intTypePromotion=1

Xác định sơ bộ giá trị phần trăm, tuyệt đối của tiêu chuẩn quần thể Lympho (T CD3, T CD4, T CD8, B, NK) ở nhóm người bình thường tại thành phố Hồ Chí Minh bằng máy Fascalibur

Chia sẻ: Sunshine_3 Sunshine_3 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

0
49
lượt xem
3
download

Xác định sơ bộ giá trị phần trăm, tuyệt đối của tiêu chuẩn quần thể Lympho (T CD3, T CD4, T CD8, B, NK) ở nhóm người bình thường tại thành phố Hồ Chí Minh bằng máy Fascalibur

Mô tả tài liệu
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Định giá trị của tiểu quần thể lympho rất có giá trị trong một số trường hợp sau: + Định lượng lympho T CD4 để biết được bệnh nhân nhiễm HIV đang ở giai đoạn nào và làm cơ sở cho việc quyết định và theo dõi điều trị. + Xác định tình trạng thiếu hụt NK ở những người nhiễm virus Herpes tái đi tái lại. + Xác định tình trạng của hệ thống miễn dịch [1, 2]. Tuy nhiên các số liệu tham chiếu cho người bình thường hầu như chỉ dùa trên các số liệu của người nước ngoài....

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Xác định sơ bộ giá trị phần trăm, tuyệt đối của tiêu chuẩn quần thể Lympho (T CD3, T CD4, T CD8, B, NK) ở nhóm người bình thường tại thành phố Hồ Chí Minh bằng máy Fascalibur

  1. TCNCYH 26 (6) - 2003 X¸c ®Þnh s¬ bé gi¸ trÞ phÇn tr¨m, tuyÖt ®èi cña tiÓu quÇn thÓ lympho (T CD3, T CD4, T CD8, B, NK) ë nhãm ng−êi b×nh th−êng t¹i thµnh phè hå chÝ Minh b»ng m¸y FASCALIBUR TrÇn Khiªm Hïng Phßng MiÔn dÞch tÕ bµo, ViÖn Pasteur TP. HCM Môc tiªu lµ x¸c ®Þnh c¸c gi¸ trÞ b×nh th−êng cña tiÓu quÇn thÓ lympho, trªn c¬ së ®ã lµm sè liÖu tham chiÕu cho bÖnh nh©n ®Õn lµm xÐt nghiÖm t¹i viÖn Pasteur Thµnh phè Hồ ChÝ Minh vµ tiÕn hµnh so s¸nh c¸c gi¸ trÞ nµy víi c¸c gi¸ trÞ cña ng−êi Iran. Ph−¬ng ph¸p ¸p dông: lÊy m¸u ng−êi b×nh th−êng (n=47) chèng ®«ng b»ng EDTA. ñ m¸u víi hai nhãm kh¸ng thÓ cña BD chøa trong hai èng kh¸c nhau: CD3/ CD8/ CD45/ CD4 ; CD3/ CD16,56 / CD45/ CD19. Sau khi xö lý mÉu ®−îc cho qua m¸y FASC, ph©n tÝch, tÝnh to¸n, thèng kª. Cuèi cïng x¸c ®Þnh c¸c gi¸ trÞ T CD3, T CD4, T CD8, B, NK ë tõng mÉu riªng biÖt. KÕt qu¶: T CD3: % (⎯X = 68, SD: 7.94) . TuyÖt ®èi (⎯X = 2412, SD: 691); T CD4: % (⎯X = 35.7, SD: 6.2) . TuyÖt ®èi (⎯X = 915, SD: 339); T CD8: % (⎯X = 25.85, SD: 5.46) . TuyÖt ®èi (⎯X = 626, SD: 245); B: % (⎯X = 7.97, SD: 2.79). TuyÖt ®èi (⎯X = 194, SD: 93); NK: % (⎯X = 20.1, SD: 7.18) . TuyÖt ®èi (⎯X = 477, SD: 203); TØ lÖ T CD4/ T CD8: ⎯X =1.53, SD: 0.46. KÕt luËn: Khi so s¸nh víi c¸c gi¸ trÞ cña quÇn thÓ Iran, th× chØ cã tØ lÖ % NK cña nhãm nghiªn cøu lµ cao cßn nh÷ng gi¸ trÞ cßn l¹i ®Òu thÊp h¬n. i. ĐÆt VÊn ®Ò ViÖt Nam th× rÊt Ýt, hoặc thiếu số liệu theo §Þnh gi¸ trÞ cña tiÓu quÇn thÓ lympho rÊt vïng địa lý. cã gi¸ trÞ trong mét sè tr−êng hîp sau: MÆc kh¸c, cßn mét vÊn ®Ò rÊt quan träng + §Þnh l−îng lympho T CD4 ®Ó biÕt ®−îc lµ hiÖn nay t¹i ViÖt Nam vÉn ch−a cã mét hÖ bÖnh nh©n nhiÔm HIV ®ang ë giai ®o¹n nµo thèng kiÓm tra chÊt l−îng bªn trong, bªn vµ lµm c¬ së cho viÖc quyÕt ®Þnh vµ theo dâi ngoµi (internal quality control and external ®iÒu trÞ. quality control) ®èi víi m¸y FASCalibur + X¸c ®Þnh t×nh tr¹ng thiÕu hôt NK ë nhaốm ®¶m b¶o ®é tin cËy cña thö nghiÖm. nh÷ng ng−êi nhiÔm virus Herpes t¸i ®i t¸i l¹i. MÆc dÇu cho tíi b©y giê FASCalibur lµ mét c«ng cô rÊt ®¸ng tin cËy nhê vµo viÖc sö + X¸c ®Þnh t×nh tr¹ng cña hÖ thèng miÔn dông c¸c kh¸ng thÓ ®¬n dßng g¾n huúnh dÞch [1, 2]. quang vµ cã thÓ phèi hîp 4 chÊt huúnh Tuy nhiªn c¸c sè liÖu tham chiÕu cho quang kh¸c nhau cïng mét lóc khi thö ng−êi b×nh th−êng hÇu nh− chØ dïa trªn c¸c nghiÖm. sè liÖu cña ng−êi n−íc ngoµi. Trªn ng−êi 27
  2. TCNCYH 26 (6) - 2003 Do ®ã viÖc x©y dùng mét bé gi¸ trÞ tham 2. Ph−¬ng ph¸p: chiÕu cho tiÓu quÇn thÓ lympho cña phßng + Xö lý mÉu: miÔn dÞch tÕ bµo (viÖn Pasteur TP.HCM) cã * 1 ml m¸u t−¬i chèng ®«ng b»ng EDTA gi¸ trÞ thùc tiÔn. ®−îc xö lý trong vßng 4 giê. H¬n thÕ n÷a chóng t«i còng muèn so * 100 µl m¸u chèng ®«ng vµo mçi èng s¸nh c¸c gi¸ trÞ cña nhãm nghiªn cøu víi nghiÖm vµ ñ trong vßng 30’. nh÷ng nhãm d©n sè kh¸c ®Ó xem tû lÖ cña tiÓu quÇn thÓ lympho cã thay ®æi g× hay - èng 1: cã 5 µl kh¸ng thÓ CD3 (FITC)/ CD8 (PE)/ CD45 (PerCP)/ CD4(APC). kh«ng? ii. §èi t−îng vµ ph−¬ng ph¸p - èng 2: cã 5 µl kh¸ng thÓ CD3 (FITC)/ nghiªn cøu CD16,56 (PE)/ CD45 (PerCP)/ CD19(APC). 1. VËt liÖu, ®èi t−îng nghiªn cøu: * Hång cÇu bÞ ly gi¶i b»ng 1 ml dung dÞch - èng chèng ®«ng b»ng EDTA-TRI K ly. cung cÊp bëi LMD Paris. * Trung hßa b»ng 1ml dung dÞch PBS. - èng nghiÖm 5ml, cì 12 575mm do h·ng * Ly t©m 2000 rpm/1’ trong vßng 4 phót. BD cung cÊp. Bá dÞch næi, thªm vµo 500 µl dung dÞch PBS, l¾c ®Òu vµ c¸c tÕ bµo ®−îc ph©n t¸ch sau - Kh¸ng thÓ cña BD: + CD3 (FITC)/ CD8 ®ã b»ng m¸y FASC. (PE) / CD45 (PerCP) / CD4 (APC). + MÉu ®−îc ch¹y b»ng m¸y FASCalibur, + CD3 (FITC) / CD16,56 (PE) / CD45 (PerCP) / CD19 (APC). s¶n phÈm cña h·ng BD (Hoa KÜ). - Dung dÞch ly gi¶i hång cÇu . * M¸y cã 2 ®Ìn laser. - M¸y FASCalibur cña BD. - Xanh: cung cÊp ¸nh s¸ng ë b−íc sãng 488 nm. - PhÇn mÒm cellquest, excel… - §á: cung cÊp ¸nh s¸ng ë b−íc sãng - MÉu m¸u cã ®−îc lÊy tõ nh÷ng ng−êi 620 nm. hiÕn m¸u nhiÒu lÇn t¹i héi ch÷ thËp ®á * Cã 6 c¶m thô quan nhËn c¶m ¸nh s¸ng TP.HCM. ph¸t x¹ vµ nh÷ng c¶m thô quan nµy cho ta + Tuæi tõ 19 ®Õn 50 tuæi bao gåm 40 nam biÕt ®−îc: vµ 8 n÷. - FSC: h×nh th¸i cña tÕ bµo. + C¸c xÐt nghiÖm: kh¸ng thÓ bÊt th−êng, - SSC: cÊu tróc cña tÕ bµo. VDRL, KSTSR, HCV, HIV, HbsAg ®Òu ©m tÝnh. - Fl1: b¾t mµu huúnh quang FITC. + C«ng thøc m¸u trong giíi h¹n b×nh - Fl2: b¾t mµu huúnh quang PE. th−êng. - Fl3: b¾t mµu huúnh quang PerCP. V× tiÕn hµnh lÊy m¸u tr−íc khi xÐt - Fl4: b¾t mµu huúnh quang APC. nghiÖm, sau khi cã kÕt qu¶ trong mÉu + MÉu ®−îc ph©n tÝch b»ng s¬ ®å ch¹y nghiªn cøu lo¹i trõ mét tr−êng hîp v× cã trong ch−¬ng tr×nh Cellquest. HbsAg (+). Nªn cì mÉu thËt sù chØ lµ 47. % TCD8, TCD4, TCD3 dïa vµo kh¸ng thÓ CD3 (FITC)/ CD8 (PE)/ CD45 (PerCP)/ CD4 (APC) vµ cã c¸ch tÝnh nh− sau: 28
  3. TCNCYH 26 (6) - 2003 A B R1 R2 C D UL UL UR=32.52% UR=34.78% LR LR E F Sample ID: 160402/6-X7 Sample ID: 160402/6-X7 Quad Events % Gated Quad Events % Gated UL 614 8.01 UL 28 0.37 UR 2492 32.52 UR 2665 34.78 LL 1909 24.91 LL 2492 32.52 LR 2648 34.56 LR 2478 32.34 H×nh 1: Ph−¬ng ph¸p x¸c ®Þnh tû lÖ % TCD4, TCD8. A- Dïng cöa sæ x=SSC, y=Fl3-CD45 ®Ó TCD8 =% vïng UR cho Fl1 vµ Fl2. Trong lo¹i trõ hång cÇu ch−a ly gi¶i, m¶nh vì cña h×nh lµ 32.52%. tÕ bµo b»ng c¸ch giíi h¹n c¸c tÕ bµo cÇn D- Cöa sæ thø 4 (x=Fl1-CD3, y=Fl4-CD4) ph©n tÝch trong khu vùc R1. V× thÕ quÇn thÓ b¾t nguån tõ héi cña vïng R1 vµ R2. KÕt lympho ph©n tÝch sau nµy thuÇn nhÊt h¬n. hîp víi phÇn thèng kª cña cöa sæ nµy (h×nh B- Cöa sæ thø 2 (x=FSC, y=SSC) b¾t 1 F) cho ta biÕt ®−îc tØ lÖ phÇn tr¨m cña nguån tõ vïng R1. ThÊy râ 3 nhãm d©n sè: TCD4 =% vïng UR cho Fl1 vµ Fl4. Trong lympho, b¹ch cÇu ®¬n nh©n, b¹ch cÇu h¹t. h×nh lµ 34,78%. Giíi h¹n d©n sè lympho trong vïng R2 Vµ tØ lÖ % CD3 = % UR + % LR. C¸c sè C- Cöa sæ thø 3 (x=Fl1-CD3, y=Fl2-CD8) liÖu cã thÓ lÊy ë cöa sæ 3 hay 4. b¾t nguån tõ héi cña vïng R1 vµ R2. KÕt % NK, B dùa vµo kh¸ng thÓ CD3 (FITC)/ hîp víi phÇn thèng kª cña cöa sæ nµy (h×nh CD16.56 (PE)/ CD45 (PerCP)/ CD19(APC) 1 E) cho ta biÕt ®−îc tØ lÖ phÇn tr¨m cña vµ cã c¸ch tÝnh nh− sau: 29
  4. TCNCYH 26 (6) - 2003 A B R1 R2 C D UL=20.9% UR UL=2.16% UR LR LR E F Sample ID: 160402/5-X7 Sample ID: 160402/5-X7 Quad Events % Gated Quad Events % Gated UL 1632 20.90 UL 169 2.16 UR 243 3.11 UR 13 0.17 LL 789 10.11 LL 2243 28.73 LR 5143 65.88 LR 5382 68.94 H×nh 2: Ph−¬ng ph¸p x¸c ®Þnh tû lÖ % B, NK. A- Dïng cöa sæ x=SSC, y=Fl3-CD45 ®Ó D- Cöa sæ thø 4 (x=Fl1-CD3, y=Fl4- lo¹i trõ hång cÇu ch−a ly gi¶i, m¶nh vì cña CD19) b¾t nguån tõ héi cña vïng R1 vµ R2. tÕ bµo b»ng c¸ch giíi h¹n c¸c tÕ bµo cÇn KÕt hîp víi phÇn thèng kª cña cöa sæ nµy ph©n tÝch trong khu vùc R1. V× thÕ quÇn thÓ (h×nh 2 F) cho ta biÕt ®−îc tØ lÖ phÇn tr¨m lympho ph©n tÝch sau nµy thuÇn nhÊt h¬n. cña B=% vïng UL cho Fl1 vµ Fl4. Trong B- Cöa sæ thø 2 (x=FSC, y=SSC) b¾t h×nh lµ 2.16%. nguån tõ vïng R1. ThÊy râ 3 nhãm d©n sè: 2. Ph−¬ng ph¸p thèng kª: lympho, b¹ch cÇu ®¬n nh©n, b¹ch cÇu h¹t. Dïng phÇn mÒm Excell ®Ó x¸c ®Þnh gi¸ Giíi h¹n d©n sè lympho trong vïng R2 trÞ trung b×nh, ®é lÖch chuÈn cña c¸c th«ng C- Cöa sæ thø 3 (x=Fl1-CD3, y=Fl2- s è. CD16.56) b¾t nguån tõ héi cña vïng R1 vµ Dïng phÐp kiÓm t ®Ó so s¸nh trung b×nh R2. KÕt hîp víi phÇn thèng kª cña cöa sæ cña 2 nhãm d©n sè. Tr−íc tiªn x¸c ®Þnh t nµy (h×nh 2 E) cho ta biÕt ®−îc tØ lÖ phÇn tÝnh, víi trÞ sè t nµy tra b¶ng ph©n phèi t víi tr¨m cña NK=% vïng UL cho Fl1 vµ Fl2. ®é tự do (n1+n2-2) ®Ó −íc l−îng gi¸ trÞ p (p Trong h×nh lµ 20.9%. value). n1, n2 lµ cì mÉu cña 2 nhãm d©n sè t−¬ng øng. 30
  5. TCNCYH 26 (6) - 2003 iii. KÕt qu¶ B¶ng 1: Tû lÖ phÇn tr¨m, gi¸ trÞ tuyÖt ®èi cña tiÓu quÇn thÓ lympho ë nhãm d©n sè TP.HCM Lo¹i tÕ bµo % TuyÖt ®èi T CD3 ⎯X: 68, SD: 7.94 ⎯X: 2412, SD: 691 T CD4 ⎯X: 35.7, SD: 6.2 ⎯X: 915, SD: 339 T CD8 ⎯X: 25.85, SD: 5.46 ⎯X: 626, SD: 245 B ⎯X: 7.97, SD: 2.79 ⎯X: 194, SD: 93 NK ⎯X: 20.1, SD: 7.18 ⎯X: 477, SD: 203 TØ lÖ TCD4/TCD8 ⎯X: 1.53, SD: 0.46 Khi so s¸nh kÕt qu¶ nµy (HCM) víi sè liÖu ng−êi Iran [3] chØ giíi h¹n ë tû lÖ phÇn tr¨m (xem b¶ng 2). B¶ng 2: B¶ng so s¸nh c¸c gi¸ trÞ gi÷a nhãm d©n sè TP.HCM víi nhãm d©n sè Iran. HCM (n=47) Iran (n=152) T tÝnh p % Mean ± SD % Mean ± SD TCD3 68 ± 7.94 70.62 ± 7.29 2.11 p < 0.05 TCD4 35.7 ± 6.2 42.11 ± 6.95 5.66 p < 0.001 TCD8 25.85 ± 5.46 28.41 ± 8.58 1.9 0.05 < p < 0.1 CD4/CD8 1.53 ± 0.46 1.61 ± 0.6 0.84 0.2 < p < 0.5 CD19 7.97 ± 2.79 13.72 ± 4.59 8.13 p < 0.001 NK 20.1 ± 7.18 15.81 ± 6.97 -3.66 p < 0.001 IV. Bµn luËn th× NK cña ng−êi Iran cao h¬n ng−êi Ch©u ¢u, trong khi tû lÖ TCD8 th× thÊp h¬n. Ngo¹i trõ TCD8, TCD4/TCD8 cã p > 0,05 tøc lµ kh«ng cã sù kh¸c biÖt vÒ trung b×nh ë Tõ nh÷ng th«ng tin nµy khiÕn ng−êi ta hai nhãm d©n sè trªn. Trong khi ®ã TCD3, nghÜ ®Õn kh¶ n¨ng lµ tû lÖ cña tiÓu quÇn thÓ TCD4, CD19 ®Òu cã sù kh¸c biÖt (p < 0,05) lympho sù thay ®æi khi cã sù kh¸c biÖt vÒ víi tû lÖ thÊp h¬n ë nhãm d©n sè TP.HCM. chñng téc. T−¬ng tù víi NK còng cã sù kh¸c biÖt (p < MÆc kh¸c víi tû lÖ NK cña nhãm nghiªn 0,05) nh−ng tû lÖ ë nhãm Iran l¹i thÊp h¬n. cøu cao h¬n h¼n khi so víi nhãm ng−êi Iran, Më réng vÊn ®Ò nµy ®èi víi mét sè chñng Ch©u ¢u, trong khi TCD3, TCD4, CD19 ®Òu téc kh¸c. Víi nghiªn cøu cña Lee BW vµ thÊp h¬n. Víi sù kh¸c biÖt nµy khiÕn ng−êi céng sù nhËn thÊy tû lÖ NK ë người §µi ta suy nghÜ nh− thÕ nµo vÒ vai trß cña ®¸p Loan th× cao h¬n người Ch©u ¢u trong khi tû øng miÔn dÞch tù nhiªn (th«ng qua NK) ë lÖ TCD4 th× thÊp h¬n [4]. KÕt luËn t−¬ng tù quÇn thÓ nµy? Sù cao h¬n vÒ tû lÖ NK cã còng t×m thÊy trªn b¸o c¸o cña Prime vµ gióp Ých g× cho c¸c c¸ thÓ trong viÖc gióp c¬ céng sù [3] lµ tû lÖ NK ë ng−êi Trung Hoa thÓ chèng l¹i nh÷ng t¸c nh©n g©y h¹i?… ®Ó cao h¬n ë ng−êi Ch©u ¢u. Theo Shahpour tr¶ lêi cho nh÷ng c©u hái trªn chóng ta cÇn Shahghasempour khi nghiªn cøu trªn ng−êi nghiªn cøu l¹i vÊn ®Ò nµy víi cì mÉu réng Iran (lµ quÇn thÓ chóng t«i dïng ®Ó so s¸nh h¬n nh»m x¸c lËp l¹i thËt sù tû lÖ NK ë víi nhãm nghiªn cøu t¹i TP.Hå ChÝ Minh) [3] ng−êi b×nh th−êng t¹i TP.HCM cao h¬n 31
  6. TCNCYH 26 (6) - 2003 nhãm ng−êi Iran, Ch©u ¢u. ThËm chÝ cÇn Khi so s¸nh víi c¸c gi¸ trÞ cña quÇn thÓ nghiªn cøu s©u h¬n vÒ chøc n¨ng cña NK, Iran, th× chØ cã tØ lÖ % NK cña nhãm nghiªn kh¶o s¸t mét sè CD bÒ mÆt cña NK nh−: cøu lµ cao cßn nh÷ng gi¸ trÞ cßn l¹i ®Òu thÊp CD1.7.1, CD158a, KAR, KIR P70, CD28, h¬n. HLA-DR… lµ nh÷ng CD cho biÕt ®−îc t×nh Tµi liÖu tham kh¶o tr¹ng ho¹t ®éng, kÝch ho¹t… cña tÕ bµo 1. Flow cytometry protocols . Mark NK… J.Jaroszeski, Richard Heller. Humana Press. v. KÕt luËn 2. Practical flow cytometry. Howard M. Sau khi xö lý mÉu ®−îc cho qua m¸y Shapiro, M.D.Wiley Liss.1995. FASC, ph©n tÝch, tÝnh to¸n, thèng kª. Cuèi 3. Enumeration of peripheral blood cïng x¸c ®Þnh c¸c gi¸ trÞ T CD3, T CD4, T lymphocyte subsets in a healthy iranian CD8, B, NK ë tõng mÉu riªng biÖt. population. Shahpour Shahghasempour, KÕt qu¶: T CD3: % (⎯X = 68, SD: 7.94) . Mitra Gerami, Zinat Entezami. Archives of TuyÖt ®èi (⎯X = 2412, SD: 691); T CD4: % Iranian Medecine, 2001; 4(2): 80-83. (⎯X = 35.7, SD: 6.2) . TuyÖt ®èi (⎯X = 915, 4. Age and sex related changes in SD: 339); T CD8: % (⎯X = 25.85, SD: 5.46) . lymphocyte subpopulation of healthy Asian TuyÖt ®èi (⎯X = 626, SD: 245); B: % (⎯X = subjects from birth to adulthood. Lee BW, Yap HK, Chew FT, Quah TC, Prabhakaran 7.97, SD: 2.79). TuyÖt ®èi (⎯X = 194, SD: K, Chan GS, Wong SC, Seah CC. Cytometry 93); NK: % (⎯X = 20.1, SD: 7.18) . TuyÖt ®èi 1996 Mar 15; 26 (1):8-15. (⎯X = 477, SD: 203); TØ lÖ T CD4/ T CD8: ⎯X =1.53, SD: 0.46. Summary LYMPHOCYTE SUBPOPULATION IN HEALTHY ADULTS DONORS OF HO CHI MINH CITY VIET NAM The primary objective of this study was to establish reference ranges for the lymphocyte subsets (T CD3, T CD4, T CD8, B, NK) in the peripheral blood of healthy adults donors. This reference ranges is used like target values for the patients at Pasteur Institute-HCMC and then compare the results with those obtained in a group of healthy adults Iranian population. The samples obtained from the 47 healthy adults donors were stained with two premixed monoclonal antibodies:CD3 (FITC)/ CD8 (PE)/ CD45 (PerCP)/ CD4 (APC); CD3 (FITC)/ CD16-56 (PE)/ CD45 (PerCP)/ CD19 (APC). After stain, whole blood is passed lyses procedures, wash and final they were analyzed by flow cytometry. The results: T CD3: % (⎯X= 68, SD: 7.94) . Absolute (⎯X = 2412, SD: 691); T CD4: % (⎯X = 35.7, SD: 6.2) . Absolute (⎯X = 915, SD: 339); T CD8: % (⎯X = 25.85, SD: 5.46) . Absolute (⎯X = 626, SD: 245); B: % (⎯X = 7.97, SD: 2.79) . Absolute (⎯X = 194, SD: 93); NK: % (⎯X = 20.1, SD: 7.18) . Absolute (⎯X = 477, SD: 203); Ratio T CD4/ T CD8: ⎯X =1.53, SD: 0.46. We have the difference clearly in subpopulation NK (population of HCMC is higher than Iranian population). The study demonstrate that on population's HCMC, the innate immunity may have a role protection importance. But we need more study with a larger of sample size to clarify 32
ADSENSE
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2