Thuyết trình Kỹ thuật di truyền: Thư viện bộ gen và ngân hàng cDNA

ƯỜ

Ứ

Ạ Ọ

Ụ

NG Đ I H C TÔN Đ C TH NG Ọ Ứ Ệ

Ỹ

Ề

Ắ KHOA KHOA H C NG D NG Ọ NGÀNH CÔNG NGH SINH H C Ậ MH. K THU T DI TRUY N

Ư Ệ Ộ TH VI N B GEN VÀ Ư Ệ TH VI N cDNA

ầ ị GVHD: TS. Tr n Th Dung

Ộ

N I DUNG CHÍNH

Ư Ệ TH VI N B GENỘ Ư Ệ TH VI N cDNA

Ư Ệ

Ộ

TH VI N B GEN

KHÁI NI MỆ

QUÁ TRÌNH THÀNH L PẬ

KHÁI NI MỆ

• Chia nh DNA b gen và

ộ

ế ư ệ ỏ chèn chúng vào t ủ bào ch .

• Ch a t

Th vi n gen (Ngân hàng gen) ứ ấ ả ủ ộ t c DNA b gen c a

sinh v t .ậ

QUÁ TRÌNH THÀNH L PẬ

Ế

TÁCH CHI T DNA

Đ A VÀO T BÀO

Ạ

C T Ắ

T O DÒNG

Ắ

G N VECTOR

SÀNG L CỌ

Ạ Ế TÁCH CHI T VÀ TINH S CH DNA

» L y m u v t (nuôi c y vi sinh v t, nghi n m u

ề ẫ ẫ ấ

ự ậ ở ộ ậ ệ ộ ấ ấ ậ ậ mô đ ng v t, th c v t nhi t đ th p).

ế ỡ » Phá v màng t bào và màng nhân.

ầ ố

» Lo i b các thành ph n không mong mu n trong t xu t b ng phenol).

ạ ỏ ẫ ấ ằ ủ ế ế m u ch y u là protein.(chi

ạ ằ i b ng ethanol hay isopropanol

ặ » Cô đ c DNA l l nh.ạ

» R a l

ử ạ ả ạ i DNA b ng ethanol l nh và đem b o qu n

ệ ộ ấ ở ị ằ DNA trong dung d ch TE ( nhi ả t đ th p).

Ộ Ắ PHÂN C T DNA B GEN

• S d ng enzyme c t gi

ử ụ ắ ớ ạ RT (Reverse i h n

Transcriptase)

ỗ ắ ạ ạ ộ ị ệ ặ i m t v trí đ c hi u trên DNA

• M i lo i enzyme c t t và vector chuy n gen.

ể

ư ệ ắ ằ ạ => T o ra 2 th vi n gen khác nhau khi c t b ng 2 lo i

ạ enzyme RT.

• S d ng enzyme Alkaline phosphatase

ử ụ

• Enzyme đ

ượ ể c dùng đ :

ü Lo i nhóm 5’ phosphate c a DNA hay RNA

ủ

ạ ướ ạ ấ c khi đánh d u phóng x . tr

ü Lo i nhóm 5’ phosphate c a DNA hay RNA.

ạ

ị ố ủ ắ ằ Không b n i vòng khi c t b ng RT

ü T4 polinucleotide kinase và alkaline phosphatase ượ ử ụ c s d ng đ ng th i trên vector và ắ ầ

ồ ng đ

ậ ạ ờ ỉ

ườ th ạ đo n DNA c n g n xen trong k thu t t o dòng.

Ổ Ợ Ạ T O DNA TÁI T H P

• S d ng enzyme n i Ligase

E.Coli DNA ligase

T4 DNA ligase

ử ụ ố

T4 RNA ligase

T4 POLYNUCLEOTIDE KINASE

ENZYME LIGASE

Ư Ế Ủ Ổ Ợ Đ A DNA TÁI T H P VÀO T BÀO CH

ụ • M c đích:

ử ụ ộ – S d ng b máy c a t

ổ ợ bào ch đ sao chép vector ộ

ườ ủ ể ớ ng l n b n sao .Tu thu c ử ụ ả ộ ỳ ậ i ta s d ng m t kĩ thu t

ủ ế ộ ố ượ h p thành m t s l ủ ợ tái t ạ ế bào ch , ng lo i t ể chuy n thích h p.

– Tách chi

ế ệ ạ t plasmid cho thí nghi m t o dòng.

Ư Ế Ủ Ổ Ợ Đ A DNA TÁI T H P VÀO T BÀO CH

• Lo i t

1. E. coli

2. Eukaryote

ạ ế ủ bào ch

Ổ Ợ Ủ Ư Đ A DNA TÁI T H P Ế VÀO T BÀO CH

• Ph

ươ ự ệ ng pháp th c hi n:

ạ – Hóa bi n n p: CaCl2 +

ế ệ t ố s c nhi

ệ ệ ế

ạ – Đi n bi n n p: dòng đi n ế ụ ộ cao th c c b

Ạ T O DÒNG

ấ ạ ứ ữ ớ

ượ ổ ợ ế • T bào đ DNA tái t c nuôi c y t o thành nh ng dòng m i ch a h p.

• Môi tr

ườ ườ ấ ạ ng nuôi c y t o dòng th ng là:

– M9 (Thành ph n dinh d

ầ ưỡ ị ng xác đ nh)

– LB (Thành ph n dinh d

ầ ưỡ ư ị ng ch a xác đ nh)

ạ ẩ ị ọ • Chu n b cho giai đo n sàng l c

Ư Ệ Ự Ọ Ậ Ể SÀNG L C TH VI N Đ NH N TRÌNH T ĐÍCH

• Sau khi th vi n gen đ ượ ử ụ

ư ệ ươ ng pháp

ụ ạ ượ ạ c t o ra. Các ph ậ ể c s d ng đ nh n d ng: thông d ng đ

ấ ụ ả ể ọ ớ ấ ẫ ẫ ằ ọ – Lai DNA v i m u dò DNA đánh d u sau đó sàng l c ạ đ ch n d u m u dò b ng phép ch p nh phóng x .

ẩ ằ ng

ễ ặ

ọ ể ọ ả ị ổ ợ ứ ệ ươ – Sàng l c đ ch n s n ph m protein b ng ph ử ử ạ pháp mi n d ch, th ho t tính protein, ho c th ề nghi m b tr (di truy n) ch c năng.

Ư Ệ

TH VI N cDNA

KHÁI NI MỆ

ƯƠ PH NG PHÁP

ĐÁNH GIÁ

Ứ Ự Ụ NG D NG VÀ THÀNH T U

KHÁI NI MỆ

DNA b tr ( ổ ợ complementary DNA) cDNA

ổ DNA t ng h p t ủ c a enzyme ợ ừ ớ mRNA v i xúc tác RT (reverse transcriptase)

KHÁI NI MỆ

• T p h p các cADN t ng h p

ổ ợ ợ

ậ ừ các mARN. t

ư ệ

• Thi

ế t trên Th vi n cDNA (Ngân hàng cDNA)

ậ l p ặ vector (plasmid ho c phage lambda)

• Đ i

ố ượ ụ t ng áp d ng:

eukaryote

KHÁI NI MỆ

Ư Ệ

TH VI N GEN

TH VI N cDNA

ậ

ạ ủ

1. T p h p các phân đo n c a

ủ

ợ DNA b genộ ộ 2. Ch a toàn b DNA c a sinh

bào xác

m t t

ợ ả ậ t p h p các b n sao cDNA ừ ấ ả t c các mARN t t ế ậ ừ ộ ế thi t l p t đ nhị

ứ

ả

h p đ a vào

3. gen c n nghiên c u ph i bi u hi n thành mARN

ứ v tậ ổ ợ ư ạ 3. T o DNA tái t ủ ậ ế bào v t ch . ủ ậ

phage

lambda;

4. V t ch : E.coli, Eukaryote 5. Vector: plasmid

ầ ệ ể 4. Vector: plasmid

ƯƠ

PH

NG PHÁP

Ạ

Ậ PHÂN L P RNA

T O DÒNG cDNA

Ị

Ế TÁCH CHI T mRNA

XÁC Đ NH DÒNG

Ổ

Ợ T NG H P cDNA

Ệ

Ậ Ữ THÀNH L P D LI U cDNA

Ậ PHÂN L P RNA

TÁCH mRNA

• Thu mRNA tr

ưở ạ ừ nhi u lo i RNA (tRNA,

ng thành t ư ưở rRNA, mRNA ch a tr ề ng thành)

• Ph

ươ ng pháp:

– Cho đuôi poly(A) c a phân t

ử ế ắ mRNA liên k t b t

ỗ ớ ộ ủ ặ c p base v i chu i olygo(dT) trong c t.

– Các RNA khác trôi kh i c t. mRNA đ

ỏ ộ ượ c gi ữ ạ l i.

– Bi n tính đ thu h i mRNA.

ế ể ồ

Ợ Ổ SINH T NG H P cDNA

1. Khuôn mRNA.

Nguyên li uệ :

2. M i oligo(dT)

3. Enzyme RT

ồ

4. dNTPs

Nguyên t cắ ồ ắ 1. G n m i ợ ổ 2. T ng h p ss cDNA ợ ổ 3. T ng h p ds cDNA 4. Hoàn ch nhỉ

Ộ Ạ HO T Đ NG Ủ C A RT

Rnase H

Ấ Ẹ

C U TRÚC “K P TÓC”

Ằ

Ắ

G N B NG TERMINAL TRANSFERASE

Ạ T O DÒNG cDNA

ươ ế ớ Hai ph ng pháp liên k t ds cDNA v i vector

ồ ổ ợ – B sung đuôi đ ng trùng h p

– B sung linker, có s tham gia c a enzyme gi

ự ủ ờ i

ổ h n.ạ

cDNA linker

DNA ligase

cDNA adapter

• Bacteriophage lambda:

CÁC VECTOR

ạ ạ – Dung n p đo n gen có kích th ướ ớ c l n

ế ệ

– Vector lambda mang vùng đ m (suffer) n u c t ng đ n kh năng sinh s n

ưở ắ ả ế ả ả

ỏ ẽ b s không nh h ủ c a phage lambda.

– Lo i b vùng này và thay b ng đo n cDNA.

ạ ỏ ằ ạ

– Trong

ườ ạ t o dòng cDNA, th

ế ệ ớ ng dùng bacteriophage lambda gt10, gt11, và lambda ZAP I, II là th h bacteriophage lambda m i.

• Plasmid:

CÁC VECTOR

ạ ạ – Dung n p đo n kích có ướ ướ c d gen th i 3kb

Ị XÁC Đ NH DÒNG

• Các ph ậ

ụ ượ ử ụ ng pháp thông d ng đ ể c s d ng đ

ươ ạ nh n d ng:

ấ

ớ ọ ể ọ ẫ ấ ụ ả ằ

Lai cDNA v i m u dò DNA đánh d u sau đó ẫ sàng l c đ ch n d u m u dò b ng phép ch p nh phóng x .ạ

ằ

ễ

ươ ặ ứ ử ệ ẩ ọ ể ọ ả Sàng l c đ ch n s n ph m protein b ng ử ạ ị ng pháp mi n d ch, th ho t tính protein, ph ề ổ ợ ho c th nghi m b tr (di truy n) ch c năng.

ươ ươ ự ư ớ ậ ư ệ ộ Ph ng pháp t ng t nh v i l p th vi n b gen.

ĐÁNH GIÁ

•

Ư Ể U ĐI M

– Các dòng cDNA ch a trình t

ứ ự ụ ủ liên t c mã hóa c a

ộ m t gen.

ộ ố ớ ữ – Nh ng t

ủ ng ng c a protein

ế bào chuyên hóa t o ra m t s l n các ộ ẽ ễ

ế ắ ạ ế

ệ ượ c hi n t ấ ẩ

ầ ạ ươ ứ ạ protein m t lo i và mRNA t ể ạ giàu đó s d tách ra đ t o ngân hàng cDNA. ụ ượ Bi n n p cDNA kh c ph c đ ng t ạ bào vi khu n không dung n p gen có c u trúc mang ph n không mã hóa.

ĐÁNH GIÁ

Ể Ế • KHUY T ĐI M

– K thu t t o cDNA cho ta nhi u gen khác nhau.

ậ ạ ề ỹ

– M i giai đo n phát tri n khác nhau c a c th thì

ủ ơ ể ể ạ

ượ ủ ệ ỗ ự s phiên mã ng c c a h gen là khác nhau.

t l p ngân hàng cDNA ch n l c gen mong

ố ờ ỷ ỉ ọ ọ ề m và t n nhi u th i

ế ậ => Thi ỏ ố mu n đòi h i công phu t gian.

Ứ

Ụ NG D NG

ủ

ậ ườ i, ở ắ m t bò,

ơ ằ ạ • T o dòng các gen mã hóa cho globin c a ng ộ đ ng v t và chim, cho protein th y phân cho ovalbumin, cho fibroin t ủ t m,…

Thuyết trình Kỹ thuật di truyền: Thư viện bộ gen và ngân hàng cDNA