Bài giảng Các kỹ thuật nghiên cứu và phân tích Protein

Các kỹ thuật Trong nghiên cứu & phân tích Protein

Tổng Quan về Proteomics

Trong bài này proteome được xác định là các thành phần protein bổ sung chuyên biệt về mặt thời gian và tế bào của một hệ gen (genome).

Nó bao gồm tòan bộ các protein được biểu hiện trong tế bào theo thời gian bao gồm cả khía cạnh hình thái và các thay đổi sau quá trình dịch mã từ mRNA.

Bộ gene của một sinh vật thường ổn định theo thời gian và thường đại diện cho tất cả các tế bào trong SV vật đó và thường khá ổn định trong lòai. Ngược lại, hệ Protein của một sinh vật thường có sự thay đổi khá lớn theo thời gian và đáp ứng rất nhanh với các nhân tố từ bên ngòai và đặc biệt là rất khác nhau giữa các nhóm tế bào.

Tổng Quan về Proteomics

Proteomics là quá trình nghiên cứu tòan bộ các protein hay các hệ protein có từ một mô hay một dòng tế bào nào đó.

Ngày nay người ta phân chia proteomics thành classical proteomics và functional proteomics.

Classical proteomics tập trung nghiên cứu tòan bộ protein hòan chỉnh thường là từ hai dòng tế bào được xử lý khác nhau; functional proteomics nghiên cứu protein ở mức độ giới hạn hơn.

Ba câu hỏi chính cho một quá trình nghiên cứu proteomic: 1) Protein nào hiện diện? 2) Có protein đặc biệt nào tương tác với các protein khác hay với tòan hệ protein (networks)? 3) Protein đặc biệt đó như thế nào (structure)?

Tổng Quan về Proteomics

Thuật ngữ Proteomics bao gồm một khỏang rất rộng các nguyên lý mà mục đích hướng đến việc hiểu rõ và nghiên cứu, giám sát được các protein.

Việc này gồm các công việc liên quan giữa trình tự di truyền với cấu trúc không gian 3 chiều của protein và cấu trúc không gian ba chiều với chức năng của protein, phát triển các phương pháp phân tách protein và các kỹ thuật nhằm hồ sơ hóa các protein và nghiên cứu mối tương tác giữa protein- protein.

Proteomics hứa hẹn nhiều khám phá các tác nhân mới trong nghiên cứu phát triển dược liệu thông qua việc xác định các chức năng của hàng ngàn protein chưa xác định mà người ta mong đợi sẽ phát hiện trong bộ gene người.

Proteomics cũng sẽ cung cấp các dữ liệu thực nghiệm giúp cho việc cải tiến các chương trình phần mềm để tiên đóan cấu trúc protein từ các trình tự DNA, giúp chúng ta nghiên cứu để giải thích các thông tin có trong bộ gene.

Phải Chăng hệ gene cung cấp cho ta những điều diệu kỳ???

Chỉ có khoảng 30,000 genes trong cấu trúc bộ gene người , nhưng có hơn 100,000 proteins được giải mã từ gene trong hệ proteome người.

Genomics đã cung cấp cho cũng ta một lượng thông tin rất lớn nhưng hầu hết đều để lại cho chúng ta khá nhiều điều chưa giải thích được với mức độ nghiên cứu hiện tại. Hay nói cách khác, genomics vẫn còn để lại cho ta nhiều câu hỏi hơn là câu trả lời.

Các lãnh vực mới và đột phá của Proteomics hứa hẹn giải đáp các câu hỏi đó thông qua việc nghiên cứu một cách có hệ thống các protein đựơc dịch mã từ hệ gene.

Phải Chăng hệ gene cung cấp cho ta những điều diệu kỳ???

The central dogma:

parents

mRNA

proteins

DNA (genes)

Proteomics

Nghiên cứu tòan bộ protein đựơc biểu hiện bởi genomes

Systematic, parallel protein analysis

Commercial Relevance of Proteomics

“The Proteome” ~750,000 Proteins

Diagnostics

Markers disease relevant proteins

Targets 8-10K proteins

Therapeutics + Drugs

One Genome Different Proteomes

Life is based on proteins and their interactions

Proteomics – Các hứơng nghiên cứu

• Protein nào? Khi nào? ở đâu và đối tượng nào?

1. Thành phần protein: Xác định các thành phần trong phức hợp đại phân tử, tổ chức, tế bào hay cơ quan

2. Protein profiling: So sánh sự thay đổi về mặt số lượng các protein giữa 2 hay nhiều đối tượng.

3. Vị trí hay chất tiết nội bào – phân lập các thành phần tế bào bằng cách sử dụng Ab hay fusion protein.

4. Tương tác protein: xác dịnh các mối tương tác giữa

các protein

Các yếu tố chủ yếu đưa đến việc nghiên cứu Protein

1. Nghiên cứu (gần) hòan tất bộ gen 2. Công cụ mới trong nghiên cứu khối phổ 3. Sinh tin học – Phần mềm, phần cứng 4. Các cải tiến trong kỹ thuật tách chiết protein 5. Tự động hóa 6. Các tiến bộ trong kỹ thuật Ab array

Các phương pháp nghiên cứu Proteomics

Kỹ thuật điện di hai chiều (2DE) là một kỹ thuật tối ưu nhất trong số các kỹ thuật truyền thống cho phép phân tách hàng ngàn protein trong cùng một gel.

Kỹ thuật xác định protein bằng khối phổ (mass spectrometry) đã trở nên là một kỹ thuật tiến bộ trong phân tích protein và là một công cụ chính yếu trong nghiên cứu Proteomics.

Protein microarrays cho phép nghiên cứu theo thời điểm một lượng lớn các protein theo các tương tác phân tử. Nhiều thí nghiệm microarray thường được thực hiện cùng với khối phổ.

Các phương pháp khác: X-ray crystallography, NMR, Edman degradation, etc.

2D-electrophoresis

Proteins được phân tách ở phương pháp này theo điểm đẳng điện và trọng lượng phân tử của chúng.

Trong phương pháp này, bước đầu tiên rất quan trọng là bước chuẩn bị mẫu; các protein trong tế bào hay mô cần nghiên cứu phải được đưa về dạng tan, đồng thời DNA và các tạp chất khác phải được lọai bỏ. Sau đó các protein được phân tách theo điện tích bằng isoelectric focusing.

Bước này thường được thực hiện bằng cách điện di trên các strip làm sẵn đã được cố định theo gradient pH.

Điện di theo chiều thứ hai đơn giản chỉ là điện di SDS-PAGE thông thường, với mẫu điện di là cácc strip đã điện di theo chiều thứ nhất.

Sau khi điện di chiều thứ 2, protein có thể được phát hiện với các thuốc nhuộm thông thường như Coomassie hay nhuộm bạc.

2D-electrophoresis

Các công cụ và kỹ thuật trong nghiên cứu Protein

• Chuẩn bị mẫu

• Điện di 2 chiều

• Nhuộm/ Blot

• Phân tích hình ảnh

• Tách / digestion

• Phân tích khối phổ

• Bioinformatics

The Proteomics Toolbox

Kỹ thuật 2-D đựơc sử dụng rộng rãi nhất trong nghiên cứu protein hiện nay. Kỹ thuật cho phép:

– Có thể xem và so sánh hàng ngàn protein

– Có khả năng phân tách các dạng protein khác nhau xảy ra

trong khi có sự thay đổi sau dịch mã.

– Cho phép so sánh sự khác biệt giúp nghiên cứu các sự thay đổi trong biểu hiện protein trong hệ phức hợp sinh học.

– Là hệ thống đơn giản dễ sử dụng cho hầu hết các PTN

nghiên cứu về Proteomics.

2-D PAGE

Phân tích phân biệt (Differential Analysis)

A

B

Proteins from cultured human cells

A = Derivative of B

Protein samples courtesy of Dr. Steven Seeholzer, Fox Chase Cancer Center

Ứng dụng của Proteomics

• Chỉ thị trong chẩn đóan/ khối u • Khám phá các mục tiêu trong điều chế thuốc. • Disease / protein pathways • Vaccine antigens / sinh học của quá trình lây nhiễm • Plant drought tolerance / Kháng bệnh • Toxicology • Gene expression profiling • Human Proteome Organization

Diagnostic Tumor Markers

Data from Francois Le Naour, INSERM U 268, France; Proteomics 2001, 1, 1295-1302

Hướng tiếp cận trong Discovery Proteomics

Automated

Biology of High-Abundance Proteins

Reference Map Primary Screen

Low-Abundance Proteins Low-Abundance Proteins Secondary Screen Secondary Screen

Tertiary Screen Tertiary Screen Refractory Proteins Refractory Proteins

Proteomics Separation Tools

1. Sample Prep

3. SDS-PAGE

2. Isoelectric Focusing

4. Protein Detection and Image Acquisition

First Dimension IEF

PROTEAN IEF Cell – Streamlined handling

• 12 channel focusing trays • Thực hiện đựơc trên lượng mẫu lớn • Thân thiện, dễ sử dụng

– Thực hiện trên 7,11,17,18,& 24 cm

ReadyStrips

• 12 Channel ‘lock and load’ system – Easiest cup loading system

– 10,000 volts and Peltier cooling – Cup Loading

available

ReadyStrip IPG Strip pH Ranges 4

9 10

Non-linear

3.9-5.1

4.7-5.9

5.5-6.7

6.3-8.3

Broad Range Separations

Công cụ để phân tách tòan bộ một mẫu trên 1 gel

pH 3-10

– Complete linear view

pH 3-10

pH 3-10NL

– Cải thiện trong phân tách vùng

pH 4-8

pH 3-10NL

More Data with Narrow Range IEF

Effective

pH 3 - 10

pH 3-10

IPG Strip Length

pH Overlapping Range Gel Area

24 cm 17 cm 11 cm 7 cm

3-10 3-10 3-10 3-10

56 cm 40 cm 26 cm 16 cm

pH 3 - 6

pH 5 - 8

pH 7 - 10

pH 7-10

pH 3- 6

pH 5- 8

Effect of Contaminants on Gel Results

ReadyPrep 2-D Cleanup Kit

Untreated Treated

E.coli cell lysates spiked with 1% SDS

Cup Loading Improves Resolution

In-Gel Re-Hydration

pH 7 ------------------------------------------------------------ pH 10

Basic ReadyStrip IPGs

Cup Loading pH 7 ------------------------------------------------------------ pH 10

– pH 7 - 10 – pH 6.8 - 8.3

Acidic ReadyStrip IPG

– pH 3 - 6

ReadyPrep Reduction Alkylation Kit

Untreated (DTT)

Reduction and alykylation of samples prior to focusing improves 2-D results

Mouse liver extract - 11 cm strips IPG strips, pH 7-10 cup loaded

Treated

Mini-PROTEAN™ 3 Dodeca™ Cell

“2-D in a day”

High-throughput 12 gel

capacity

Rapid results with 35 minute

run times

High resolution separations

with gel to gel reproducibility

Simplified assembly and space

saving design

A Complete Large-Format Family

Optimizing Staining Efficiency

(cid:153) Staining Tray

(cid:153) Shaking Rack

(cid:153) Solution Box

(cid:153) Lid with Motor

Ideal shaking motion for optimal staining efficiency (patent pending)

Large Gel Handling Accessory

Gel Clip

(cid:190) Improved Gel Manipulation

(cid:190) Helps Eliminate Gel Breakage!

Mass Spec Compatible Stains

• Bio-Safe™ Coomassie™ colloidal 250

stain

• Silver Stain Plus™ stain

• SYPRO® Ruby protein gel stain

SYPRO® Ruby Protein Gel Stain

λex = 300 nm, 470 nm

(532 nm)

λem = 618 nm

Sensitivity: comparable to silver staining (1–10 ng)

Linear to three orders of magnitude

Convenient

Compatible with mass spectrometry

100 µg E. coli protein

Imaging Systems

GS-800™ Calibrated Densitometer Reflectance and Transmittance Modes 30 x 40 cm scanning area

VersaDoc Imaging System CCD–Based UV / Visible, Fluorescence & Chemiluminescence

Molecular Imager® FX Pro Plus™ Multiimager System Fluorescence and Storage Phosphor Imaging 488 nm, 532 nm and 635 nm laser excitation sources

Integrated Data Management

Spot Cutting

Differential Analysis

Protein Digestion

PDQuest Image

Mass Spec PMF / MS-MS

PDQuest Image Auto-annotation Global Database Search / Protein ID

Sample Prep in Proteomics

Homogeneous cell population

Protein Enrichment

Solubilization

Electrophoresis

Chromatography

Narrow and micro range

Sequential Extraction Kits

IPG strips

Fractionation based on physical characteristics

Removal of

Membrane Extraction kits

Rotofor IEF cell

housekeeping proteins

New detergents / reagents

Model 491 Prep cell

Enrichment based on protein function

Methods for protein identification

Mass Spectrometry (MS)

• over 100 years old (1899)

-Thomson J.J. ‘On the Masses of the Ions in Gases at Low Pressure’ Philosophical Magazine 48:295, p. 547-567

• by 1953, all of the instrumentation on which modern mass spectrometers are based had been invented

• MALDI (1985) Koichi Tanaka • ESI (1989) John Fenn

• 2002 Nobel Prize for Chemistry

Mass Spectrometry (MS)

• Introduce sample to the instrument • Generate ions in the gas phase • Separate ions on the basis of differences in

m/zwith a mass analyzer

• Detect ions

Mass Spectrometry (MS)

• m/z : mass-to-charge ratio

Mass = 1059.25 Da VALEACVQAR

VALEACVQAR

H+ Mass = 1060.25 Da m/z = 1060.25 / 1 = 1060.25

H+ VALEACVQAR

H+

Mass = 1061.25 Da m/z = 1061.25 / 2 = 530.63

Mass Spectrometry (MS)

Ionisation Methods: Matrix Assisted Laser Desorption

Ionisation (MALDI)

Mass Spectrometry (MS)

Ionisation Methods: Matrix Assisted Laser Desorption

Ionisation (MALDI)

Mass Spectrometry (MS)

Detector type: Time of Flight (TOF)

SELDI – Kỷ Thuật Protein Chip & Ứng Dụng

SELDI là gì? Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization

• Định nghĩa: Là phương pháp hấp phụ/ ion hóa các hợp chất không bay hơi mà trong đó mẫu trên bề mặt có hoạt tính trong việc ly trích, thay đổi cấu trúc, làm giàu mẫu và/hoặc ion hóa mẫu cần phân tích (So sánh với MALDI mẫu được thực hiện trong các probe thụ động)

• Thực tế: Đây chính là một kỷ thuật mới kết hợp hai kỷ thuật sắc ký và khối phổ với nhiều ứng dụng trong phân tích nhanh và trên nhiều đối tượng mẫu dùng trong protein profiling, phát triển phương pháp và giám sát quy trình.

ProteinChip® Arrays – Chemically Derivatized Surfaces

Coupling Chemistry (PS10, RS100 [Carbonyldiimidazole, amine],

Chromatography (Hydrophobic [C16], HIC [C9+phenyl], CM [carboxylate], Q [quaternary ammonium], IMAC [nitrilotriacetic acid], Normal [silica

PS20 [Epoxy, amine or thiol])

oxide], SEND)

N

O

Hydrophobic Barrier

NH

Functionalized Hydrogel or Latex

Aluminium Base

ProteinChip® Array Technology

Chemical Surfaces – Protein Expression Profiling:

Hydrophobic

Metal Ion

Normal Phase

Anionic

Cationic

Biological Surfaces – Protein Interaction Assays:

PS-10 or PS-20

Antibody - Antigen

Receptor - Ligand

DNA - Protein

Ứng dụng

Protein Profiling

•Target discovery and validation •Disease monitoring (drug efficacy studies) •Toxicology •Clinical Diagnostics •Pharmacokinetics

Molecular Recognition

•Immunoassay development and screening •Receptor-ligand assays •Protein-protein interactions •DNA-protein interactions

Protein Purification and Characterization

•Purification development and monitoring •Peptide Mapping •Sequencing •PT modification analysis (phosphorylation, glycosylation) •Epitope Mapping

Sample Preparation - Protein Isoelectric Point (pI)

•

pI = pH at which the protein has no

net charge (equal number of + and –

charges)

If pH > pI (more basic) there is a net

•

- charge

+

•

If pH < pI (more acidic) there is a net

-

O

+ charge O O

H C C

N H

R

CH2

C

O-

O

+

CH2 CH2 CH2 CH2 NH3

Lysine, pKa

Aspartic acid, pKa

pH 7

10.8

3.9

The SELDI-TOF Process

Embedded Proteins

Matrix Crystals

Chip Surface

ProteinChip® Array Preparation

1. Apply Sample

Proteins within the sample bind to chemical or biological “docking sites” on the ProteinChip surface through an affinity interaction.

2. Wash ProteinChip Array

Proteins that bind non- specifically or buffer contaminants are washed away, eliminating sample “noise”.

3. Add Energy Absorbing Molecules

After sample processing the chip is dried and EAM is applied to each spot to facilitate desorption and ionization in the TOF-MS.

Time-Of-Flight Fundamentals

Field Free Region

Ion Source

Detector

Time

Các Ion rời khỏi nguồn được tăng cường đến một mức năng lựơng như nhau. Các ion có khối lượng khác nhau sẽ có vận tốc khác nhau và do đó sẽ đi đến detector tại các thời điểm khác nhau.

ProteinChip® Technology: Detection by TOF Mass Spectrometry

(cid:131) Các proteins bị giữ lại được giải phóng khỏi ProteinChip® Array nhờ Laser

Desorption/Ionization

(cid:131) Các protein bị ion hóa đựơc phát hiện và khối lượng của chúng được xác

đinh chính xác bởi khối phổ theo thời gian (Time-of-Flight Mass Spectrometry).

(cid:131) Phần mềm ProteinChip ghi nhận biểu đồ của protein cho thấy khối lựơng

Trace View

chính xác của chúng và mật độ ion tương đối của chúng.

N-Laser

Map View

r r o o t t c c e e t t e e D D

TOF-MS

Gel View

Interpretation of Mass Spectra

• M/z: the mass-to-charge ratio

MWanalyte + Σ(MWcs) M/z =

Σ Charge

cs = charging species

Flowchart of data analysis

25000

50000

75000

25000

50000

75000

100

15 10

Preprocess Baseline subtract Normalize Calibrate Removal of Outliers

50 25

5 0

25000

50000

75000

25000

50000

75000

Univariate analysis CiphergenExpress™ Cluster Analysis, Detect peaks, Calculate P-values, ROC/AUC

Multivariate analysis (with appropriate sample number) CiphergenExpress Hierarchical Clustering, PCA; Biomarker Patterns Software

Cluster: A group of peaks of similar mass that are treated as the same substance across multiple spectra

C1Day28116

C o n C1Day28117 t r o

C1Day28118

T2Day282011 T r e a t T2Day282013 e d

T2Day282015

20 15 10 5 0 20 15 10 5 0 20 15 10 5 0 20 15 10 5 0 20 15 10 5 0 20 15 10 5 0

Comparison of Control and Treated samples reveals a number of clear biomarkers Comparison of Control and Treated samples reveals a number of clear biomarkers

Example of CV Analysis:

Fraction 5; CM10; LLE = 17.82%

0.2

0.1

50000

100000

150000

0 20

0.2

0.1

Ref 1

A u

0 20

0.2

Ref 2

A u

0.1

0 20

0.2

Ref 3

A u

0.1

0 20

Ref 4

A u

0.2

0.1

Ref 5

A u

0 20

0.2

0.1

Ref 6

A u

0 20

0.2

0.1

Ref 7

A u

0 20

0.2

0.1

Ref 8

A u

80000

90000

100000

110000

5000

7500

10000

12500

15000

50000

100000

150000

Range = 10-20%

ProteinChip® technology Three dimensions of separation

Wide range of sample types can be accommodated by SELDI

Animal models

Clinical samples

(cid:132) Tissue lysates

(cid:132) Serum or plasma

(cid:132) Liver

(cid:132) Urine

In-vitro studies • Cell lysates • Cell culture

(cid:132) Brain

(cid:132) CSF

media

(cid:132) Urine

(cid:132) Pleural effusions

(cid:132) Serum or plasma

(cid:132) Laser capture

microdissected cells

(cid:132) Laser capture

microdissected cells

• Laser capture microdissecte d cells

(cid:132) Lavage

• Tissue lysates

(cid:132) Aspirates

Protein Profiling: Crude liver extracts from treated animals profiled on Reversed- Phase, Strong Anionic, or Weak Cationic Exchange Surfaces

5 0 0 0

7 5 0 0

1 0 0 0 0

1 2 5 0 0

H50

Reversed-Phase (water wash)

Q10

Strong Anionic Exchanger

(pH 8.5 wash)

CM10

Weak Cationic Exchanger

(pH 4.5 wash)

5 0 0 0

7 5 0 0

1 0 0 0 0

1 2 5 0 0

Subsets of proteins bind with different affinities

Differential Protein Expression - Example

upregulated

2 0 0 0 0

2 2 5 0 0

2 5 0 0 0

2 7 5 0 0

3 0 0 0 0

2 0 2 8 9 .4 + H

20000

22500

25000

27500

30000

2 6 1 8 1 .8 + H

1 .5

2 0 8 3 5 .3 + H

S 3 U H E ( 2 )

0 .5

S3U HE(2)

2 0 2 9 5 .5 + H

2 6 1 8 4 .7 + H

1 .5

S 3 U H E ( 4 )

2 0 8 4 4 .2 + H

S3U HE(4)

0 .5

2 0 8 9 7 .5 + H

1 .5

2 0 3 0 4 .0 + H

S3T HE

S 3 T H E

0 .5

2 6 2 1 0 .7 + H

treated

S3T HE(2)

2 0 9 0 5 .6 + H

1 .5

2 0 3 1 0 .2 + H

S 3 T H E (2 )

0 .5

2 6 2 1 2 .2 + H

20000

22500

25000

27500

30000

2 0 0 0 0

2 2 5 0 0

2 5 0 0 0

2 7 5 0 0

3 0 0 0 0

downregulated

untreated

Differential Expression Profiling ProteinChip Technology: Differential Expression Profiling

(cid:135) Because of the ability of the ProteinChip arrays to effectively de-convolute complex protein profiles, different sample types can now be compared directly to reveal differential protein expression patterns.

Disease/Treatment

Peak A Criteria

Differential Protein Expression Patterns

Peak B Criteria

Peak C Criteria

Cancer

Normal

Cancer

Normal

Protein Profiling: Multidimensional Separation

∆ Salt

CM10 Array (condition 1)

CM Array

∆ pH

CM10 Array (condition 2)

0 40 30 20 10 0

CM10 Array (condition 3)

2000

4000

6000

8000

10000

Molecular Mass (M/z)

∆ Salt

IMAC30 Array (condition 1)

∆

IMAC30 Array (condition 2)

IMAC Array

Imidazole

IMAC30 Array (condition 3)

2000

4000

6000

8000

10000

Molecular Mass (M/z)

Biomarker Discovery via SELDI

20.0

5000

7500

10000

12500

15000

15.0

Control

10.0

100 75 50 25 0

5.0

Control

Treated

Groups

100 75 50 25 0

20.0

Control

15.0

100 75 50 25 0

10.0

Treated

5.0

Control

100 75 50 25 0

Control

Treated

Control

Groups

Treated

Control

100 75 50 25 0

Treated

100 75 50 25 0

Treated

5000

7500

10000

12500

15000

Under specific bind/wash conditions, look for statistically significant up and down regulation of protein signals

11000

11500

12000

12500

13000

Biomarker Discovery Process

Study Design

Profile Q10, CM10, IMAC30, H50, RS100

Fractionate (optional) Anion Exchange or Equalization

Discovery 1

Multivari ate Model Derivatio n

Candidate Markers

Cross Comparison

Discovery 2

Multivariate Models

Stag e I/II Beni (20) gn Contr (50) ol (30) Stag e I/II Stag (35) e Beni III/IV gn Contr (2) (90) ol (49) Stag e I/II Stag (35) e Beni III/IV gn (103) (26)

Independent Validation

Contr ol 63

Protein ID

ROC cur ve, are a= 0. 94 327 , std = 0 .09 49 73 , a lph a= 2. 79 1, be ta= 0.4 71 54

0. 9

0. 8

0. 7

0. 6

y t i v i t i

0. 5

s n e S

0. 4

0. 3

Independent Validation by Immunoassay

0. 2

0. 1

0 0

0.1

0 .2

0 .3

0. 4

0. 6

0 .7

0. 8

0 .9

0 .5 1 - Spe cific ity

Ca (41) Other Ca 1 Other (20) Ca 2 Other (20) Ca 3 Contr (20) ol (41)

Custom SELDI Assay

Characterize and Identify Peptide Mass Fingerprinting, MS/MS

Univariate, Multivariate analysis to Prioritize Biomarkers CiphergenExpress Heirarchical Clustering, PCA; BPS, DA

Collect and Preprocess Baseline subtract, Normalize Calibrate

2 0

1 0

1 0 0 0 0

2 0 0 0 0

3 0 0 0 0

Positioning to 1D/2D PAGE

ProteinChip Technology Exploring Unmined Regions of the Proteome and complements 2-D

ProteinChip Arrays

1D/2D SDS-PAGE

High resolution between the mass ranges 20kDa to 150kDa Methodologies developed for further analysis via Mass Spectrometry

Improved discovery of proteins MW < 25 kDa Irrespective of protein pI and hydrophobicity Rapid throughput Micro-volume capability Easy to use and automate

No currently available technique is capable of mapping the entire proteome ProteinChip SEIDI and 1-D/2-d PAGE are Complementary Techniques

SELDI ProteinChip® Technology Exploring Unmined Regions of the Proteome and complements 2-D

kDa

•

200 About 50% of the proteome in serum is comprised of molecules less than 45 kDa in size.

175

•

150 SELDI’s “sweet spot” is the detection of proteins that are less than 45 kDa in size, at a very wide pI range.

•

125 2D Gel electrophoresis is not optimized for profiling proteins of this range, but best used for separation of large proteins.

100

75

2D Gel

50 45 kDa

SELDI

25 *

4

6

8

10

12

α-defensins: 3.5 kDa and 8.7 pl

SELDI ProteinChip® Technology Exploring Unmined Regions of the Proteome and complements 2-D

kDa

200

175

Gel Electrophoresis

150

125

100

SELDI

75

1D, 2D Gel

50

Mass Spec (ESI)

MS, LC/MS

SELDI

25

1

10

100 1000

Throughput (samples/day)

Bài giảng Các kỹ thuật nghiên cứu và phân tích Protein

Nội dung bài giảng giới thiệu tổng quan về Proteomics, các hướng nghiên cứu Proteomics, các yếu tố chủ yếu đưa vào việc nghiên cứu Proteomics, các phương pháp nghiên cứu Proteomics,... Hy vọng đây là tài liệu tham khảo hữu ích cho các bạn.

Các kỹ thuật Trong nghiên cứu & phân tích Protein

Tổng Quan về Proteomics

Proteomics là quá trình nghiên cứu tòan bộ các protein hay các hệ protein có từ một mô hay một dòng tế bào nào đó.

Ngày nay người ta phân chia proteomics thành classical proteomics và functional proteomics.

Classical proteomics tập trung nghiên cứu tòan bộ protein hòan chỉnh thường là từ hai dòng tế bào được xử lý khác nhau; functional proteomics nghiên cứu protein ở mức độ giới hạn hơn.

Ba câu hỏi chính cho một quá trình nghiên cứu proteomic: 1) Protein nào hiện diện? 2) Có protein đặc biệt nào tương tác với các protein khác hay với tòan hệ protein (networks)? 3) Protein đặc biệt đó như thế nào (structure)?

Thuật ngữ Proteomics bao gồm một khỏang rất rộng các nguyên lý mà mục đích hướng đến việc hiểu rõ và nghiên cứu, giám sát được các protein.

Proteomics hứa hẹn nhiều khám phá các tác nhân mới trong nghiên cứu phát triển dược liệu thông qua việc xác định các chức năng của hàng ngàn protein chưa xác định mà người ta mong đợi sẽ phát hiện trong bộ gene người.

Proteomics cũng sẽ cung cấp các dữ liệu thực nghiệm giúp cho việc cải tiến các chương trình phần mềm để tiên đóan cấu trúc protein từ các trình tự DNA, giúp chúng ta nghiên cứu để giải thích các thông tin có trong bộ gene.

Phải Chăng hệ gene cung cấp cho ta những điều diệu kỳ???

Phải Chăng hệ gene cung cấp cho ta những điều diệu kỳ???

parents

mRNA

proteins

DNA (genes)

Proteomics

Nghiên cứu tòan bộ protein đựơc biểu hiện bởi genomes

Systematic, parallel protein analysis

Commercial Relevance of Proteomics

“The Proteome” ~750,000 Proteins

Diagnostics

Markers disease relevant proteins

Targets 8-10K proteins

Therapeutics + Drugs

Life is based on proteins and their interactions

Proteomics – Các hứơng nghiên cứu

1. Thành phần protein: Xác định các thành phần trong phức hợp đại phân tử, tổ chức, tế bào hay cơ quan

2. Protein profiling: So sánh sự thay đổi về mặt số lượng các protein giữa 2 hay nhiều đối tượng.

3. Vị trí hay chất tiết nội bào – phân lập các thành phần tế bào bằng cách sử dụng Ab hay fusion protein.

4. Tương tác protein: xác dịnh các mối tương tác giữa

các protein

Các yếu tố chủ yếu đưa đến việc nghiên cứu Protein

1. Nghiên cứu (gần) hòan tất bộ gen 2. Công cụ mới trong nghiên cứu khối phổ 3. Sinh tin học – Phần mềm, phần cứng 4. Các cải tiến trong kỹ thuật tách chiết protein 5. Tự động hóa 6. Các tiến bộ trong kỹ thuật Ab array

Các phương pháp nghiên cứu Proteomics

Kỹ thuật điện di hai chiều (2DE) là một kỹ thuật tối ưu nhất trong số các kỹ thuật truyền thống cho phép phân tách hàng ngàn protein trong cùng một gel.

Kỹ thuật xác định protein bằng khối phổ (mass spectrometry) đã trở nên là một kỹ thuật tiến bộ trong phân tích protein và là một công cụ chính yếu trong nghiên cứu Proteomics.

Protein microarrays cho phép nghiên cứu theo thời điểm một lượng lớn các protein theo các tương tác phân tử. Nhiều thí nghiệm microarray thường được thực hiện cùng với khối phổ.

Các phương pháp khác: X-ray crystallography, NMR, Edman degradation, etc.

2D-electrophoresis

Proteins được phân tách ở phương pháp này theo điểm đẳng điện và trọng lượng phân tử của chúng.

Bước này thường được thực hiện bằng cách điện di trên các strip làm sẵn đã được cố định theo gradient pH.

Điện di theo chiều thứ hai đơn giản chỉ là điện di SDS-PAGE thông thường, với mẫu điện di là cácc strip đã điện di theo chiều thứ nhất.

Sau khi điện di chiều thứ 2, protein có thể được phát hiện với các thuốc nhuộm thông thường như Coomassie hay nhuộm bạc.

2D-electrophoresis

Các công cụ và kỹ thuật trong nghiên cứu Protein

The Proteomics Toolbox

2-D PAGE

Phân tích phân biệt (Differential Analysis)

A

B

Ứng dụng của Proteomics

Diagnostic Tumor Markers

Data from Francois Le Naour, INSERM U 268, France; Proteomics 2001, 1, 1295-1302

Hướng tiếp cận trong Discovery Proteomics

Proteomics Separation Tools

1. Sample Prep

3. SDS-PAGE

2. Isoelectric Focusing

4. Protein Detection and Image Acquisition

PROTEAN IEF Cell – Streamlined handling

available

ReadyStrip IPG Strip pH Ranges 4

Non-linear

3.9-5.1

4.7-5.9

5.5-6.7

6.3-8.3

Broad Range Separations

Công cụ để phân tách tòan bộ một mẫu trên 1 gel

pH 3-10

pH 3-10NL

More Data with Narrow Range IEF

Effective

pH 3-10

IPG Strip Length

pH Overlapping Range Gel Area

24 cm 17 cm 11 cm 7 cm

3-10 3-10 3-10 3-10