NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT: KĨ THUẬT VÀ ỨNG DỤNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TPHCM KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC VIỆN TẾ BÀO GỐC
BẢO QUẢN ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO
CRYOPRESERVATION
TPHCM 03/2018
Lê Thị Ngân Hà ltnha@hcmus.edu.vn
…"I want to live and live longer and I think that in the future they may find a cure for my cancer and wake me up," the 14-year-old wrote to a British judge before her recent death.
She said "being cryopreserved gives me a chance to be cured and woken up — even in hundreds of years' time.”…
o Tái lưu thông máu
o Thuốc hỗ trợ bảo vệ tế bào
o Thay máu và dịch lỏng trong cơ thể bằng chất chống đông
o Giảm nhiệt với
tốc độ 0,5/giờ đến nhiệt độ nito lỏng
o Bảo quản trong các tủ
đông hình trụ.
Lịch sử
now
1987 Tạm dừng các bảo quản trứng.
Phát triển các nghiên cứu về đông lạnh tinh trùng người.
1970s 1959 Lovelock, Bishop: DMSO – red blood cell 1953
Sherman: đông lạnh tinh trùng người – rã đông Polge: glycerol – tinh trùng gà 1949
Mantagazza: ngân hàng tinh trùng cho tinh trùng người đông lạnh 1866
1776 Spallanzani: tinh trùng người vẫn di chuyển khi gặp nhiệt độ thấp
Bảo quản đông lạnh là gì?
Bảo quản: là quy trình sinh học nhằm đảm bảo (cid:141)nh ổn định về mặt di truyền và cấu trúc nguyên vẹn củ a các tế bào sống; đảm bảo các thành phần như nucleic acid và protein của tế bào không thay đổi.
Bảo quản lạnh là việc sử dụng nhiệt độ rất thấp để bảo vệ tế bào và mô sống còn nguyên vẹn trong một thời gian dài
Vì sao phải bảo quản đông lạnh tế bào?
Ngân hàng tế bào Thuận lợi bảo tồn gen
Tiết kiệm thời gian nguyên vật liệu
Giảm rủi ro nhiễm
Ngăn cản sự biệt hoá / lão hoá
Thuận lợi phân loại, tạo dòng
Thuận lợi vận chuyển
Dòng tế bào quý hiếm
Đáp ứng của tế bào với các stress khi đông lạnh
Tác nhân stress Phản ứng của tế bào
Giảm nhiệt độ
Biến đổi lớp màng lipid, khử polymer hoá bộ xương tế bào
Tăng nồng độ các chất hoà tan Giảm áp suất thẩm thấu
Tăng nồng độ ion
Phản ứng trực tiếp trên màng bào gồm tính tan của màng protein
Khử nước Mất ổn định lớp đôi phospholipid
Kết tủa muối Không rõ
Hình thành bọt khí
Tổn thương cơ học lên màng và bộ xương tế bào
Thay đổi pH Biến tính protein
Tế bào bị chèn xếp khít lại Tổn thương màng
Tính nhớt của môi trường tăng
Quá trình khuếch tán/thẩm thấu bị hạn chế
NGUYÊN TẮC
Giảm thiểu sự hình thành tinh thể băng trong tế bào
(1) Đông lạnh “chậm” (2) Sử dụng chất bảo quản đông lạnh (3) rữ các tế bào ở mức nhiệt độ thấp nhất có thể để giảm thiểu tác động của nồng
độ muối cao lên sự biến đổi protein trong TB.
(4) tan băng nhanh chóng để giảm thiểu sự phát triển của tinh thể băng (tái kết tinh)
Nhiệt độ
CPA
Quy trình
Tốc độ làm lạnh
Yếu tố ảnh hưởng đến TB
Tae Hoon Jang, Cryopreservation and its clinical applications, 2017
CHẤT BẢO QUẢN ĐÔNG LẠNH – CRYOPROTECTANTS AGENT CPA
Là các loại hoá chất tan được trong nước, có khả năng xâm nhập vào bên trong tế bào, được sử dụng với mục đích giúp tế bào ngăn ngừa các tổn thương tế bào do đông lạnh. Nguyên tắc: (1) Thay thế nước trong tế bào à giảm hình thành tinh thể đá nội bào à
giảm tổn thương do tinh thể đá gây ra.
(2) Hạn chế tăng nồng độ các chất hoà tan nội bào (3) Kết lên màng bào tương à bảo vệ tế bào. Hoạt động: “khử nước” trong quá trình đông lạnh, “bù nước” trong quá trình giải đông VD: DMSO, glycerol, glycols, một vài amino acid (proline), …
Non-permeating
Permeating
Sucrose, dextran
Ảnh hưởng của CPA lên Tế bào
Nồng độ?
QUY TRÌNH BẢO QUẢN ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO
CHUẨN BỊ TẾ BÀO
BỔ SUNG CHẤT BẢO QUẢN
LÀM LẠNH
LƯU TRỮ
GIẢI ĐÔNG - PHỤC HỒI
NUÔI TĂNG SINH
CHUẨN BỊ
Thiết bị
Kính hiển vi đảo ngược • Tủ thao tác an toàn sinh h ọc cấp II • Máy ly tâm • Tủ ủ nuôi tế bào (370C, 5% CO2) • Tủ mát 2-80C • Tủ âm 00C đến -200C • Bình chứa nito lỏng Bể ổn nhiệt
Dụng cụ – hoá chất Dụng cụ nuôI cấy tế bào phù hợp Trypsin/EDTA 0,25% PBS không Ca2+ và Mg 2+ (PBS-) Môi trường đông lạnh tế bào Ống bảo quản đông lạnh (cryovial) 1,5-2 ml Ống ly tâm 15ml hoặc 50 ml vô trùng Môi trường giải đông
CHUẨN BỊ
CHUẨN BỊ TẾ BÀO
ü Tình trạng tế bào: pha log
ü Số lượng tế bào?
ü Nhiễm?
ü Xác định tỷ lệ tế bào sống chết
ü Dán nhãn cryotube
BỔ SUNG CHẤT BẢO QUẢN
Thành phần môi trường đông lạnh tế bào: ✓ môi trường cơ bản: RPMI, DMEM/F12, IMDM… ✓ huyết thanh thai bò (FBS): 40-50% ✓ CPA: dimethylsulphoxide (DMSO): 5-10%
LÀM LẠNH
Đông lạnh chậm
Đông lạnh cực nhanh
Đông lạnh insitu
Chuyển TB trực tiếp vào -196
Đông lạnh nhanh 3 bước 4 -20 -80 -196
Đông lạnh khi tế bào vẫn giữ trạng thái tăng sinh lúc nuôi cấy
Đông lạnh theo chương trình, giảm nhiệt theo set up trên máy.
LƯU TRỮ
Bất kỳ một gián đoạn nào trong thời gian trữ đông đều ảnh hưởng đến khả năng sống của Tb sau giải đông.
Thời gian lưu trữ:
Nhiệt độ lưu trữ: Nhiệt độ Thời gian
4 độ Vài giờ
-20 độ Vài ngày
-80 độ Vài tháng
-196 độ Vài thế kỷ
GIẢI ĐÔNG - PHỤC HỒI
Thao tác?
NUÔI TĂNG SINH
MTGĐ: môi trường cơ bản (RPMI, DMEM/F12, IMDM...) bổ sung 20- 30% huyết thanh thai bò (FBS), 1% kháng sinh-kháng nấm
Kiểm tra sống/chết
Thu cặn TB + MTGĐ Ly tâm 5p Tốc độ thấp
Chết TB
Giảm nhiệt
↓p/u sinh hoá Tăng nhiệt Loại CPA
Tốc độ làm lạnh CPA
Cryopreservation Thawing
