CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (10 TIẾT)
Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng
gen
Các phương pháp lai phân tử Phương pháp PCR, ứng dụng Kỹ thuật xác định trình tự DNA Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA
1 8/26/2014
BM CNSH TV – Khoa CNSH
CƠ SỞ KHOA HỌC
Sự bắt cặp lai (Hybridization) theo cơ chế
bổ sung (Complementarity)
Các dạng phức hợp lai bổ sung:
– DNA - DNA
Lai giữa các nucleic acid
– DNA - RNA
– Protein – Protein (thường ở dạng phức hợp
kháng nguyên – kháng thể)
2
8/26/2014
LAI GIỮA CÁC NUCLEIC ACID (DNA – DNA hoặc DNA – RNA)
Lai phân tử là quá trình kết hợp lại của hai mạch đơn DNA hoặc DNA- RNA.
Cơ sở của việc lai phân tử là các mối liên kết hydro giữa các base trên hai mạch. Giữa một base A và một base T (hoặc U) hình thành hai liên kết hydro còn giữa G và C hình thành ba liên kết.
T A
U A
Lai giữa các nucleic acid
C G
8/26/2014 3
LAI GIỮA CÁC NUCLEIC ACID (DNA – DNA hoặc DNA – RNA)
8/26/2014 4
MỘT SỐ KỸ THUẬT LAI PHÂN TỬ
• LAI SOUTHERN (DNA – DNA) • LAI NORTHERN (DNA – RNA) • LAI WESTERN (PROTEIN – PROTEIN)
8/26/2014 5
So sánh sự phân tích gene X sử dụng các kỹ thuật lai Southern, Northern và Western
8/26/2014 6
LAI SOUTHERN
• Lịch sử
– Do Edwin Southern đề xuất năm 1975 và sau đó được tiếp tục hoàn thiện.
– Với sự phát triển của kỹ thuật này, Southern đã nhận được giải thưởng Lancaster trong lĩnh vực Y học vào năm 2005.
Edwin Southern
8/26/2014 7
LAI SOUTHERN
• Nguyên lý
– Dựa trên sự bắt cặp bổ sung giữa 2 phân tử DNA mạch đơn
(DNA-DNA)
– Cho phép xác định được sự có mặt của những trình tự nucleotide trên một đoạn DNA nào đó trong một hỗn hợp các đoạn DNA khác nhau dựa trên sự bắt cặp của mẫu dò đã được đánh dấu với đoạn DNA chứa trình tự bổ sung với mẫu dò đó.
• Kỹ thuật lai Southern cho biết
– Sự có mặt của đoạn DNA (gen) – Số lượng đoạn DNA có mặt (tương ứng với số gen) – Độ lớn của đoạn DNA – Trình tự tương tự giữa đoạn DNA mục tiêu và mẫu dò
8/26/2014 8
Các bước tiến hành
Bước1: Chuẩn bị DNA mẫu.
Bước 2: Chuyển ssDNA lên màng lai
(giai đoạn này gồm nhiều bước)
Bước 3: Lai ssDNA với mẫu dò
Bước 4: Kết thúc phản ứng lai, thu kết quả lai.
8/26/2014 9
Bước 1: Chuẩn bị DNA mẫu
1
2
1 2 3
3
Marker
Đối chứng
Mẫu nghiên cứu
8/26/2014 10
Bước 2: Chuyển DNA mạch đơn lên màng lai
DNA
Giấy thấm
Gel
Membrane
Gel Membrane
Buffer
8/26/2014 11
Bước 3: Lai phân tử
Bổ sung chất “khóa” màng lai
Bổ sung mẫu dò
Màng lai sau khi rửa
Màng lai có mang các DNA mạch đơn
lai Phần màng không mang DNA được phủ bằng chất “khóa” màng lai
Mẫu dò chỉ còn có mặt ở trạng thái liên kết bổ sung với DNA
Mẫu dò được phủ trên bộ toàn màng lai nhưng chỉ liên kết với các DNA bổ sung
8/26/2014 12
Bước 4: Thu kết quả
Màng mang phân tử lai giữa mẫu dò và DNA
Phim X-quang được đặt lai trên màng cho đến khi sự phát xạ từ mẫu dò được ghi lên phim
Các đoạn bổ sung với mẫu dò xuất hiện như các vạch băng
8/26/2014 13
Bước 4: Thu kết quả
Kết quả lai hiện lên phim nhờ phóng xạ tự ghi
8/26/2014 14
8/26/2014 15
LAI NORTHERN
• Lịch sử
− Được phát triển vào năm 1977 bởi James Alwine
và George Stark tại Stanford University.
− Phát triển từ kỹ thuật lai Southern và được ứng
dụng cho phân tích RNA
8/26/2014 16
LAI NORTHERN
• Nguyên lý
– Dựa trên sự bắt cặp bổ sung giữa DNA và RNA – Phương pháp lai Northern Blot là phương pháp lai RNA của tế bào với mẫu dò DNA. Các bước tiến hành cũng tương tự như phương pháp Southern blot.
• Phương pháp này cho biết – Sự có mặt của mRNA trong mô – Mức độ thể hiện của gen – Độ lớn của mRNA – Trình tự tương đồng giữa đoạn mục tiêu và mẫu dò
8/26/2014 17
Mẫu RNA
Giấy thấm
Màng lai
Vật nặng
chứa
Khay dung dịch đệm
Giá đỡ
Tập giấy thấm
Đặt màng lai lên trên gel, đặt giấy thấm, vật nặng lên trên. RNA di chuyển lên màng lai nhờ mao dẫn
Phân tách RNA theo kích thước nhờ chạy điện di
Bổ sung mẫu dò phóng xạ mạch đơn
Túi lai
Khoảng trống
Các bước tiến hành
Bước1: chuẩn bị RNA mẫu.
(E)
Ghi nhận kết quả bằng phóng xạ tự ghi
- Chạy điện di - Chuyển RNA lên màng lai
Vị trí không lai Vị trí xảy ra lai RNA-DNA
Bước 2: Chuyển RNA lên màng lai Bước 3: Lai RNA với mẫu dò Bước 4: Kết thúc phản ứng lai, thu kết quả lai.
8/26/2014 18
LAI WESTERN
• Lịch sử
− Phương pháp này được thực hiện đầu tiên ở phòng thí nghiệm của George Stark ở Stanford. Kỹ thuật này đã được W. Neal Burnette đặt tên là Western blot (1981), nối tiếp theo tên Southern blot.
8/26/2014 19
LAI WESTERN
• Nguyên lý
– Lai Western Blot được thực hiện giữa các protein với nhau dựa trên nguyên tắc phản ứng miễn dịch giữa kháng nguyên và kháng thể
• Phương pháp này cho biết
– Sự thể hiện của gen thông qua sự có mặt của
protein trong mô
– Mức độ thể hiện của gen
– Độ lớn của protein
8/26/2014 20
Các bước tiến hành
1. Chuẩn bị mẫu protein 2. Chạy điện di SDS-PAGE 3. Chuyển protein lên màng 4. Cố định màng 5. Ủ với kháng thể và phát hiện
8/26/2014 21
Chuẩn bị mẫu
1. Chuẩn bị mẫu protein 2. Chạy điện di SDS-PAGE 3. Chuyển protein lên màng 4. Cố định màng 5. Ủ với kháng thể và phát hiện
8/26/2014 22
Chuẩn bị mẫu
Tách chiết protein Hòa tan và biến tính protein
Protein ở dạng cấu trúc 2' and 3' thường không tích điện âm xử lý với SDS (sodium dodecyl sulfate) để bọc protein với điện tích âm
8/26/2014 23
Chạy điện di SDS-PAGE
Cực âm
1. Chuẩn bị mẫu protein 2. Chạy điện di SDS-PAGE 3. Chuyển protein lên màng 4. Cố định màng 5. Ủ với kháng thể và phát hiện
Cực dương
8/26/2014 24
Chuyển protein lên màng
1. Chuẩn bị mẫu protein 2. Chạy điện di SDS-PAGE 3. Chuyển protein lên màng 4. Cố định màng 5. Ủ với kháng thể và phát hiện
Cực dương Bọt biển Giấy thấm Màng Gel
Giấy thấm Bọt biển Cực âm
8/26/2014 25
Cố định màng
1. Chuẩn bị mẫu protein 2. Chạy điện di SDS-PAGE 3. Chuyển protein lên màng 4. Cố định màng 5. Ủ với kháng thể và phát hiện
Sau khi sử dụng hệ thống chuyển protein lên màng, màng sẽ chứa các protein ở vị trí giống như vị trí của chúng ở trên gel.
Màng được ủ với các protein “khóa” (thường sử dụng BSA hoặc sữa bột) để “khóa” những khoảng trống trên màng tránh kháng thể bám vào khoảng trống của màng.
8/26/2014 26
Ủ với kháng thể và phát hiện
1. Chuẩn bị mẫu protein 2. Chạy điện di SDS-PAGE 3. Chuyển protein lên màng 4. Cố định màng 5. Ủ với kháng thể và phát hiện
8/26/2014 27
Ủ với kháng thể và phát hiện
Ủ với kháng thể 1: trong 1-2 giờ ở nhiệt độ phòng hoặc
qua đêm ở 4oC.
Kháng thể 1 gắn với kháng nguyên đặc hiệu. Các kháng thể không liên kết với kháng nguyên thì được rửa đi.
Màng được ủ với kháng thể thứ 2, kháng thể này nhận biết và chỉ bám vào kháng thể 1. Kháng thể này liên kết với một phân tử cho phép chúng ta phát hiện được vị trí liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên – kháng thể trên màng.
Ủ với kháng thể 2: trong 1-3 giờ ở nhiệt độ phòng.
8/26/2014 28
Một số phương pháp phát hiện khác
• Phát hiện nhờ tạo màu • Phát hiện nhờ quang hóa học • Phát hiện nhờ phóng xạ • Phát hiện nhờ phát huỳnh quang
8/26/2014 29
Ủ với kháng thể và phát hiện
Cơ chất VD: Hydrogen peroxide + luminol
HRP
3-aminophtalate (nhạy với ánh sáng)
Kháng thể 2
Kháng thể 1
Kháng nguyên nằm trên màng
Sự phát hiện nhờ phát quang hóa học
8/26/2014 30
Tóm tắt quy trình thực hiện Western blot
bị
Chuẩn mẫu protein
Chạy điện di SDS-PAGE phân tách các phân tử protein theo kích thước
protein
Bổ sung cơ chất (hoặc không cần), phát hiện vị trí lai giữa kháng nguyên – kháng thể
Chuyển lên màng lai
Màng lai được xử lý với kháng thể thứ 2 mang phân tử giúp nhận biết sự liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể. Kháng thể này liên kết với kháng thể 1.
lai mang các Màng phân tử protein có vị trí giống như trên bản gel
Màng lai được xử lý với kháng thể 1, kháng thể này bám đặc hiệu vào kháng nguyên (protein) mục tiêu
Xử lý BSA hoặc sữa bột để “khóa” chỗ trống trên màng lai
8/26/2014 31
So sánh 3 phương pháp lai
Gel
Phân tử Phát hiện
agarose
DNA
nucleic acid
agarose
RNA
nucleic acid
Kỹ thuật Southern Northern Western
polyacrylamide Protein
Kháng thể
8/26/2014 32
