trị ởmax và tìm

.

Amax

1.4.2.2. Phương pháp so sánh

Đo độ hấp thụ Ax, Ac của dung dịch thử có nồng độ Cx (chưa biết) và của

x

x

dung dịch chuẩn có nồng độ Ac (đã biết).

c

c

xC cC

A A

A A

Ta có: = → Cx = x Cc

Chú ý: nồng độ của dung dịch thử Cx và của dung dịch chuẩn Cc không

được chênh lệch nhau quá nhiều. Nồng độ dung dịch này càng gần nhau, kết

quả càng chính xác.

Ngoài ra còn có các kỹ thuật định lượng khác như: phương pháp đường

chuẩn, phương pháp thêm đường chuẩn, phương pháp chuẩn độ đo quang,

phương pháp định lượng hỗn hợp theo nguyên tắc cộng phổ .

17

PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1.1. Nguyên liệu, hoá chất, thuốc thử:

2.1.1.1. Đối tượng nghiên cứu:

. Berberin clorid: Chất chuẩn hàm lượng 83,3% do Viện kiểm nghiệm

thuốc TW cung cấp

. Berberin clorid dạng nguyên liệu do bộ môn Hoá Dược cung cấp

. Palmatin: do viện kiểm nghiệm thuốc TW cung cấp

2.1.1.2. Hoá chất, thuốc thử:

. Muối potasium dihydrophosphate (KH2PO4), acid phosphoric

(H3PO4)

. Heptane sodium sulfonate, triethylamine

. Acetonitril dùng cho HPLC (Merk)

. Nước cất 2 lần (cất trực tiếp tại Bộ môn Hóa vô cơ trường đại học

Dược Hà Nội) dùng cho máy HPLC

. Một vài hóa chất khác

2.1.1.3. Thiết bị:

+ Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao: DIONEX- Detector UV Diode

array- PDA 100

+ Cân phân tích AY 220 , Max = 220 g, độ chính xác 0,1 mg

+ Máy đo pH JENWAY của Anh

+ Máy cất nước 2 lần

+ Máy lắc siêu âm EBRO ARMATUREN của Đức

18

+ Máy lọc hút chân không Satorius

+ Bình định mức các loại: 20,0 ml; 25,0 ml; 100,0 ml ...

+ Cốc có mỏ: các loại 100; 200; 500

+ Pipet chính xác, pipet thường, đũa thủy tinh.

+ Bơm tiêm, lọ đựng mẫu, màng lọc 0,45 µm...

2.1.2. Phương pháp nghiên cứu:

2.1.2.1. Chỉ tiêu nghiên cứu:

. Phân tích mẫu thử bằng phương pháp HPLC và phương pháp đo

quang phổ hấp thụ UV- VIS

. Đánh giá độ chính xác, tính đúng, tính tuyến tính, tính đặc hiệu của

hai phương pháp trên

. So sánh 2 phương pháp trên

2.1.2.2. Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu:

 Nghiên cứu trên lý thuyết và tài liệu tham khảo để lựa chọn

phương pháp phân tích

 Bằng thực nghiệm, dựa vào kết quả thu được, xử lý thống kê và

rút ra kết luận

 Phương pháp sử dụng trong thực nghiệm: HPLC, Đo quang phổ

hấp thụ UV-VIS

2.1.2.3.Phương pháp xử lý số liệu thống kê:

. Dữ liệu thu được được xử lý bằng phương pháp thống kê - sử dụng

công cụ hỗ trợ là phần mềm Microsoft Excel

n

. Một số đặc trưng thống kê được sử dụng:

=

∑

ix

1 n

1i =

n

2

x

−

- Giá trị trung bình: x

)

∑

1i =

S

=

- Độ lệch chuẩn:

( ix 1n −

19

× 100

S x

S

- Độ lệch chuẩn tương đối (RSD): RSD% =

=

s x

n

x

- Sai số chuẩn :

100

ε

=

×

×

( %

)

n(

)1

α

−

t

s x

- Sai số tương đối:

- Khoảng tin cậy: µ = x ± tαSx

Trong đó : xi là kết quả xác định lần thứ i ; n là số lần xác định

2

+ Tiêu chuẩn Fischer để đánh giá độ chính xác hay độ lặp lại của 2

1 2

2

S S

phương pháp thí nghiệm khác nhau : Ftn = ; trong đó S1 > S2

Ftn>Flt : độ chính xác hay độ lặp lại của hai phương pháp khác nhau có ý

nghĩa thống kê

 Ftn>Flt : độ chính xác hay độ lặp lại của hai phương pháp khác

nhau có ý nghĩa thống kê

 Ftn

nhau không có ý nghĩa thống kê

 Flt tra bảng ở mức tin cậy 95% khi bậc tự do K = n – 1

+ Test T để so sánh giá trị trung bình kết quả định lượng của hai

2

2

−

−

(

) 1

1

2

2

1

n

S

phương pháp khác nhau :

1

2

pS =

X X>

2 2

n −

p

1

2

X X − S

( ) S 1 + 1 n n +

1

2

1 1 + n n

T = ( ) với

20

2

2

− : giá trị trung bình kết quả định lượng của hai

n n + tα 1 / 2

 T <

2

2

phương pháp khác nhau không có ý nghĩa thống kê

− : giá trị trung bình kết quả định lượng của hai

n n + tα 1 /2

 T >

2

2

phương pháp khác nhau có ý nghĩa thống kê

− tra bảng ở mức tin cậy 95% khi bậc tự do K = n1+n2-2

n n + tα 1 /2

2.2. Kết quả thực nghiệm :

2.2.1. Định lượng Berberin clorid nguyên liệu bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III *

Cách tiến hành :

+ Dung dịch thử : Cân 0,200 g chế phẩm và hoà tan trong 200 ml

nước bằng cách đun nóng. Sau đó làm lạnh và thêm nước đến 1000 ml. Lấy

10 ml dung dịch này pha loãng với nước đến 100 ml (C = 20 µg/ml)

+ Dung dịch chuẩn được pha tương tự dung dịch thử , dùng chất đối

chiếu berberin clorid

+ Đo độ hấp thụ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn trong cùng

điều kiện tại bước sóng cực đại 421 nm với mẫu trắng là nước cất, cốc đo dày

1 cm.

* Do có sẵn berberin, mặt khác dự định áp dụng phương pháp này cho cả berberin trong các dạng bào chế nên chúng tôi thay kali dicromat bằng berberin chuẩn.

* Cách tính kết quả :

21

t

c

Theo phương pháp so sánh, hàm lượng phần trăm được tính theo công

c

t

mA × mA ×

thức : C% = × C

Trong đó :

C% : Hàm lượng % Berberin clorid có trong mẫu thử.

C : Hàm lượng % Berberin clorid có trong mẫu chuẩn

At : Độ hấp thụ của dung dịch thử.

Ac : Độ hấp thụ của dung dịch chuẩn.

mt : Khối lượng tính bằng gam của Berberin clorid trong bột

nguyên liệu đã cân để pha dung dịch thử.

mc : Khối lượng tính bằng gam của Berberin clorid chuẩn đã

cân để pha dung dịch chuẩn.

Tiến hành định lượng 5 mẫu. Kết quả ghi trong bảng 1 .

Bảng1 : Kết quả định lượng Beberin clorid trong nguyên liệu

STT Khối lượng cân(g) Độ hấp thụ(A) C%

1 0,1971 0,269 86,50

2 0,2010 0,272 85,76

3 0,2062 0,280 86,06

4 0,2090 0,285 86,42

5 0,2030 0,277 86,48

Chuẩn 0,2001 0,263 83,30

22

Theo kết quả ở bảng 1, ta có:

 Giá trị trung bình: X = 86,24%

 Độ lệch chuẩn : S = 0,324

 Khoảng tin cậy của giá trị trung bình (ở mức tin cậy 95%):

∆X(%) = 0,40

 Độ lệch chuẩn tương đối: RSD = 0,37%

± 0,40%.

Kết luận: Hàm lượng Beberin clorid trong bột nguyên liệu là 86,24%

2.2.2. Đánh giá phương pháp định lượng Berberin clorid nguyên liệu

bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III

2.2.2.1./Tính chính xác :

Nguyên tắc: Độ chính xác của phương pháp được đánh giá bằng độ

lệch chuẩn tương đối của các phép thử song song.

Cách tiến hành và kết quả được trình bày như trong phần 2.2.1.1

Kết quả thử độ chính xác của phương pháp cho thấy độ lệch chuẩn

tương đối của các kết quả (RSD = 0,37% < 2%). Như vậy phương pháp là

chính xác

2.2.2.2 Tính tuyến tính:

Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp

thụ trên chất chuẩn Berberin.

Cân 5 mẫu chất chuẩn Berberin clorid có khối lượng từ 0,1600g→

0,2400g ( tại các điểm 80%,90%,100%,110%,120% nồng độ dùng khi định

lượng)

Cách tiến hành tương tự 2.2.1

Bảng 2: Sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ dung dịch

23

STT 1 2 3 4 5

C 0,0161 0,0180 0,0202 0,0220 0,0240

(mg/ml)

0.35

y = 12.5x + 0.013 R = 0.998

0.3

0.25

0.2

0.15

A ô h t p Ê h é §

0.1

0.05

0

0

0.005

0.01

0.015

0.02

0.025

0.03

C(mg/ml)

A 0,215 0,239 0,262 0,286 0,315

Hình 6 .Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào

nồng độ dung dịch

- Phương trình hồi quy biểu thị mối tương quan giữa mật độ quang và

nồng độ dung dịch là: y = 12,5 x + 0,013;

- Hệ số tương quan: 0,998

- Độ lệch chuẩn của y_ intercept: Sb = 0,009

- Với độ tin cậy 95% ta có khoảng tin cậy của y_intercept:

b ±3,182Sb = 0,013 ± 0,029 hay - 0,016 ≤ y_intercept ≤ 0,042

Từ kết quả trên cho thấy hệ số tương quan của đường hồi quy vượt

quá 0,99…Tất cả các giá trị nằm trên đường hồi quy hoặc phân bố đồng đều

cả hai phía của đường hồi quy.

Khoảng tin cậy của y_intercept chứa 0.

Vậy phương pháp là tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 80% đến

120% nồng độ làm việc.

24

2.2.2.3. Độ đúng:

. Cân 3 mẫu chất đối chiếu Beberin clorid ( hàm lượng 83,3%) với

khối lượng từ 0,1600g → 0,2400g (tại các điểm 80, 100, 120% so với lượng

cân dùng khi định lượng)

. Tiến hành tương tự 2.2.1. Mỗi mẫu đo 3 lần, lấy kết quả trung bình

. Tính toán kết quả khảo sát độ đúng dựa vào độ hấp thụ của mẫu

chuẩn là 0,263 ứng với khối lượng cân 0,2001g

Kết quả thu được ghi ở bảng 3

Bảng 3: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đo quang phổ

hấp thụ UV-VIS

STT Khối Lượng hoạt Độ hấp Lượng tìm Phần trăm

lượng cân chất có thực thụ trung lại trung tìm lại

(g) a (g) bình (A) bình b (g) (b/a.100%)

0,1322 0,208 98,88 1 0,1605 0,1337

0,1696 0,267 100,77 2 0,2020 0,1683

0,1984 0,313 100,86 3 0,2362 0,1967

Từ kết quả bảng 3 ta có:

- Trung bình % tìm lại: 100,17%

- Phương trình hồi quy về mối tương quan giữa lượng hoạt chất ban

đầu và lượng hoạt chất tìm lại là: y = 1,052x – 0,008

- Hệ số tương quan: r = 0,999

25

- Độ lệch chuẩn của y_intercept: Sb = 0,003

- Độ lệch chuẩn của độ dốc: Sa = 0,019

- Với độ tin cậy 95% ta có:

Khoảng tin cậy của độ dốc: a ± 3,182Sa = 1,052 ± 0,060 hay 0,992

< a < 1,112

Khoảng tin cậy của y_intercept: b ± 3,182Sb = - 0,008 ± 0,009

0.25

y = 1.052x - 0.008 R = 0.999

0.2

) g ( i ¹ l

m

0.15

0.1

× t g n î L

0.05

0

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

Lîng ho¹t chÊt cã thùc (g)

hay - 0,017 < y_intercept < 0,001

Hình 7: Đồ thị biểu diễn phương trình hồi quy tuyến tính về mối

tương quan giữa lượng hoạt chất tìm lại và lượng hoạt chất có thực

Kết luận:

- Không có sai số hệ thống hằng định vì khoảng tin cậy của

y_intercept chứa 0.

- Không có sai số hệ thống tỷ lệ vì khoảng tin cậy độ dốc chứa 1.

- Giá trị trung bình của tỷ lệ thu lại là 100,17% nghĩa là nằm trong

khoảng từ 98% đến 102%.

Như vậy, phương pháp đưa ra là đúng trong khoảng khảo sát.

2.2.2.4. Tính đặc hiệu:

Như trong phần 1.1.2 đã trình bày, các tạp chất cần xác định trong

Berberin nguyên liệu là Palmatin và Jatrorrhizin. Nhưng trong điều kiện thí

nghiệm không có chất chuẩn Jatrorrhizin, chúng tôi chỉ tiến hành xác định sự

ảnh hưởng của tạp chất Palmatin đối với phương pháp định lượng

26

Tiến hành:

+ Cân 0,200 g chất chuẩn berberin clorid và hòa tan trong 200 ml

nước bằng cách đun nóng. Sau đó làm lạnh và thêm nước đến 1000 ml, thu

được dunhg dịch berberin chuẩn 0,2 mg/ml. Lấy 10 ml dung dịch này cho vào

4 bình định mức 100 ml.

+ Pha dung dịch Palmatin 10%, 5% và 2,5% so với nồng độ của

berberin clorid đem đo

. Cân 0,02 g Palmatin chuẩn và hòa tan trong 20 ml nước bằng cách

đun nóng. Sau đó làm lạnh và thêm nước đến 100 ml. Lấy 10 ml dung dịch

này cho vào bình định mức 100 ml và thêm nước vừa đủ tới vạch, được dung

dịch palmatin chuẩn 0,02 mg/ml

. Lấy 25 ml dung dịch palmatin 0,02 mg/ml cho vào bình định mức 50

ml và thêm nước vừa đủ tới vạch, ta được dung dịch palmatin 0,01 mg/ml.

. Lấy 25 ml dung dịch palmatin 0,01 mg/ml cho vào bình định mức

50 ml và thêm nước vừa đủ tới vạch, được dugn dịch palmatin 0,005 mg/ml.

. Lần lượt thêm 10 ml dung dịch palmatin 0,02; 0,01; 0,005 mg/ml

vào 3 bình định mức 100 ml đã chứa berberin clorid chuẩn trên và thêm nước

vừa đủ tới vạch. Một bình định mức 100 ml không thêm palmatin và thêm

nước tới vạch. Đem đo độ hấp thụ quang của dung dịch 4 bình này tại bước

sóng 421 nm

Bảng 4: Kết quả thu được về sự ảnh hưởng của tạp chất palmatin tới

độ hấp thụ quang của berberin clorid

Bình 1 Bình 2 Bình 3 Bình 4

Berberin clorid 0,2 mg/ml 10 10 10 10 (ml)

Palmatin 0,02 mg/ml (ml) 10

Palmatin 0,01 mg/ml (ml) 10

27

Palmatin 0,005 mg/ml (ml) 10

Độ hấp thụ A 0,263 0,282 0,271 0.266

Nhận xét: Từ kết quả bảng trên, ta thấy độ hấp thụ quang của dung

dịch tăng theo sự tăng của nồng độ dung dịch palmatin. Khi thêm 2,5%

palmatin, hàm lượng berberin trong bột nguyên liệu định lượng theo phương

pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS của DĐVN III tăng 1,14%. Nếu có 2%

palmatin như trong giới hạn về palmatin mà DĐVN III yêu cầu thì kết quả

định lượng tăng 0,91%

Vậy phương pháp không có tính đặc hiệu.

2.2.3. Định lượng berberin clorid nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển

Trung Quốc (2005):

Điều kiện sắc ký để định lượng Berberin clorid nguyên liệu

- Cột sắc ký: hạt nhồi silicagel được octadecylsilan hóa

- Detector UV: 263 nm

- Pha động: đệm phosphate [ hỗn hợp KH2PO4 0,05M và heptan Na

sulfonate(1:1) chứa 0,2% triethylamin, điều chỉnh pH=3,0 bằng H3PO4] –

acetonitril (60:40).

- Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng thí nghiệm

- Thể tích tiêm: 20ỡl

- Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút

* Tiến hành:

+ Dung dịch thử: Cân 0,04 g berberin clorid hòa tan trong nước nóng,

cho vào bình định mức 100 ml.Sau đó làm lạnh và thêm nước tới vạch. Lọc

qua màng lọc 0,45 ỡm, bỏ 8 ml dịch lọc đầu. Lấy chính xác 2 ml dịch lọc trên

cho vào bình định mức 25 ml , thêm nước tới vạch.

28

+ Dung dịch chuẩn : pha tương tự dung dịch thử, dùng chất đối chiếu

berberin clorid

+ Tiêm lần lượt 10 ỡl dung dịch chuẩn và các dung dịch thử vào hệ

thống sắc ký, chạy sắc ký theo các điều kiện đã lựa chọn. Dựa vào diện tích

hoặc chiều cao pic trên sắc đồ của dung dịch chuẩn và dung dịch thử, nồng

độ của dung dịch chuẩn, tính hàm lượng (%) Berberin clorid có trong mẫu thử

83,30

t

theo công thức sau:

c

t

S m × × c S m ×

HL% =

tS : Diện tích pic mẫu thử

cS : Diện tích pic mẫu chuẩn (

cS = 12,2646)

cm : Khối lượng cân mẫu chuẩn (0,0405 g)

X : Khối lượng cân mẫu thử

Trong đó:

83,30: Hàm lượng thực của mẫu chuẩn

Bảng 5: Kết quả định lượng Berberin clorid nguyên liệu

STT Khối lượng cân (g) Diện tích pic (mAU.min) Hàm lượng (%)

1 0,0407 12,6917 85,78

2 0,0402 12,6120 86,30

3 0,0398 12,4224 85,86

4 0,0405 12,7101 86,32

5 0,0400 12,5350 86,20

Chuẩn 0,0405 12,2646 83.30

Theo kết quả ở bảng 5, ta có:

29

- Giá trị trung bình: X = 86,09 %

- Độ lệch chuẩn: S = 0,254

- Khoảng tin cậy của giá trị trung bình (ở mức tin cậy 95%): X (%) =

86,09% ± 0,315%

- Độ lệch chuẩn tương đối: RSD (%) = 0,295

Vậy theo phương pháp định lượng trên, hàm lượng Berberin clorid

trong bột nguyên liệu là: 86,09% ± 0,315%

2.2.4. Đánh giá phương pháp định lượng berberin clorid nguyên liệu

bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005):

2.2.4.1. Tính chính xác:

Cách tiến hành và kết quả được trình bày như trong phần 2.2.3

Kết quả thử độ chính xác cho thấy độ lệch chuẩn của các kết quả RSD

=0,295 % < 2%. Vậy phương pháp là chính xác.

2.2.4.2. Tính tuyến tính:

Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích

pic trên chất chuẩn Berberin.

Cân 5 mẫu chất chuẩn Berberin clorid có khối lượng từ 0,1600g→

0,2400g ( tại các điểm 80%,90%,100%,110%,120% nồng độ dùng khi định

lượng)

Tiến hành tương tự 2.2.3

Kết quả thu được ở bảng 6

Bảng 6: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ dung dịch

STT 1 2 3 4 5

C (ỡg/ml) 25,76 28,80 32,16 35,04 38,48

Diện tích pic 9,7115 10,8580 12,1243 13,2081 14,5069

(mAU.min)

30

y = 0.377x + 0.002 R = 0,999

.

) n i m U A m

( c i p h c Ý t n Ö i D

16 14 12 10 8 6 4 2 0

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

C(µg/ml)

Hình 10: Đồ thị biễu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic vào nồng

độ của dung dịch

- Phương trình hồi quy về mối tương quan giữa diện tích pic và nồng

độ dung dịch là:y = 0,377x + 0,002

- Hệ số tương quan: R = 0,9999

- Độ lệch chuẩn của y_intercept: Sb = 0,003

- Với độ tin cậy 95% ta có khoảng tin cậy của y_intercept:

b ± 3,182Sb = 0,002 ± 0,009 hay - 0,007 < y_intercept <0,011

Nhận xét: Hệ số tương quan của đường hồi quy vượt quá 0,99…Tất

cả các giá trị đo được nằm trên đường hồi quy hoặc phân bố đồng đều cả hai

phía của đường hồi quy. Khoảng tin cậy của y_intercept chứa 0.

Vậy phương pháp này là tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 80% đến

120% nồng độ làm việc.

2.2.4.3. Tính đúng:

. Cân 3 mẫu chất đối chiếu berberin clorid (hàm lượng 83,3%) với

khối lượng từ 0,032g → 0,048g (tại các điểm 80%,100%,120% so với lượng

cân dùng khi định lượng).

. Mỗi mẫu chạy sắc ký 3 lần, lấy giá trị trung bình. Tiến hành tương

tự 2.2.3

31

. Tính toán kết quả khảo sát tính đúng dựa trên diện tích pic của mẫu

chuẩn là 12,2646 mAU.min ứng với khối lượng cân 0,0405 g.

Két quả thu được ghi ở bảng 7

Bảng 7: Kết quả khảo sát tính đúng của phương pháp HPLC

STT Khối lượng Lượng Lượng tìm Phần trăm tìm Diện tích

cân(g) Beberin pic trung lại trung lại

clorid có bình bình b (g) %=b/a× 100%

(mAU.min) thực a (g)

1 0,0322 0,0268 9,8535 0,0270 100,75

2 0,0402 0,0335 12,1701 0,0334 99,70

y = 0.977x + 0.001 R = 0.999

) g ( i ¹ l

m

× t g n î L

0.045 0.04 0.035 0.03 0.025 0.02 0.015 0.01 0.005 0

0

0.005

0.01

0.015

0.02

0.025

0.03

0.035

0.04

0.045

Lîng ho¹t chÊt cã thùc (g)

3 0,0481 0,0401 14,5705 0,0400 99,75

Hình 11: Đồ thị biểu diễn phương trình hồi quy tuyến tính về mối tương

quan giữa lượng hoạt chất có thực và lượng tìm lại

- Phương trình hồi quy về mối tương quan giữa lượng hoạt chất ban

đầu và lượng hoạt chất tìm lại là: y = 0,997x + 0,001

- Hệ số tương quan: R = 0,999

- Trung bình % tìm lại :100,07%

- Độ lệch chuẩn của y_intercept: Sb = 0,001

- Độ lệch chuẩn của độ dốc: Sa = 0,013

32

- Với độ tin cậy 95% ta có:

Khoảng tin cậy của độ dốc: a ± 3,182Sa hay 0,9560 < a <1,038

Khoảng tin cậy của y_intercept :b ± 3,182Sb hay -0,002 <

y_intercept <0,004

Kết luận :

- Không có sai số hệ thống hằng định vì khoảng tin cậy của

y_intercept chứa 0.

- Không có sai số hệ thống tỷ lệ vì khoảng tin cậy của độ dốc chứa 1.

- Giá trị trung bình của tỷ lệ thu lại là 100,07% nằm trong khoảng từ

98% đến 102%.

Như vậy phương pháp là đúng trong khoảng khảo sát.

2.2.4.4. Tính đặc hiệu:

Như trong phần 1.1.2 đã trình bày, các tạp chất cần xác định trong

Berberin nguyên liệu là Palmatin và Jatrorrhizin. Nhưng trong điều kiện thí

nghiệm không có chất chuẩn Jatrorrhizin, chúng tôi chỉ tiến hành xác định sự

ảnh hưởng của tạp chất Palmatin đối với phương pháp định lượng

Tiến hành:

. Cân 0,04 g berberin clorid chuẩn hòa tan trong nước nóng, cho vào

bình định mức 100 ml.Sau đó làm lạnh và thêm nước tới vạch, thu được dung

dịch Berberin clorid 0,4 mg/ml. Lọc qua màng lọc 0,45 ỡm, bỏ 8 ml dịch lọc

đầu. Lấy chính xác 2 ml dịch lọc trên cho vào 4 bình định mức 25 ml , thêm

nước tới vạch.

. Pha dung dịch palmatin chuẩn có nồng độ 10%; 5%; 2,5% so với

nồng độ berberin clorid đem chạy sắc ký.

+ Cân 0,04 g palmatin chuẩn hòa tan trong nước nóng, cho vào bình

định mức 100 ml, thêm nước tới vạch. Lọc qua màng lọc 0,45 ỡm, bỏ 8 ml

33

dịch lọc đầu. Lấy 5 ml dịch lọc này cho vào bình định mức 50 ml, thêm nước

tới vạch, thu được dung dịch palmatin 0,04mg/ml.

+ Lấy chính xác 25 ml dung dịch palmatin 0,04 mg/ml cho vào bình

định mức 50 ml, thêm nước tới vạch., thu được dung dịch palmatin 0,02

mg/ml.

+ Lấy chính xác 25 ml dung dịch palmatin 0,02 mg/ml cho vào bình

định mức 50 ml, thêm nước tới vạch, thu được dung dịch palmatin 0,01

mg/ml.

. Lần lượt thêm 2 ml dung dịch palmatin 0,04; 0,02; 0,01 mg/ml vào 3

bình định mức 25 ml trên, thêm nước vừa đủ tới vạch. Bình định mức 25ml

không thêm palmatin được thêm nước vừa đủ tới vạch.

. Chạy sắc ký dung dịch 4 bình này.

Kết quả thu được ghi trong bảng 8

Bảng 8: Kết quả thu được về sự ảnh hưởng của tạp chất palmatin

tới diện tích pic của Berberin clorid

Bình 1 Bình 2 Bình 3 Bình 4

Berberin clorid 0,4 mg/ml 2 2 2 2

Palmatin 0,04 mg/ml 2

Palmatin 0,02 mg/ml 2

Palmatin 0,01 mg/ml 2

Diện tích pic (mAU.min) 12,2650 12,3011 12,3229 12,2530

34

1.0 ]

UV_VIS_1 WVL:263 nm

mAU

min

6.0

7.0

9.0

10.1

-0.10 0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

8.0

BERBERIN CH

35.0

UV_VIS_1 WVL:263 nm

mAU

1 - 7.353

min

-5.0

6.0

7.0

9.0

10.1

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

8.0

Hình 12: Sắc ký đồ mẫu trắng

BERBERIN TH10,4

35.0 KLLien #83 [modified by Administrator]

z

UV_VIS_1 WVL:263 nm

mAU

A

2 - 7.420

1 - 4.653

min

-5.0

13.4

0.7

2.5

3.8

5.0

6.3

7.5

8.8

10.0

11.3

Hình 13: Sắc ký đồ mẫu chuẩn

Hình 14: Sắc ký đồ mẫu chuẩn có thêm Palmatin

Nhận xét: Diện tích pic hầu như không thay đổi khi có mặt tới 10%

palmatin. Vậy phương pháp có tính đặc hiệu khi có mặt của tạp chất này.

2.2.5. So sánh hai phương pháp định lượng Berberin clorid trong bột

nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc 2005 và đo quang

phổ hấp thụ UV-VIS theo dược điển Việt Nam III:

2.2.5.1. So sánh kết quả độ chính xác của hai phương pháp định lượng:

35

Các tính toán được thực hiện trên các kết quả thu được khi định lượng

Berberin clorid nguyên liệu do bộ môn Hóa Dược trường Đại Học Dược Hà

Nội cung cấp.

Tóm tắt kết quả thu được khi định lượng nguyên liệu Berberin clorid

bằng hai phương pháp ở bảng 9

Bảng 9: Tóm tắt các kết quả thực nghiệm thu được khi định lượng

nguyên liệu Berberin clorid

Phương Hàm lượng Số lần thí

Độ lêch chuẩn (S) pháp trung bình Phương sai (S2) nghiệm

(%)

HPLC 86,09 0,0645 0,254 5

Đo quang 86,24 0,1050 0,324 5 UV-VIS

2/S2

2 (S1>S2)

Dùng chuẩn F (Fisher): Ftn = S1

Ftn = 0,1050/0,0645 = 1,3

S1: độ lệch chuẩn của phương pháp đo quang UV-VIS

S2: độ lệch chuẩn của phương pháp HPLC

Flt ( ở mức tin cậy 95% khi bậc tự do K1 = 5 - 1 = 4; K2 = 5 - 1 = 4) là:

6,39

Như vậy Ftn

Berberin nguyên liệu khác nhau không có ý nghĩa thống kê.

2.2.3.2. So sánh kết quả giá trị trung bình của hai phương pháp định

lượng :

Do độ lặp lại của 2 phương pháp định lượng khác nhau không có ý

nghĩa thống kê nên để so sánh kết quả giá trị trung bình của hai phương pháp

định lượng, ta dùng Test T.

36

2

2

−

−

(

) 1

1

2

1

2

n

S

pS =

2 2

n −

p

1

2

) ( S 1 + 1 n n +

X X − S

1

2

1 1 + n n

T = với

2

8

2

) − =

T phân phối Student với n1 + n2 – 2 bậc tự do

0,025

( n n + 1 / 2 α

t

t

ở mức tin cậy 95% hay ỏ =0,05, ta có: =2,306

pS =

4.0, 0645 4.0,1050 + 5 5 2 + −

= 0,291

0, 291

+

− 86, 24 86, 09 1 5

1 5

= 0,815 Do đó Tqs =

Như vậy 0,815 < 2,306 nên với mức ý nghĩa 0,05 giá trị trung bình

hàm lượng Berberin trong nguyên liệu của hai phương pháp định lượng khác

nhau không có ý nghĩa thống kê.

2.2.3.2. Đánh giá ưu nhược điểm của hai phương pháp định lượng

Berberin clorid trong bột nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung

Quốc (2005) và bằng đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III

 Phương pháp HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005):

+ Ưu điểm:

. Phương pháp có tính đặc hiệu khi có mặt tạp chất palmatin

+ Nhược điểm:

. Yêu cầu phải có các hóa chất dung môi tinh khiết dùng cho HPLC

. Chi phí cao khi phải chạy pha động có acetonitril và đặc biệt là hóa

chất heptan natri sulfonat rất đắt tiền

. Quá trình chuẩn bị chạy sắc ký và chạy đường nền tốn thời gian

 Phương pháp đo quang phổ UV-VIS theo DĐVN III:

+ Ưu điểm:

. Không tốn hóa chất dung môi

37

. Thời gian phân tích nhanh chóng, chỉ cần 5-10 phút có thể cho biết

ngay kết quả

. Kỹ thuật thao tác đơn giản, máy móc dễ tìm, gọn nhẹ

+ Nhược điểm:

Phương pháp không có tính đặc hiệu (palmatin ảnh hưởng tới kết quả

định lượng)

2.3. BÀN LUẬN:

Phương pháp HPLC là một phương pháp phân tích hiện đại, đang

từng bước được đưa vào phòng kiểm nghiệm và trung tâm kiểm nghiệm ở

Việt Nam. Phương pháp định lượng Berberin nguyên liệu bằng HPLC theo

dược điển Trung Quốc (2005) cho biết hàm lượng Berberin trong nguyên liệu

là 86,09% ± 0,315%; phương pháp chính xác với RSD = 0,295% < 2%, tuyến

tính trong khoảng 80%-120% nồng độ định lượng và đúng trong khoảng khảo

sát. Ưu điểm của phương pháp này là có tính đặc hiệu khi có mặt tạp chất

palmatin trong nguyên liệu Berberin. Tuy nhiên phương pháp này lại rất tốn

kém khi phải dùng những dung môi và hóa chất đắt tiền như: natri heptan

sulfonat, acetonitril…

Hàm lượng Berberin trong nguyên liệu khi định lượng bằng phương

pháp đo quang phổ UV-VIS theo DĐVN III là 86,24% ± 0,40%; phương

pháp chính xác với RSD = 0,37% < 2%, tuyến tính trong khoảng 80%-120%

nồng độ định lượng và đúng trong khoảng khảo sát nhưng không đặc hiệu (

tạp chất palmatin ảnh hưởng tới kết quả định lượng). Tuy nhiên. DĐVN III có

quy định giới hạn tạp chất palmatin không quá 2% [6]. Theo kết quả ở mục

2.2.2.4 thì nếu palmatin có mặt 2%, kết quả định lượng tăng 0,91%. Nên với

berberin nguyên liệu thõa mãn yêu cầu về giới hạn tạp chất palmatin thì sự có

mặt của palmatin không ảnh hưởng lớn đến kết quả định lượng.

38

Ngoài ra, khi so sánh kết quả của hai phương pháp định lượng ta thấy

độ chính xác và giá trị trung bình khác nhau không có ý nghĩa thống kê.

Như vậy, nếu không yêu cầu độ chính xác cao, có thể dùng phương

pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III để định lượng berberin

nguyên liệu (đạt yêu cầu về giới hạn tạp chất palmatin không quá 2%) vì

phương pháp này không tốn kém, tiến hành nhanh, thao tác đơn giản, dễ thực

hiện. Với thành phẩm do không quy định hàm lượng palmatin và những tạp

khác cũng có thể hấp thụ UV nên để có kết quả định lượng chính xác thì nên

dùng phương pháp HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005).

KẾT LUẬN

* Kết luận

Trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp, chúng tôi đã thu được

một số kết quả:

+ Xác định được hàm lượng của berberin trong nguyên liệu bằng

phương pháp đo quang phổ UV-VIS ( theo DĐVN III) và bằng phương pháp

HPLC( theo dược điển Trung Quốc 2005). Kết quả cho thấy cả hai phương

pháp đều đáp ứng các chỉ tiêu : độ chính xác, độ đúng, tính tuyến tính. Nhưng

chúng khác nhau về tính đặc hiệu: phương pháp HPLC với sự có mặt

palmatin không ảnh hưởng tới kết quả định lượng, trong khi đó palmatin ảnh

hưởng tới kết quả định lượng trong phương pháp đo quang phổ UV-VIS

+ Hiểu được cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng

cao, một phương pháp phân tích hiện đại có nhiều ứng dụng trong kiểm

nghiệm thuốc, biết sử dụng thành thạo các thao tác cơ bản của máy HPLC.

+ Học được cách tìm tài liệu, làm thực nghiệm và trình bày văn bản

một cách khoa học về một vấn đề nghiên cứu;

39

+ Tìm hiểu phương pháp HPLC, làm quen và sử dụng thành thạo được

máy HPLC để định lượng một sản phẩm; biết cách đánh giá một phương pháp

định lượng.

* Đề xuất:

Do điều kiện thời gian và hóa chất có hạn nên chúng tôi chỉ mới tiến

hành định lượng Berberin clorid nguyên liệu. Tuy nhiên từ kết quả thu được

trong khóa luận, chúng tôi có những đề xuất sau:

+ Áp dụng phương pháp HPLC theo dược điển Trung Quốc(2005) để

định lượng Berberin clorid trong một số chế phẩm thuốc nhỏ mắt

+ Nghiên cứu, khảo sát điều kiện định lượng berberin bằng HPLC

không phải dùng Natri heptan sulfonat để áp dụng định lượng ở các cơ sở

kiểm nghiệm trong nước.

40

TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tiếng việt

1. Bộ môn Dược liệu (1998), Bài giảng dược liệu, Trường ĐH Dược Hà Nội,

tập 2, tr. 89- 91.

2. Bộ môn Hóa Phân tích (2006), Hóa phân tích, Trường ĐH Dược Hà Nội,

tập 2, tr. 41- 62.

3. Bộ môn Hóa Phân tích (2002), Hóa phân tích, Trường ĐH Dược Hà Nội,

tập 1, tr. 27- 44.

4. Bộ môn Hóa Phân tích (2004), Kiểm nghiệm thuốc, Trường ĐH Dược Hà

Nội, tr. 68- 79,83-98.

5. Bộ Y tế (1994), Dược điển Việt Nam II, Nhà xuất bản Y học, tập 3, tr.71-

74.

6. Bộ Y tế (2002), Dược điển Việt Nam III, Nhà xuất bản Y học Hà Nội,

tr.33- 35, 178- 179 phụ lục 3 (PL- 75, 76).

7. Nguyễn Minh Đức (2006), Sắc ký lỏng hiệu năng cao và một số ứng

dụng vào nghiên cứu, kiểm nghiệm dược phẩm, dược liệu và hợp chất tự

nhiên, Nhà xuất bản y học thành phố Hồ Chí Minh, tr.138,148-149.

8. Phạm Gia Huệ, Trần Tử An (1998), Hóa phân tích tập 2, Đại học dựợc Hà

Nội, tr.55-98.

9. Đỗ Tất Lợi (1999), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Xuất bản lần

thứ VIII- Nhà xuất bản Y học, tr.195.

10. Từ Văn Mạc (1995), Phân tích hóa lý, NXB khoa học và kỹ thuật Hà Nội,

tr.313-319.

11. DS. Phạm Thiệp- DS.Vũ Ngọc Thúy( tái bản lần thứ 13), Thuốc biệt

dược và cách sử dụng, Nhà xuất bản Y học, tr.106.

II. Tiếng Anh

12. Martindal 34 (2005), volume II, p.1659.

41

13. Pharmacopoeia of the people′s republic of China (2005), volum III, p.94-

96. 14. The Korean Pharmacopoeia, 8th edition (2002), p.81-82.

15. The Japanese Pharmacopoeia fifteenth edition (2006), p.351- 352.

16. Wang, S. D; Song, B.S . (2000), Determination of berberin in decoted

liquid from Shensu granules with water by reversed- phase liquid

chromatography, Sepu, p. 261- 262.

III. Trang web

17. Cây thuốc quý (2007), berberin, www. cây thuốc quý. Info.vn.

18. Wikipedia (2007), berberin, http://en.wikipedia.org.

.

42

)

)

1

A,R

A,R

B,R

B

( t

=R

=

=

N 4

B,R +

  

  

   

   

B

B

A2/1

B2/1

A

( t t 2 − ww +

18,1 w

t − w

'k + 'k1

2

2

R

[4], [8] ...................... 11 ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................... 2 PHẦN I. TỔNG QUAN ................................................................................ 3 1.1. VÀI NÉT VỀ BERBERIN: ................................................................ 3 1.1.1. Cấu trúc: ............................................................................................. 3 Cấu trúc của isoquinolin ............................................................................... 3 Công thức cấu tạo: ....................................................................................... 3 1.1.2. Nguồn gốc: ........................................................................................... 3 1.1.3. Tính chất ............................................................................................. 4 1.5. Tác dụng dược lý: .................................................................................. 4 1.1.6. Chống chỉ định: [17] ........................................................................... 5 1.1.7. Dạng thuốc và hàm lượng: [11] .......................................................... 5 1.2. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BERBERIN: .................. 5 1.2.1. Phương pháp thể tích: [5], [13] .......................................................... 5 1.2.2. Phương pháp đo UV-VIS ................................................................... 5 1.2.3. Phương pháp cân [5] .......................................................................... 6 1.2.4. Phương pháp HPLC ........................................................................... 7 1.3. TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP HPLC ............................................... 9 1.3.1. Nguyên tắc ........................................................................................... 9 1.3.2. Cơ sở lý thuyết .................................................................................... 9 1.3.3. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký: ................................. 10 Hình 1: sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trưng ............................ 10 1.3.2.1. Hệ số dung lượng k’ ......................................................................... 10 1.3.2.2 Độ chọn lọc α (selectivity - factor) ................................................... 11 α khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng, tối ưu từ 1,5 đến 2. ...... 11 1.3.2.3. Độ phân giải (resolution) ................................................................ 11 −α α

  

  

  

t R w

t w

B2/1

B

[4], [8] .................................... 12 hay N=5,54 N = 16

Độ phân giải cơ bản đạt được khi R = 1,5 .................................................... 11 1.3.2.4. Hệ số bất đối AF .............................................................................. 11 Cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, nó được tính theo công thức: ......... 11 Trong đó:...................................................................................................... 11 1.3.2.5. Số đĩa lý thuyết N ............................................................................. 11    1.3.4. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC [4],[8] ..................................... 12 a/Hệ thống bơm ........................................................................................... 12 a/ Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi ................................... 12 c/ Hệ tiêm mẫu ............................................................................................ 12

43

d/ Cột sắc ký lỏng HPLC ............................................................................. 12 e/ Detector trong HPLC ............................................................................... 13 Hình 2: Sơ đồ khối tổng quát hệ thống HPLC ........................................... 13 1.3.5. Cách đánh giá pic[7] ......................................................................... 13 1.4.TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ UV-VIS 14 1.4.1. Cơ sở lý thuyết[2],[3],[4],[6] ............................................................. 14 1.4.1.1. Định luật Lambert-Beer ................................................................. 14 1.4.1.2. Điều kiện ứng dụng định luật Lambert – beer ............................... 14 1.4.1.3. Sự sai lệch đối với định lật Lambert-beer ....................................... 14 1.4.1.4. Một số đại lượng thông dụng[ ........................................................ 15 1.4.2. Một số kỹ thuật định lượng bằng phương pháp quang phổ UV- VIS.[2],[4],[8] .............................................................................................. 16 1.4.2.1. Phương pháp đo phổ trực tiếp: ....................................................... 16 1.4.2.2. Phương pháp so sánh ..................................................................... 17 PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ .............................................. 18 2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu .................................... 18 2.1.1. Nguyên liệu, hoá chất, thuốc thử: .................................................... 18 2.1.1.1. Đối tượng nghiên cứu: ................................................................... 18 2.1.1.2. Hoá chất, thuốc thử: ...................................................................... 18 2.1.1.3. Thiết bị: .......................................................................................... 18 2.1.2. Phương pháp nghiên cứu: ................................................................ 19 2.1.2.1. Chỉ tiêu nghiên cứu: ...................................................................... 19 2.1.2.2. Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu: ........................... 19 2.1.2.3.Phương pháp xử lý số liệu thống kê: ............................................. 19 2.2. Kết quả thực nghiệm : ......................................................................... 21 2.2.1. Định lượng Berberin clorid nguyên liệu bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III ........................................... 21 Bảng1 : Kết quả định lượng Beberin clorid trong nguyên liệu................ 22 2.2.2. Đánh giá phương pháp định lượng Berberin clorid nguyên liệu bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III ....... 23 2.2.2.1./Tính chính xác : ............................................................................. 23 Nguyên tắc: Độ chính xác của phương pháp được đánh giá bằng độ lệch chuẩn tương đối của các phép thử song song. ............................................... 23 2.2.2.2 Tính tuyến tính: ............................................................................... 23 Bảng 2: Sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ dung dịch ............ 23 Hình 6 .Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào ................... 24 2.2.2.3. Độ đúng: ......................................................................................... 25 2.2.2.4. Tính đặc hiệu:................................................................................. 26 Bảng 4: Kết quả thu được về sự ảnh hưởng của tạp chất palmatin tới ... 27

44

83,30

t

2.2.3. Định lượng berberin clorid nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005): .................................................................................... 28

c

t

S m × × c S m ×

.................................................................................. 29 HL% =

Bảng 5: Kết quả định lượng Berberin clorid nguyên liệu ........................ 29 2.2.4. Đánh giá phương pháp định lượng berberin clorid nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005): ..................................... 30 2.2.4.1. Tính chính xác: .............................................................................. 30 2.2.4.2. Tính tuyến tính: .............................................................................. 30 Bảng 6: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ dung dịch .............. 30 2.2.4.3. Tính đúng: ...................................................................................... 31 Bảng 7: Kết quả khảo sát tính đúng của phương pháp HPLC ................ 32 2.2.4.4. Tính đặc hiệu:................................................................................. 33 Hình 12: Sắc ký đồ mẫu trắng .................................................................... 35 Hình 13: Sắc ký đồ mẫu chuẩn ................................................................... 35 Hình 14: Sắc ký đồ mẫu chuẩn có thêm Palmatin ...................................... 35 2.2.5. So sánh hai phương pháp định lượng Berberin clorid trong bột nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc 2005 và đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo dược điển Việt Nam III: ................................. 35 2.2.5.1. So sánh kết quả độ chính xác của hai phương pháp định lượng: 35 2.2.3.2. So sánh kết quả giá trị trung bình của hai phương pháp định lượng : ......................................................................................................... 36 2.2.3.2. Đánh giá ưu nhược điểm của hai phương pháp định lượng Berberin clorid trong bột nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005) và bằng đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III ..... 37 . Không tốn hóa chất dung môi ..................................................................... 37 . Kỹ thuật thao tác đơn giản, máy móc dễ tìm, gọn nhẹ ................................ 38 2.3. BÀN LUẬN: ......................................................................................... 38 KẾT LUẬN ................................................................................................. 39 * Kết luận .................................................................................................... 39 * Đề xuất: .................................................................................................... 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................... 41 I. Tiếng việt ................................................................................................. 41 II. Tiếng Anh .............................................................................................. 41 III. Trang web ............................................................................................ 42

45