CHUYEÅN GENE
Nguyeãn Thaùi Thuûy, MSc. National Sales Manager Bio-Rad Laboratories VN Email: thai_thuy@bio-rad.com
NOÄI DUNG
Giôùi thieäu kyõ thuaät chuyeån gene Caùc phöông phaùp chuyeån gene ñang ñöôïc söû duïng. Lipofection Electroporation Biolistics Microinjection
GIÔÙI THIEÄU KYÕ THUAÄT CHUYEÅN GENE
1928 – Baùo caùo ñaàu tieân veà chuyeån gene: vi khuaån coù theå thu nhaän sinh chaát naøo ñoù töø moâi tröôøng soáng laøm chuùng thay ñoåi.
Chuyeån gene = chuyeån gene/genome töø sinh vaät naøy vaøo genome sinh vaät khaùc.
Chuyeån toaøn boä nuclear
GIÔÙI THIEÄU KYÕ THUAÄT CHUYEÅN GENE
TAÏI SAO PHAÛI CHUYEÅN GENE
Nghieân cöùu:
Bieåu hieän gene trong teá baøo soáng Ñieàu hoøa bieåu hieän gene Taàm soaùt caùc höôùng trò lieäu Sinh hoïc ung thö
TAÏI SAO PHAÛI CHUYEÅN GENE
ÖÙng duïng: duøng teá baøo soáng ñeå saûn xuaát caùc vector di truyeàn, protein taùi toå hôïp phuïc vuï cho caùc muïc ñích chuyeân bieät:
heo saûn xuaát noäi taïng ngöôøi phuï vuï caáy gheùp, protein trò lieäu taùi toå hôïp theá heä thöù ba ñöôïc taïo ra vaø söû duïng ngay trong teá baøo chuû, thöïc vaät khaùng coân truøng, choáng chòu nhieät ñoä cao, choáng chòu laïnh, choáng chòu haïn vaccine DNA trò lieäu gene
Taïi sao phaûi chuyeån gene
Cloning:
Cöøu vôùi genome xaùc ñònh
CAÙC PHÖÔNG PHAÙP CHUYEÅN GENE
vi khuaån thu nhaän
Khueách taùn thuï ñoäng: DNA khoâng caàn baát kyø xöû lyù ñaëc bieät naøo. Khueách taùn ñöôïc hoå trôï: ví duï teá baøo vi khuaån xöû lyù CaCl2 keøm soác nhieät ôû 420C. Vector vi khuaån/virus: ví duï Agrobacterium tumefaciens hay CaMV chuyeån DNA vaøo thöïc vaät Lipofection Electroporation Biolistics Microinjection
LIPOFECTION
Söû duïng hoùa chaát höõu cô toång hôïp lipid-polyamines thieát keá ñaëc bieät ñeå chuyeån nucleic acid vaøo teá baøo ñoäng vaät höõu nhuõ.
Caáu taïo bao goàm ñaàu öa nöùôc (+) vaø ñuoâi kî nöôùc (-). Ñaàu (+) baùm vôùi nucleic acid (-) Lipid micelle phaûn öùng vôùi maøng teá baøo ñeå chuyeån nucleic acid vaøo beân trong teá baøo. Söû duïng ñeå chuyeån DNA/RNA vaøo trong raát nhieàu loaïi teá baøo. Ñoäc tính ñoái vôùi teá baøo thaáp
LIPOFECTION
ELECTROPORATION
Electroporation ( chuyeån gene xung ñieän) söû duïng ñieän tröôøng maïnh trong thôøi gian ngaén laøm taïm thôøi maát tính oån ñònh cuûa maøng teá baøo. Trong thôøi gian naøy, maøng teá baøo coù khaû naêng thaám cao ñoái vôùi caùc phaân töû hieän dieän trong moâi tröôøng xung quanh. Nhôø ñoù, DNA/ RNA coù theå ñöôïc chuyeån vaøo teá baøo.
ELECTROPORATION
Electroporation
CAÙC ÖU ÑIEÅM CUÛA ELECTROPORATION
Khoâng söû duïng hoùa chaát, khoâng laøm thay ñoåi caáu truùc, chöùc naêng cuûa teá baøo ñích Deã thöïc hieän Thôøi gian ngaén Khoâng ñoäc haïi Hieäu quaû cao Coù theå aùp duïng cho nhieàu loaïi teá baøo
ÖÙNG DUÏNG CUÛA ELECTROPORATION
Chuyeån caùc gene marker Saùt nhaäp caùc gene chöùc naêng Chuyeån thuoác, protein, moài phaân töû, caùc chaát chuyeån hoùa, khaùng theå … ñeå khaûo saùt chöùc naêng vaø caáu truùc cuûa teá baøo.
CÔ CHEÁ
• Teá baøo ñöôïc cho vaøo cuvette
cuøng vôùi DNA
• Cho xung ñieän qua cuvette vaø ñieän tröôøng taïo caùc loã treân maøng teá baøo.
• DNA ñi vaøo trong teá baøo qua
caùc loã
• Khi xung ñieän taét, caùc loã treân maøng teá baøo ñoùng laïi, giöõ laïi caùc DNA beân.
HEÄ THOÁNG GENE PULSER Xcell
(Pulse Controller)
PC module
CE module
(Capacitance Extender)
Main unit
ShockPod
CHÖÙC NAÊNG
Taïo hai loaïi xung: daïng haøm muõ giaûm, daïng soùng vuoâng. Ñaùp öùng toái öu vôùi nhieàu loaïi teá baøo, eukaryote hay prokaryote.
CHÖÙC NAÊNG
PulsTrac ñaûm baûo cung caáp hieäu ñieän theá chính xaùc.
3ohm resistor
Charger
Capacitor
Cuvette
Charging Circuit
Discharge Circuit
CHÖÙC NAÊNG
ARQ giaûm khaû naêng taïo tia löûa ñieän ôû ñieän theá cao, baûo veä maãu vaø thieát bò
Ion tích tuï treân beà maët maãu taïo hieän töôïng tia löûa ñieän
CHÖÙC NAÊNG
PC module ñieàu chænh thôøi gian xung ñieän phuø hôïp vôùi ñieän trôû cuûa maãu nhôø ñieän trôû noái song song vôùi cuvette maãu. Nhôø vaäy caùc maãu coù ñieän trôû cao ( vi khuaån) khoâng bò cheát do xung ñieän daøi.
3ohm resistor
Charger
Capacitor
Cuvette
Resistor in parallel
Charging Circuit
Discharge Circuit
Pulse Controller
TB ÑVHN TB VK
TB Naám
CHÖÙC NAÊNG
E. coli
S. cerivisiae
CHO
Chöông trình ñaõ thieát laäp saün cho moät soá teá baøo thoâng duïng.
A. tumefaciens P. pastoris
Cos7
P. aeruginosa
C. albicans
3T3
S. pombe
S. aureus
293
D. discoideum
B. cereus
HeLa
S. pyogenes
BHK21
L. plantrum
A549
CV1
K562
HL60
Jurkat
HuT78
Bird
BIOLISTICS- BAÉN GENE
Chuyeån nucleic acid vaøo trong teá baøo baèng caùch baén vi ñaïn phuû nucliec acid vaøo chuùng.
PDS-1000/He
Helios Gene Gun
ÖU ÑIEÅM
Phöông phaùp ñôn gæan, nhanh, linh ñoäng Khoâng phuï thuoäc loaïi teá baøo Söû duïng ít DNA Chuyeån moät hoaëc nhieàu gene Coù theå chuyeån ñoaïn DNA lôùn Khoâng chuyeån gene khoâng mong muoán hoaëc protein Ít thao taùc treân teá baøo Ñoä laäp laïi cao
Helios Gene Gun
Suùng caàm tay – coù theå aùp duïng thöïc ñòa Aùp suaát 100 – 600 psi Vuøng ñích nhoû cho pheùp ñònh vò muïc tieâu chính xaùc
ÑOÁI TÖÔÏNG
In vitro – teá baøo ñoäng vaät, thöïc vaät nuoâi caáy, cô quan In vivo – ñoäng vaät, thöïc vaät, giun, coân truøng, naám men, taûo, vi khuaån vaø caùc vi sinh vaät khaùc In situ – Moâ thöïc vaät, cô quan nuoâi caáy
LÓNH VÖÏC NGHIEÂN CÖÙU
Bieåu hieän gene Lieäu phaùp gene Mieãn dòch di truyeàn Sinh hoïc ung thö Haøn veát thöônmg Beänh nhieãm truøng Ñaùnh daáu maøu caùc neuron
QUY TRÌNH
Vi ñaïn baèng vaøng vì: . Vaøng khoâng gaây ñoäc cho teá baøo . DNA gaén leân vaøng khoâng bò phaân huûy
Vi ñaïn vaøng
Chuaån bò oáng ñaïn
CÔ CHEÁ HOAÏT ÑOÄNG
b-gal expression in CHO cells
CHUYEÅN GENE in vitro
THOÂNG SOÁ CHO in vitro
Aùp suaát Helium
100 – 200 psi
Kích thöôùc vi ñaïn
1.6 µm
Soá löôïng DNA
0.5 – 2.5 µg DNA/mg gold (0.06 – 1.25 µg DNA/cartridge)
Soá löôïng vi ñaïn
0.125 – 0.5 mg/tube
CHUYEÅN GENE in vivo
0.5mg vi ñaïn vaøng 400 psi, 24 hours sau baén gene
Aùp suaát Helium
200 – 400 psi
Kích thöôùc vi ñaïn vaøng
1.6 µm
Soá löôïng DNA
1.0 – 2.5 µg DNA/mg gold (0.12 – 1.25 µgDNA/cartridge)
Soá löôïng vi ñaïn vaøng
0.25 – 0.5 mg/tube
THOÂNG SOÁ CHO in vivo
CHUYEÅN GENE ÔÛ GIUN
• Chuyeån cDNA virus vaøo khoai taây. Tuija Kekarainen and Jari P. T. Valkonen, Department of Plant Biology, Swedish
CHUYEÅN GENE ÔÛ LAÙ CAÂY
MAÃU CAÉT NAÕO CHOÀN FERRET
Dr. Donald Lo / Duke University
HEÄ THOÁNG PDS-1000/He
in vitro, ex vivo (vaø in vivo cho moät soá thöïc vaät, vi sinh vaät) Aùp duïng cho teá baøo ñoäng vaät, cô quan nuoâi caáy, teá baøo vaø moâ thöïc vaät nuoâi caáy, phaán hoa, coân truøng, taûo, naám vaø vi khuaån Aùp suaát trong khoaûng 450 - 2200 psi Vuøng baén lôùn – nhieàu teá baøo ñöôïc chuyeån
• In Vitro – Teá baøo vaø cô quan ñoäng vaät
ÑOÁI TÖÔÏNG
nuoâi caáy, teá baøo thöïc vaät
• Ex vivo – moâ vaø phaán hoa thöïc vaät
• In vivo - moät soá thöïc vaät, coân truøng, taûo,
naám, vi khuaån vaø moät soá vi sinh vaät
• Bieåu hieän gene
• Coâng ngheä sinh hoïc noâng nghieäp vaø phaùt
LÓNH VÖÏC NGHIEÂN CÖÙU
trieån muøa vuï – vaccine cho thöïc vaät
• Khaùng beänh
PDS-1000/He
CHUAÅN BÒ MAÃU
PDS-1000/He Rupture Disk
PDS-1000/He Naïp Macrocarrier
1
2
3
4
PDS-1000/He Naïp Teá Baøo Ñích
PDS-1000/He Baén
THOÂNG SOÁ
Kích thöôùc vi ñaïn
Vacuum Target dist Helium ins Hg cm psi 1100 6
29
M5 Tungsten
Vi Khuaån
Naám Men
28
6
1300
0.6m vaøng
Taûo
29
6
1300
0.6m vaøng
TB Thöïc Vaät
28
9
1100
1.0m vaøng
TBÑoâng Vaät
15
3
1100
1.6m vaøng
Luùa Maïch Chuyeån Gene
Peggy G. Lemaux and colleagues / UC Berkeley
• Boä chuyeån ñoåi cho 7 ngoõ ra
• Taïo vuøng baén lôùn
• Thích hôïp soá löôïng lôùn maãu • Aùp duïng cho teá baøo vaø cô quan ñoäng vaät nuoâi caáy, teá baøo vaø moâ thöïc vaät, naám men vaø vi khuaån
PDS-1000/Hepta
So Saùnh Helios va øPDS
MICROINJECTION
ÑAËC HIEÄU
Nhaém ñeán moät teá baøo Thao taùc vaät lyù teá baøo Cho vaøo hoaëc laáy ra caùc thaønh phaàn cuûa teá baøo
Kính hieån vi
THAØNH PHAÀN
Kính hieån vi, boä vi thao taùc
THAØNH PHAÀN
Kính hieån vi, boä vi thao taùc, boä vi tieâm
THAØNH PHAÀN
Vi thao taùc: • motor töï ñoäng
– 3 truïc – Di chuyeån 25mm – Ñoä phaân giaûi 40nm
Boä ñieàu khieån Tay ñieàu khieån joystick
– Joystick treo – Coù boä nhôù vò trí
Thaønh phaàn cuûa heä thoáng
• Boä giao dieän ñieàu
khieån
Vi tieâm kyõ thuaät soá: • 2 keânh aùp suaát
• Boä neùn beân trong -350 ñeán +5600 hPa
– Giöõ – Tieâm/chuyeån
Thaønh phaàn cuûa heä thoáng
syringe micrometer
Vi Tieâm Ñoàng Boä: • • 2 vaän toác • Töông thích nhieàu theå tích • Duøng daàu hoaëc nöôùc
Thaønh phaàn cuûa heä thoáng
ÖÙNG DUÏNG
Taïo ñoäng vaät chuyeån gene Vi tieâm teá baøo coá ñònh Thuï tinh nhaân taïo
• 2 microtools
– Giöõ – Bôm/chuyeån • Aùp suaát thaáp
– Döông (tieâm) – Aâm (giöõ, huùt)
TEÁ BAØO KHOÂNG COÁ ÑÒNH
VI TIEÂM TIEÀN NHAÂN
Hôïp töû ôû giai ñoaïn tieàn nhaân cuûa teá baøo ñoäng vaät höõu nhuû ñöôïc tieâm dung dòch DNA. Tieâm DNA vaøo trong tieàn nhaân Hôïp töû phaùt trieån thaønh caùc theå coù theå bieåu hieän chuyeån gene
CHUYEÅN TEÁ BAØO MAÀM
Phoâi chöa bieät hoùa chöùa khoaûng 100 teá baøo maàm ñöôïc chuyeån vaøo moät soá teá baøo maàm mang ñoät bieán gene quan taâm Phoâi phaùt trieån thaønh caù theå mang theå khaûm.
CHUYEÅN NHAÂN
Teá baøo tröùng ñöôïc laáy toaøn boä nhaân ra baèng vi huùt Chuyeån nhaân teá baøo sinh döôõng vaøo teá baøo tröùng Keát quaû taïo doøng voâ tính (cöøu Dolly 1996)
intracytoplasmic sperm injection (ICSI)
Teá baøo tröùng ñöôïc vi tieâm tinh truøng Thuï tinh nhaân taïo
• phase contrast • Goùc thao taùc 45 ñoä • 1 vi thao taùc • 1 vi tieâm kyõ thuaät sooâ1
TEÁ BAØO COÁ ÑÒNH
Biolistics
Helios Gene Gun PDS-1000/He
Electroporation
Gene Pulser Xcell MicroPulser Cuvettes
ElectroCompetent Cells
Gene Transfer
XenoWorks
GT Reagents
Microinjection
Competent Cells
Lipid
Lipid Transfection
ÖÙng duïng môùi: RNAi trong öùc cheá HBV ôû chuoät.
McCaffrey, A. P. et al.
Cô cheá töï nhieân coù ôû haàu heát eukaryotes giuùp ñieàu hoaø bieåu
hieän gene lieân quan ñeán quaù trình bieät hoùa, hay choáng laïi söï xaâm nhaäp cuûa virus.
• RNAi: RNA interference, RNA maïch ñoâi baùm vaøo mRNA
laøm baát hoaït bieåu hieän gene. siRNA: small interfering RNA
•
RNAi vaø Central Dogma
A
B
Cô Cheá RNA
21-25 nt siRNA
hoaëc
dsRNA (>25 nt)
Dicer
Böôùc 1: dsRNA> 25nt vaøo trong teá baøo, Dicer endonuclease caét dsRNA thaønh siRNAs (MacRae et al.2006), hoaëc chuyeån caùc siRNA <25 nt vaøo trong teá baøo
siRNA
Böôùc 2: siRNAs gaén vôùi phöùc hôïp protein
RISC
Nhaän bieát muïc tieâu
RISC (RNA-induced silencing complex) vaø loaïi boû bôùt moät maïch ñôn RNA.
RISC
Phaân caét
Böôùc 3: RISC-siRNA gaén ñaëc hieäu boå xuang vôùi mRNA ñích vaø phaân caét mRNA naøy.
mRNA bò phaân huûy
Quy Trình Thí Nghieäm RNAi
siRNA
Chuyeån voâ teá baøo ñích
Phaùt hieän vaø phaân tích
Gene Expression
Protein Expression
• 2-D Analysis • Western Blots • Bio-Plex assays
• qRT-PCR • Microarrays • Northern Blots
Quy Trình Thí Nghieäm RNAi : qRT-PCR
Phaân tích Protein Expression (2D, Bio-Plex, Western blotting)
Microarray
Chuaån bò RNA
Phaân tích RNA (Chaát löôïng, hieäu suaát)
•Aurum Total RNA Kits
•Experion System •SmartSpec Plus •VersaFluor fluorometer
Chuyeån RNAi
• siLentFect • Transfectin
•Gene Pulser Xcell
Reverse Transcription & amplification
iScript cDNA kits iQ Supermixes iTaq Supermix iProof polymerase PCR instrument
Phaân tích
•Real time PCR Systems (iQ 5, Chromo 4, MyiQ)
Quy Trình Thí Nghieäm RNAi : Microarray
Chuaån bò RNA
Chuyeån RNAi
Taïo microarray slides
Phaân tích RNA (soá löôïng, hieäu suaát)
•Aurum Total RNA Kits
•BioOdyssey Calligrapher MiniArrayer
•Gene Pulser Xcell •siLentFect Lipid Reagent •TransFectin (vector-based)
•Experion System •SmartSpec Plus •VersaFluor
Xaùc ñònh laïi qRT-PCR
Label probes baèng Cy3 & CY5
Scan möùc ñoä bieåu hieän
Phaân tích
Lai treân microarray
• VersArray ChipReader
•GeneGazer Software •VersArray analyzer 5.0
• VersArray Hybridization Chamber
Quy Trình Thí Nghieäm RNAi : ñieän di SDS-PAGE vaø blotting
SDS-PAGE
Chuaån bò maåu protein
Ñaùnh giaù soá löôïng vaø hieäu suaát
•Protein Prep kits •Premixed Sample Buffers
Experion System SmartSpec Plus VersaFluor Fluorometer Protein Assays (Bradford, RC DC, ..)
Chuyeån RNAi
•Mini-PROTEAN 3 Cell •Ready Gel Precast Gels •Criterion Cells + Precast Gels •PROTEAN Plus and PROTEAN Cells •Protein Standards •Power supplies
Gene Pulser Xcell • siLentFect Lipid Reagent (siRNA) •TransFectin or HEKFectin (vector-based)
Blotting/Transfer
•Protein Blotting Membranes •Protein Blotting Cells •Protein Blotting Buffers
Chuïp aûnh vaø phaân tích
Ñaùnh daáu/ phaùt hieän
• Immun-Star Chemiluminescent Kits • Immun-Blot Colorimetric Assay Kits • Amplified Alkaline Phosphatase Immun-Blot Kit • Opti-4CN Substrate and Detection Kits • Colorimetric Blotting Substrates; Conjugated 2o Antibodies
• Molecular Imager FX Pro Systems • VersaDoc systems • ChemiDoc XRS system • Gel Doc XR system • Quantity One 1-D Analysis Software
Quy Trình Thí Nghieäm RNAi : ñieän di 2D
Chuaån bò maãu protein
1st dimension IEF
2nd dimension SDS-PAGE
•PROTEAN IEF Cell •ReadyStrip IPG Strips •Power Supplies
•Aurum serum protein mini kits •Aurum Affi-Gel Blue mini kits •Aurum ion exchange mini kits •ReadyPrep 2-D Starter kit •Premixed Sample Buffers
•Mini-PROTEAN 3 Cell •Ready Gel Precast Gels •Criterion Cells + Precast Gels •PROTEAN Plus and PROTEAN Cells •Protein Standards •Power Supplies
Phaân tích Protein Expression (Bio- Plex, Western blotting, etc); or qRT-PCR, Microarrays
Chuyeån RNAi
Nhuoäm gel
Gene Pulser Xcell • siLentFect Lipid Reagent (siRNA) •TransFectin or HEKFectin (vector-based)
•Silver stain •Coomassie Blue •SYPRO Ruby •Dodeca stainers
Chuïp aûnh vaø phaân tích
Xaùc ñònh caùc spot baèng Mass Spec
Caét caùc spot quan taâm
•EXQuest Spot Cutter
•Molecular Imager FX Pro systems •VersaDoc systems, PDQuest software
Quy Trình Thí Nghieäm RNAi : Bio-Plex
(qRT-PCR, Microarrays, Northern blots)
Chuaån bò maãu protein
Bio-Plex Assays
Western blotting
•Bio-Plex Cell Lysis Kit
•Bio-Plex Phosphoprotein Assays •Bio-Plex Total Target Assays
Chuyeån RNAi
• siLentFect • Transfectin • HEKFectin • Gene Pulser Xcell
