BÁO CÁO KHOA HỌC: "NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN LOẠI CHI Ganoderma BẰNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ RAPDPCR VÀ MỒI ĐẶC HIỆU LACCASE"

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN LOẠI CHI

Ganoderma BẰNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ RAPD-

PCR VÀ MỒI ĐẶC HIỆU LACCASE

Nguyễn Hoài Giang

Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương

Nguyễn Xuân Hùng, Trịnh Tam Kiệt, Lê Đình Lương

Trung tâm Công nghệ Sinh học, ĐHQG Hà nội

ĐẶT VẤN ĐỀ

Từ lâu, nấm linh chi (Ganoderma) được biết tới như một

loại thuốc dân gian có tác dụng tăng cường sức khoẻ và

chữa trị nhiều loại bệnh (bệnh thận, gan, bệnh tiểu đường,

bệnh tim mạch, dị ứng...). Ganoderma có khả năng tăng

cường sự thải độc ở gan và kích thích hệ thống miễn dịch

hoạt động hiệu quả hơn. Ganoderma còn kìm hãm sự sinh

tổng hợp ADN mới của tế bào ung thư, kìm hãm sự phát

triển của các khối u và hạn chế sự di căn. Các nghiên cứu y

và dược học cũng cho thấy các loài Ganoderma khác nhau

cũng có thể sản sinh ra các loại hợp chất sinh học có hoạt

tính khác nhau (1). Việc phân loại Ganoderma dựa vào

hình thái và các isozym gặp nhiều khó khăn, nhiều khi

thiếu chính xác. Gần đây, việc sử dụng đoạn trình tự ITS

(Internal Transcribed Spacer) của ADN ribosom và kỹ

thuật nhân bản ngẫu nhiên ADN bằng mồi tuỳ ý (Random

Amplified Polymorphic DNA: RAPD) đã góp phần quan

trong trọng việc phân loại Ganoderma ở mức độ ADN (2).

Ngoài tác dụng làm thuốc, Ganoderma cũng là những loài

nấm gây bệnh và phá huỷ nhiều cây thân gỗ. Laccase,

lignin peroxidases (LIPs) và peroxidases phụ thuộc mangan

(MNPs) là ba nhóm enzym được cho là có vai trò quan

trọng trong việc phân huỷ gỗ của các loại nấm. Enzym

laccase, LIPs và MNPs có khả năng oxy hoá các phức

phenolic để tạo thành gốc phenoxy. Mỗi phân tử enzym

laccase liên kết với bốn nguyên tử đồng. Những nghiên cứu

về cấu trúc và chức năng của laccase cho thấy tại vị trí giữa

một axit amin cystein và mười axit amin histidin là điểm

bám cho bốn nguyên tử đồng và trình tự ở quanh vị trí này

thường rất ít thay đổi ở những loài nấm khác nhau (3, 4).

Nghiên cứu này giới thiệu một cách tiếp cận nhằm góp

phần phân loại và xếp nhóm ở Ganoderma: Sử dụng

RAPD-PCR với mồi ngẫu nhiên OPU1 và PCR với cặp

mồi đặc hiệu cho hai đoạn trong gen laccase.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP:

Vật liệu:

Các mẫu nấm Ganoderma lucidum với các nhóm dưới loài

khác nhau được ký hiệu là Gl 1 và Gl 2; Ganoderma

australe sensulato với các nhóm dưới loài khác nhau được

ký hiệu là Ga 1 và Ga 2; Ganoderma applanatum sensulato

với các nhóm dưới loài khác nhau được ký hiệu là Gb 1 và

Gb 2; Ganoderma tortnatum sensulato với các nhóm dưới

loài khác nhau được ký hiệu là Gc 1 và Gc 2; Ganoderma

australe được ký hiệu là Gau, do phòng thí nghiệm nấm -

Trung tâm Công nghệ Sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội

cung cấp.

Phương pháp nghiên cứu:

- Tách chiết ADN từ các mẫu Ganoderma theo phương

pháp của Porebski và được thích ứng với điều kiện phòng

thí nghiệm của Việt Nam theo cải tiến của các tác giả

Nguyễn Thị Kim Dung và Lê Đình Lương (6).

- Kỹ thuật RAPD-PCR với mồi OPU 1, trình tự là 5'-

ACGGACGTCA -3' (6). - PCR với mồi đặc hiệu cho 2

đoạn gen laccase của G. lucidum 103561 (4).

- Điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamid 6% và

nhuộm bạc (7).

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Sử dụng kỹ thuật RAPD-PCR để phân loại Ganoderma

Đoạn trình tự ITS của ADN ở ribosom được sử dụng rất

phổ biến trong nghiên cứu phân loại Ganoderma. Tuy

nhiên, thông tin về trình tự vùng ITS nhiều khi không thay

đổi ở một số taxon gần nhau. Do vậy nếu chỉ sử dụng kết

quả đoạn ITS sẽ không đảm bảo có sự chính xác cao trong

phân loại Ganoderma (2). Trong thời gian gần đây, kỹ

thuật RAPD-PCR được sử dụng rất phổ biến và là một

trong những phương pháp nhạy, có hiệu quả cao để phân

biệt những taxon không thể phân biệt được bằng ITS (2).

Để phân loại các loài Ganoderma mà chúng tôi hiện đang

có, kỹ thuật RAPD-PCR với mồi OPU 1 được sử dụng (6). Điều kiện PCR sau khi được tối ưu hoá là 94oC 2 phút/ 35 chu kỳ với 94oC 1 phút, 46oC 30 giây, 72oC 2 phút/ 72oC

10 phút.

Kết quả điện di trên gel polyacrylamid 6% và nhuộm bạc

cho thấy: các mẫu Ganoderma lucidum có 5 băng ADN

giống nhau với kích thước khoảng 1636, 800, 690, 630 và

450 bp; các mẫu Ganoderma australe sensulato có 4 băng

ADN giống nhau với kích thước khoảng 1824, 407, 370 và

300 bp; các mẫu Ganoderma applanatum sensulato có 3

băng ADN giống nhau với kích thước khoảng 310, 240 và

140 bp; các mẫu Ganoderma tortnatum sensulato có 4 băng

ADN giống nhau với kích thước khoảng 702, 510, 412 và

350 bp. Mẫu Ganoderma australe có 1 băng ADN kích

thước khoảng 450 bp giống như các mẫu Ganoderma

lucidum.

Kết quả RAPD-PCR với mồi OPU 1 cho thấy các mẫu nấm

Ganoderma lucidum, Ganoderma australe sensulato,

Ganoderma applanatum sensulato, Ganoderma tortnatum

sensulato và Ganoderma australe có những băng ADN đặc

trưng riêng của từng loài. Hơn nữa, ở các mẫu dưới loài

ngoài những băng khác nhau, giữa chúng còn có những

băng đặc trưng riêng biệt.

Hình 1. Kỹ thuật RAPD-PCR với các mẫu Ganoderma

khác nhau

Giếng 1 và 2: Ganoderma lucidum (Gl 1 và Gl 2).

Giếng 3: Ganoderma australe (Gau).

Giếng 4 và 5: Ganoderma tortnatum sensulato (Gc 1 và Gc

2).

Giếng 6 và 7: Ganoderma applanatum sensulato (Gb 1 và

Gb 2).

Giếng 8 và 9: Ganoderma australe sensulato (Ga 1 và Ga

2).

Mr: Thang ADN chuẩn 1kb

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho 2 đoạn của gen laccase

trong phân loại Ganoderma

Những nghiên cứu về gen laccase cho thấy vùng I và II ở vị

trí bám của nguyên tử đồng thường có trình tự không thay

đổi (4). Vùng bảo thủ này tại đầu N của enzym laccase có

trình tự là HWHGFQ và TFWYHSH. Căn cứ vào các axit

amin này chúng tôi đã thiết một cặp mồi đặc hiệu cho gen

này ở Ganoderma lucidum 103561 là LA1: 5'- CAT TGG

CAC GGA TTC TTC -3’; LA2: 5'- ATG GCT GTG GTA CCA GAA -3'. Điều kiện PCR sau khi tối ưu hoá là 94oC 3 phút/ 30 chu kỳ với 94oC 30 giây, 55oC 30 giây, 72oC 20 giây/ 72oC 3 phút.

Kết quả điện di các sản phẩm PCR cho thấy: Ganoderma

lucidum (Gl 1 và Gl 2) tạo ra 2 băng ADN với kích thước

217 và 144 bp. Ganoderma australe (Gau) tạo ra 1 băng

kích thước 144 bp. Ganoderma tortnatum sensulato (Gc 1

và Gc 2) tạo ra 1 băng kích thước 144 bp. Ganoderma

australe sensulato và Ganoderma applanatum sensulato

(Ga và Gb) không cho sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu

cho các đoạn trong gen laccase của Ganoderma lucidum

103561 (Hình 2). Kết quả với mồi ngẫu nhiên OPU 1 (từ

giếng 6 đến 9, hình 1) đã khẳng định tất cả các mẫu

Ganoderma đã được tách chiết tốt. Việc không tạo ra PCR

sản phẩm của Ganoderma australe sensulato và

Ganoderma applanatum sensulato chỉ có thể là do trình tự

gen laccase (nếu có) của chúng khác với trình tự của

Ganoderma lucidum 103561 tại vị trí được chúng tôi thiết

kế cặp mồi.

Kết quả này phù hợp với kết quả tách dòng gen laccase từ

nhiều loài nấm khác nhau của D’souza và các cộng sự

(1996). Sử dụng cặp mồi thoái hoá (degenerate PCR

primers) được thiết kế tại vùng bảo thủ của gen laccase,

D’souza và các cộng sự quan sát được 2 băng sản phẩm

PCR kích thước 217 và 144 bp ở các loài nấm Ganoderma

lucidum 103561, Grifola frondosa, Lentinula edodes và

Lentinus tigrinus. Ở các loài nấm Ganoderma lucidum

58537, Phlebia brevispora, Phlebia tremellosa và Trametes

versicolor sản phẩm PCR với cặp mồi kể trên chỉ là một

băng với kích thước 217 bp. Trong thí nghiệm sử dụng cặp

mồi laccase do chúng tôi thiết kế cũng cho 1 băng duy nhất

kích thước 217 bp với Ganoderma lucidum của Hàn quốc

(kết quả chưa công bố). Ở loài Gloeophyllum trabeum sản

phẩm PCR của gen laccase lại chỉ là một băng duy nhất với

kích thước 144 bp. Ngược lại ở các loài nấm Fomes

fomentarius và Pleurotus ostreatus thì không quan sát được

sản phẩm PCR.

Kết quả nghiên cứu này cũng gợi ý chúng tôi việc sử dụng

cặp mồi đặc hiệu của gen laccase ở Ganoderma lucidum

103561 để thực hiện phân loại Ganoderma. Về cơ bản nếu

1 mẫu nấm cho 2 băng ADN sản phẩm PCR (217 và 144

bp) với cặp mồi đặc hiệu cho gen laccase của Ganoderma

lucidum 103561 thì chúng có nhiều khả năng sẽ thuộc

nhóm Ganoderma lucidum.

Nếu mẫu nấm cho 1 băng ADN sản phẩm PCR (144 bp) thì

mẫu này có nhiều khả năng thuộc nhóm Ganoderma

australe hoặc Ganoderma tortnatum sensulato. Ngược lại

nếu không tạo ra được sản phẩm PCR thì mẫu đó ít có khả

năng là Ganoderma lucidum, Ganoderma australe hoặc

Ganoderma tortnatum sensulato. Nhóm Ganoderma

australe sensulato và Ganoderma applanatum sensulato có

thể vẫn có gen mã hoá cho enzym laccase nhưng trình tự sẽ

khác với cặp mồi chúng tôi đã thiết kế, vì vậy không cho

sản phẩm PCR khi được nhân lên với cặp mồi đặc hiệu của

Ganoderma lucidum 103561.

Bước tiếp theo của nghiên cứu này sẽ là tiến hành giải trình

tự các đoạn gen laccase của các loài Ganoderma ở Việt

nam, để nghiên cứu sự giống và khác nhau của các loài

Ganoderma lucidum. Sau khi biết trình tự của các đoạn

trong gen laccase này chúng tôi có thể sẽ sử dụng kỹ thuật

RFLP để phân biệt các loài khác nhau cho cùng một kích

thước sản phẩm PCR với gen laccase.

Hình 2. Nhân các đoạn gen laccase từ các mẫu Ganoderma

khác nhau bằng PCR

Giếng 1 và 2: Ganoderma lucidum (Gl 1 và Gl 2).

Giếng 3: Ganoderma australe (Gau).

Giếng 4 và 5: Ganoderma tortnatum sensulato (Gc 1 và Gc

2).

Giếng 6 và 7: Ganoderma applanatum sensulato (Gb 1 và

Gb 2).

Giếng 8 và 9: Ganoderma australe sensulato (Ga 1 và Ga

2).

Mr: Thang ADN chuẩn 1kb

KẾT LUẬN

Kỹ thuật RAPD-PCR có thể sử dụng để xác định mối quan

hệ về nguồn gốc các loài Ganoderma đang có ở Việt nam.

Gen laccase là một chỉ thị phân tử có triển vọng để ứng

dụng trong việc phân loại và định nhóm Ganoderma ở Việt

nam.

LỜI CẢM ƠN

Công trình này được hoàn thành với sự hỗ trợ của Chương

trình Nghiên cứu Cơ bản trong lĩnh vực Khoa học Tự

nhiên, hướng 8.2

This work was supported by the National Basis Research

Program for Natural Sciences, direction 8.2

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Jong, S. C., and Birmingham, M. J. (1992). Medical

benefits of the mushroom Ganoderma. Advance and

Applied Microbiology. 37, pp. 101-134.

2. Hseu R., Wang H. H., Wang F. H., and Moncalvo M. J.

(1996). Differentiation and grouping of isolates of the

Ganoderma lucidum complex by random amplified

polymorphic DNA- PCR compared with grouping on the

basis of internal transcribed spacer sequences. Applied and

Environmental Microbiology. 62(4), pp. 1354-1363.

3. Thurston, C. F. (1994). The structure and function of

fungal laccases. Microbiology. 140, pp. 19-26.

4. D’souza, M. T., Boominathan, K., and Reddy A.C.

(1996). Isolation of Laccase Gene- Specific Sequences

from White Rot and Brown Rot Fungi by PCR. Applied

and Environmental Microbiology. 62(10), pp. 1354-1363.

5. Poreski, S., Bailey, G. L., and Baum, R. B. (1997).

Modification of a CTAB Extraction Protocol for Plant

containing High

Polysaccharide and Polyphenol Components. Plant

Molecular Biology. 15(1), pp. 8-15.

6. Nguyễn Thị Kim Dung, Lê Đình Lương. (2004). Nghiên

cứu khắc phục khó khăn trong tách chiết ADN và bất hoạt

ức chế PCR ở Ganoderma. Tạp chí Di truyền học và ng

dụng. Số 4, trang 1-7.

7. Sambrook, J., Frisch, E. F., and Maniatis, T. (1989).

Molecular Cloning.

SUMMARY

Classification of the Ganoderma complex by RAPD- PCR

and specific primers of laccase gene

Ganoderma species are known as the herb of longevity.

These fungi have been used in folk medicine for hundreds

of years. The use of traditional taxonomic methods has

been inconclusive for establishing a stable classification of

the group, and these methods are useless for

characterization of individual strains. Parsimony analysis of

nucleotide sequences from the internal transcribed spacers

(ITS) of the ribosomal gene can be used to distinguish

some monophyletic groups of the Ganoderma species.

However, some other Ganoderma species have identical

ITS sequences. RAPD-PCR is one of the most sensitive and

efficient methods currently available for distinguishing

between different strains of a species. RAPD-PCR is

helpful for systematics at the lower taxonomic levels that

are unsolved by ITS sequence data. Laccase are copper-

containing oxidases which catalyze the four-electron

oxidatin of a variety of phenolic compound and

simultaneous four-electron reduction of oxygen to water.

Structure-function studies of laccase have shown that one

cysteine and ten histidine residues are involved in binding

the four copper atoms and that the sequences around these

residues are highly conserved in different laccases.

Our data demonstrated that RAPD-PCR with OPU1 primer

(5'- ACGGACGTCA -3') and PCR with the specific pair of

PCR primers for laccase gene from Ganoderma lucidum

103561 (LA1: 5'- CAT TGG CAC GGA TTC TTC -3’ and

LA2: 5'- ATG GCT GTG GTA CCA GAA -3') can be used

for classification of Ganoderma complex in Vietnam.

Người thẩm định nội dung khoa học: GS.VS. Vũ Tuyên

Hoàng