"Bài giảng Sản xuất kháng thể đơn dòng mAb" trình bày về định nghĩa kháng thể đơn dòng mAb, 8 bước tạo mAb, gây đáp ứng MD, xác định hiệu giá kháng thể, môi trường chọn lọc HAT...
AMBIENT/
Chủ đề:
Nội dung Text: Bài giảng Sản xuất kháng thể đơn dòng mAb
- SẢN XUẤT #
KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG#
mAb#
- Định nghĩa#
Là kháng thể kháng một kháng
nguyên nào đó được tạo ra từ một
dòng tế bào lymphocyte B trong
điều kiện in vitro !
Là kháng thể với một đặc hiệu
duy nhất cho một vị trí epitope
duy nhất của kháng nguyên
(Milstein)#
- George Kohler và César Milstein #
Nobel Y-Sinh học 1984#
:
- Kháng thể đa dòng# Kháng thể đơn dòng#
Tương tác KN-KT# Tương tác KN-KT
không chuyên biệt# chuyên biệt #
Dễ sản xuất# Đòi hỏi kỹ thuật cao#
Giới hạn về số lượng# Không giới hạn về số lượng #
- Kháng thể đơn dòng#
1# 4#
epitope#
2# 3#
Huyết thanh#
Kháng thể đa dòng#
Kháng thể đơn dòng#
- 8 bước tạo mAb#
• Chọn động vật gây nhiễm, chọn Ag#
• Gây đáp ứng miễn dịch#
• Thu TB lách và TB myeloma#
• Dung hợp TB lách với TB myeloma#
• Sàng lọc, dòng hóa hybridoma#
• Nhân sinh khối mAb bằng phương pháp #
in vitro hay in vivo#
• Tinh chế mAb#
• Thu nhận, kiểm tra mAb#
- (1a) Chọn động vật gây nhiễm#
• Động vật thường được sử dụng để tạo
hybridoma: mouse (chuột nhắt), Sprague Dawley
rat (chuột lớn), Armenian hamster, thỏ…#
• Mouse là mô hình lý tưởng nhất:#
đáp ứng miễn dịch mạnh#
tổng hợp kháng thể nhanh#
#
• 2 dòng mouse lý tưởng trong công nghệ sản
xuất mAb: BALB/c và C57BL/6#
- BALB/c C57BL/6#
Lai tạo 1913 tại Mỹ# Lai tạo1921 tại Mỹ#
# • Lai cùng dòng# #
• Chuột cái#
• 6-8 tuần tuổi#
• “sạch tuyệt đối”#
- Rat Hamster #
- Hệ thống chuồng chuột sạch#
- (1b) Chọn Ag#
• Quyết định sự thành công của quy trình#
• Quyết định hiệu quả ứng dụng của sản
phẩm tạo thành #
• Quyết định quy trình sản xuất sản phẩm
(mAb gắn đặc hiệu với Ag tiêm vào)#
- Antigen#
• Được nhận diện bởi mAb mục tiêu#
#
• Có tính gây đáp ứng miễn dịch (antigenic) mạnh#
#
• Có cấu trúc càng giống với Ag tự nhiên càng tốt#
Hiện nay, Ag thường được tạo ra bằng kỹ thuật
protein tái tổ hợp.#
#
• Có thể là vi khuẩn gây bệnh, virus gây bệnh, các
hapten phối hợp với protein, vaccine thương
phẩm hay là một phân tử protein nào đó#
#
#
#
- Các vị trí tiêm Ag#
Intravenous (i.v.): into a vein (tiêm vào tĩnh mạch)#
Intradermal (i.d.): into the skin (tiêm vào da)#
Subcutaneous (s.c.): beneath the skin (tiêm dưới da)#
Intramuscular (i.m.): into a muscle (tiêm vào cơ)#
Intraperitoneal (i.p.): into the peritoneal cavity (tiêm vào khoang bụng)#
- (2) Gây đáp ứng MD#
Nguyên tắc 1#
Phải gây ĐƯMD khác loài#
Sử dụng động vật gây nhiễm là
mousethì phải dùng kháng nguyên có
nguồn gốc từ rat hay hamster để gây
đáp ứng miễn dịch#
- (2) Gây đáp ứng MD#
Nguyên tắc 2#
Dòng tế bào myeloma phải có nguồn gốc từ cùng
một loài với đối tượng gây ĐƯMD để đảm bảo khả
năng dung hợp của nó với tế bào lách#
- Tế bào lách được thu nhận từ mouse thì nên
chọn dòng myeloma mouse như SP2/0 hay
X63/Ag.8653#
- Tế bào lách được thu nhận từ rat thì nên chọn
dòng myeloma rat như Y3/Ag1.2.3#
- (2) Gây đáp ứng MD#
Nguyên tắc 3#
Phải có chất bổ trợ (adjuvant) đi kèm#
• CFA (Complete Freud’s Adjuvant): nước, nhũ tương
dầu, xác vi khuẩn Mycobactericum#
# #
• IFA (incomplete Fleud’s adjuvant): nước, nhũ tương
dầu#
• ALUM (Aluminum hydroxide gel)#
- Với kháng nguyên là protein#
Tiêm 10-100µg/1 chuột/1 lần#
Tá dược thường được sử dụng là CFA#
Với kháng nguyên là tế bào#
Tiêm 0,5 - 5 x107 tb/1 chuột/ 1 lần #
Tá dược thường được sử dụng là ALUM #
- Quy trình gây ĐƯMD ở mouse#
Ngày# Thao tác# Tá dược# Vị trí tiêm #
0# Tiêm mũi cơ bản# CFA# s.c.#
14# Tiêm nhắc lại lần 1# IFA# s.c.#
28# Tiêm nhắc lại lần 2# IFA# s.c.#
36# Thu serum#
42# Nghỉ trước khi dung hợp # IFA# s.c.#
(hay tiêm nhắc lần 3)#
52# Tiêm nhắc lại lần cuối# i.v.#
55# Thu tế bào lách sau khi đã xác
định hiệu giá của Ig trong huyết
thanh#
- Quy trình gây ĐƯMD ở rat#
Ngày# THAO TÁC# Chất bổ trợ# Vị trí tiêm#
0# Tiêm mũi cơ bản# CFA# i.p.#
21# Tiêm nhắc lần 1 # IFA# i.p.#
42# Tiêm nhắc lần 2 # IFA# i.p.#
52# Kiểm tra serum#
53# ELISA#
63# Tiêm nhắc lần 3# IFA# i.p.#
73# Kiểm tra serum#
74# ELISA#
84# Tiêm nhắc lần 4# IFA# i.p.#
94# Kiểm tra serum#
95# ELISA#
98# Tiêm nhắc lần cuối# i.v.#
101-110# Thu lách#
- Xác định hiệu giá kháng thể #
(1)# Pha loãng huyết thanh
theo từng bậc#
Undiluted
Huyết thanh
serum
ban đầu#
1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 Negative
Chứng âm#
control
#
(2)# Bổ sung một lượng nhất
định KN vào mỗi tube#
Huyết thanh
Undiluted
ban
serumđầu# 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 Negative
Chứng âm#
(3)# Ủ - xác định độ pha control
#
loãng cao nhất vẫn cho
phản ứng (trong trường
hợp này là 1/16)#
Thêm vào BST
Báo xấu
Download
Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ
