CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (9 TIẾT)
Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng
gen
Các phương pháp lai phân tử Phương pháp PCR, ứng dụng Kỹ thuật xác định trình tự DNA Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA
1 8/26/2014
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Kiến thức ôn tập
• Cấu trúc phân tử DNA
2 8/26/2014
Thành phần cấu tạo của DNA- các bazơ
Purines
Pyrimidines
3 8/26/2014
ii). Structure of the Structure of the DNA DNA double helix polynucleotide chain
5’
3’
• polynucleotide chain • 3’,5’-phosphodiester bond
4 8/26/2014
Nucleoside
[structure of deoxyadenosine]
Nucleotide
5 8/26/2014
6 8/26/2014
Học thuyết trung tâm:The Central Dogma
DNA RNA Protein Function
Replication
Translation
Work
Transcription
7 8/26/2014
Phân loại Gene
intergenic region
coding genes
non-coding genes
Chromosome (simplified)
Messenger RNA
Structural RNA
Proteins
transfer RNA
ribosomal RNA
other RNA
Structural proteins
Enzymes
8 8/26/2014
2.1 ENZYME GIỚI HẠN (RESTRICTION ENZYME - RE)
Khái niệm: là các enzyme có khả năng nhận dạng và cắt DNA ở những vị trí đặc hiệu. = – Restriction
Restriction
enzymes
endonuclease
Endo (bên trong), nuclease (cắt nucleic
acid)
– Trình tự nhận biết của RE được gọi là trình
tự giới hạn
Ví dụ: trình tự nhận biết của EcoRI
9 8/26/2014
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Lịch sử phát hiện
• 1950s: một số dòng vi khuẩn có khả năng chống lại sự
xâm nhiễm của một số bacteriophages.
• 1962: phát hiện các vi khuẩn này có chứa hệ thống enzyme có khả năng nhận biết và phá huỷ DNA của phage, đồng thời có khả năng tự biến đổi DNA của bản thân để tránh bị phá huỷ
• 1970: Haminton Smith at Johns Hopkins University, Phát hiện được enzyme HindII từ Haemophilus influenzae: có khả năng cắt đặc hiệu đồng thời tự methyl hoá DNA của tế bào chủ để tự bảo vệ.
10 8/26/2014
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Restriction Endonucleases
Why don’t bacteria destroy their own DNA with their restriction enzymes?
11 8/26/2014
Methylation
12 8/26/2014
Phân loại các RE
• Loại I: Cắt tại điểm cách vị trí giới hạn
khoảng 1000-5000 nucleotide
• Loại II: cắt ngay tại vị trí giới hạn.
• Loại III: cắt ở vị trí cách vị trí giới hạn đó
khoảng 20 nucleotide.
13 8/26/2014
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Cách gọi tên
Ví dụ: EcoRI
Genus (Tên chi)
Escherichia
Species (Tên loài)
coli
R
Strain (Chủng)
I
Thứ tự tìm ra enzyme
14 8/26/2014
BM CNSH TV – Khoa CNSH
(số La Mã)
Đặc điểm của trình tự nhận biết của RE loại II
tự nhận biết
Trình là các là đoạn DNA palindrome. Đây mạch kép, 2 mạch bổ sung có trình tự giống nhau khi đọc theo cùng chiều 5’3’ hoặc ngược lại
g n ứ x i
ố đ c ụ r T
Don't nod Dogma: I am God Never odd or even Too bad – I hid a boot Rats live on no evil star No trace; not one carton Was it Eliot's toilet I saw? Murder for a jar of red rum Some men interpret nine memos Campus Motto: Bottoms up, Mac Go deliver a dare, vile dog! Madam, in Eden I'm Adam Oozy rat in a sanitary zoo Ah, Satan sees Natasha Lisa Bonet ate no basil Do geese see God? God saw I was dog Dennis sinned
15 8/26/2014
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Tần suất cắt
Nếu giả thiết trình tự sắp xếp của các loại base là ngẫu nhiên thì xác suất để một đoạn trình tự được nhận biết sẽ là 1/4n (n là chiều dài (bp) của chuỗi được nhận biết).
Số nucleotide của đoạn nhận biết
Xác suất xảy ra sự kiện phân cắt bởi RE
4
1/ 44= 1/256
5
1/ 45= 1/ 1024
6
1/ 46= 1/ 4096
8
1/ 48= 1/ 65.536
n
1/ 4n
16 8/26/2014
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Các kiểu cắt
5’ overhangs
l
3’ overhangs
T ạ o đ ầ u s o e
blunt ends
T ạ o đ ầ u b ằ n g
17 8/26/2014
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Ví dụ một số RE loại II
18 8/26/2014
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Ứng dụng của RE loại II trong công nghệ gen
• Tạo DNA tái tổ hợp
• Lập bản đồ giới hạn
19 8/26/2014
BM CNSH TV – Khoa CNSH
Tạo DNA tái tổ hợp
• DNA tái tổ hợp là các DNA được tạo thành từ ít nhất hai đoạn DNA có nguồn gốc khác nhau thông qua vi thao tác của con người
• Nếu như 2 (hay nhiều) DNA đều được cắt bởi cùng một loại enzyme thì các đầu cắt của các đoạn DNA được tạo ra hoàn toàn khớp nhau (tương ứng theo quy tắc bổ sung) gọi là các đầu dính và chúng rất dễ dàng gắn lại với nhau khi có mặt enzym ligase. Từ đây xuất hiện khả năng ghép nối các DNA có nguồn gốc khác nhau để tạo nên DNA tái tổ hợp
BM CNSH TV – Khoa CNSH
20 8/26/2014
Bản đồ giới hạn
• Là bản đồ thể hiện loại enzyme giới hạn, số lượng và kích thước các đoạn DNA bị cắt bằng enzyme giới hạn.
• Một phân tử khi sử dụng các loại enzyme khác nhau có thể cho nhiều đoạn cắt khác nhau hình thành nên các bản đồ giới hạn khác nhau.
• Được sử dụng trong xác định nguồn gốc hoặc sự
khác nhau giữa các cá thể trong loài.
BM CNSH TV – Khoa CNSH
21 8/26/2014
Phương pháp lập bản đồ giới hạn
• Tách chiết DNA mẫu nghiên cứu và thực hiện PCR
tạo ra một lượng DNA cần thiết.
• Lựa chọn các enzym giới hạn thích hợp, xử lý enzym giới hạn các mẫu trong điều kiện thích hợp.
• Điện di kết quả trên gel agarose cùng với thang
DNA chuẩn, tính toán kết quả và lập bản đồ.
BM CNSH TV – Khoa CNSH
22 8/26/2014
VÍ DỤ VỀ LẬP BẢN ĐỒ GIỚI HẠN
Sử dụng enzym 1 để cắt đoạn ADN nghiên cứu (kích thước 17kb). Kết quả cho 3 đoạn ADN (6kb, 3kb, 8kb). Điều này chứng tỏ enzym 1 có 2 vị trí cắt trên đoạn ADN nhưng chưa rõ đoạn 3kb nằm ở giữa hay ở cuối sợi. Khi cắt sợi ADN nghiên cứu bằng enzym 2, kết quả cho 2 đoạn cắt (7kb, 10kb) chứng tỏ enzym này chỉ có một điểm cắt trên sợi 17kb. Khi cắt bằng tổ hợp hai enzym 1 và 2 cho thấy có sự xuất hiện lại đoạn 6kb và 8kb, hai đoạn này là sản phẩm của sự hoạt động của enzym 1. Như vậy đoạn 3kb sẽ bị cắt bởi enzym 2 (vỡ kết quả cắt phối hợp cho 4 đoạn (6kb, 8kb, 2kb, 1 kb). Từ đây suy ra đoạn 3kb phải nằm ở giữa sợi.
23 8/26/2014
Restriction enzyme animation http://www.dnai.org/b/index.html
24 8/26/2014
Bµi tËp
Nhân dòng một đoạn ADN có chiều dài 900 bp sau đó phân cắt với 3 enzyme, chạy điện di cho các kết quả sau đây:
Enzyme
Độ lớn các đoạn phân cắt (bp)
200, 700 300,600 50,350,500 100,200,600 50,150,200,500 50,100,250,500
25
