Ạ Ọ Ạ ƯỜ NG Đ I H C ĐÀ L T

Ứ

Ử

Ụ

Ậ

NG D NG KĨ THU T PHÂN T  TRONG XÉT

NGHI M Ệ NÔNG NGHI PỆ

ủ

ệ

ộ

Ệ

Ch  nhi m b  môn:

Ọ LÊ NG C TRI U

TR KHOA SINH H C Ọ

Danh sách thành viên

ề

ọ

ọ

ề  và nhi u  c ti p

ươ

ử ượ ế ớ

ả

ọ ờ ố

ự

ậ ạ ế i k t qu  có ý nghĩa to l n, trong  ế , khoa h c đ i s ng. PCR là

ươ

ơ

ặ

ộ ậ ẩ ệ

ệ ấ ự

ấ

ễ ự ợ ồ

ặ ấ Đ t v n đ           Nh  phát minh kĩ thu t PCR mà ngành sinh h c phân t ử ậ ờ ử ụ ọ ngành khoa h c khác có s  d ng kĩ thu t sinh h c phân t  đ ớ ậ ớ ộ c n v i m t ph ng pháp m i đem l ứ ề đó có các nghiên c u v  các lĩnh v c y t ệ ả ph ng pháp đ n gi n, d  th c hi n, có đ  nh y và tính đ c hi u r t  cao; do đó, PCR r t thích h p cho xét nghi m ch n đoán trong lĩnh v c  ệ y h c, pháp y, b nh lí cây tr ng

Ạ Ự

ƯƠ

Ọ

Ằ

Ậ

Ệ

NG PHÁP XÉT NGHI M B NG KĨ THU T PCR ?

Ồ Ặ

Ơ Ở

Ả Ứ

Ộ

Ộ

Ẩ

Ể

Ế

Ế

Ệ

ọ  NH  V Y: Ư Ậ  ­ T I SAO L I L A CH N PH Ạ  ­ C  S  NÀO Đ  THI T K  CÁC M I Đ C HI U CHO M T PH N  NG TRONG M T CHU N ĐOÁN

?

Ố ƯỢ

Ả Ứ

Ữ

Ư

Ầ

NG LÀ VIRUS C N CÓ NH NG L U Ý GÌ TRONG PH N  NG ?

Ẩ

Ằ

Ệ

Ệ

Ệ

 ­ TRÊN Đ I T  ­ Ý NGHĨA C A VI C CHU N ĐOÁN B NG XÉT NGHI M NÀY TRONG NÔNG NGHI P ? Ủ

ệ

ớ

ậ

i thi u nguyên lý k  thu t PCR

ỹ ủ

ạ ộ ụ

ủ

I. Gi II. Nguyên lí ho t đ ng c a PCR III. M t s   ng d ng c a PCR trong nông

ộ ố ứ ệ

ệ

nghi p hi n nay

ớ

ệ

ậ

ỹ

I.Gi

i thi u nguyên lý k  thu t PCR

ặ

ợ

ự

ế

  D a vào c  ch  t ng h p gen đ c hi u trong t

bào,

ơ ế ổ ườ

ậ ổ

ể ổ

ươ

ộ

ợ

ệ ng pháp in vitro đ  t ng h p m t

ồ

ạ

ặ

ệ ủ ủ

ớ

ợ

ạ

ủ

ệ nhà hóa sinh ng i Mĩ Karry Mullis đã phát minh ra kĩ  ố ợ thu t t ng h p gen trong  ng nghi m (PCR) vào năm  1985. PCR là ph ờ đo n DNA đ c thù nh  công hi u c a 2 m i  ắ oligonucleotide g n vào 2 s i đôi c a đo n DNA đích v i  ự s  tham gia c a DNA polymerase.

ả ứ

  Ph n  ng PCR đ

ự c th c

ượ ạ

ạ

ắ ặ

i t

ố

ủ

ạ ả

ượ

c

ố

ệ hi n qua 3 giai đo n trong 1  chu kì: ế ­ Giai đo n bi n tính  (denaturation) ạ ­ Giai đo n b t c p  (annealing) ạ ­ Giai đo n kéo dài  (elongaction) ượ ặ          Chu kì này đ c l p đi  ầ ặ ạ ừ  20 ­ 40 l n và cho  l p l ẩ ả ra các s n ph m cu i cùng  c a PCR là các đo n DNA  ố ặ ho c RNA phiên b n. S   ả ượ ng các b n sao này đ l tính theo hàm s  mũ.

Máy PCR

ạ ộ

ủ

ả ứ

II.Nguyên lí ho t đ ng c a PCR ầ 1. Các thành ph n tham gia vào  ph n  ng PCR ( PCR mix):  ­  DNA khuôn  ­ Taq. DNA polymerase.  ­ d NTPs (dATP, dCTP, dGTP,

dTTP).

ả ứ

ự

ệ

ạ

ạ

 ­ Primer ( oligonucleotide).  ­ PCR buffer. ạ 2. Ba giai đo n ph n  ng PCR  ệ t  th c hi n trên máy luân nhi (Thermalcycles) ế  ­ Giai đo n bi n tính  (denaturation): 92 – 98 đ  Cộ - Giai đo n b t c p (annealing) ắ ặ

-

ệ ộ

45 thoi gian 20s­2phut ạ  Giai đo n kéo dài  (elongaction) nhi

t đ  68­72

ớ

ướ ơ ả ủ ỹ

ệ

ậ

i thiêu các b

c c  b n c a k  thu t PCR trong vi c

ẫ

Gi ấ l y m u đem phân tích

ẩ

ệ

tế

ệ

ự

ệ

ẩ

Th c hi n xét nghi m ch n  ằ đoán b ng PCR

ệ ả ổ

ẩ ệ

ằ

ọ Các b nh ph m y h c    (cid:0) Ly trích pre ­ nucleic acide    (cid:0) Ly trích acide nucleic tinh khi    (cid:0) PCR ( RT ­ PCR)    (cid:0) Phân tích phát hi n s n ph m  PCR b ng quang ph  hay đi n  di

ể

ơ

ỹ c tách chi

ể

ệ ặ ộ

ượ ẹ

ẫ ượ ử ụ

ướ

ế ừ t t ẫ ạ ả ng gi m  (t

ứ ng DNA đ

ế ườ

ử ụ

ả i ta s  d ng polymerase cho hi u qu

ế ạ

ặ ẫ

ậ ằ Có th  là DNA kép, đ n, ho c RNA đ  các đ i t nghiên c u. DNA m u có đ  nguyên v n cao tránh l n t p ch t. ượ L c s  d ng cũng có khuynh h ố xu ng còn 100µg) vì th  ng cao .

ệ

ủ ế ừ   t t ươ i, máu  ệ c xúc mi ng, tóc,  ỗ i ch  ho c  ề

ử ừ

xa hàng nghìn kilômet, m t nhi u  ư ườ ư ướ ể ấ ạ ấ ng, qua b u

ả ạ ệ ả

Sáu khâu chính c a quy trình xét nghi m b ng k  thu t PCR  1. L y m u ố ượ ấ ẫ : ADN có th  tách chi ng  ấ ẫ ữ nh ng m u khác nhau, nh  máu t ừ  1mg  khô, t  bào niêm m c, n ệ da, phân, v.v... M u có th  l y t ấ ẫ Kí hi u­L y m u đem  g i t phân tích ngày, trong phong bì bình th ầ đi n, không c n b o qu n l nh.

 2. Tách chi

ế

ượ

ử ề ế ớ ứ : Nhi u quy trình tách chi t ADN ủ i đã đ ớ ệ

ệ ậ

ứ ướ ế ả ạ ớ ệ ẫ

ợ

ượ ừ ả ữ  nh ng l ng ADN t

ế t  c nghiên  ADN khác nhau c a th  gi ề c u, th  nghi m và thích  ng v i đi u ki n  ầ c ta. Do v y, góp ph n gi m giá thành,  n ộ ỗ t ki m kinh phí. V i m i lo i m u có m t  ti ả ế t thích h p riêng. Đ m b o  quy trình tách chi ố ượ ấ ượ ng và s  l ch t l ng  ỏ   ẫ m u nh .

ế

Tách chi

t ADN

ạ Tinh s ch ADN

ặ

ỗ

ệ :  ấ ủ ấ t khác nhau đã đ ồ ặ

ừ

ượ ơ ở ỗ ặ

 3. Nhân ADN đ c hi u  Đây là khâu quan tr ng nh t c a quy  ọ ợ trình. Các h n h p hoá ch t khác nhau và  ử ệ c th   các chu trình nhi ệ nghi m cho t ng c p m i. Trên c  s  đó,  ầ ủ ừ ố ư i  u hoá thành ph n c a t ng h n  đã t ừ ệ ừ ợ t cho t ng c p  h p, t ng chu trình nhi ồ ấ ẵ ự m i, d a vào nh ng hoá ch t s n có trên  ướ   ị ườ c th  tr

ữ ng trong n

ặ

ệ    Nhân ADN đ c hi u

ệ

ệ

t các

ế ố

. Các y u t

đã  i  u hoá trên c  s  v t li u

ể

ạ

ộ

ệ

ỉ

 4. Đi n di ệ ể ượ : Đi n di đ c dùng đ  tách bi ộ ạ ộ ắ đo n ADN có đ  dài ng n khác nhau. Đ  tách  ộ ụ ệ ế ố ề t này ph  thu c nhi u y u t bi ơ ở ậ ệ ố ư ọ ượ ự đ c l a ch n và t ẵ s n có, h  giá thành đáng k  và tăng đ  phân  ầ ả i lên hàng trăm l n, giúp phân bi gi t rõ các  ố ệ ạ đo n ADN ch  chênh l ch nhau b n nucleotid.

ệ Đi n di

ế

ấ ượ  Ch t l ỉ ệ

 5. Nhu m màu ADN: ặ

ộ ả ả

ộ

ươ

ệ

ọ

ấ ầ

ế

ậ

ệ ng đi n di và  ể ệ ượ c  ợ ộ ng pháp nhu m thích h p  ỹ c l a ch n. Ngoài ra, kinh nghi m và k   t, góp

ủ ỹ ạ

ầ

k t qu  nhân ADN đ c hi u ch  có th  hi n rõ  ớ trên b n gel v i quy trình nhu m ADN đ ố ư i  u hoá và ph t ượ ự đ năng c a k  thu t viên cũng r t c n thi ph n h  giá thành chung

ộ

Nhu m màu ADN

ộ

ế

ạ

ạ

ẽ

ộ

ả

ế

ắ

ợ

ậ

ố

ằ ự ng h p, có th  xác đ nh trình t ả c l u gi

c phân tích và hi n đ

ữ ạ  t

 6. Phân tích k t qu : ả  B n gel sau khi nhu m  ả ư xong s  có d ng nh  hình trên. Các đo n ADN có  ệ ể đ  dài khác nhau hi n rõ trên b n gel, có th  quan  ộ ố ườ ng và đo đ m. Trong m t s   sát b ng m t th ể ể ị ườ  ADN đ  có  tr ư ế ế k t lu n cu i cùng. Hàng nghìn b n gel nh  th  đã  ệ ượ ư ượ i Phòng thí  đ nghi m. ệ

ả

Phân tích k t quế

Ạ

ƯƠ

Ọ

NG PHÁP

Ệ

ủ ộ ầ ẫ

Ạ Ự ­ T I SAO L I L A CH N PH Ậ Ằ XÉT NGHI M B NG KĨ THU T PCR ? Ý NGHĨA TRONG NÔNG NGHI P ?Ệ ü  Đ  tinh sach c a m u không c n cao

ü  D  th c hi n ệ ễ ự

ẽ ề ự ờ ệ

ü  R  ti n và th i gian th c hi n ng n ắ

ộ

ü  Đ  chính xác cao đáng tin c y ậ

ề ầ

ü Trong nông nghi p hi n đ i có nhi u lo i b nh c n ph i đ ạ

ẩ c chu n đoán

ả ượ ể ạ ỏ ặ ữ ồ ọ

ể ạ ừ ớ ầ ị

ể ấ ả

ể ế ữ ư ờ ể ị ầ ậ ư

ế ầ ệ ệ ạ ệ ạ ồ ạ ố ạ ườ ươ ớ i v n  m hay trên ngu n h t gi ng đ  lo i b  tác nhân gây h i  s m ngay t ố ấ ạ ả ượ ư ướ c khi đ tr c đ a ra tr ng tr t và s n su t đ i trà m t khác trên nh ng đ i  ệ ờ ượ ệ ễ ng nghi ng  đã b  lây nhi m m m b nh có th  lo i tr  s m đ  tránh vi c  t ứ ế ấ ệ ạ ế t h i đ n m c th p nh t. Vì th  nh ng  u th   lây lan nh m gi m thi u thi ể ả ộ ế ủ c a kĩ thu t này giúp đ a ra k t qu  m t cách chính xác và k p th i đ  có th   ồ ệ ả gi i quy t m m móng các ngu n b nh.

Ế

Ồ Ặ

Ệ

Ể Ả Ứ

Ơ Ở Ộ

Ộ

Ẩ

ệ ộ ắ ế ắ ạ ồ ộ t đ  g n m i, m t m i s ồ ẽ g n đ c hi u

ắ ể ự ặ ợ ộ

ế ế ồ ẽ ồ ẽ ạ ể ượ ế ị ệ ồ ể ở ầ ế c khu ch đ i. ạ  Do đó, vi c thi

Ế ­ C  S  NÀO Đ  THI T K  CÁC M I Đ C HI U  CHO M T PH N  NG TRONG M T CHU N  ĐOÁN ?  Khi nhi ặ ệ vào m ch mang nghĩa trong khi m t  ệ ộ ạ ố ộ t đ  h  xu ng đ n nhi ự ố ẽ ắ ồ ạ ể ệ m i khác s  g n vào m ch đ i nghĩa. Trong đó, m i là các trình t  oligonucleotide ng n có th  bám đ c hi u  ạ ể ổ ự ấ ị vào m t vùng trình t  nh t đ nh. M i s  là đi m kh i đ u đ  các polymerase có th  th c hi n t ng h p m ch  ứ ộ ị ư ớ ổ b  sung m i cũng nh  xác đ nh đo n ADN đ t k  m i s  quy t đ nh m c đ   ấ ủ ặ đ c hi u và năng su t c a ph n  ng.

ả ứ ệ

ế ế ồ ặ ự ả ồ ự ệ ằ b o t n n m trong vùng b o t n genome c a

ả ồ ự ả ứ ư ệ ộ t k  m i đ c hi u cho m t ph n  ng đ a vào trình t ừ ặ  b o t n th  hi n đ c tr ng riêng bi ủ ể ậ ụ ể t cho t ng sinh sinh v t c  th  mà d a vào đó có th

 Vi c thi ệ ậ sinh v t, trình t ế ế thi

ự ả ồ ệ ồ ặ ể ệ ừ ậ   t k  các m i đ c hi u cho t ng loài sinh v t.

ọ ệ

ộ ậ  đích quan tr ng trong phát hi n vi sinh v t  v a có vùng b o t n cao cho m t nhóm vi sinh

ế ế ồ ặ

ệ

t k  m i đ c hi u cho

Thi loài

ế ộ ư ừ ặ

ự ­  Trình t ả ồ ự ừ ­  Trình t ừ ậ v t và v a có vùng bi n đ ng đ c tr ng cho t ng loài  t.ệ riêng bi

NG LÀ VIRUS C N CÓ

Ầ Ả Ứ

Ữ

Ố ƯỢ TRÊN Đ I T Ư NH NG L U Ý GÌ TRONG PH N  NG ?

 Ho t tính RNase H: ho t tính RNase cho phép phá h y đ c hi u RNA trong ph c h p (RNA­

ứ ệ ạ ặ

ệ ượ ủ ợ ủ ế

ầ ợ ổ ớ ạ ng này không có l ợ

ả ứ ả ứ ể ẽ ổ ả ợ ẫ ế ạ ế ổ ợ RNA b  tr ), hi n t i cho PCR n u quá trình phá h y khuôn m u RNA  ạ ạ c nh tranh v i quá trình t ng h p DNA  khi t o s i DNA đ u tiên. Nói cách khác n u trong  ph n  ng test virus ta b  sung thêm RNase thì ph n  ng chuy n RNA s  không đ t k t qu

 Enzmye phiên mã ng

ượ ụ c ( ReverseTransciptase): các enzyme ReverseTransciptase ph

ộ ớ ự ầ ợ ổ

ả ứ ủ ệ ổ ỗ thu c RNA, xúc tác quá trình t ng h p RNA­>DNA đ u tiên sau đó DNApolimerase m i th c  ợ hi n ph n  ng t ng h p chu i DNA c a virus.

Ộ

Ụ Ề

Ệ

M T VÍ D  V  XÉT NGHI M VIRUS  DÂU TÂY(Strawberry) ề

 B y virus r p truy n qua đ ệ

ườ ng

ả ượ đ

ể c tái chuy n trong dâu tây: - Strawberry crinkle virus (SCV) - SMYEV - Strawberry mottle virus (SMoV) - Strawberry vein banding virus

- Strawberry pseudo mild yellow

(SVBV)

- Strawberry chlorotic fleck virus

edge virus (SPMYEV)

- Strawberry latent C virus (SLCV)

(SCFV)

ượ c coi

ấ ề ế ủ ố ọ Trong đó: SCV, SMYEV, SMoV, và SVBV đã đ là b n virus quan tr ng nh t v  kinh t c a dâu tây.

ấ ưở ườ ề n, tang tr ng không đ u

ỏ

ậ ả ỏ ủ ự ả ỏ ỏ ệ A: xu t hi n hóa đ  trên toàn v B: các dãi đ  lây lan ọ C: c n c nh s  hóa đ , còi c c, méo mó qu  nh  c a dâu

 Các tri u ch ng suy gi m trong cây dâu tây:

ứ ệ ả

ạ ẫ ỏ A: m ch d n hóa đ

ế ỏ ổ ạ ạ ẫ ươ ố ng trên cu ng

B: lá bi n d ng, m ch d n hóa đ , t n th lá

 nh điên di phân tích k t qu  test virus trên m t s   ộ ố ế

Ả ả

ổ ế ạ ủ ch ng dâu tây ph  bi n t ạ i Đà L t

Ở Ộ

M  R NG:

Ồ

PCR ĐA M I­ MULTIPLEX PCR

 Multiplex PCR là ph

ươ ử ụ ể ạ ng pháp s  d ng nhi u c p m i cùng lúc đ  khu ch đ i

ự ế ể ị ậ ồ  DNA đích, có th  s  d ng kĩ thu t này đ  đ nh nhóm

ề ặ ằ ự ự nhi u khu v c trên trình t ạ ho c phân lo i virus b ng các trình t ề ặ ể ử ụ  Nucleic acid

ế ệ ể ờ

 Trong m t xét nghi m đ  tăng đ  tin c y cho k t qu  và ti ệ

ả ứ ế ể ộ ợ ả ệ t ki m th i gian, chi phí,  ề c “Mix” h n h p m i ta có th  phát hi n cùng lúc nhi u virus trên

ầ ượ ẫ ỗ ấ ặ ệ

ệ ế ưở ệ ệ ế ậ ộ ồ ph n  ng c n đ ệ ủ ả ộ cùng m t m u. Do tính ch t đ c hi u c a m i nên vi c ph i h p s  đ t hi u qu   ả cao trong xét nghi m mà không làm  nh h ố ợ ẽ ạ ồ ả ng đ n k t qu  thí nghi m

ả ứ ể ạ Ph n  ng multiplex PCR có th  chia thành 2 lo i:

 a) Ph n  ng multiplex PCR dùng m t khuôn

ả ứ ộ

ử ụ ạ ệ ặ ớ

 Ph ươ ồ m i (các m i xuôi và m i ng ợ s i khuôn.

ng pháp này s  d ng m t lo i khuôn, th ồ ộ ượ ể ế ồ ườ ạ ứ ộ ng là ADN h  gen, cùng v i các c p  ụ ể c) đ  khu ch đ i m t vùng gen c  th  có ch a trong

 b) Ph n  ng multiplex PCR dùng nhi u khuôn

ả ứ ề

 Có th  th c hi n duy nh t m t ph n  ng v i nhi u lo i khuôn và nhi u c p m i.  ả ứ ồ

ề ặ ể ự ệ ấ ồ ớ

ộ ề ặ ề ể ẫ ặ ủ ạ ế ữ ự ệ ế Tuy nhiên s  có m t c a nhi u c p m i có th  d n đ n vi c liên k t chéo gi a các

ự ắ ặ ồ ớ ữ ệ ể ầ ồ m i v i nhau và có th  có s  b t c p nh m gi a m i này và khuôn kia. Do đó vi c

ế ế ồ ấ ọ thi t k  m i là r t quan tr ng.

ả ứ Ph n  ng  ELISA

ặ ấ

ề Đ t v n đ :

 Ngoài vi c xét nghi m các b nh lí do sinh v t gây ra, trong nông nghi p vi c s  d ng các  ậ

ệ ệ ệ

ố ấ ệ ệ ự ậ ả

ề ủ ệ ấ ố ử ụ ọ ng thu c BVTV trong nông s n hi n nay là v n đ  c a xã h i. ELISA­ m t ph

ệ ư ộ ế ố ế ứ  h t s c quan tr ng. D   ươ ộ ộ ng pháp  ể ượ ứ ụ ệ ệ ầ

ư ượ ướ ứ ể ả ấ ợ ả ừ  lâu trong xét nghi m các b nh lí, g n đây phát tri n theo  ộ ng các h p ch t BVTV trong nông s n và

ườ ệ ạ lo i hóa ch t, thu c b o v  th c v t (BVTV) cũng là m t y u t ượ l ệ xét nghi m đã đ ể h trong môi tr c  ng d ng t ng ki m tra, đánh giá m c đ  ô nhi m d  l ng sinh thái nông nghi p

:

ị

Đ nh nghĩa

ế ớ

)

ấ ự

ữ ể ặ

ệ

ạ

ẩ

ả

ấ ọ ủ

ộ ặ

ệ

ELISA ( Enzyme­Linked  ImmunoSorbent Assay_ Xét nghi m ệ ị ễ h p thu mi n d ch liên k t v i enzyme ự ế ợ d a trên s  k t h p gi a kháng  ả nguyên và kháng th  đ c hi u, ph n  ứ ng t o s n ph m có màu hay phát  ủ sáng. Trong đó tính ch t h at hóa c a  ể enzyme và đ  đ c hi u c a kháng th   là không đ i.ổ

ế

ự ệ

ớ

Nguyên t c:ắ ử ụ ữ ủ ợ

ẽ ạ ế

ự

ạ

ắ

ợ ấ ặ

ứ ơ

ế

ủ ả ứ ả

ấ ể ạ

ủ ẩ

ơ

ơ ủ ề S  d ng KT đ n dòng(Mabs) ph  b   ế ặ m t nh ng đĩa gi ng. N u có s  hi n  ẫ ệ di n c a KN trong m u,KN s  t o  ố ị ứ ph c h p v i KT c  đ nh trên gi ng và   do có g n enzyme t o thành   KT t ổ ộ m t ph c h p kép(sandwich).Khi b   ệ sung c  ch t đ c hi u c a enzyme vào  gi ng,enzyme xúc tác ph n  ng th y  phân c  ch t đ  t o ra các s n ph m  có màu hay phát sáng.

ử ụ ể ế ệ

Ðĩa plastic s  d ng đ  ti n hành xét nghi m  ELISA

ươ

ệ

ng pháp xét nghi m

Có hai ph ELISA:

 Ph

ể ệ ế ể ng pháp ELISA gián ti p(indirect ELISA): dùng đ  phát hi n kháng th

ệ ế ươ chuyên bi t trong huy t thanh

  Ph

ươ ự ể ệ ế ng pháp ELISA tr c ti p( direct ELISA): dùng đ  phát hi n kháng nguyên

ệ ẫ trong m u xét nghi m.

ạ

ườ

Các lo i enzyme th

ng dùng:

 Alkaline phosphatase

 Peroxydase

 Glucoxydase

 ­galactosidase

β

ộ b  KIT Elisa.

ể ệ ằ ộ ố Thí nghi m ki m tra s t dengue b ng b  KIT Elisa.

ọ

ươ

ộ

ấ ủ ể

ng pháp  ượ ệ

Ư ể  u đi m quan tr ng nh t c a ph ạ

ỏ

ợ

ứ

ệ

ạ

ầ

ở

c  ớ ớ  giai đo n s m khi m m

ệ

ớ

ấ ố ượ

ả ẩ

u đi m: Ư ể ELISA là đ  nh y cao, có th  phát hi n đ ệ ph c h p nh  KN_KT, cho phép phát hi n s m  tác nhân gây b nh  ễ b nh m i xâm nhi m.  Nhanh,thao tác đ n gi n. ơ  R  ti n, ít t n sinh ph m,hóa ch t,s  l ố ấ

ng  ố ớ

ẻ ề ẫ ớ

ớ ệ

ợ

ộ

m u l n, r t thích h p v i vi c phân tích đ i v i  ệ nguyên li u thô. ượ c đi m:

ể  đ  chính xác không cao

Nh

ạ

Ph

ng pháp ELISA c nh tranh dùng

ừ

ố

ươ cho phân tích các thu c tr  sâu

 (1) C nh tranh tr c ti p: C  đ nh kháng th

ố ị ự ế ạ ể

 (2) C nh tranh gián ti p: C  đ nh c ng h p kháng nguyên

ố ị ế ạ ộ ợ

ế ể ế ủ ừ ượ ỏ ộ

c ph  lên m t gi ng nh a nh . M t  ỏ ộ ừ ượ ớ ố

ự ắ c g n v i  ế ớ ả

ị ộ ể ấ ạ ế ợ ợ ế ố

ẫ ộ ể ế ẽ

ấ ư ừ ứ

ợ ữ ư ơ ướ ự i s  xúc tác c a các enzyme p  t o màu hay phát

ủ ố ừ ề ệ ấ ợ ỳ

ạ ạ ố Trong ki u (1), kháng th  là thu c tr  sâu đ hapten(kháng nguyên không hoàn toàn) mô ph ng thu c tr  sâu đ ộ m t Enzyme đánh d u t o nên c ng h p enzyme có kh  năng liên k t v i kháng  ừ ộ t m u và c ng h p enzyme vào trong các gi ng, thu c tr   th .  Khi cho d ch chi ế ớ ạ ị t và c ng h p enzyme s  cùng c nh tranh nhau đ  liên k t v i  sâu trong d ch chi ớ ấ ươ ữ ể kháng th . Sau khi r a trôi nh ng ch t d  th a sau p  c  ch t t ng  ng v i  ư ạ ẽ ượ c cho vào d enzyme s  đ ế ẽ hu nh quang s  xu t hi n trong gi ng. Thu c tr  sâu nhi u thì c ng h p enzyme  ể ử ạ do kém c nh tranh nên kháng th  gi ẽ i ít màu s  nh t và ng ộ ượ ạ c l l i

ữ ề ặ ắ ẽ ượ ố ị

ừ ộ ộ ượ ể ố ị ượ ừ ộ c c  đ nh trên b  m t r n. Thu c

ng kháng th  c  đ nh đ ớ ố ị ề ng KN t

ữ ố ị ượ ừ ấ ộ ị

ứ ừ ệ ấ ằ ầ ợ ể Trong ki u (2) c ng h p gi a KN­ Protein s  đ tr  sâu và m t l ẽ ạ do s  c nh tranh v i KN c  đ nh bám vào KT. L ữ  c  đ nh càng ít. Sau khi r a trôi ch t th a sau p  ng b  KN gi ể th  2 có đánh d u b ng enzyme đ  phát hi n KT ban đ u b  gi ố ự ố c cho vào, thu c tr  sâu là m t KN t ự  do càng nhi u thì KT  ườ ư i ta dùng m t KT  ị ữ ạ i. T  đó ta có   l

ể ị ượ ượ ừ ẫ ố th  đ nh l ng đ c thu c tr  sâu trong m u.