SẢN XUẤT #
KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG#
mAb#
Định nghĩa#
Là kháng thể kháng một kháng nguyên nào đó được tạo ra từ một dòng tế bào lymphocyte B trong điều kiện in vitro !
Là kháng thể với một đặc hiệu duy nhất cho một vị trí epitope duy nhất của kháng nguyên (Milstein)#
George Kohler và César Milstein # Nobel Y-Sinh học 1984#
:
Kháng thể đa dòng#
Kháng thể đơn dòng#
Tương tác KN-KT# không chuyên biệt#
Tương tác KN-KT chuyên biệt #
Dễ sản xuất#
Đòi hỏi kỹ thuật cao#
Giới hạn về số lượng#
Không giới hạn về số lượng #
Kháng thể đơn dòng#
1#
4#
epitope#
2#
3#
Huyết thanh#
Kháng thể đa dòng#
Kháng thể đơn dòng#
8 bước tạo mAb#
• Chọn động vật gây nhiễm, chọn Ag# • Gây đáp ứng miễn dịch# • Thu TB lách và TB myeloma# • Dung hợp TB lách với TB myeloma# • Sàng lọc, dòng hóa hybridoma# • Nhân sinh khối mAb bằng phương pháp # in vitro hay in vivo# • Tinh chế mAb# • Thu nhận, kiểm tra mAb#
(1a) Chọn động vật gây nhiễm#
• Động vật thường được sử dụng để tạo
hybridoma: mouse (chuột nhắt), Sprague Dawley rat (chuột lớn), Armenian hamster, thỏ…#
• Mouse là mô hình lý tưởng nhất:# đáp ứng miễn dịch mạnh# tổng hợp kháng thể nhanh#
• 2 dòng mouse lý tưởng trong công nghệ sản
xuất mAb: BALB/c và C57BL/6#
#
Lai tạo1921 tại Mỹ#
BALB/c C57BL/6# Lai tạo 1913 tại Mỹ#
# #
• Lai cùng dòng# • Chuột cái# • 6-8 tuần tuổi# • “sạch tuyệt đối”#
Rat Hamster #
Hệ thống chuồng chuột sạch#
(1b) Chọn Ag#
• Quyết định sự thành công của quy trình#
• Quyết định hiệu quả ứng dụng của sản
phẩm tạo thành #
• Quyết định quy trình sản xuất sản phẩm
(mAb gắn đặc hiệu với Ag tiêm vào)#
Antigen#
• Được nhận diện bởi mAb mục tiêu#
#
• Có tính gây đáp ứng miễn dịch (antigenic) mạnh#
#
• Có cấu trúc càng giống với Ag tự nhiên càng tốt# Hiện nay, Ag thường được tạo ra bằng kỹ thuật
protein tái tổ hợp.#
#
• Có thể là vi khuẩn gây bệnh, virus gây bệnh, các hapten phối hợp với protein, vaccine thương phẩm hay là một phân tử protein nào đó#
#
#
#
Các vị trí tiêm Ag#
Intravenous (i.v.): into a vein (tiêm vào tĩnh mạch)#
Intradermal (i.d.): into the skin (tiêm vào da)#
Subcutaneous (s.c.): beneath the skin (tiêm dưới da)#
Intramuscular (i.m.): into a muscle (tiêm vào cơ)#
Intraperitoneal (i.p.): into the peritoneal cavity (tiêm vào khoang bụng)#
(2) Gây đáp ứng MD#
Nguyên tắc 1#
Phải gây ĐƯMD khác loài#
Sử dụng động vật gây nhiễm là mousethì phải dùng kháng nguyên có nguồn gốc từ rat hay hamster để gây đáp ứng miễn dịch#
(2) Gây đáp ứng MD#
Nguyên tắc 2#
Dòng tế bào myeloma phải có nguồn gốc từ cùng một loài với đối tượng gây ĐƯMD để đảm bảo khả năng dung hợp của nó với tế bào lách#
- Tế bào lách được thu nhận từ mouse thì nên chọn dòng myeloma mouse như SP2/0 hay X63/Ag.8653#
- Tế bào lách được thu nhận từ rat thì nên chọn
dòng myeloma rat như Y3/Ag1.2.3#
(2) Gây đáp ứng MD#
Nguyên tắc 3#
Phải có chất bổ trợ (adjuvant) đi kèm#
• CFA (Complete Freud’s Adjuvant): nước, nhũ tương
dầu, xác vi khuẩn Mycobactericum#
# #
• IFA (incomplete Fleud’s adjuvant): nước, nhũ tương
dầu#
• ALUM (Aluminum hydroxide gel)#
Tiêm 10-100µg/1 chuột/1 lần# Tá dược thường được sử dụng là CFA#
Với kháng nguyên là tế bào#
Tiêm 0,5 - 5 x107 tb/1 chuột/ 1 lần # Tá dược thường được sử dụng là ALUM #
Với kháng nguyên là protein#
Quy trình gây ĐƯMD ở mouse#
Ngày#
Thao tác#
Tá dược# Vị trí tiêm #
0#
Tiêm mũi cơ bản#
CFA#
s.c.#
14#
Tiêm nhắc lại lần 1#
IFA#
s.c.#
28#
Tiêm nhắc lại lần 2#
IFA#
s.c.#
36#
Thu serum#
42#
IFA#
s.c.#
Nghỉ trước khi dung hợp # (hay tiêm nhắc lần 3)#
52#
Tiêm nhắc lại lần cuối#
i.v.#
55#
Thu tế bào lách sau khi đã xác định hiệu giá của Ig trong huyết thanh#
Quy trình gây ĐƯMD ở rat#
Ngày#
THAO TÁC#
Chất bổ trợ#
Vị trí tiêm#
0# Tiêm mũi cơ bản#
CFA#
i.p.#
21# Tiêm nhắc lần 1 #
IFA#
i.p.#
42# Tiêm nhắc lần 2 #
IFA#
i.p.#
52# Kiểm tra serum#
53# ELISA#
63# Tiêm nhắc lần 3#
IFA#
i.p.#
73# Kiểm tra serum#
74# ELISA#
84# Tiêm nhắc lần 4#
IFA#
i.p.#
94# Kiểm tra serum#
95# ELISA#
98# Tiêm nhắc lần cuối#
i.v.#
101-110# Thu lách#
Xác định hiệu giá kháng thể #
(1)#
Pha loãng huyết thanh theo từng bậc#
Chứng âm#
Undiluted Huyết thanh serum 1/2 ban đầu#
1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 Negative control
(2)#
Bổ sung một lượng nhất định KN vào mỗi tube#
Chứng âm#
#
1/4
Huyết thanh Undiluted serum 1/2 ban đầu#
1/8 1/16 1/32 1/64 Negative control
(3)#
Ủ - xác định độ pha loãng cao nhất vẫn cho phản ứng (trong trường hợp này là 1/16)#
#
Chọn lọc hybridoma#
Con đường de novo (bị ức chế bởi môi trường HAT)#
Tổng hợp nucleotide#
Con đường dự trữ (sử dụng enzyme HGPRT)#
Môi trường chọn lọc HAT#
Hybridoma#
Myeloma#
B cell# de novo#
de novo#
Salvage (HGPRT+)#
de novo# Salvage (HGPRT+)#
Salvage # (HGPRT-)#
Chết#
Sống#
Chết#
Môi trường chọn lọc HAT # Tế bào tổng hợp purine và pyrimidin bằng 2 con
dihydrofolate reductase (DHFR) #
– Con đường Salvage cần enzyme HGPRTase (hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase) để tổng hợp purine #
– Aminopterin có trong HAT ức chế hoạt tính của DHFR à tế bào phải tổng hợp nucleotide bằng con đường Salvage #
– Tế bào HGPRT(-) không có khả năng tổng hợp purine (hypoxanthine hay guanine) bằng con đường Salvage#
đường:# – Con đường De novo cần hoạt động của enzyme
Chuột#
Dầu khoáng#
Chuột đã được gây MD#
Plasmacytoma (Bào tương ung thư)#
Không sản xuất Ig#
Myeloma#
Lympho B#
Có bộ máy tiết Ig#
“Bất tử” trong in vitro #
Sản xuất Ig#
Không tồn tại lâu dài trong in vitro#
Dung hợp#
Hybridoma#
Sản xuất Ig#
Có bộ máy tiết Ig#
“Bất tử” trong in vitro #
Dung hợp tế bào lách với myeloma#
#
Kiểm tra myeloma#
8 - Azaguanine#
Myeloma Cells#
Immortal Tumor Of Lymphocytes# +
#
Myeloma Cells# #HGPRT-#
(4) Các kĩ thuật dung hợp tế bào#
• Kết dính tự nhiên# • Hóa chất (PEG)# • Các yếu tố vật lý (xung điện,
sóng siêu âm)# • Virus (Sendai)# • Vi tiêm #
Buồng dung hợp
Tế bào trong buồng dung hợp
Máy tạo xung điện
(5a) Sàng lọc hybridoma#
Lympho B#
Hybridoma#
Myeloma#
Sàng lọc #
Ag#
Dòng hóa#
Dung hợp#
Hybridoma sản xuất Ig
mục tiêu#
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ELISA
Western Blotting
Immunoflorescent essay #
(5b) Dòng hóa Hybridoma#
(6) Nhân sinh khối MAb#
(6a) Sản xuất MAb in vitro#
• Hybridoma được nuôi trong môi trường phát triển
nhân tạo (bioreactor, bình Roux…)#
• MAb được tiết vào nước nổi của dịch nuôi cấy tế bào
(supenatant cell culture)#
• Nhược điểm: Nồng độ MAb thu được tương đối thấp
(0,01-0,5mg/mL dịch nuôi cấy)#
• Ưu điểm: Có thể sản xuất với số lượng lớn bằng hệ
thống bioreactor#
Hệ thống bioreactor nhân sinh khối tế bào#
(6b) Sản xuất MAb in vivo#
• Hybridoma được tiêm vào khoang bụng của vật chủ
(ascites)#
• MAb được tiết vào dịch nước báng (ascites fluid)# # • Ưu điểm: Nồng độ MAb thu được khá cao (1-15mg/
mL nước báng) #
#
• Hạn chế: Đạo lí xã hội về sử dụng động vật thí
nghiệm#
Mồi chuột bằng pristane#
Tiêm hybridoma vào khoang bụng (peritoneal cavity)#
Thu thập nước báng (ascites fluid)#
Pristane#
• 2,6,10,14 - tetramethylpentadecane# • Tách chiết từ dầu gan cá mập# • Gây ra bệnh viêm khớp ở Rat, là mô hình nghiên cứu
bệnh viêm khớp mãn tính ở người#
• Gây ra bệnh lao da ở chuột, là mô hình nghiên cứu
bệnh tự miễn#
• Là yếu tố quan trọng kích thích tạo nước báng trong
khoang bụng của chuột, kích thích sự tạo MAb#
(7) Tinh chế protein#
• Sắc ký ái lực (affinity chromatography)#
• Sắc ký trao đổi ion (ion exchange chromatography)#
• Lọc gel (gel filtration)#
• Sắc ký cao áp #
#
• Kết tủa với muối ammonium sulfate hay acid caprylic#
Hệ thống sắc kí lỏng cao áp HPLC#
(High pressure liquid chromatography)#
Sắc ký ái lực#
NK cells, Mf#
ADCC#
Tế bào khối u#
Mab kháng Ag ung thư #
Bổ thể#
Ag ung thư#
MAC#
Mab trong liệu pháp chữa trị ung thư#
Kháng thể đơn dòng gắn hạt nano (quantum dot) #
Kháng thể đơn dòng gắn hạt nano (quantum dot) ứng dụng trong in vitro #
KTĐD gắn quantum d o t p h á t h u ỳ n h quang trong nhận diện thụ thể bề mặt tế bào ung thư đại tràng#
Kháng thể đơn dòng gắn hạt nano (quantum dot) ứng dụng trong in vivo #
Mouse MAb Chimeric MAb Humanized MAb #
Mouse Mab: toàn bộ phân tử kháng thể có nguồn gốc từ chuột#
Chimeric MAb: vùng Fab từ chuột, vùng Fc từ người#
Humanized MAb: 3 vùng hypervariable từ chuột, các vùng còn lại từ người #
