5/11/20 ngocvu@sci.edu.vn
•
Khi "khách hàng" đã chết về mặt pháp y, nhân viên Alcor chuyển họ lên giường lạnh và dùng thiết bị hồi sức tim phổi làm cho máu lưu thông khắp cơ thể một lần nữa. Sau đó, họ sử dụng 16 loại thuốc khác nhau để giúp cho tế bào không bị hư tổn sau khi chết trước khi rút hết máu và dịch cơ thể rồi bơm chất lỏng bảo vệ nội tạng vào thay thế.
Dịch vụ làm đông lạnh cơ thể người chết để chờ hồi sinh
Cuối cùng, các nhân viên tiến hành làm lạnh thi thể 0,5 độ C mỗi giờ cho đến khi đạt tới nhiệt độ của nitơ lỏng -160 độ C sau 2 tuần. Tiếp đó, họ cho các thi thể vào tủ đông lạnh hình trụ trong tư thế đầu lộn xuống.
5/11/20 ngocvu@sci.edu.vn
https://www.youtube.com/watch?v=YhPQhU5a7fE
Cryonics
5/11/20 ngocvu@sci.edu.vn
Bảo quản đông lạnh đã tồn tại trong tự nhiên từ rất lâu
•
Bọ cánh cứng Alaskan
•
•
Sản xuất chất chống đông sugary carbohydrate có tên xylomannan (polymer đường của xylose và mannose sugars). chịu được nhiệt -100 0C
5/11/20 ngocvu@sci.edu.vn
1949 Polge, Parks và Smith
1950 Smith
GLYCEROL
Sperm
Human red blood cells
1959 Lovelock and Bishop
Dimethyl sulfoxide- DMSO
5/11/20
TĂNG CƯỜNG TÍNH THẤM ngocvu@sci.edu.vn
là quy trình sinh học nhằm đảm bảo tính ổn định về mặt di truyền và cấu trúc nguyên vẹn của các tế bào sống; đảm bảo các thành phần như nucleic acid và protein của tế bào không thay đổi.
Quá trình ổn định vật liệu sinh học ở nhiệt đô cực thấp được gọi là bảo quản đông lạnh.
5/11/20 ngocvu@sci.edu.vn
Tất cả nước trong hệ thống bị chuyển đổi thành đá THÌ hoạt động biến dưỡng ngưng
Hoạt động biến dưỡng tế bào ngưng lại là một điều kiện tiên quyết trong quy trình bảo quản tế bào
Sử dụng chất bảo quản đông lạnh
Nguyên tắc bảo quản đông lạnh tế bào là làm cho tế bào mất đi một lượng nước nhất định nhằm hạn chế tình trạng đóng băng trong quá trình làm lạnh.
5/11/20 ngocvu@sci.edu.vn
Áp lực chọn lọc khiến dòng tế bào bất ổn về đặc tính
Sự giới hạn về khả năng tăng sinh của tế bào
Sự bất ổn trong kiểu gen và kiểu hình
Sự tương đồng trong thí nghiệm
Tiết kiệm thời gian và vật liệu
Sự nhiễm chéo, nhiễm khuẩn trong nuôi cấy
5/11/20
ngocvu@sci.edu.vn
5/11/20 ngocvu@sci.edu.vn
Nhiệt độ
Tốc độ làm lạnh
Chất bảo quản
Quy trình đông lạnh- rã đông
YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỐNG- CHẾT CỦA TẾ BÀO
5/11/20 ngocvu@sci.edu.vn
Môi trường đông lạnh-chất bảo quản
ØMôi trường cơ bản: DMEM, IMDM, RPMI, …. ØHuyết thanh ØKháng sinh ØChất bảo quản
(CPA): glycerol, DMSO
VD: DMEM/F12; 20-40%FBS, 5-10% DMSO, 1% Antibiotic-antimycotic
5/11/20 ngocvu@sci.edu.vn
Chất bảo quản đông lạnh (CPA)
là chất được dùng để bảo vệ mô/tế bào khỏi các tổn thương do đông lạnh (tổn thương do tạo đá ).
Các chất có thể thâm nhập dễ dàng vào tế bào và thường không độc hại cho tế bào.
• glycerol và DMSO được sử dụng rộng rãi • giảm nồng độ các chất điện giải trong suốt quá trình đóng băng • giảm mức độ co tế bào do thẩm thấu ở nhiệt độ thấp
5/11/20 ngocvu@sci.edu.vn
Các chất tan không thấm qua màng: đường và các hợp chất có phân tử lượng cao như polyvinylpyrrolidone, hydroxyethyl starch, polyethylen glycol và dextrans.
chất bảo quản không thấm có thể góp phần tăng cường sự thuỷ tinh hoá dung dịch, ổn định protein và màng, ngăn chặn sự tiến triển trong hình thành tinh thể đá
5/11/20 ngocvu@sci.edu.vn
4oC ——> 2 giờ
-40oC ——> Một vài ngày
-80oC ——> Một vài tháng
-196oC à một vài thế kỷ
Nhiệt độ thấp có khả năng "làm chậm thời gian" hoặc thậm chí dừng lại thời gian” sinh học.
5/11/20 ngocvu@sci.edu.vn
Nhiệt độ bảo quản lạnh
-50C, cả tế bào và môi trường quanh nó chưa bị đóng băng.
-50C đến -150C, đá ngoại bào hình thành. Tế bào ở trạng thái “siêu lạnh” (supercool)
Ở thấp hơn -1200C, phản ứng hoá học không thể xảy ra đối với cơ thể sống.
Ở -1960C, phản ứng liên quan đến nhiệt không thể xảy ra vì năng lượng nhiệt không đủ, do đó, tế báo có thể được lưu trữ ở nhiệt độ này trong nhiều thế kỷ.
5/11/20 ngocvu@sci.edu.vn
Tốc độ làm lạnh Chuẩn hoá thời gian hạ nhiệt
5/11/20 ngocvu@sci.edu.vn
Bảo quản đông lạnh
Đông lạnh
Bổ sung CPA
Kiểm soát tốc độ Vận chuyển của nước
Kie+m soát 2 tiêu chí
Kết quả đông lạnh tốt nhất
Cách tiếp cận hiệu quả
để tối ưu hoá bảo quản đông lanh
2 tiêu chí: (1) sự tạo tinh thể đá và (2)thay đổi thể tích tế bào
5/11/20 ngocvu@sci.edu.vn
You hurt me.
Optimal
Quy trình đông lạnh quá chậm
Tế bào sẽ mất nhiều nước
Thể tích tế bào trở nên quá nhỏ
Tế bào sẽ bị tổn thương nghiêm trọng
5/11/20 ngocvu@sci.edu.vn
Optimal
Why it’s me?
Nếu đông lạnh quá nhanh, tế bào mất rất ít nước
nước được giữ trong tế bào trở thành tinh thể đá,
thể tích tế bào có thể không đổi, thậm chí lớn hơn
Tế bào chịu tổn thương nghiêm trọng do sự tạo đá nội bào
5/11/20 ngocvu@sci.edu.vn
I am Lucky.
Op)mal
Thời gian đông lạnh phù hợp, tế bào giữ được điều kiện tốt nhất cho sự sống sót
5/11/20 ngocvu@sci.edu.vn
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/9/93/Cryopreservation.jpg http://www.scq.ubc.ca/a-cold-greeting-an-introduction-to-cryobiology/ 5/11/20 ngocvu@sci.edu.vn
Tốc độ làm lạnh có ảnh hưởng lớn đến sự hình thành đá nội bào
Đông lạnh nhanh
Đông lạnh chậm
5/11/20 ngocvu@sci.edu.vn
Nuôi cấy/chuẩn bị tế bào
Bổ sung chất bảo quản
Làm lạnh
Lưu trữ
Rã đông phục hồi tế bào
Nuôi tăng sinh
5/11/20 ngocvu@sci.edu.vn
Kính hiển vi đảo ngược
Tủ thao tác an toàn sinh học cấp II
Máy ly tâm
Tủ ủ nuôi tế bào (370C, 5% CO2)
Tủ mát 2-80C
Tủ âm 00C đến -200C
Bình chứa nitơ lỏng
5/11/20 ngocvu@sci.edu.vn
• Tế bào được nuôi cấy trong Flask hoặc dụng cụ nuôi phù hợp • Trypsin/EDTA 0,25% • PBS không Ca2+ và Mg 2+ (PBS-) • Môi trường đông lạnh tế bào: bao gồm môi trường cơ bản
(RPMI, DMEM/F12, IMDM…) bổ sung 40-50% huyết thanh thai bò (FBS), 5-10% dimethylsulphoxide (DMSO)
• ống bảo quản đông lạnh (cryovial) 1,5-2 ml • Ống ly tâm 15ml hoặc 50 ml vô trùng
5/11/20 ngocvu@sci.edu.vn
Chuẩn bị tế bào trước đông lạnh
Kiểm tra dòng tế bào về sự ổn định và nhiễm.
Tế bào được nuôi lại để đảm bảo ở pha log của tăng trưởng.
Dán nhãn cryotubes với tên dòng tế bào, số lượng tế bào/lọ, ngày
Xác định tỉ lệ tế bào sống chết
5/11/20 ngocvu@sci.edu.vn
Đông lạnh tế bào
Thu tế bào đơn
Bổ sung từ từ (nhỏ giọt) môi trường đông lạnh chứa chất bảo
quản đông lạnh (DMSO nồng độ 5-10%) vào ống chứa tế bào sao cho mật độ tế bào từ 106 đến 107 tế bào/vial
Làm lạnh tế bào theo quy trình phù hợp
Lưu giữ tế bào ở nhiệt độ -80 đến -1960C
5/11/20 ngocvu@sci.edu.vn
Các bướ c cơ bả n cho bả o quả n đông lạ nh mô/te. bào
Thu nhận và chọn lọc nguồn
Chất bảo quản đông lạnh (CPA) --là chất được dùng để bảo
Thêm chất bảo quản đông lạnh
quản mô/tế bào khỏi các tổn
(CPAs)
thương do đông lạnh
Đông lạnh mẫu, thường từ -80
(tổn thương do tạo đá ).
hoặc -120oC
VD: glycerol, DMSO……
liquid nitrogen (-196oC),
và bảo quản trong thời gian dài
http://www.agr.kuleuven.ac.be/dtp/tro/cost871/Home.htm http://blog.bioethics.net/cryopreservation.jpg 5/11/20 ngocvu@sci.edu.vn
LÀM LẠNH CỰC NHANH
LÀM LẠNH CHẬM (3 BƯỚC)
LÀM LẠNH THEO CHƯƠNG TRÌNH
Chuyển nhanh tế bào vào ni tơ lỏng
chuyển tế bào vào tủ mát 4-80C trong 30 phút
Đặt tế bào vào hệ thống làm lạnh theo chương trình
chuyển vào tủ đông -200C trong 120 phút
cài đặt hệ thống làm lạnh với thông số nhiệt độ và thời gian làm lạnh tương ứng
Chuyển sang -800C, để qua đêm
chuyển vào bình ni tơ lỏng
Chuyển vào bình ni tơ lỏng ngocvu@sci.edu.vn
5/11/20
• Ở tốc độ làm lạnh cực nhanh và độ nhớt cao, tế bào không
hình thành tinh thể đá nội bào và ngoại bào.
• việc kiểm soát độ nhớt mong muốn cần phải được khảo
sát và chuẩn hoá.
• phương pháp đã thành công cho tế bào tinh trùng, trứng,
phôi và tế bào gốc phôi.
5/11/20 ngocvu@sci.edu.vn
• Nhiệt độ khởi động: 40C hoặc RT • Tốc độ hạ nhiệt: làm lạnh -10C mỗi phút và hạ nhiệt đến • nhiệt độ đạt dưới -1000C, có thể đặt trực tiếp vào ni tơ
lỏng
• cọng rạ hoặc các lọ chứa được làm lạnh bằng nitrogen • Các loại tế bào khác nhau có thể đòi hỏi tốc độ làm mát
khác nhau
5/11/20 ngocvu@sci.edu.vn
Rã đông tế bào
Các tế bào cần được làm tan nhanh chóng và sau đó pha loãng từ từ vào môi trường tăng trưởng.
Chuyển một ống tế bào 1ml vào ống ly tâm 15 ml. Thêm từ từ (nhỏ giọt) 10ml môi trương ấm.
DMSO có thể gây độc cho tế bào à nên thay môi trường nhanh.
Có thể thay DMSO bằng glycerol
5/11/20 ngocvu@sci.edu.vn
Các bước cần thiết để rã đông mô/tế bào và chuẩn bị cho sử dụng lâm sàng
Lấy mẫu đông lạnh khỏi bình chứa nito lỏng
Làm ấm tế bào đông lạnh trong bể ổn nhiệt
Loại bỏ CPA khỏi mẫu đông lạnh
Ứng dụng lâm sàng
37oC Water Bath
5/11/20 ngocvu@sci.edu.vn
làm tan nhanh tinh thể đá có thể cứu được nhiều tế bào vì có thể ngăn chặn được sự tăng trưởng của tinh thể đá nhỏ thành tinh thể đá lơn hơn (tái kết tinh) trong tế bào (-5 đến -15 độ).
1 số nghiên cứu cho thấy làm ấm chậm có hiệu quả tối ưu cho các mẫu đông lạnh lậm
5/11/20 ngocvu@sci.edu.vn
tế bào nhạy cảm với việc phình ra hơn so với việc co nên việc loại bỏ chất bảo quản có thể gây hư hại tế bào nhiều hơn so với việc bổ sung (ASTT)
trong quá trình rã đông, môi trường chứa chất bảo quản thường được pha loãng trước khi loại bỏ hoàn toàn khỏi tế bào
5/11/20 ngocvu@sci.edu.vn
tế bào bám dính, việc thao tác rã đông đơn giản hơn với việc loại bỏ môi trường đông lạnh khỏi lớp đơn tế bào và bổ sung môi trường nuôi tế bào mới.
huyền phù tế bào, ly tâm để tách tế bào khỏi môi trường có chất bảo quản đông lạnh
5/11/20 ngocvu@sci.edu.vn
Bể ổn nhiệt Tủ thao tác an toàn sinh học cấp II
• • • Máy ly tâm •
Tủ ủ nuôi tế bào (370C, 5% CO2)
5/11/20 ngocvu@sci.edu.vn
• Ống chứa tế bào đông lạnh • Môi trường rã đông: bao gồm môi trường cơ bản (RPMI, DMEM/F12, IMDM…) bổ sung 20- 30% huyết thanh thai bò (FBS), 1% kháng sinh- kháng nấm
• Ống ly tâm 15ml hoặc 50 ml vô trùng •
Flask nuôi tế bào
5/11/20 ngocvu@sci.edu.vn
Tế bào từ các bình bảo quản đông lạnh (ở nhiệt thập cực thấp) nên được chuyển ngay sang bể ổn nhiệt (370C) để tránh tối đa sự tái kết tinh tinh thể đá
Các thao tác trên tế bào nên được thực hiện nhẹ nhàng để tránh gây tổn thương cho tế bào.
Sau khi rã đông 1 ngày, tỷ lệ tế bào chết chiếm một số lượng đáng kể, nên thay môi trường mới để loai bỏ tế bào chết.
5/11/20 ngocvu@sci.edu.vn
Ủ ấm môi trường nuôi tế bào ở 370C và chuyển vào tủ thao tác vô trùng
Lấy ống tế bào từ bình ni tơ lỏng, chuyển ngay vào bể ổ nhiệt ở 370C, ủ đến khi dung dịch tan băng trên 70% (tránh cho nước dính vào nắp cryovial, có thể gây nhiễm khuẩn)
Nhẹ nhàng hút chuyển tế bào sang ống ly tâm 15 ml
Nhẹ nhàng bổ sung thêm môi trường rã đông với tốc độ 6-10 ml môi trường rã đông trong 2 phút, trộn nhẹ
Ly tâm ở tốc độ 1.500-3.000 vòng/phút trong 5 phút để loại bỏ môi trường có chứa DMSO, thu tế bào
Tái huyền phù tế bào trong môi trường rã đông hoặc môi trường chuyên biệt
Phần tế bào còn lại trong ống ly tâm có thể sử dụng để kiểm tra tỷ lệ sống chết của tế bào
Chuyển huyền phù tế bào vào Flask nuôi và tiến hành nuôi trong tủ nuôi tế bào ở điều kiện phù hợp ngocvu@sci.edu.vn
5/11/20
5/11/20 ngocvu@sci.edu.vn
5/11/20 ngocvu@sci.edu.vn
