Chương II. Các kỹ thuật nền của CNSH hiện đại
Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen Phương pháp PCR Các phương pháp lai phân tử (lai Southern, Northern, Western) Kỹ thuật xác định trình tự DNA Các kỹ thuật xác đinh tính đa hình DNA (dựa trên PCR, dựa trên
RELP)
Kỹ thuật tạo thư viện hệ gen và cDNA
Kỹ thuật lai phân tử
Cơ sở khoa học
Sự bắt cặp lai (Hybridization) theo cơ chế
bổ sung (Complementarity)
Các dạng phức hợp lai bổ sung
1) DNA-DNA.
2) DNA-RNA.
3) Protein-Protein (thường ở dạng phức hợp kháng nguyên-kháng thể )
Lai DNA-DNA hoặc DNA-RNA
Lai phân tử là quá trình kết hợp lại của hai mạch đơn DNA. Cơ sở của việc lai phân tử là các mối liên kết hydro giữa các base trên hai mạch. Giữa một base A và một base T hình thành hai liên kết hydro còn giữa G và C hình thành ba liên kết.
DNA có thể biến tính hoặc tái hồi khi đun nóng hoặc làm lạnh
Để tiến hành phản ứng lai phân tử trước hết DNA mạch kép phải được biến tính. Đó là một quá trình trong đó các liên kết hydro của mạch DNA kép ban đầu bị phá vỡ giải phóng hai mạch đơn với toàn bộ các base sẵn sàng tiếp nhận các liên kết hydro mới.
Một số trường hợp xảy ra khi lai ADN
42 C is more stringent condition that 35 C
(hybridization is more specific)
http://amiga1.med.miami.edu/Medical/PDF-Files/Lecture10.pdf
Lai Southern
Lµ kü thuËt dïng ®Ó nhËn d¹ng mét ®o¹n DNA ®Æc thï
dùa trªn trình tù thÓ hiÖn cña nã sau khi ®iÖn di trªn gel agarose.
Ph ¬ng ph¸p nµy ® îc ph¸t triÓn bëi Edwin Southern
(1975) nªn ® îc gäi lµ ph ¬ng ph¸p “Southern Blot”.
Kỹ thuật Southern Blot cho biết
Sự có mặt của đoạn ADN (gen)
Số lượng đoạn ADN có mặt (tương ứng với số gen)
Độ lớn của đoạn ADN
Trình tự tương tự giữ đoạn ADN mục tiêu và mẫu dò
.
Edwin Southern University of Oxford
Nguyên tắc
Southern Blot dùa trªn khả năng giữ l¹i c¸c ®o¹n ADN ®· qua xö lý enzyme giíi h¹n, trªn mét mµng máng ®Æc biÖt (Hybond - N).
Mµng máng nµy sau ®ã ® îc ng©m trong dung dÞch chøa mẫu dò ®· cho ë d¹ng cã ®¸nh dÊu 32P. NÕu cã mÆt gen ®· cho trong ADN trªn mµng máng thì c¸c ®o¹n ADN cña cïng gen sÏ sung b¾t (complementation) vµ nhËn biÕt qua phãng x¹ tù ghi.
theo (lai) cÆp chÕ bæ c¬
C¸c b íc tiến hành
1. ChuÈn bÞ mÉu:
ChiÕt t¸ch ADN nghiªn cøu, c¾t ADN nghiªn cøu b»ng enzym giíi h¹n, kÕt quả cho mét hçn hîp c¸c ®o¹n c¾t cã kÝch th íc kh¸c nhau.
TiÕn hµnh ®iÖn di hçn hîp sản phÈm c¾t trªn gel ®Ó
t¸ch c¸c ®o¹n DNA
Lµm biÕn tÝnh (t¹o thµnh c¸c sîi ®¬n) c¸c băng ADN trªn gel ®iÖn di b»ng c¸ch xö lý gel với nhiệt độ cao hoặc ®iÖn di 20 phót trong dung dÞch NaOH 0,5M hoÆc NaCl1,5 M
C¸c b íc tiến hành (tiếp)
2. ThÊm truyÒn (blotting): ĐÆt gel lªn hÖ thèng gi¸ chuyÓn (m¸y Blotting) ®Ó chuyÓn nguyªn vÑn c¸c ADN ®· biÕn tÝnh trªn gel (mµng nitrocellulose, mµng nylon (giữ chÆt c¸c ®o¹n ADN ® îc chuyÓn lªn tõ gel ®iÖn di). PhÝa trªn ®Ó mét líp giÊy thÊm. Trªn cïng ®Æt mét vËt nÆng
Qu¸ trình thÊm truyÒn thùc hiÖn víi dung dÞch
lªn mµng lai
dÉn chuyÓn lµ NaOH 0,5M trong 8-12h.
C¸c b íc tiến hành (tiếp)
3. Lai ph©n tö C¸c ®o¹n ADN cè ®Þnh trªn mµng lai ® îc ®em lai víi dung dÞch mÉu dß ®· ® îc ®¸nh dÊu hoÆc b»ng p32 hoÆc mét chÊt g©y phản øng mµu. Qu¸ trình ® îc thùc hiÖn ë buång lai (nhiÖt ®é 65- 680 C) trong thêi gian 3- 12 giê.
Röa mµng lai ë 650 C b»ng dung dÞch SSC (NaCl 3M, natri citrat 0,3 M vµ n íc, pH=7.0) ®Ó lo¹i bá c¸c mÉu dß kh«ng tham gia phản øng lai.
C¸c b íc tiến hành (tiếp)
(autoradiogragh).
Mµng lai sau khi ® îc lµm kh«, lÊy mét tÊm phim nh¹y X quang ®Æt lªn mµng lai vµ ®Ó trong mét thiÕt bÞ chuyªn dông. Xö lý ¸nh s¸ng tö ngo¹i, N¬i xảy ra phản øng lai sÏ mang ho¹t tÝnh phãng x¹ (do cã mÆt mÉu dß), VÞ trÝ xảy ra phản øng lai sÏ ph¸t x¹ vµo phim. Tr¸ng phim sÏ thu ® îc c¸c vÕt ®en t¹i n¬i ph¸t x¹ ®Þa ®iÓm lai.
4. X¸c ®Þnh kÕt qña b»ng kü thuËt phãng x¹ tù ghi
Southern Blot Technique
Southern Blot Technique
MOVIE_Southern Blot
Ph ¬ng ph¸p Northern Blot
Ph ¬ng ph¸p lai Northern Blot lµ ph ¬ng ph¸p lai ARN cña tÕ bµo víi mÉu dß ADN. VÒ mÆt nguyªn lý vµ c¸c b íc tiÕn hµnh còng t ¬ng tù nh ph ¬ng ph¸p trªn.
Phương pháp này cho biết Sự có mặt của mARN trong mô Mức độ thể hiện của gen Độ lớn của mRNA Trình tự tương đồng giữa đoạn mục tiêu và mẫu dò
Northern blot
Western blot
Lai Western Blot ® îc thùc hiÖn giữa c¸c
Phương pháp này cho biết:
Sự thể hiện của gen thông qua sự có mặt của
protein trong mô
Mức độ thể hiện của gen Độ lớn của protein
protein víi nhau dùa trªn nguyªn t¾c phản øng miÔn dÞch giữa kh¸ng nguyªn vµ kh¸ng thÓ
Các bước tiến hành - Western Blot
Protein ở dạng cấu trúc 2' and 3' thường không tích điện âm xử lý với SDS (sodium dodecyl sulfate) để bọc protein với điện tích âm
Mixture of protein
molecules
So sánh 3 phương pháp lai
Blot Type
Matrix
Molecule Detection
northern
agarose
RNA
nucleic acid
Southern agarose DNA nucleic acid
western polyacrylamide Protein antibody
