intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Báo cáo khoa học: Khảo sát tác động của tốc độ làm lạnh và nồng độ huyết thanh lên tỉ lệ sống và tính gốc của tế bào gốc trung mô sau khi đông lạnh

Chia sẻ: Lan Lan | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:11

Thêm vào BST
Báo xấu
180
lượt xem 50
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tế bào gốc trung mô có thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau, trong đó máu cuống rốn là một nguồn tế bào gốc trung mô dồi dào. Việc bảo quản các tế bào gốc này sao cho có thể duy trì được tính gốc và tỉ lệ sống cao sau khi bảo quản là cần thiết cho các ứng dụng y học. Nghiên cứu này nhằm xác định tỉ lệ sống và tính gốc của các tế bào gốc trung mô sau khi đông lạnh bằng các phương pháp và môi trường bảo quản khác nhau....

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Báo cáo khoa học: Khảo sát tác động của tốc độ làm lạnh và nồng độ huyết thanh lên tỉ lệ sống và tính gốc của tế bào gốc trung mô sau khi đông lạnh

  1. Science & Technology Development, Vol 12, No.09 - 2009 KH O SÁT TÁC ð NG C A T C ð LÀM L NH VÀ N NG ð HUY T THANH LÊN T L S NG VÀ TÍNH G C C A T BÀO G C TRUNG MÔ SAU KHI ðÔNG L NH Ph m Văn Phúc(1), Nguy n Thanh Tâm(2), Vương Th H ng Nhung(1), Dương Th B ch Tuy t(2), Phan Kim Ng c(1) (1) Trư ng ð i h c Khoa h c T nhiên, ðHQG-HCM (2)Trư ng ð i h c Sư ph m Tp. H Chí Minh (Bài nh n ngày 08 tháng 01 năm 2009, hoàn ch nh s a ch a ngày 28 tháng 07 năm 2009) TÓM T T: T bào g c trung mô có th ñư c thu nh n t nhi u ngu n khác nhau, trong ñó máu cu ng r n là m t ngu n t bào g c trung mô d i dào. Vi c b o qu n các t bào g c này sao cho có th duy trì ñư c tính g c và t l s ng cao sau khi b o qu n là c n thi t cho các ng d ng y h c. Nghiên c u này nh m xác ñ nh t l s ng và tính g c c a các t bào g c trung mô sau khi ñông l nh b ng các phương pháp và môi trư ng b o qu n khác nhau. K t qu nghiên c u cho th y: tính g c c a các t bào g c trung mô không b nh hư ng b i quy trình b o qu n và môi trư ng b o qu n. T t c các t bào g c còn s ng sau các quy trình b o qu n trong các môi trư ng b o qu n khác nhau ñ u có th hình thành các t p ñoàn cũng như bi t hóa thành xương và m . Trái l i, t l s ng c a t bào g c trung mô sau gi i ñông b nh hư ng l n b i phương pháp ñông l nh và thành ph n huy t thanh c a môi trư ng b o qu n. T khóa: T bào g c trung mô, ñông l nh, máu cu ng r n, tính g c. 1.M ðU T bào g c trung mô máu cu ng r n là m t trong nh ng ngu n t bào g c quý. Chúng có th bi t hóa thành nhi u ki u t bào khác nhau thu c trung mô, n i mô và bi u mô. Nhi u nghiên c u ñã s d ng thành công ngu n t bào g c này trong ñi u tr c n lâm sàng và lâm sàng trên nhi u b nh [8]. Tuy nhiên, các nghiên c u v b o qu n ñông l nh và xác ñ nh các nh hư ng c a quá trình ñông l nh ñ n tính g c c a các t bào này v n chưa ñư c nghiên c u nhi u. Nghiên c u này t p trung vào kh o sát các tác ñ ng c a phương pháp ñông l nh và thành ph n huy t thanh trong môi trư ng ñông l nh ñ n t l s ng sót c a t bào sau khi gi i ñông nh m xây d ng quy trình ñông l nh hi u qu nh t ñ b o qu n ngu n t bào g c trung mô t máu cu ng r n ngư i nói riêng và t bào g c trung mô nói chung. Nghiên c u s d ng 3 phương pháp ñông l nh thư ng ñư c s d ng nh t trong các t bào sinh dư ng là: (1) ñông l nh in situ: các t bào ñư c ñông l nh tr c ti p trong các flask 25 cm2 (Nunc, ð c) nuôi trong môi trư ng b o qu n l nh nhi t ñ -800C; (2) ñông l nh nhanh: t bào ñư c ñông l nh trong cryotube 1,8 ml trong môi trư ng b o qu n, ñư c gi m nhi t ñ d n d n (40C trong 30 phút, -200C trong 45 phút, -800C qua ñêm; và sang hôm sau cho vào nitơ l ng); (3) ñông l nh c c nhanh hay th y tinh hóa: t bào trong môi trư ng b o qu n trong cryotube ñư c ñ t tr c ti p vào nitơ l ng. Chúng tôi s d ng ch t b o qu n là DMSO v i n ng ñ 10%, b sung trong môi trư ng nuôi t bào g c trung mô máu cu ng IMDM v i các n ng ñ huy t thanh FBS khác nhau: 20%, 50% và 90% (v i kí hi u: Môi trư ng 1: 20% FBS, 10% DMSO, 70% IMDM; Môi trư ng 2: 50% FBS, 10% DMSO, 40% IMDM; Môi trư ng 3: 90% FBS, 10% DMSO). Trang 12 B n quy n thu c ðGQG-HCM
  2. T P CHÍ PHÁT TRI N KH&CN, T P 12, S 09 - 2009 2.V T LI U – PHƯƠNG PHÁP 2.1.Thu nh n t bào g c trung mô t máu cu ng r n ngư i T bào g c trung mô t máu cu ng r n ñư c thu nh n theo quy trình c a Oscar K. Lee và cs, 2004 [10]. Máu cu ng r n thu nh n t các s n ph ñã ñư c xét nghi m âm tính v i HIV, HBV, B nh vi n Hùng Vương Thành ph H Chí Minh. Thu nh n qu n th t bào ñơn nhân b ng phương pháp li tâm trên gradient n ng ñ Ficoll-paque (Sigma) t c ñ 2.500 vòng/phút, trong 5 phút. Sau ñó, thu nh n phân ño n t bào ñơn nhân n m gi a l p Ficoll- paque và l p huy t tương bên trên. T bào ñơn nhân sau khi thu nh n ñư c huy n phù trong môi trư ng nuôi c y IMDM, 20% FBS, nuôi trong bình nuôi c y (Nunc, 25 cm2) sao cho ñ t m t ñ 3.105 t bào/cm2 ñi u ki n 370C, 5% CO2. Sau 48 gi , các t bào g c trung mô b t ñ u bám trên b m t bình nuôi, thay môi trư ng ñ lo i b các t bào không bám (các t bào ch t và t bào g c t o máu), ti p t c nuôi ñ n khi t bào ñ t m t ñ 70-80% di n tích b m t bình nuôi c y v i ch ñ thay môi trư ng là 4 ngày/l n. Khi m t ñ t bào MSC trong bình nuôi ñ t kho ng 70-80%, ti n hành c y chuy n tăng sinh. Các t bào sau khi ñư c c y chuy n 7 l n s ñư c s d ng ñ ñông l nh. Ch t b o qu n l nh ñư c s d ng là DMSO, v i t l 10%; ñây là t l ñư c s d ng trên h u h t các dòng t bào sinh dư ng và t bào g c phôi cho t l s ng cao sau khi gi i ñông [3; 5; 6; 7; 11]. 2.2.Phương pháp ñông l nh nhanh Các t bào g c trung mô máu cu ng r n sau khi nuôi c y trong flask 25 cm2 v i m t ñ t bào chi m kho ng 70% b m t ñư c tách b ng trypsin/EDTA 0,25%. Huy n phù t bào ñư c li tâm 2500 vòng/phút trong 5 phút và ch nh m t ñ t bào v 106 t bào/ml. Li tâm hút 1 ml huy n phù trên (2500 vòng/phút trong 5 phút) ñ thu nh n t bào. Tái huy n phù c n t bào b ng 1 ml môi trư ng ñông l nh (tương ng t ng môi trư ng), chuy n toàn b huy n phù t bào trên vào Cryotube 1,8 ml (Nunc). Dán nhãn và ñánh d u dòng t bào, lo i môi trư ng tương ng trên Cryotube. ð t các Cryotube trên vào t mát 40C trong 30 phút và chuy n sang t l nh -200C trong 45 phút, sau ñó chuy n sang t l nh -800C và ñ qua ñêm. Sáng hôm sau mang các Cryotube ñ t vào bình nitơ l ng (-1960C) ñ b o qu n. Thí nghi m ñư c ti n hành 10 l n l p l i, m i l n ti n hành 3 m u; m i m u ch a 1 tri u t bào g c trung mô. K t qu ñư c tính v t l ph n trăm và x lí b ng ph n m m th ng kê Statgraphic version 7.0. 2.3.Phương pháp ñông l nh c c nhanh (th y tinh hóa) T bào g c trung mô máu cu ng r n nuôi trong flask 25cm2 (70% b m t phát tri n), ñư c tách b ng Trypsin/EDTA 0,25%. Huy n phù t bào ñơn thu nh n ñư c li tâm 2500 vòng/phút trong 5 phút và ch nh m t ñ t bào v 106 t bào/ml. Hút 1 ml huy n phù trên, li tâm 2500 vòng/phút trong 5 phút ñ thu nh n t bào. Huy n phù c n t bào v i 1 ml môi trư ng ñông l nh (tương ng t ng môi trư ng) vào c n t bào trên, chuy n toàn b huy n phù t bào trên vào Cryotube 1,8 ml. Dán nhãn và ñánh ñ u dòng t bào, lo i môi trư ng tương ng trên Cryotube. ð t các Cryotube vào bình nitơ l ng (-1960C). Thí nghi m ñư c ti n hành 10 l n l p l i, m i l n ti n hành 3 m u; m i m u ch a 1 tri u t bào g c trung mô. K t qu ñư c tính v t l ph n trăm và x lí b ng ph n m m th ng kê Statgraphic version 7.0. 2.4.Phương pháp ñông l nh in situ (ñông l nh trong bình nuôi) T bào g c trung mô máu cu ng r n trong flask 25 cm2 phát tri n ñ n 70% di n tích b m t nuôi. ð b d ch nuôi ra ngoài, r a l i t bào 2 l n b ng PBSA. B sung 4 ml môi trư ng ñông l nh (tương ng t ng môi trư ng). Dán nhãn, vi t kí hi u tương ng lên các bình nuôi và B n quy n thu c ðGQG-HCM Trang 13
  3. Science & Technology Development, Vol 12, No.09 - 2009 ñ t vào t l nh -800C. Thí nghi m ñư c ti n hành 10 l n l p l i, m i l n ti n hành 3 m u; m i m u ch a 1 tri u t bào g c trung mô. K t qu ñư c tính v t l ph n trăm và x lí b ng ph n m m th ng kê Statgraphic version 7.0. 2.5.Phương pháp gi i ñông L y Cryotube ra kh i bình nitơ l ng (-1960C) ho c l y flask ra kh i t l nh (-800C). ð t vào b n nhi t 370C trong 3 -5 phút ñ n khi tan h t ñá. Chuy n t bào sang ng nghi m vô trùng ch a môi trư ng IMDM, 40% FBS ñã làm m. Ly tâm nh 800 vòng/phút trong 3-5 phút. Tái huy n phù t bào trong 1 ml môi trư ng IMDM, 20% FBS. Hút 10 µl huy n phù trên ñi xác ñ nh hi u qu s ng b ng cách nhu m ñ m v i Trypan blue. Ph n huy n phù còn l i ñư c pha loãng 4 l n, nuôi 370C, 5% CO2 sau 1-3 ngày ñ xác ñ nh kh năng tăng sinh và phát tri n. 2.6.ðánh giá t bào sau gi i ñông Các t bào sau khi gi i ñông ñư c ñánh giá thông qua 3 ch tiêu: t l s ng ch t (thông qua phương pháp ñ m v i trypan blue), kh năng t làm m i (thông qua phương pháp colony assay) và kh năng bi t hóa thành xương và m [10]. Bi t hóa thành t bào t o m (adipocyte) ð bi t hóa thành m , các MSC ñư c nuôi trong môi trư ng IMDM 10% FBS b sung 1 µM dexamethasone, 200 µM indomethacin, 1,7 µM insuline, 500 µM isobutyl-methylxanthine (Sigma). S bi t hóa ñư c ghi nh n khi quan sát dư i kính hi n vi ñ phóng ñ i X20, X40 th y có s xu t hi n các gi t m nh . Bi t hoá thành t bào t o xương (Osteoblast) Các t bào MSC ñư c nuôi trong môi trư ng IMDM 10% FBS b sung 100 nM dexamethasone, 50 µg/ml L-ascorbic acid 2-phosphat (AsAP) và 100 mM β-glycerolphosphate (Sigma). Phân tích RT-PCR Ki u hình c a t bào t o xương ñư c ñánh giá thông qua s bi u hi n c a các gen marker như osteopontin (hOSP) và osteocalcin (hOC). RNA ñư c tách t 3-30. 105 t bào MSC s d ng TRI reagent (Sigma) theo hư ng d n nhà s n xu t. Ph n ng RT-PCR ñư c ti n hành s d ng Kit one-tube c a Stratagene. Trong t t c các ph n ng s d ng beta-actin như là m t ñ i ch ng n i. Ph n ng PCR ñư c ti n hành theo chu trình sau: 94°C trong 40 giây, 56°C trong 50 giây, và 72°C trong 60 giây v i 40 chu kì, sau th i kì bi n tính 94°C trong 5 phút. Sau 49 chu kì, ti n hành thêm 7 phút 720C và làm l nh xu ng 40C trong 5 phút. Các primer s d ng cho RT-PCR v i trình t như sau: Osteocalcin: sense 5’- CGCAGCCACCGAGACACCAT-3’, antisense 5’-GGGCAAGGGCAAGGGGAAGA-3’ (405bp); Osteopontin: sense 5’-CTAGGCATCACCTGTGCCATACC-3’, antisense 5’- CTACTTAGACTACTTGACCAGTGAC-3’ (330 bp); Beta-actin, Sense: 5’- CCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGAC-3’, antisense: 5’- AGGGTACATGGTGGTGCCGCCAGAC-3’ (587 bp). K t qu RT-PCR ñư c ch y ñi n di trên gel agarose 3%, quan sát k t qu dư i bàn ñèn UV. Trang 14 B n quy n thu c ðGQG-HCM
  4. T P CHÍ PHÁT TRI N KH&CN, T P 12, S 09 - 2009 3.K T QU -TH O LU N 3.1.T l ph n trăm t bào s ng sau khi ñông l nh b ng phương pháp ñông l nh nhanh D a vào k t qu cho th y s khác bi t rõ r t t l ph n trăm c a t bào s ng gi a 3 môi trư ng. môi trư ng 1 v i t l t bào s ng là 23,5172 % th p hơn r t nhi u so v i môi trư ng 2 là 64,7806% và môi trư ng 3 là 78,2187%. Ba môi trư ng s d ng, ch khác nhau v n ng ñ huy t thanh b sung, ñi u này g i cho ch y r ng n ng ñ huy t thanh ñã nh hư ng ñ n s c s ng sót c a t bào khi ñông l nh. Nhi u nghiên c u t trư c ñ n hi n nay ñ u cho th y huy t thanh có vai trò c c kì quan tr ng trong nuôi c y t bào, v i nhi u thành chưa bi t rõ; huy t thanh có th h i ph c màng t bào, trung hòa tính ñ c c a DMSO, ñ m pH t t, ñi u hòa áp su t th m th u… vì th v i n ng ñ huy t thanh càng cao thì t l s ng c a t bào càng cao. ñ tin c y 95% (LSD = 95%), s khác bi t có ý nghĩa th ng kê v t l ph n trăm t bào s ng c a ba môi trư ng là khác nhau và t l này tăng d n t môi trư ng 1 ñ n môi trư ng 2 và môi trư ng 3. 3.2.T l ph n trăm t bào s ng sau khi gi i ñông phương pháp ñông l nh c c nhanh Sau khi gi i ñông, t l t bào s ng 3 môi trư ng là: môi trư ng 1 là 65,2116 % ; môi trư ng 2 là 53,3749 % và môi trư ng 3 là 60,3556 %. Theo k t qu này, dư ng như r ng n ng ñ huy t thanh không nh hư ng quan tr ng ñ n t l s ng c a t bào sau khi gi i ñông. T l ph n trăm các t bào s ng sau gi i ñông không có s khác bi t có ý nghĩa th ng kê. ði u này có th gi i thích như sau: Khi ti n hành phương pháp ñông l nh c c nhanh, sau khi cho môi trư ng ñông l nh vào t bào, t bào trong môi trư ng b o qu n ñư c ñ t tr c ti p vào bình nitơ l ng nhi t ñ -1960C, trong t bào x y ra hi n tư ng hình thành tinh th th y tinh (glass) thay vì hình thành băng ñá (ice) n i bào. Tuy nhiên, vì nhi t ñ gi m quá nhanh t 250C c a nhi t ñ phòng xu ng -1960C trong 1 - 2 giây hay gi m t c ñ 12.0000C/phút; th i gian ñ t bào m t nư c khi b sung ch t ñông l nh vào quá ng n nên v n còn m t lư ng l n nư c t n t i trong t bào ch t c a t bào khi ñông l nh. Tuy r ng nh ng phân t nư c này không gây h i cho t bào vì chúng t n t i d ng tinh th th y tinh (kính) nên không làm ch t t bào. Song, v n ñ nghiêm tr ng có th x y ra quá trình gi i ñông. Khi gi i ñông, t bào -1960 C v 370C, nên các tinh th th y tinh chuy n t tr ng thái này sang tr ng thái tinh th ñá r i tr l i tr ng thái l ng. Vì th , khi có s xu t hi n các tinh th ñá là nguyên nhân gây ch t t bào. [1; 2; 9] 100 78.2187 80 64.7806 60 40 23.5172 20 0 Môi Môi Môi trư ng 1 trư ng 2 trư ng 3 a) B n quy n thu c ðGQG-HCM Trang 15
  5. Science & Technology Development, Vol 12, No.09 - 2009 100 80 65.2116 60.3556 60 53.3749 40 20 0 Môi trư ng Môi trư ng Môi trư ng 1 2 3 b) 100 80 60 39.9859 40 34.5337 27.2727 20 0 Môi Môi Môi trư ng 1 trư ng 2 trư ng 3 c) 100 Phương pháp in situ 90 Phương pháp 3 bư c 78.2187 80 Phương pháp c c nhanh 70 65.2116 64.7806 60.3556 60 53.3749 50 39.9859 40 34.5337 30 23.4887 23.5172 20 10 0 Môi trư ng 1 Môi trư ng 2 Môi trư ng 3 d) Hình 1. T l ph n trăm t bào s ng sau khi ñông l nh b ng phương pháp ñông l nh nhanh (a), c c nhanh (b), và in situ (c). (d) T l ph n trăm t bào s ng trong các phương pháp và môi trư ng ñông l nh khác nhau. Th t v y, nhi u nghiên c u khi ti n hành ñông l nh phôi b ng phương pháp này, các tác gi ph i s d ng môi trư ng có áp su t th m th u cao hơn môi trư ng ñông l nh t bào theo quy trình bình thư ng (3 bư c) ñ lo i b nhanh chóng các phân t nư c n i bào, làm gi m s hình thành các tinh th ñá khi gi i ñông; và khi ñó t l s ng s ñư c c i thi n. Trang 16 B n quy n thu c ðGQG-HCM
  6. T P CHÍ PHÁT TRI N KH&CN, T P 12, S 09 - 2009 Trong quá trình ñông l nh 3 bư c (nhanh); t bào ch u tác ñ ng gi m d n c a nhi t ñ trong tr ng thái ti p xúc v i ch t ñ c DMSO, trong khi chúng chưa hoàn toàn ng ng tăng trư ng nên n ng ñ huy t thanh càng cao s giúp t bào gi m ñư c các tác ñ ng b t l i c a DMSO gây ra. Trong khi ñó, trong quy trình ñông l nh c c nhanh, th i gian t bào chuy n t tr ng thái còn s ng v tr ng thái ti m tàng quá ng n nên huy t thanh không phát huy ñư c vai trò h n ch tác ñ ng x u c a DMSO. [1; 3]. 3.3.T l ph n trăm t bào s ng sau khi gi i ñông phương pháp ñông l nh in situ Trong phương pháp ñông l nh in situ, t l s ng c a t bào sau quá trình ñông l nh là không cao, c ba môi trư ng ñ u th p hơn 50% t bào s ng. T l t bào s ng môi trư ng 1 luôn th p hơn môi trư ng 2 và môi trư ng 3 vì n ng ñ huy t thanh trong môi trư ng ñông l nh th p ch chi m 10%. ði u này m t l n n a kh ng ñ nh nh hư ng c a huy t thanh ñ n s s ng sót c a các t bào trong các quá trình ñông l nh nhi t ñ h ch m. môi trư ng 2 và môi trư ng 3 v i n ng ñ huy t thanh khác nhau nhưng t l ph n trăm t bào s ng sau khi gi i ñông là như nhau. ði u này có th gi i thích là phương pháp ñông l nh này huy t thanh nh hư ng ñ n s c s ng c a t bào là có ngư ng tác ñ ng (tuy nhiên ngư ng này chưa xác ñ nh trong nghiên c u này). Nhi u nghiên c u ti n hành ñông l nh t bào g c t o máu, t bào g c trung mô t t y xương và t bào g c phôi cho th y h u h t các k t qu v i t l ph n trăm t bào s ng sau gi i ñông cao ñư c ñ ngh là 40-50% huy t thanh b sung trong môi trư ng nuôi. ði u này có th suy lu n r ng, n u s d ng n ng ñ huy t thanh th p thì t l ph n trăm t bào s ng sót sau gi i ñông th p hơn hay là ngư ng n ng ñ 40-50% là cho k t qu t t. Vi c tăng n ng ñ huy t thanh cao hơn không ñư c ñ ngh trong h u h t các nghiên c u vì giá thành c a t bào sau khi gi i ñông tăng r t cao (huy t thanh là thành ph n chi m ñ n 99% giá c a m t môi trư ng nuôi). ñ tin c y 95% (LSD = 95%), cho th y s khác bi t có ý nghĩa th ng kê v t l t bào s ng môi trư ng 1 so v i môi trư ng 2 và môi trư ng 3. Trong khi ñó, môi trư ng 2 và môi trư ng 3 không có s khác bi t có ý nghĩa th ng kê. 3.4.T l s ng c a các t bào các môi trư ng và các phương pháp ñông l nh khác nhau Trong môi trư ng 1 (10% FBS), t l ph n trăm t bào s ng sau khi gi i ñông gi a hai phương pháp in situ và ñông l nh nhanh là tương ñương nhau (23,4887% và 23,5172%); phương pháp ñông l nh c c nhanh cho t l ph n trăm t bào s ng r t cao so v i hai phương pháp còn l i (g p ch ng 2,5 l n). ði u này có th gi i thích: Trong phương pháp ñông l nh nhanh và in situ, t bào chuy n t nhi t ñ 250C xu ng - 0 80 C ch m, v i n ng ñ huy t thanh th p, nên s lư ng t bào ch t nhi u. Trong khi ñó, phương pháp ñông l nh c c nhanh, do s thay ñ i nhi t ñ c c nhanh nên tác ñ ng c a DMSO làm h i t bào gi m. ði u th y rõ hơn trong môi trư ng 2 khi ñông l nh b ng 3 phương pháp trên. môi trư ng v i n ng ñ huy t thanh cao (50%), s c s ng c a t bào tăng lên ñáng k , g i ý cho r ng ñ c tính c a DMSO gi m khi n ng ñ huy t thanh tăng. T l ph n trăm t bào s ng trong 3 môi trư ng có s khác bi t có ý nghĩ th ng kê. T l ph n trăm t bào s ng cao nh t phương pháp ñông l nh nhanh. Như v y, n u ñông l nh v i môi trư ng có 50% FBS trong môi trư ng nuôi và b ng phương pháp ñông l nh nhanh thì s có t l t bào s ng cao nh t. B n quy n thu c ðGQG-HCM Trang 17
  7. Science & Technology Development, Vol 12, No.09 - 2009 Trong môi trư ng 3, t l t ph n trăm t bào s ng cao nh t v n ñư c ghi nh n phương pháp ñông l nh nhanh. Có l , trong phương pháp này nhi t ñ gi m t t , n u b sung n ng ñ huy t thanh thích h p thì s c s ng c a các t bào sau khi gi i ñông khá cao. Tóm l i, các phương pháp ñông l nh khác nhau khi ti n hành ñông l nh v i m t môi trư ng ñông l nh s cho k t qu t l ph n trăm t bào s ng khác nhau. 3.5.S tương quan h i quy gi a n ng ñ huy t thanh trong môi trư ng b o qu n và t l s ng sót sau gi i ñông Các k t qu th c nghi m ñư c phân tích ANOVA cho th y: Trong phương pháp ñông l nh nhanh n ng ñ huy t thanh có nh hư ng ñ n t l ph m trăm t bào s ng sau khi gi i ñông: n ng ñ huy t thanh càng cao, t l s ng cao. Tuy nhiên, khi phân tích ANOVA cho th y s tương quan này không tuy n tính hay nói cách khác khi tăng n ng ñ huy t thanh càng cao thì t l ph n trăm t bào s ng không tăng theo. M t l n n a cho th y, s tác ñ ng c a huy t thanh lên t l ph n trăm t bào s ng sau gi i ñông là ngư ng tác ñ ng. Trong phương pháp ñông l nh in situ: n ng ñ huy t thanh cũng có nh hư ng ñ n s c s ng c a t bào sau gi i ñông. Các s li u cho th y, s c s ng c a t bào n ng ñ huy t thanh 50% và 90% là như nhau nhưng cao hơn có ý nghĩa th ng kê n ng ñ huy t thanh 20%. Như v y, trong thí nghi m, ngư ng tác ñ ng lên s c s ng c a t bào ñông l nh khi gi i ñông cho th y rõ r t. S tương quan c a t l ph n trăm t bào s ng sau khi gi i ñông và t l ph n trăm huy t thanh là không tuy n tính hay ch tuy n tính trong m t kho ng nào ñó (có th dư i 50% huy t thanh) mà nghiên c u chưa xác ñ nh. Trong phương pháp ñông l nh c c nhanh: s tương quan gi a t l ph n trăm t bào s ng và t l ph m trăm huy t thanh là không có. Như v y, t các phân tích trên có th k t lu n r ng: s tác ñ ng c a huy t thanh lên s c s ng c a t bào có ý nghĩa khi t bào chìm trong môi trư ng b o qu n ti p xúc DMSO và nhi t ñ gi m t t . Vai trò b o v c a huy t thanh không th y rõ khi ti n hành ñông l nh c c nhanh (hay gi m nhi t ñ c c nhanh). Trong nghiên c u, chưa xác ñ nh tác ñ ng có hay không c a huy t thanh lên s c s ng khi ñông l nh c c nhanh (không có ti n hành b o qu n t bào trong môi trư ng không có huy t thanh). 3.6.K t qu xác ñ nh colony assay K t qu ñ m các colony hình thành t các t bào còn s ng sau gi i ñông cho th y, 100% các t bào còn s ng s hình thành các t p ñoàn sau 24 gi , 48 gi . Sau 7 ngày, các colony h p dòng và m t ñ ñ t t 70-80% di n tích b m t bình nuôi. Các t bào sau khi gi i ñông ñã c y chuy n 3 l n (ñ n th i ñi m vi t báo cáo) và v n cho th y kh năng tăng sinh m nh. Trang 18 B n quy n thu c ðGQG-HCM
  8. T P CHÍ PHÁT TRI N KH&CN, T P 12, S 09 - 2009 (a) (b) (c) (d) Hình 2. K t qu xét nghi m colony assay. Các c m t bào hình thành sau khi nuôi c y 3 ngày (a), 5 ngày (b), 7 ngày (c) và 10 ngày (d). Quá trình tăng sinh hình thành t p ñoàn và h p dòng c a các t bào sau khi gi i ñông là tương t v i các t bào trư c khi ñông l nh. Th i gian th h c a các t bào ñư c xác kho ng 24 gi . K t qu này tương t v i các nghiên c u c a m t s tác gi khác trên th gi i v th i gian th h các t bào g c trung mô t t y xương ngư i. 3.7.Bi t hoá hành t bào t o m Sau 48 gi , các t bào b t ñ u tích t các gi t m trong t bào ch t. Các gi t m nh góp l i d n thành các gi t l n. Các gi t m l n sau ñó s góp l i thành gi t m l n hơn chi m g n h t th tích t bào và ép nhân t bào ra ngoài. Vì th , chúng t d ng dài, tr i r ng chuy n sang d ng b u d c và cu i cùng là hình tròn. Các t bào t o m v i hình d ng tròn b t ñ u xu t hi n vào ngày th 7 sau khi ti n hành c m ng. (a) (b) Hình 3. T bào sau khi bi t hóa trong môi trư ng c m ng t o m 7 ngày. (a) T bào trư c khi c m ng bi t hóa, (b) T bào sau khi c m ng bi t hóa. B n quy n thu c ðGQG-HCM Trang 19
  9. Science & Technology Development, Vol 12, No.09 - 2009 S xu t hi n các gi t m có th quan sát dư i kính hi n vi ñ o ngư c ñ phóng ñ i 200 hay 400 l n. Dư i kính hi n vi, các gi t m có d ng tròn, ph n chi u ánh sáng. 3.8.Bi t hóa thành t bào t o xương Sau khi nuôi trong môi trư ng bi t hóa, sau 7 ngày, các t bào b t ñ u chuy n t d ng dài sang d ng tròn và hình h t ñ u. ðó là hình d ng ñ c trưng c a t bào t o xương (osteoblast). Khi ñư c c m ng bi t hóa, h u như t t c các t bào ñ u ng ng phân chia. ðây cũng là m t d u hi u cho th y t bào g c ñã bi t hóa thành t bào ch c năng. ði u này cũng ñúng v i trư ng h p khi c m ng bi t hóa MSC thành t bào t o m . Các t bào sau khi c m ng bi t hóa dương tính v i các marker cho t bào xương là osteocalcin và osteopontin khi xác ñ nh b ng RT-PCR. M 1 2 3 (a) (b) Hình 4. (a) T bào g c trung mô khi chưa bi t hóa, (b) K t qu ch y RT-PCR c a m u t bào g c trung mô sau khi bi t hóa xương. M: thang chu n (100 bp), 1: osteopontin, 2: osteocalcin, 3: beta actin. 4.K T LU N Phương pháp ñông l nh nhanh v i môi trư ng 90% FBS và 10% DMSO cho k t qu t t nh t (78,22% t bào s ng sau gi i ñông) trong các phương pháp kh o sát. Trong phương pháp ñông l nh c c nhanh, s c s ng c a t bào sau khi gi i ñông trong 3 môi trư ng b o qu n ch a 10% DMSO và l n lư t 20%, 50% và 90% FBS là tương ñương nhau (kho ng 60%). Trong phương pháp ñông l nh in situ: s c s ng t bào trong ba môi trư ng là khác nhau, t l s ng cao hơn môi trư ng 2 và 3 v i 10% DMSO, 50% và 90% FBS; nhưng th p hơn 50% t bào s ng sau khi gi i ñông. Trong ba phương pháp ñông l nh, dù môi trư ng nào thì t l ph n trăm t bào s ng c a phương pháp ñông l nh nhanh cũng cao hơn phương pháp ñông l nh in situ, và tương ñ i cao hơn phương pháp ñông l nh c c nhanh. Tác ñ ng c a huy t thanh lên s c s ng t bào sau khi gi i ñông là có, nhưng ch t n t i trong m t ngư ng nh t ñ nh (có th là 50%). Tính g c c a t bào g c trung mô máu cu ng r n sau quá trình ñông l nh b ng ba phương pháp v i ba môi trư ng khác nhau s không thay ñ i, ti m năng tăng sinh và phát tri n c a chúng trư c và sau khi gi i ñông là như nhau. ð b o qu n t bào g c trung mô t máu cu ng r n, n u s d ng ñông l nh nhanh thì nên ch n môi trư ng ñông l nh là 90% FBS và 10% DMSO. N u s d ng phương pháp c c nhanh thì nên ch n môi trư ng v i 10% FBS và 10% DMSO vì s gi m giá thành. Phương pháp này cũng có l i ñi m khác là ti n hành r t nhanh (ch trong 15 phút, k c th i gian ñưa t bào vào cyotube) v i phương pháp ñông l nh nhanh (t n ch ng 3 gi ñ ñưa vào nitơ l ng). Phương Trang 20 B n quy n thu c ðGQG-HCM
  10. T P CHÍ PHÁT TRI N KH&CN, T P 12, S 09 - 2009 pháp ñông l nh in situ dù v i môi trư ng có n ng ñ huy t thanh c c cao (90%) cũng cho t l ph n trăm t bào s ng r t th p (
  11. Science & Technology Development, Vol 12, No.09 - 2009 [7]. Moustapha Kassen, Mesenchymal Stem Cells: Cell Biology and Potenntial Use in Therapy. Basic & Clinical Pharmacology & Texicology. 95, 209 – 214, (2004).. [8]. Orief Y, Mosgau AS, Dafopoulos K, Al-Hasani S, Vitrification: will it replace the conventional gamete cryopreservation techniques? Middle East Fertility Society Journal. 10(3): 171 – 184, (2005). [9]. Oscar K. Lee, Tom K. Kuo, Wei-Ming Chen, Kuan-Der Lee, Shie-Liang Hsieh and Tain-Hsiung Chen, Isolation of multipotent mesenchymal stem cells from umbilical cord blood. Blood, 103: 1669-1675, (2004). [10]. Son JH, Kim KH, Nam YK, Park JK, Kim SK, Optimization of Cryoprotectants for Cryopreservation of Rat Hepatocyte. Biotechnol Lett. 26 (10): 829 – 833, (2004). Trang 22 B n quy n thu c ðGQG-HCM
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

LV.15: Bộ Đồ Án Tốt Nghiệp Chuyên Ngành Cơ Khí
65 tài liệu
2431 lượt tải
THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
7=>1