Ổ
Ộ
Ệ
T NG LIÊN ĐOÀN LAO Đ NG VI T NAM
ƯỜ
Ạ Ọ
Ứ
Ắ
TR
NG Đ I H C TÔN Đ C TH NG
o0o
Ậ
Ề
Ỹ
Ọ MÔN H C: K THU T DI TRUY N
Ủ Ề Ỹ
Ậ
CH Đ : K THU T RAPD (RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA)
Ầ
Ị
GVHD: THS. TR N TH DUNG
Ự
Ệ
NHÓM TH C HI N:
1. BÙI MINH TRÍ 61203161
Ậ
Ỳ
2. HU NH THU N PHÁT 61203109
Ọ
Ễ
Ị
3. NGUY N TH NG C TRINH 61203163
ớ I. Gi ệ i thi u:
ỹ ỹ ậ ự ử ụ
ữ ậ ắ
ẫ ả ữ
ự ủ ố
ể ở ề ư ệ ệ
ả ứ ằ ạ ự ố ượ ng các đo n b ng nhau và chi u dài các đo n t ạ ươ ứ ng ng
ằ _ K thu t RAPD d a trên k thu t PCR, b ng cách s d ng ắ ự ế ướ ả c, b t t tr nh ng primer ng n (kho ng 10 nucleotide) có trình t bi ạ ớ ự ổ ặ c p và nhân b n ng u nhiên nh ng đo n DNA có trình t b sung v i ắ c a các primer. Theo nguyên t c, khi 2 cá th hoàn toàn gi ng trình t nhau, sau khi th c hi n ph n ng PCR – RAPD đi u ki n nh nhau ề ẽ ạ s t o ra s l ằ b ng nhau.
ộ ấ ấ ắ ặ ộ ị
ệ ề ạ
ẫ ữ ệ ậ ộ
ế ọ ữ
ướ ế ề ầ ẩ ỗ t rõ tr c bi
ươ ứ ế _ Khi có đ t bi n làm xu t hi n hay m t đi m t v trí b t c p ẽ ạ ố ượ ng và chi u dài các đo n DNA khác nhau ng u nhiên s t o ra s l ộ ể ỹ ậ ể gi a các cá th , vì v y k thu t RAPD có th phát hi n đ t bi n. M t ố ớ ớ ạ ủ ẩ i h n c a PCR chu n đ i v i ALP marker là m i thông trong nh ng gi ị ả ượ ề tin v chu i mã di truy n đ u tiên ph i đ c khi chu n b ng ng. các primer 23 t
ế ụ ứ ủ
ệ ớ ẽ ặ ề ầ ồ ỷ
ử ớ ự ậ ọ ắ ớ ộ ể _ Vì th , vi c áp d ng nó đ nghiên c u DNA genome c a m t ộ ố gi ng cây tr ng m i s g p nhi u khó khăn. Vào đ u th p k 90, m t ậ ỹ k thu t phân t m i d a trên nguyên t c PCR v i tên g i là RAPD
ờ ộ
ệ ộ ậ ạ i (Random amplified polymorphic DNA) đã ra đ i m t cách đ c l p t hai phòng thí nghi m khác nhau (William, 1990; Welsh và ctv., 1991).
ả ộ ướ ự ệ ươ c th c hi n ph ng pháp RAPD
Hình nh m t trong các b (PCR)
II. Nguyên lý:
ỹ ậ ướ ự
ệ c th c hi n theo ba b ệ ằ
ề ạ ằ ầ ị
ụ ậ
ượ ề ơ ả c: Tách _ V c b n k thu t RAPD đ ố ổ ế chi t DNA t ng s , nhân DNA b ng máy PCR; đi n di trên gel agarose ặ ho c gel polyacrylamid; xác đ nh tính đa d ng di truy n b ng các ph n ề m m thông d ng (NTSYSpc, UPGMA cluster, Gelcompar, l p dendrogram)
ủ ỹ ậ ả Hình nh c a k thu t PCR
ỹ ậ ạ
ẫ ứ ệ ệ c nhân b n ng u nhiên b ng vi c dùng m t primer ch a m t tr t t
ườ ằ ng primer này ch a t
ư ể ộ ậ ự 9 12 oligonucleotit, ố i thi u là 4 bp. Có hàng ngàn lo i primer ch a kho ng 10 bp nh ng s
ộ ứ ừ ứ ấ ạ ạ ứ _ K thu t này cho phép phát hi n tính đa hình các đo n DNA ả ượ đ ẫ nucleotide ng u nhiên. Th ố t ượ l ả ế ng primer dùng trong nghiên c u này r t h n ch .
ắ ơ
ạ ể ơ
ệ ủ ể ế ườ ể ắ ng 200 2000 nucleotide) c (th
ạ ả ứ _ Trong ph n ng này, các primer đ n g n vào hai đi m khác nhau ở ố hai m ch đ n đ i di n c a DNA khuôn. N u các đi m g n primer ả ượ ả ằ n m trong kho ng có th nhân b n đ ẽ ượ thì đo n DNA s đ c nhân lên.
ẩ ự ượ
c quan sát thông qua đi n di ự ươ ứ ỏ ồ ệ ng đ ng hoàn có s t
ộ ầ ữ
ễ ắ c ng n nên d tìm đ
ơ ồ
ạ ả ể
ệ ể ữ ặ ủ ả _ S có m t c a s n ph m này đ ặ trên gel agarose ho c polyacrylmide đã ch ng t ớ toàn hay m t ph n gi a DNA genome v i các primer oligonucleotide. ượ ướ c các Các primer dùng trong RAPD có kích th ạ ươ ế ng đ ng trên các m ch đ n DNA trong genome. Vì th , nó là đo n t ề ậ ự ị ươ ộ ng pháp có hi u qu đ xác đ nh tính đa hình v tr t t m t ph nucleotide gi a các cá th 24.
ụ ầ ố ấ ự ở
ậ ươ ở cây ng, 1 / 1 primer cây đ u t ở
Ví d : t n s tìm th y s đa hình RAPD là 0,3 / 1 primer Arabidopsis thaliana là 0,5 / 1 primer ngô.
ư ể ượ ủ ỹ ể ậ III. Các u đi m và nh c đi m c a k thu t RAPD:
Ư ể 1. u đi m:
ề ặ ỹ ậ _ V m t k thu t:
ễ ự ệ ỹ
ủ ố ượ ễ ầ ứ + K thu t RAPD d th c hi n và d thành công do không ầ c n bi ậ ự ộ c trình t ng c n nghiên c u. b gene c a đ i t ế ướ t tr
ả ơ + Thao tác đ n gi n.
ấ ượ ầ ạ ộ + Ch t l ng DNA khuôn không c n đ tinh s ch cao.
ự ệ ả ả ờ + Th i gian th c hi n nhanh. Kh năng nhân b n cao.
ề ặ _ V m t kinh t ế :
ự ệ ấ + Chi phí th c hi n th p.
ậ ườ
ế ợ c s d ng k t h p v i nh ng ậ ượ ử ụ ng đ ạ ớ ệ ề ể ậ
ử ậ ộ ữ ỹ + K thu t RAPD th ỹ ỉ ấ k thu t cao c p khác đ đánh giá đa d ng di truy n và nh n di n ch ị th phân t có đ tin c y cao
ỉ ủ ầ ế ướ t tr
ầ ự c trình t ễ ạ ố
ằ ỏ
ỉ ớ ẫ ị ạ nuleotide c a đo n _ Ch th RAPD không c n bi ế ế DNA c n khu ch đ i, quy trình ti n hành nhanh, d làm, ít t n kém, cho ộ ượ ế ng nh DNA tính b ng nanogam đa hình cao, ti n hành ch v i m t l ớ ệ ộ ố ượ và trên m t s l ng m u thí nghi m l n.
ờ ệ ấ
ạ ể ị ố
ể ể ụ ụ ườ ứ ữ ồ
ộ ạ ạ ồ _ Đ ng th i RAPD không dùng ch t phóng x đ phát hi n đa ệ ng dùng trong phân tích và xác đ nh m i quan h hình. Do đó RAPD th ữ thân thu c gi a các th cây tr ng hay gi a các cá th đ ph c v công ặ tác lai t o ho c phân lo i.
ề ằ ỉ ị
ể ớ ướ ế ể _ Đ nghiên c u s đa d ng di truy n b ng ch th RAPD có th ti n hành v i các b ứ ự ạ ư c nh sau:
ế ằ ổ ố + Tách chi t DNA t ng s , nhân DNA b ng máy PCR.
ệ ặ + Đi n di trên gel agarose ho c gel polyacrylamid.
ề ề ằ ầ
ụ ạ ị + Xác đ nh tính đa d ng di truy n b ng các ph n m m thông d ng (NTSYSpc, UPGMA cluster.).
ữ ứ ứ ự ụ ạ
ự ậ ọ ậ ậ ồ
ề ủ ượ ử ụ ụ ị Ngoài nh ng ng d ng trong nghiên c u s đa đ ng sinh h c và ỉ ộ ố ngu n g c di truy n c a các loài đ ng v t, th c v t và vi sinh v t, ch th RAPD cũng đ ữ c s d ng cho nh ng m c đích sau:
ậ ế ồ
ế ớ ạ ả ư ạ ộ cây bông, tính tr ng ữ ị ợ ở ấ ượ ng s i
ở + L p b n đ liên k t, xác đ nh nh ng gen liên k t v i m t ạ tính tr ng nào đó nh tính tr ng ch t l kháng virus cà.
ề ủ ấ ầ ể + Phân tích c u trúc di truy n c a qu n th .
ấ + In d u vân tay (DNA fingerprinting).
ệ ự ệ t trong các dòng soma (Somaclonal
+ Phát hi n s khác bi variation).
ượ 2. Nh ể c đi m:
ề ứ ụ ề
ứ ế ư ư ỉ ị ạ _ Tuy có nhi u ng d ng trong nghiên c u đa d ng di truy n ộ ố ạ nh ng ch th RAPD cũng có m t s h n ch nh sau:
ệ ượ t đ ữ c nh ng
ặ ộ + Có tính tr i (dominant) do đó khó phân bi ể ị ợ ử . gen l n hay cá th d h p t
ấ ả ẩ ườ ng
ấ ẫ + Có tính ch t ng u nhiên nên s n ph m PCR th ố không th ng nh t.
ả ế ị ệ ố ệ ể ử ầ + C n ph i có các thi t b đi n toán đ x lý s li u.
ậ ậ ộ ộ ỳ ỹ + Đ tin c y còn tu thu c vào k thu t cá nhân.
ậ ộ ỹ _ K thu t RAPD có đ chính xác không cao.
ể ệ ở ứ ộ ặ ạ ị ấ ố ổ _ Không n đ nh (th hi n m c đ l p l i gi ng nhau th p).
ả ứ ư ả ả ả
ệ ấ ấ _ Kh năng nhân b n trong ph n ng PCR cao nh ng kh năng xu t hi n đa hình th p
ệ ả ị ỉ ử ấ ậ ộ th p và có đ tin c y
ậ _ Kh năng nh n di n ch th phân t không cao.
ệ ủ ớ ữ IV. Nh ng khác bi t c a RAPD v i PCR:
ừ ấ
ượ ừ ẫ _ Do tính ch t ghép c p ng u nhiên nên primer v a là primer xuôi v a là primer ng ặ c.
ế ả _ RAPD không cho băng nhân b n n u:
ự ố ự nu gi ng trình t primer trong genom
ứ + Không có trình t ủ ố ượ c a đ i t ng nghiên c u.
ự ư ằ i cũng n m trên m t s i hay này nh ng l
ợ ặ ộ ợ ạ hai s i quá xa nhau hay khi ghép c p các primer
+ Có các trình t ự ằ ở các trình t n m ướ ng vào nhau. không h
ả ử ụ ề ớ
ủ ố ượ ệ ủ ữ ể t c a genom c a đ i t c nh ng đa hình hay các khác bi ệ ng nghiên
_ Ph i s d ng nhi u primer khác nhau m i có th phát hi n ượ đ c u.ứ
ố ợ ả ứ ể ộ
ể ả _ Có th dùng ph i h p vài primer cùng m t ph n ng đ tăng ố s băng nhân b n.
Ứ V. ụ ng d ng:
ụ Ứ
ượ ế ậ ặ ỹ ờ ậ ậ
ủ ỹ ỹ ẫ ả ễ ự ử ụ ậ ượ ử ụ ư ể c s d ng do u đi m d th c
ệ c phát minh _ ng d ng c a k thu t RAPD K thu t RAPD đ ộ và s d ng ngay sau khi k thu t PCR ra đ i, m c dù cho k t qu có đ ư tin c y không cao nh ng v n còn đ ấ hi n và chi phí th p.
ữ ứ ủ ỹ ậ ụ _ Nh ng ng d ng c a k thu t RAPD:
ề ượ ụ c áp d ng trên các
ạ ắ ậ
ng: cúc lai, cà phê, b p, đ u nành, lúa mì, lúa m ch, dâu tây, ế ạ ộ ề ệ n ng đ DNA, đi u ki n
ươ ạ ợ
ự + Đánh giá đa d ng di truy n: Đã đ ố ượ đ i t ế ố ồ ầ khoai tây, cà chua,… C n quan tâm đ n y u t ọ ầ ự ệ thí nghi m, ch ng trình ch y PCR và c n l a ch n primer thích h p cho s đa hình cao.
ệ ố ớ ấ ượ
ể ụ ự ậ ề ủ ậ ạ ấ ỹ ề ạ
ư
c + Đ i v i n m b nh th c v t thì k thu t RAPD đã đ áp d ng đ phân tích đa d ng di truy n c a nhi u lo i n m khác nhau nh : Leptosphaeria maculans (Desm.) Ces. et de Not, Corynespra cassiicola, Rhizoctonia solani, ...
ị ỉ ử Ở ệ ứ Vi t Nam, nghiên c u đa
ể ả ng quan gi a ki u gene và ki u hình ph n ánh
ệ ố ươ ộ ố ố ủ ạ ở ệ ậ + Nh n di n ch th phân t ữ ề ạ d ng di truy n và m i t ệ Vi b nh đ o ôn c a m t s gi ng lúa : ể t Nam
VI.
ả ế ủ ỹ ữ ậ Nh ng c i ti n c a k thu t RAPD:
ỹ ậ
ử ụ ng.
ươ ườ ớ ố
ể ệ ự ọ ộ
ữ ủ ể ợ
ả ứ ấ ử ụ + K thu t th nh t: s d ng cùng lúc 2 primer khác ậ ư ỹ nhau thay vì s d ng 1 primer nh k thu t RAPD thông th ử ả ặ ng pháp này có th làm tăng ho c gi m đi s băng so v i khi s Ph ụ ử ụ d ng m t primer. Vi c l a ch n, s d ng cùng lúc 2 primer khác nhau ộ m t cách phù h p cũng có th làm tăng tính đa hình c a nh ng primer ẩ cho s n ph m ít đa hình.
ứ ớ ạ
ặ ướ
ả ế ố ượ ậ ệ ể ắ i h n ể ạ c ho c sau khi th c hi n ph n ng PCR. S c t này cũng có th t o ị
ộ ề ệ ạ
ơ ẫ ự ề
ữ
ỉ
ữ ậ
ố ỉ ả ế ụ ể ố ộ ằ ỹ + K thu t th hai: c t DNA b ng các enzyme gi ả ứ ự ắ ự tr ả ra hai k t qu . M t là có th làm gi m s l ng các băng khó xác đ nh ễ (complex band), đi u đó làm d dàng h n cho vi c đánh giá đa d ng di ở ạ ế ề ự ạ các m u có h n ch v s đa hình. truy n. Hai là t o ra s đa hình ằ ả ế ế ượ ộ ỳ ệ ử ụ c nh m Tuy nhiên vi c s d ng nh ng c i ti n tu thu c vào chi n l ặ ạ ượ ộ ị ồ ể ị c các ch th đ ng tr i. làm tăng s ch th đa hình có th ho c đ t đ ế ủ ỹ ợ ả ế ạ Nh ng c i ti n này có h n ch là làm gi m đi l i th c a k thu t ơ ứ ạ ử ụ RAPD c th là t c đ , giá thành và s d ng ph c t p h n
