CHƯƠNG 3: SẢN XUẤT SẢN PHẨM TỪ VI SINH VẬT
1
NỘI DUNG
3.1. Sản xuất amino acid
3.2. Sản xuất enzyme
3.3. Sản xuất chất kháng sinh
2
3.1. SẢN XUẤT AMINO ACID
• Đặc tính và vai trò của amino acid: – Là thành phần cấu tạo nên ……. – Hầu hết aa trong tự nhiên đều có dạng L,
sinh vật sử dụng aa dạng L là chủ yếu
– Một số aa dạng D mà gia cầm và heo có thể
3
sử dụng: Lysine, Valine, Methionine
3.1. SẢN XUẤT AMINO ACID
• Vì sao phải sản xuất amino acid?
4
• Cần sản xuất loại amino acid nào?
3.1. SẢN XUẤT AMINO ACID
• Aa dễ được hấp thu. • Aa cần thiết cho người và vật nuôi
– Cơ thể người và động vật không thể tự tổng hợp
một số aa thiết yếu
– Số lượng aa thiết yếu phụ thuộc vào giống loài và
giai đoạn phát triển.
– Vd: ở người, có …. aa thiết yếu ở giai đoạn ….
→ cần bổ sung nguồn aa từ động thực vật hoặc
sản xuất công nghiệp
Nếu thiếu một số aa hay một aa nào đó → trạng thái bệnh tật cho cơ thể → tình trạng sức khoẻ kém.
5
Các aa dùng trong công nghiệp thực phẩm
6
3.1. SẢN XUẤT AMINO ACID
I need more L-Lysine
• Trong chăn nuôi, vật nuôi cũng cần lượng aa từ bên ngoài, nhưng thức ăn cung cấp thường không đủ
– Aa giới hạn là aa thiết yếu có hàm lượng trong thức ăn thấp hơn so với nhu cầu của vật nuôi
7
Aa giới hạn
• Chỉ số aa giới hạn
Paa= (aa khẩu phần/ aa nhu cầu)*100
• Axit amin nào có Paa thấp nhất là aa giới hạn thứ nhất
Met
Phe
Try
Khẩu phần %
0.50
0.2
0.1
0.60
0.4
0.15
83%
50%
67%
Nhu cầu % Paa
8
3.1. SẢN XUẤT AMINO ACID
aa giới hạn trong vài loại thức ăn cho heo, gà
9
Cân bằng aa trong khẩu phần
10
3.1. SẢN XUẤT AMINO ACID
• Sản lượng aa được sản xuất công nghiệp ngày
• Một số lĩnh vực hỗ trợ quá trình sản xuất aa:
càng tăng.
– Phân lập vsv sinh aa, tạo vsv mới bằng công
– Kết hợp tổng hợp hóa học và enzyme và vsv – Sử dụng nguyên liệu rẻ tiền – Tối ưu hóa các điều kiện lên men nhằm thu
nhận tối đa lượng aa từ vsv
11
nghệ gen có hoạt tính sinh aa cao
3.1. SẢN XUẤT AMINO ACID
12
Một số aa được sản xuất và ứng dụng: (thống kê 2003)
3.1. SẢN XUẤT AMINO ACID
Các phương pháp sản xuất aa: 1. Tách chiết aa từ dịch thủy phân protein • Dùng thu nhận L-C, L-Y • Phụ thuộc vào tính sẵn có của nguyên liệu để
13
ứng dụng phương pháp này hóa chất/enzyme Protein aa
3.1. SẢN XUẤT AMINO ACID
– Dây chuyền phản ứng hóa học từ các tiền chất – Thường tạo ra 2 dạng đồng phân D và L, khó tách ra – Một số aa tổng hợp được: M, K, W, T, G
Các phương pháp sản xuất aa: 2. Tổng hợp hóa học
Vd: Sx Methionine từ acrolein
14
3.1. SẢN XUẤT AMINO ACID
– Lên men trực tiếp trong môi trường – Chuyển hóa tiền chất của aa nhờ vsv – Sử dụng enzyme tự do hoặc cố định hoặc tế bào sinh
enzyme được cố định.
15
Các phương pháp sản xuất aa: 3. Tổng hợp aa nhờ vi sinh vật
3.1. SẢN XUẤT AMINO ACID
Các phương pháp sản xuất aa: 3. Tổng hợp aa nhờ vi sinh vật
Quy trình chung của lên men để thu nhận sản phẩm từ vsv
16
3.1. SẢN XUẤT AMINO ACID
• Nguyên liệu: Đảm bảo cung cấp nguồn carbon, nitơ, và các nguyên tố khác để vi sinh vật phát triển và tổng hợp được nhiều sản phẩm.
– Nguồn carbon: rỉ đường, nguyên liệu giàu tinh bột
(khoai mì, bắp..) ….
– Nguồn nitơ: ure, muối amoni,… – Các hợp chất khoáng – Các chất kích thích sinh trưởng: vitamin, aa cần thiết cho quá trình tổng hợp aa mong muốn trong vi sinh vật
17
Các phương pháp sản xuất aa: 3. Tổng hợp aa nhờ vi sinh vật
3.1. SẢN XUẤT AMINO ACID
Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng
Nồng độ và thành phần thích hợp phụ thuộc vào
chủng vi sinh vật và giống sản xuất
Điều chỉnh pH và thanh trùng môi trường
18
Các phương pháp sản xuất aa: 3. Tổng hợp aa nhờ vi sinh vật
Chuẩn bị giống
• Chủng vi sinh vật trong môi trường bảo quản • Nhân giống các cấp
Lên men
19
Chú ý điều chỉnh các thông số kỹ thuật pH, nhiệt độ, thông khí, bổ sung chất dinh dưỡng…
Xử lý và thu nhận sản phẩm
• Tùy vào mục đích sử dụng mà thực hiện các biện
pháp xử lý và thu nhận khác nhau:
khiết hoặc chỉ cần chế phẩm thô
– Dùng để chế biến thức ăn gia súc: cần dạng tinh
– Dùng trong chế biến thực phẩm hoặc y học: cần độ
20
tinh sạch cao hơn
Các con đường biến dưỡng aa
21
3.1. SẢN XUẤT AMINO ACID
Cryptococcus laurentii
Corynebacterium glutamicum
22
• Các chủng vsv dùng sản xuất aa
3.1. SẢN XUẤT AMINO ACID
Cryptococcus laurentii
Corynebacterium glutamicum
23
• Các chủng vsv dùng sản xuất aa
3.2. SẢN XUẤT ENZYME
• Ưu điểm của việc dùng VSV tổng hợp enzyme
• Hệ enzyme phong phú: protease, cellulase, racemase, amylase, …trong vsv có thể phục vụ nhiều nhu cầu khác nhau
enzyme từ sinh vật khác.
• Enzyme của VSV có hoạt tính cao hơn
24
• VSV sinh trưởng và phát triển nhanh, lượng enzyme trong tế bào lớn → thích hợp cho sản xuất công nghiệp
3.2. SẢN XUẤT ENZYME
• Ưu điểm của việc dùng VSV tổng hợp enzyme
• Các chu kỳ lên men ngắn ngày. • Có thể kiểm soát trạng thái sinh lý của vi sinh vật trong quá trình lên men và đảm bảo được tính đồng nhất của các mẻ lên men.
25
• Quy trình nuôi dễ công nghiệp hóa, môi trường nuôi đơn giản, rẻ tiền → hiệu quả kinh tế cao
3.2. SẢN XUẤT ENZYME
• VSV có khả năng điều chỉnh quá trình trao đổi chất để thích nghi với môi trường→ thay đổi thành phần môi trường để thu nhận enzyme mong muốn
26
• Ưu điểm của việc dùng VSV tổng hợp enzyme
3.2. SẢN XUẤT ENZYME
• Một số VSV có khả năng tiết enzyme ngoại bào → không phải phá vỡ tế bào để thu nhận enzyme → tái sử dụng nhiều kỳ và dễ dàng thu nhận sản phẩm
27
• Ưu thế của việc dùng VSV tổng hợp enzyme
3.2. SẢN XUẤT ENZYME
1. Lựa chọn chủng: dựa vào nhu cầu thực tế
– VD: thu nhận protease loại nào? với mục đích gì? – Thu nhận chitinase, để phân giải chitin từ vỏ tôm
2. Sử dụng các kỹ thuật trên giống – Phân lập từ mẫu thích hợp – Huấn luyện thích nghi – Cải tạo
28
• Các công đoạn chính:
3.2. SẢN XUẤT ENZYME
3. Xác định thành phần môi trường lên men: cần cung cấp đầy đủ lượng C, N, O, nước và khoáng
– Nguồn C: đường , rỉ đường, nước ép trái cây, cám
• Các công đoạn chính:
mì, cám gạo, bã rượu ….
– Nguồn N: nước chiết bắp, bột đậu nành, dịch thủy
phân casein, cao nấm men, …
– Nhu cầu về vitamin hay chất sinh trưởng
Việc xác định thành phân môi trường thường qua nhiều nghiên cứu với quy mô rộng dần (scale up)
29
• Hãy thiết kế thí nghiệm xác định thành phần dinh dưỡng để nuôi cấy Bacillus cho việc sản xuất protease cao nhất.
• Nêu cách thức phân lập và lựa chọn chủng vi sinh
30
vật có khả năng sinh cellulase.
3.2. SẢN XUẤT ENZYME
4. Lên men: lựa chọn phương pháp lên men và điều kiện lên men thích hợp
– Lên men bề mặt: cám, tấm lên men mốc sinh
• Các công đoạn chính:
amylase
– Lên men bề sâu (lên men chìm) – Điều kiện cần lưu ý: nhiệt độ, pH, tốc độ khuấy
31
3.2. SẢN XUẤT ENZYME
5. Thu nhận enzyme và xử lý an toàn chất thải
– Chế phẩm enzyme thô: sử dụng toàn bộ canh
• Các công đoạn chính:
trường lên men • Không tinh khiết • Không bảo quản lâu
– Chế phẩm enzyme kỹ thuật:
• Đối với enzyme ngoại bào: thu dịch, trích ly enzyme • Đối với enzyme nội bào: phá vỡ tế bào, thu nhận enzyme qua tủa phân đoạn, hoặc tách qua cột sắc ký sau đó cô chân không
32
33
• Thu nhận enzyme bằng sắc ký ái lực
enzyme bằng tủa phân đoạn
34
• Thu nhận
3.2. SẢN XUẤT ENZYME
Một số vi sinh vật sinh enzyme protease: • Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5-8) và có khả năng chịu nhiệt thấp. Được sinh ra nhiều bởi B. subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số chủng thuộc chi Clostridium • Nấm sinh protease được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm: Aspergillus oryzae, A. terricola, A. fumigatus, A. saitoi, Penicillium chysogenum. Một số nấm mốc khác như: A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti, … có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất pho mát.
• Xạ khuẩn: một số chủng có khả năng tổng hợp protease cao
như: Streptomyces grieus, S. fradiae, S. trerimosus…
35
3.2. SẢN XUẤT ENZYME
Nguồn thu nhận enzyme cellulase: • Động vật: dịch tiết dạ bò, nhóm thân mềm, … • Thực vật: trong ngủ cốc nảy mầm như lúa mì, yến
mạch, …
– Nấm sợi: Aspergilus niger, A. oryzae, A.
• Vi sinh vật: vi khuẩn, nấm sợi, nấm men
candidus, …
– Xạ khuẩn: Actinomyces griseus, Streptomyces
reticuli,…
– Vi khuẩn: Acetobacter xylinum, Bacilllus
36
subtilis, B. pumilis, …
3.3. SẢN XUẤT KHÁNG SINH
Những chất hóa học có tác động chống lại sự sống
• Kháng sinh (Antibiotic) là gì?
của VSV ở nồng độ thấp, ức chế hoặc tiêu diệt VSV
bằng cách tác động ở mức phân tử, hoặc tác động
vào một hay nhiều giai đoạn chuyển hóa hoặc thay
đổi cân bằng lý hóa của VSV mà vẫn an toàn cho
người và vật nuôi.
37
3.3. SẢN XUẤT KHÁNG SINH
• Lịch sử
được dùng để chữa vết thương
– Cuối TK 19 tại Anh, các mẫu bánh mì mốc
38
– 1928, Alexander Flemming (BV Saint Mary, London) phát hiện nấm tiết ra chất có tác dụng diệt khuẩn • Nấm Penicillium notatum • Chất có tác dụng diệt khuẩn : penicillin
3.3. SẢN XUẤT KHÁNG SINH
• Lịch sử
– 1938, Ernst Boris Chain và Howard Walter Florey (ĐH Oxford) bắt đầu nghiên cứu tác dụng điều trị của penicillin
– 25/5/1940 thử nghiệm thành công trên chuột. Edward Abraham nghiên cứu điều chế penicillin tinh chất
– 1942 triển khai công nghệ lên men chìm sản
39
xuất penicillin G
40
3.3. SẢN XUẤT KHÁNG SINH
– Ức chế sự thành lập vách tế bào – Ức chế nhiệm vụ của màng tế bào – Ức chế sự tổng hợp protein – Ức chế sự tổng hợp acid nucleic
41
• Cơ chế tác động
3.3. SẢN XUẤT KHÁNG SINH
• Cơ chế tác động
• VK G (+) biến thành dạng hình cầu không có vách
(proto-plast)
• VK G (-) có vách không hoàn chỉnh (spheroplast) • tế bào dễ vỡ ở môi trường có trương lực bình
– Ức chế sự thành lập vách tế bào
thường
42
3.3. SẢN XUẤT KHÁNG SINH
• Cơ chế tác động
– Ức chế sự thành lập vách tế bào. Ks thuộc
nhóm này:
43
Bacitracin, Cephalosporin, Cycloserine Penicillin, Rostocetin, Vancomycin
3.3. SẢN XUẤT KHÁNG SINH
– Ức chế nhiệm vụ của màng tế bào
• Mất sự toàn vẹn của màng tế bào đại phân tử
và ion thoát ra khỏi tế bào tế bào chết
• Màng tế bào VK và vi nấm dễ bị phá hủy bởi
một số tác nhân
Imidazole làm suy yếu sự toàn vẹn của màng tế bào vi nấm bằng cách ức chế sự tổng hợp lipid Polymycins tác động lên VK Gr (-) Polyenes tác động lên vi nấm Colistin
44
• Cơ chế tác động
3.3. SẢN XUẤT KHÁNG SINH
• Cơ chế tác động
– Ức chế sự tổng hợp protein
Tetracyclines • Thuốc gắn vào tiểu đơn vị 30S của ribosome ngăn chặn các amino acid mới gắn vào chuỗi peptid mới được thành lập
45
3.3. SẢN XUẤT KHÁNG SINH
• Cơ chế tác động
– GĐ 1: thuốc gắn vào thụ thể trên tiểu đơn vị 30S – GĐ 2 : phong bế hoạt tính của phức hợp đầu tiên trong
quá trình thành lập chuỗi peptid
– GĐ 3 : thông tin mRNA bị đọc sai 1 acid amin không
phù hợp
– GĐ 4 : làm vỡ các polysomes thành monosomes
không có chức năng tổng hợp protein
46
– Ức chế sự tổng hợp protein Aminoglycosides : Streptomycin
3.3. SẢN XUẤT KHÁNG SINH
• Cơ chế tác động
– Ức chế sự tổng hợp protein
Chloramphenicol
47
– Thuốc gắn vào tiểu đơn vị 50S của ribosome ức chế peptidyltransferase ngăn các amino acid mới gắn vào chuỗi peptid mới thành lập
3.3. SẢN XUẤT KHÁNG SINH
• Cơ chế tác động
– Ức chế sự tổng hợp protein
Macrolides
– Thuốc gắn vào tiểu đơn vị 50S ribosome ngăn cản sự thành lập phức hợp đầu tiên để tổng hợp chuỗi peptid
Lincomycins
48
– Cơ chế giống nhóm Macrolides
3.3. SẢN XUẤT KHÁNG SINH
• Cơ chế tác động
– Ức chế sự tổng hợp acid nucleic
Actinomycin
– Thuốc gắn vào DNA tạo nên một phức hợp ức chế polymerase ngăn sự tổng hợp RNA (mRNA)
Mitomycin
– Thuốc gắn vào 2 chuỗi DNA ngăn 2 chuỗi
49
tách rời ra không sao chép được
3.3. SẢN XUẤT KHÁNG SINH
• Cơ chế tác động
Rifampin
– Ức chế sự tổng hợp acid nucleic
– Thuốc gắn vào polymerase ức chế tổng
hợp RNA Nalidixic acid
– Phong tỏa DNA gyrase ức chế tổng hợp
50
DNA
3.3. SẢN XUẤT KHÁNG SINH
• Cơ chế tác động
– Ức chế sự tổng hợp acid nucleic
Sulfonamides
– PABA là một tiền chất để tổng hợp acid folic
– Sulfonamides có cấu trúc tương tự PABA cạnh tranh tạo những chất tương tự acid folic nhưng không có chức năng cản trở sự phát triển của VK
51
tổng hợp acid nucleic
3.3. SẢN XUẤT KHÁNG SINH
• Biểu diễn nồng độ kháng sinh – mg/ml, ug/ml, UI/ml, UI/g
• Xác định nồng độ kháng sinh gây ức chế hoặc
52
tiêu diệt vi khuẩn – MIC, MBC
3.3. SẢN XUẤT KHÁNG SINH
53
• Cách xác định MIC, MBC
3.3. SẢN XUẤT KHÁNG SINH
• Điều chỉnh tổng hợp chất KS
sản xuất kháng sinh: • Tuyển chọn quy mô PTN: đặc tính sinh lý, sinh hóa, động học phát triển, động học quá trình tạo sản phẩm, nguồn cơ chất, điều kiện lên men, các công nghệ thu sản phẩm
– Tuyển chọn và tạo chủng công nghiệp siêu
• Tuyển chọn quy mô sản xuất thử và sản xuất công nghiệp: chủng phù hợp với trang thiết bị, nguồn nguyên liệu sẵn có, trình độ công nghệ và năng lực vận hành
54
3.3. SẢN XUẤT KHÁNG SINH
• Điều chỉnh tổng hợp chất KS
sản xuất kháng sinh: • Việc chọn chủng tốn nhiều thời gian, nhân lực và
đòi hỏi phải tiến hành nghiêm túc, lâu dài
• Một số chủng vsv sản xuất kháng sinh:
55
– Tuyển chọn và tạo chủng công nghiệp siêu
3.3. SẢN XUẤT KHÁNG SINH
• Điều chỉnh tổng hợp chất KS
lên men, điều kiện vận hành: • Nguồn C: các loại bột, cám, vỏ khoai tây, rỉ
đường, …
• Nguồn N: bột đậu nành, cao nấm men,. … • Khoáng đa lượng: P, S, Mg,Fe, Ca, K, Na … • Khoáng vi lượng • Chất cảm ứng, chất phá bọt, chất kìm hãm, chất
định hướng, …
56
– Tối ưu hóa thành phần môi trường, thiết bị
3.3. SẢN XUẤT KHÁNG SINH
• Điều chỉnh tổng hợp chất KS
lên men, điều kiện vận hành: • Nhiệt độ, • pH • Nồng độ oxy • Thế oxy-hóa khử • Cường độ sục khí • Cường độ khuấy trộn
57
– Tối ưu hóa thành phần môi trường, thiết bị
SẢN XUẤT PENICILLIN
58
SẢN XUẤT PENICILLIN
59
SẢN XUẤT PENICILLIN
60
SẢN XUẤT PENICILLIN
heat_sterilization
61
SẢN XUẤT PENICILLIN
Fermenters Chủng vsv vào nồi lên men
62
SẢN XUẤT PENICILLIN
63
SẢN XUẤT PENICILLIN
Rotary_vacuum_filter To remove biomass
64
SẢN XUẤT PENICILLIN
disk_centrifuge
65
SẢN XUẤT PENICILLIN
• Batch_extraction
Penicillin được hòa tan trong phosphate buffer, sau đó là chloroform, hòa lại trong phosphate buffer và cuối cùng là ether (ê-te). Sau đó, được trộn với sodium bicarbonate để thu penicillin dạng muối Na có thể bảo quản lâu ở nhiệt độ phòng.
66
Ôn tập
• Vì sao cần sản xuất aa quy mô công nghiệp? • So sánh các phương pháp sản xuất aa. • Aa thiết yếu là gì? Aa giới hạn là gì? • Nhận biết aa dạng L, D, học các chữ viết tắt
của 20 loại aa.
• Cho ví dụ ứng dụng của 3 loại aa trong thực
phẩm hay trong thức ăn vật nuôi.
• Vẽ quy trình sản xuất vsv sinh aa từ giống bảo
67
quản ban đầu.
Ôn tập
• Nêu được các loại vsv có khả năng sản xuất aa, enzyme, kháng sinh cho nhu cầu con người? • Nêu ưu điểm của việc sản xuất enzyme từ vsv. • Giải thích các cách thu nhận enzyme từ dịch
nuôi cấy vsv.
• Định nghĩa kháng sinh. Liệt kê các cơ chế tác
động của kháng sinh.
• Nêu cách thu nhận penicillin tinh khiết từ dịch
nuôi cấy mốc Penicillum
68
• MIC, MBC là gì?
