Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật đề tài: Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp cyclophosphamide làm thuốc điều trị ung thư

viÖn ho¸ häc

viÖn khoa häc vµ c«ng nghÖ viÖt nam

18 §−êng Hoµng Quèc ViÖt - CÇu GiÊy - Hµ Néi B¸o c¸o tæng kÕt khoa häc kü thuËt

®Ò tµi:

"nghiªn cøu x©y dùng quy tr×nh

tæng hîp cyclophosphamide lµm

thuèc ®iÒu trÞ ung th−"

GS. TSKH. TrÇn V¨n Sung

6500 10/9/2007

Hµ Néi, 4 - 2006

B¶n quyÒn 2006 thuéc VHH - VAST §¬n xin sao chÐp toµn bé hoÆc tõng phÇn tµi liÖu nµy ph¶i göi ®Õn ViÖn tr−ëng VHH - VAST trõ tr−êng hîp sö dông cho môc ®Ých nghiªn cøu.

viÖn ho¸ häc

viÖn khoa häc vµ c«ng nghÖ viÖt nam

18 §−êng Hoµng Quèc ViÖt - CÇu GiÊy - Hµ Néi

B¸o c¸o tæng kÕt khoa häc kü thuËt

®Ò tµi:

"nghiªn cøu x©y dùng quy tr×nh

tæng hîp cyclophosphamide lµm

thuèc ®iÒu trÞ ung th−"

GS. TSKH. TrÇn V¨n Sung Hµ Néi, 4 - 2006

B¶n th¶o viÕt xong 1/ 2006. Tµi liÖu nµy ®−îc chuÈn bÞ trªn c¬ së kÕt qu¶ thùc hiÖn §Ò tµi cÊp Nhµ n−íc, m· sè KC 10. 25

Danh s¸ch c¸n bé tham giathùc hiÖn ®Ò tµi

Hä vµ tªn C¬ quan c«ng t¸c

Chñ nhiÖm ®Ò tµi

1. GS.TSKH. TrÇn V¨n Sung ViÖn Ho¸ häc, ViÖn KH vµ CNVN

C¸n bé tham gia nghiªn cøu

1. PGS. TS. NguyÔn H÷u §Þnh Khoa Ho¸

Tr−êng §HKHTN, §HQG Hµ Néi

2. ThS. NguyÔn ViÖt Th¾ng nt

3. ThS. TrÇn V¨n Léc ViÖn Ho¸ häc, ViÖn KH vµ CNVN

4. ThS. TrÇn V¨n ChiÕn nt

5. ThS. TrÇn §øc Qu©n nt

6. CN. Ph¹m ThÞ Ninh nt

7. TS. TrÞnh ThÞ Thuû nt

8. TS. NguyÔn ThÞ Hoµng Anh nt

9. TS. NguyÔn Thanh §¹m BÖnh ViÖn K Hµ Néi

10. ThS. NguyÔn TuyÕt Mai nt

11. DS. Lª TiÕn Dòng XN D−îc phÈm TW I

12. TS. Phïng ThÞ Vinh ViÖn KiÓm nghiÖm

Môc lôc

Bµi tãm t¾t

1. 2.

PhÇn chÝnh b¸o c¸o

2.1.

PhÇn tæng quan

2.1.1.

Cyclophosphamide

2.1.1.1.

C¬ chÕ t¸c dông cña cyclophosphamide

2.1.1.2.

2.1.1.3.

2.1.1.4.

2.1.1.5.

Tæng hîp cyclophosphamide Tiªu chuÈn cña cyclophosphamide ®−îc m« t¶ trong c¸c D−îc ®iÓn T×nh h×nh nghiªn cøu, sö dông cyclophosphamide t¹i ViÖt Nam C¸c d¹ng s¶n phÈm chÝnh cña cyclophosphamide vµ nhu cÇu vÒ thuèc cyclophosphamide

2.1.2.

TrÝch dÉn néi dung thuyÕt minh cña §Ò tµi

2.2.

C¸c kÕt qu¶ nghiªn cøu cña §Ò tµi

2.2.1.

Nghiªn cøu quy tr×nh tæng hîp cyclophosphamide

Quy tr×nh tinh chÕ s¶n phÈm cyclophosphamide

2.2.2.

2.2.3.

2.2.4.

Nghiªn cøu kh¼ng ®Þnh cÊu tróc ho¸ häc cña s¶n phÈm cyclophosphamide tæng hîp ®−îc KiÓm nghiÖm s¶n phÈm cyclophosphamide theo tiªu chuÈn D−îc ®iÓn Anh, BP 2001 Nghiªn cøu ®éc tÝnh cÊp vµ b¸n cÊp cña s¶n phÈm cyclophosphamide

2.2.5.

Nghiªn cøu bµo chÕ thuèc cyclophosphamide pha tiªm

2.2.6.

Nghiªn cøu thö nghiÖm l©m sµng thuèc cyclophosphamide pha tiªm

2.2.6.1.

§Ò c−¬ng nghiªn cøu thö nghiÖm l©m sµng

2.2.6.2.

KÕt qu¶ nghiªn cøu thö nghiÖm l©m sµng

2.2.7.

Nghiªn cøu ®é bÒn cña cyclophosphamide

2.2.7.1.

2.2.7.2.

Nghiªn cøu ®é bÒn cña nguyªn liÖu cyclophosphamide Nghiªn cøu ®é bÒn cña cyclophosphamide ë trong dung dÞch n−íc

2.2.8.

C¸c kÕt qu¶ kh¸c

KÕt luËn vµ kiÕn nghÞ

B¸o c¸o quyÕt to¸n tµi chÝnh

Lêi c¶m ¬n

Tµi liÖu tham kh¶o

1. Bµi tãm t¾t

1.1. §Æt vÊn ®Ò

HiÖn nay ViÖt Nam vÉn ph¶i nhËp khÈu mét l−îng lín thuèc

cyclophosphamide ®Ó ®iÒu trÞ ung th− vµ mét sè bÖnh kh¸c cã nguyªn nh©n

tù miÔn. Theo dù tÝnh, hµng n¨m sè tiÒn ®Ó nhËp khÈu cyclophosphamide

riªng cho nhu cÇu ch÷a bÖnh ung th− lµ kho¶ng 26 tØ ®ång. §Ò tµi "Nghiªn

cøu x©y dùng quy tr×nh tæng hîp cyclophosphamide lµm thuèc ®iÒu trÞ ung

th−" cã m· sè KC 10.25 ®Æt ra c¸c môc ®Ých sau ®©y:

• Nghiªn cøu x©y dùng quy tr×nh tæng hîp cyclophosphamide cã tÝnh kh¶ thi,

vµ tÝnh kinh tÕ cao.

• Nghiªn cøu ®éc tÝnh cÊp vµ b¸n cÊp cña cyclophosphamide; KiÓm nghiÖm

cyclophosphamide theo tiªu chuÈn D−îc ®iÓn Anh BP 2001.

• Nghiªn cøu bµo chÕ thuèc cyclophosphamide pha tiªm trªn d©y chuyÒn

GMP. Thuèc bµo chÕ xong ph¶i ®¹t tiªu chuÈn thuèc tiªm cña D−îc ®iÓn Anh

BP 2001.

• Nghiªn cøu ®¸nh gi¸ l©m sµng giai ®o¹n I thuèc cyclophosphamide tæng hîp

®−îc trªn bÖnh nh©n ung th−.

1.2. Nguyªn liÖu vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu:

1.2.1. Nguyªn liÖu:

C¸c ho¸ chÊt ®−îc sö dông cã ®é tinh khiÕt P. A. cña h·ng Merck, CHLB

§øc.

1.2.2. Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu:

• C¸c ph−¬ng ph¸p dïng ®Ó ph©n tÝch cÊu tróc cña cyclophosphamide tæng hîp

®−îc lµ hiÖn ®¹i vµ phï hîp nh− phæ MS, LC/MS, IR vµ NMR (1H -, 13C -

NMR) ®−îc thùc hiÖn t¹i ViÖn Ho¸ häc, ViÖn Khoa häc vµ C«ng nghÖ ViÖt

Nam.

• C¸c ph−¬ng ph¸p tæng hîp ®−îc dùa theo patent cña §øc, Liªn minh Ch©u

¢u, Mü cã kÕt hîp víi c¸c tµi liÖu tham kh¶o kh¸c, ®−îc thùc hiÖn t¹i tr−êng

§HKHTN - §HQG Hµ Néi vµ ViÖn Ho¸ häc, ViÖn KH vµ CNVN.

• C¸c ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu vÒ y d−îc ®−îc sö dông lµ nh÷ng ph−¬ng ph¸p

quy chuÈn cña Bé Y tÕ, ®−îc thùc hiÖn t¹i c¸c c¬ quan khoa häc do Bé Y tÕ

chØ ®Þnh nh− ViÖn KiÓm nghiÖm, xÝ nghiÖp D−îc phÈm TW I vµ bÖnh viÖn K

Hµ Néi.

1.3. C¸c kÕt qu¶ ®· ®¹t ®−îc:

• §· tiÕn hµnh nghiªn cøu vµ ®Ò ra ®−îc quy tr×nh kh¶ thi cã hiÖu qu¶ kinh tÕ

vµ øng dông quy tr×nh nµy ®Ó tæng hîp 4250 gam cyclophosphamide.

• §· ®−a ra ®−îc bé phæ chuÈn cña cyclophosphamide tæng hîp ®−îc gåm: IR,

MS, LC/ MS, 1H -, 13C - NMR.

• S¶n phÈm cyclophosphamide tæng hîp ra ®· ®−îc nghiªn cøu ®éc tÝnh cÊp vµ

®éc tÝnh b¸n cÊp, ®−îc ph©n tÝch, kiÓm nghiÖm theo tiªu chuÈn D−îc ®iÓn

Anh BP 2001. TÊt c¶ c¸c tiªu chÝ ®Òu ®¹t.

• Cyclophosphamide ®· ®−îc bµo chÕ thµnh thuèc bét pha tiªm trªn d©y

chuyÒn GMP cña xÝ nghiÖp D−îc phÈm TW I. Thuèc vµ n−íc cÊt pha tiªm

®¹t tiªu chuÈn BP 2001.

• Thuèc cyclophosphamide ®· ®−îc nghiªn cøu l©m sµng giai ®o¹n I ®èi víi

bÖnh nh©n ung th− t×nh nguyÖn t¹i bÖnh viÖn K Hµ Néi.

KÕt qu¶: Víi liÒu 750 mg/ m2 da c¬ thÓ c¸c bÖnh nh©n ®Òu cã ®¸p øng mét

phÇn. LiÒu 750 mg/ m2 da c¬ thÓ lµ liÒu sö dông an toµn.

1.4. KÕt luËn vµ kiÕn nghÞ

• §Ò tµi ®· hoµn thµnh tèt c¸c môc tiªu ®· ®Ò ra vµ theo ®óng tiÕn ®é.

• Thanh quyÕt to¸n tµi chÝnh theo ®óng dù to¸n vµ quy ®Þnh cña nhµ n−íc.

• §Ò nghÞ Bé Khoa häc vµ C«ng nghÖ xem xÐt phª duyÖt giai ®o¹n tiÕp theo

cña §Ò tµi ®Ó nghiªn cøu l©m sµng giai ®o¹n II vµ III nh»m ®¸nh gi¸ hiÖu

qu¶ chèng ung th− cña thuèc vµ ®−a ra s¶n xuÊt, ®¸p øng nhu cÇu trong n−íc,

thay thÕ thuèc nhËp khÈu.

PhÇn chÝnh b¸o c¸o 2.

2.1. PhÇn tæng quan

Cyclophosphamide 2.1.1.

Cyclophosphamide cã tªn khoa häc lµ (RS)-2-[bis(2-chloroethyl) amino]

tetrahydro-2H-1,3,2-oxazo phosphorine 2-oxide hoÆc N,N-bis-[2-chloroethyl] N,O-

trimethylendiamidophosphat (I); c«ng thøc tæng lµ C7H15Cl2N2O2P. H2O, khèi l−îng

ph©n tö lµ 279,1.

C«ng thøc cÊu t¹o lµ:

O

Cl

H2C

O

P

N

. H2O

Cl

H2C

HN

Tinh thÓ cyclophosphamide cã mµu tr¾ng hoÆc gÇn tr¾ng, tan trong n−íc, rÊt

dÔ tan trong cån, tan võa ph¶i trong ete.

2.1.1.1. C¬ chÕ t¸c dông cña cyclophosphamide

Cyclophosphamide ®−îc sö dông nhiÒu trong l©m sµng víi mét phæ t¸c dông

réng vµ hiÖu qu¶ ®èi víi c¸c bÖnh ung th− ë ng−êi. Ngoµi lý do vÒ t¸c dông ®iÒu trÞ,

cyclophosphamide cßn cã c¬ chÕ t¸c dông rÊt ®éc ®¸o vµ tÝnh chän läc trong ®iÒu

trÞ.

HiÖn nay cyclophosphamide lµ lo¹i thuèc chèng ung th− ®−îc sö dông nhiÒu

nhÊt trong ®iÒu trÞ ho¸ chÊt liÒu cao víi tæng liÒu l−îng dïng lµ 500 -700mg/m2 da

ng−êi trong 1 ®Õn 4 ngµy. Lµ mét lo¹i ho¹t chÊt dÔ mÊt nit¬, cyclophosphamide

®ãng vai trß ankyl ho¸ ADN lµm cho ADN kh«ng th¸o rêi ®−îc, do vËy kh«ng t¹o

thµnh ARN do ®ã dÉn tíi viÖc t¸i s¶n xuÊt tÕ bµo bÞ k×m h·m, tr−íc hÕt lµ ®èi víi

c¸c hÖ tÕ bµo ph¸t triÓn nhanh nh− c¸c tuyÕn tiÕt, da, tuû x−¬ng vµ ®Æc biÖt lµ c¸c u

¸c tÝnh [1,2].

C¸c hîp chÊt cã tÝnh ankyl ho¸ sÏ tÊn c«ng vµo qu¸ tr×nh trao ®æi chÊt cña a

xÝt nucleic vµ k×m h·m sù ph¸t triÓn hoÆc tiªu diÖt nh÷ng tÕ bµo bÞ bÖnh. Tuy nhiªn,

chóng còng tÊn c«ng c¶ tÕ bµo lµnh vµ ë liÒu hiÖu dông chóng còng cã ®éc tÝnh ®¸ng

kÓ.

Theo t¸c gi¶ Charlotte le Roux vµ céng sù th× c¬ chÕ alkyl ho¸ cña

cyclophosphamide ®−îc lý gi¶i nh− sau [6]:

HO O P

O O P

Cl

CH2

Cl

CH2

-H + +H +

N

NH

H2N

N

H2N

Cl

CH2

Cl

CH2

Cyclophosphamide (I)

(A)

- Cl -

O O P

+ Nu -

Nu

O O P

+ Nu -

CH2

CH2 CH2 Nu

O O P

N

H2N

N

H2N

N

H2N

Nu

CH2

CH2 CH2 Cl

CH2 CH2 Nu

CH2 CH2 Cl

(B)

Trong c¬ thÓ cyclophosphamide gi¶i phãng ra chÊt phosphoramidat (A) mét

t¸c nh©n alkyl ho¸ cã ho¹t tÝnh sinh häc. Ho¹t tÝnh sinh häc cña chÊt (A) ®−îc gi¶i

thÝch qua d·y ph¶n øng bao gåm: ®ãng vßng néi ph©n tö; më vßng nucleophil. Qu¸

tr×nh nµy lÆp l¹i hai lÇn dÉn ®Õn s¶n phÈm cuèi cïng ®−îc alkyl ho¸ hai lÇn (B).

Tuy nhiªn, c¬ chÕ chÝnh x¸c cña qu¸ tr×nh alkyl ho¸ cña chÊt (A) vÉn lµ vÊn

®Ò cßn Ýt ®−îc biÕt. C¸c b−íc theo tr×nh tù trªn bao gåm c¸c chÊt azinidin trung gian

®· ®−îc minh chøng b»ng c¸c thÝ nghiÖm ®¬tªr« ho¸. Nh−ng liÖu chÊt (A) sÏ tham

gia ph¶n øng alkyl ho¸ nguyªn vÑn hay liªn kÕt P-N sÏ bÞ c¾t tr−íc khi alkyl ho¸ th×

hiÖn vÉn cßn tranh c·i [6].

Theo nguyªn lý vÒ ''d¹ng vËn chuyÓn" (transport) vµ '' d¹ng ho¹t tÝnh '' (active

form) cña mét biÖt d−îc ®èi víi c¸c chÊt cã t¸c dông ankyl ho¸ th× mét ho¹t chÊt

cÇn ®−îc ®−a vµo c¬ thÓ ë ''d¹ng vËn chuyÓn'' tøc lµ ë d¹ng ch−a cã ho¹t tÝnh. D¹ng

nµy sÏ chuyÓn thµnh ''d¹ng ho¹t tÝnh'' trong c¬ thÓ vµ nÕu cã thÓ th× ngay t¹i vÞ trÝ

cÇn ®iÒu trÞ cã nghÜa lµ lµm t¨ng ®é chän läc cña thuèc. VÝ dô: §èi víi c¸c chÊt dÔ

bÞ lo¹i nit¬ th× hîp chÊt chøa nhãm oxit nit¬ (N→O) lµ mét '' d¹ng vËn chuyÓn''

thùc thô. Nguyªn lý nµy ®· ®−îc ¸p dông víi lo¹i thuèc ch÷a ung th− tiÒn liÖt tuyÕn

lµ stilbeoestroldiphosphate.

Nh− ®· biÕt th× trong c¬ thÓ ng−êi bÖnh, t¹i bé phËn bÞ ung th− cã tån t¹i mét

enzym d¹ng phosphamidasa vµ phosphatasa cã thÓ thuû ph©n ®−îc liªn kÕt

phosphamide vµ este cña axit phosphoric.

Víi ý t−ëng lµ: ®é chän läc cña thuèc sÏ t¨ng ®¸ng kÓ, nÕu ''d¹ng ho¹t tÝnh''

®−îc t¹o thµnh trùc tiÕp t¹i vÞ trÝ cÇn ®iÒu trÞ, ng−êi ta ®· tæng hîp ra chÊt

phosphamide este II ®Ó nghiªn cøu ®éng d−îc häc cña cyclophosphamide.

Cl

NH

H2C

R1

N P

O

Cl

O

H2C

R2

2.1.1.2. Tæng hîp cyclophosphamide

Cyclophosphamide ®· ®−îc Arnold, Bourseaux vµ Hirsch [3,4] t×m ra lÇn ®Çu

tiªn n¨m 1956 trong phßng nghiªn cøu cña nhµ m¸y Asta víi ký hiÖu lµ B518. ViÖc

tæng hîp ra chÊt nµy lµ kÕt qu¶ cña sù mong muèn ¸p dông nguyªn lý ''d¹ng vËn

chuyÓn" vµ '' d¹ng ho¹t tÝnh ''. Cyclophosphamide ®−îc sö dông trong ®iÒu trÞ ung

th− tõ n¨m 1958 hoÆc 1970 [1]. Ngoµi ra, cyclophosphamide cßn ®−îc sö dông nh−

mét chÊt øc chÕ miÔn dÞch ®Ó ®iÒu trÞ c¸c bÖnh tù miÔn nh− nh−îc c¬, thÊp khíp,

lupót ban ®á vµ ®Æc biÖt ®Ó chèng th¶i ghÐp trong c¸c ca ghÐp t¹ng [19, 24, 25].

Arnold, Bourseaux vµ Brock [7] ®· nghiªn cøu mèi quan hÖ gi÷a cÊu tróc vµ

ho¹t tÝnh kh¸ng ung th− cña hîp chÊt nµy. KÕt qu¶ thu ®−îc ë chÊt

cyclophosphamide lµ rÊt kh¶ quan vÒ mÆt d−îc lý vµ l©m sµng [4].

C¬ chÕ biÕn ®æi cña cyclophosphamide trong c¬ thÓ ®· ®−îc C.L. Roux vµ

céng sù tiÕp tôc nghiªn cøu [6].

Mét dÉn xuÊt kh¸c cña cyclophosphamide cã nhãm thÕ ë m¹ch vßng còng ®·

®−îc tæng hîp ®Ó nghiªn cøu ho¹t tÝnh chèng ung th− [7, 8, 25].

Cyclophosphamide cßn ®−îc sö dông lµm ®éc tè cho s¬n chèng hµ dïng cho

c¸c tµu biÓn [9].

Trong nh÷ng n¨m gÇn ®©y, tÝnh chÊt d−îc lý cña cyclophosphamide vÉn cßn

®−îc tiÕp tôc nghiªn cøu [10,11,12].

KÓ tõ khi t×m ra cyclophosphamide vµo n¨m 1956 vµ b¶n quyÒn s¸ng chÕ

(patent) ®Çu tiªn ®−îc chÊp nhËn vµo n¨m 1957 [26] cho ®Õn nay vÉn lu«n cã c¸c

b¶n quyÒn s¸ng chÕ míi vÒ tæng hîp cyclophosphamide ®−îc ®¨ng ký. B¶n quyÒn

s¸ng chÕ gÇn ®©y nhÊt mµ chóng t«i cã ®−îc lµ cña Ulf Niemeyer vµ céng sù vµo

cuèi n¨m 2001 [28]. Nh×n chung c¸c patent vÒ tæng hîp cyclophosphamide ®Òu dùa

theo s¬ ®å nh− sau:

O

R1

OH

O

R1

P

N

Triethylamin

R4

HN

Y

+

+ POCl3

R2

N

dung m«i

Y

R2

R3

3

1

2

víi R1 vµ R2 lµ chloroethyl, R3 vµ R4 lµ H. Ng−êi ta th−êng ¸p dông gi¶i ph¸p kü

thuËt tiªn tiÕn ®−îc gäi lµ "ph¶n øng hai b−íc trong cïng mét nåi ph¶n øng" (two-

stage one-pot reaction). Lîi thÕ cña gi¶i ph¸p kü thuËt nµy lµ:

− HiÖu suÊt tæng cña ph¶n øng cao

− Kh«ng ph¶i t¸ch s¶n phÈm trung gian

− Chi phÝ cho thiÕt bÞ ph¶n øng thÊp

− Gi¶m thêi gian s¶n xuÊt

− Tiªu thô Ýt nguyªn liÖu ®Çu

− Kh«ng ph¶i ch¹y s¾c ký hoÆc c¸c b−íc tinh chÕ kh¸c

− Gi¶m l−îng chÊt th¶i g©y ®éc h¹i tíi m«i tr−êng

§Ó thùc hiÖn kü thuËt nµy, ng−êi ta cho phosphoryl halogenid vµ hai chÊt

amin lµ bis 2- chloroethyl amin vµ n- propylamin- 3- ol t¸c dông víi nhau trong mét

dung m«i h÷u c¬ tr¬ víi mét chÊt kiÒm hç trî, tr¸nh sù cã mÆt cña n−íc vµ alcol,

kh«ng cÇn t¸ch c¸c s¶n phÈm trung gian. C¸c t¸c nh©n ®−îc cho lÇn l−ît vµo b×nh

ph¶n øng.

§iÒu ®Æc biÖt quan träng ë ®©y lµ h¹n chÕ tèi ®a ¶nh h−ëng cña n−íc hoÆc

h¬i Èm ®èi víi c¸c t¸c nh©n, ®Æc biÖt lµ POCl3. NÕu cã mÆt n−íc trong m«i tr−êng

ph¶n øng th× sÏ cã nhiÒu s¶n phÈm phô vµ hiÖu suÊt thu ®−îc cyclophosphamide bÞ

gi¶m nhanh chãng. Vµ nh− vËy s¶n phÈm chØ kÕt tinh ®−îc sau khi ph¶i cã thªm

b−íc tinh chÕ vÝ dô ch¹y s¾c ký cét. Nh÷ng quy tr×nh tæng hîp cyclophosphamide

tr−íc n¨m 2001 ch−a ®¸nh gi¸ ®−îc hÕt møc ®é ¶nh h−ëng cña n−íc ®èi víi ph¶n

øng nµy.

Ngoµi n−íc ra, th× c¸c alcol còng kh«ng ®−îc cã mÆt trong m«i tr−êng ph¶n

øng. Ng−êi ta ®· chøng minh ®−îc r»ng: sù cã mÆt l−îng vÕt methanol hoÆc ethanol

trong dung m«i sÏ t¹o ra nhiÒu ph¶n øng phô vµ lµm gi¶m hiÖu suÊt.

Ph¶n øng ®−îc thùc hiÖn trong mét dung m«i hoÆc mét hçn hîp dung m«i

h÷u c¬ tr¬. Cã thÓ sö dông c¸c dung m«i nh−: dichlorometan, 1,2- dichloroetan,

chloroform, dioxan, acetonitril, tetrahydrofuran vµ toluen.

Nång ®é cña hçn hîp ph¶n øng, tøc lµ tû lÖ gi÷a c¸c chÊt 1, 2, 3, víi thÓ tÝch

dung m«i cã thÓ dao ®éng tõ 0,1 ®Õn 6 mol/ lit.

C¸c amin 1 vµ 2 ®−îc sö dông theo tû lÖ mol t−¬ng ®−¬ng nhau. NÕu amin 2

Ýt h¬n amin 1 5% hoÆc nhiÒu h¬n 20% còng kh«ng cã vÊn ®Ò g×.

ChÊt kiÒm hç trî (®Ó kÐo axit ra khái hçn hîp ph¶n øng) cã thÓ lµ

triethylamin, pyridin, hoÆc natri cacbonat. Nh×n chung, tû lÖ mol gi÷a c¸c amin víi

chÊt kiÒm lµ t−¬ng ®−¬ng nhau.

VÝ dô: NÕu amin 2 (n- propylamin- 3- ol) tham gia ph¶n øng ë d¹ng muèi th×

cÇn hai ®−¬ng l−îng chÊt kiÒm hç trî, cßn nÕu nã ë d¹ng kiÒm tù do th× chØ cÇn mét

®−¬ng l−îng chÊt kiÒm hç trî lµ ®ñ.

Ph¶n øng ng−ng tô cña POCl3 víi amin lµ ph¶n øng to¶ nhiÖt. §Ó kiÓm so¸t

®−îc nhiÖt ®é ph¶n øng ta ph¶i cho c¸c t¸c nh©n vµo tõ tõ vµ ph¶i lµm l¹nh hçn hîp

ph¶n øng. Cã nhiÒu c¸ch kh¸c nhau khi cho c¸c t¸c nh©n vµo b×nh ph¶n øng ®−îc

m« t¶ trong c¸c b¶n quyÒn s¸ng chÕ.

VÝ dô: Cã thÓ nhá giät tõ tõ POCl3 vµo mét amin ë d¹ng kiÒm tù do; hoÆc

chÊt kiÒm hç trî nh− triethylamin ®−îc cho tõ tõ vµo hçn hîp gåm POCl3 vµ mét

amin ë d¹ng muèi. ë giai ®o¹n ®Çu cña ph¶n øng nhiÖt ®é nh×n chung ®−îc gi÷

trong kho¶ng tõ - 40 oC ®Õn 20 oC, trong nhiÒu tr−êng hîp ng−êi ta gi÷ ph¶n øng ë

nhiÖt ®é gi÷a - 20 oC ®Õn ± 10 oC. NhiÖt ®é cã thÓ t¨ng tíi 100 oC sau khi ®· ph¶n

øng ®−îc mét nöa, hoÆc t¨ng ®Õn nhiÖt ®é s«i cña dung m«i nÕu cÇn thiÕt b»ng c¸ch

®un nãng.

Trong mét tr−êng hîp kh¸c ng−êi ta còng cã thÓ tiÕn hµnh nh− sau:

• B−íc mét: Cho chÊt bis- 2- chloroethylamin vµo b×nh, sau ®ã cho tõ tõ

n- propylamin- 3- ol cïng víi chÊt kiÒm hç trî (vÝ dô: triethylamin) vµo b×nh.

ChÊt n- propylamin- 3- ol cã thÓ ®−a vµo b×nh ph¶n øng ë d¹ng muèi vµ trong

dung m«i; chÊt bis- 2- chloroethylamin vµ kiÒm hç trî sÏ lÇn l−ît ®−îc ®−a tõ

tõ vµo b×nh, hoÆc còng cã thÓ ®−îc cho ch¶y cïng mét lóc vµo b×nh tõ hai

ng¶ sao cho chÊt kiÒm hç trî lu«n lu«n d− so víi bis- 2- chloroethylamin.

• B−íc hai: POCl3 cã thÓ ®−îc cho tõ tõ cïng víi chÊt kiÒm hç trî vµo

hçn hîp ph¶n øng cña b−íc mét, hoÆc ng−îc l¹i, hçn hîp cña b−íc mét ®−îc

cho tõ tõ vµo dung dÞch POCl3 vµ chÊt kiÒm hç trî.

Nh»m gi¶m thiÓu tèi ®a l−îng n−íc trong hçn hîp ph¶n øng th× tÊt c¶ c¸c ho¸

chÊt vµ thiÕt bÞ ph¶n øng ®Òu ph¶i kh« tuyÖt ®èi.

VÝ dô: ph¶i sÊy nãng thiÕt bÞ ph¶n øng ®Ó lo¹i h¬i n−íc, lµm khan dung m«i

vµ c¸c t¸c nh©n tr−íc lóc ph¶n øng. POCl3 ph¶i cÊt l¹i trong ®iÒu kiÖn kh« tr−íc khi

dïng. Hµm l−îng n−íc tr−íc lóc ph¶n øng kh«ng ®−îc v−ît qu¸ 0,5%, tèt h¬n c¶ lµ

trong kho¶ng tõ 0,001% ®Õn 0,1%.

C¸c s¶n phÈm phô sÏ ®−îc h¹n chÕ nÕu hçn hîp ph¶n øng ®−îc xö lý víi c¸c

chÊt phô gia tr−íc khi ph¶n øng. C¸c chÊt phô gia nµy cã thÓ lµ: R©y ph©n tö; oxit

nh«m ë c¸c d¹ng kh¸c nhau, chlorua canxi (d¹ng khan hoÆc ngËm n−íc), P2O5 vµ

MgCl2. L−îng chÊt phô gia nh×n chung dao ®éng trong kho¶ng 5 ®Õn 150 gam/ mol

chÊt bis- 2- chlor ethylamin. Hçn hîp ph¶n øng cã thÓ ë d¹ng dung dÞch hoÆc huyÒn

1 2

phï vµ th−êng ®−îc khuÊy tõ cho ®Õn 3 giê tr−íc lóc ph¶n øng ng−ng tô ®−îc

b¾t ®Çu b»ng viÖc cho thªm chÊt kiÒm hç trî hoÆc POCl3 vµo b×nh.

Sau khi ph©n tö chlor thø nhÊt hoÆc thø hai cña POCl3 ®· ph¶n øng, ng−êi ta

cã thÓ läc t¸ch muèi t¹o thµnh hoÆc röa hçn hîp ph¶n øng, sau ®ã cho ph¶n øng tiÕp

tôc b»ng c¸ch bæ sung thªm amin vµ chÊt kiÒm hç trî.

Xö lý hçn hîp ph¶n øng sau khi ph¶n øng kÕt thóc ®−îc b¾t ®Çu b»ng viÖc

läc t¸ch muèi, hoÆc/ vµ röa víi n−íc ë c¸c ®é pH kh¸c nhau. CÇn chó ý tr¸nh sù

thuû ph©n hoÆc tan vµo n−íc cña s¶n phÈm b»ng c¸ch cho thêi gian tiÕp xóc víi pha

n−íc ng¾n vµ lµm l¹nh hçn hîp.

Cã thÓ xö lý hçn hîp ph¶n øng theo ph−¬ng ph¸p khan, nghÜa lµ trung hoµ

hçn hîp ph¶n øng b»ng khÝ HCl cho tíi pH = 4 - 6. Ngoµi ra, sö dông c¸c axit yÕu

nh− axit acetic, axit oxalic còng ®em l¹i kÕt qu¶.

Tiªu chuÈn cña cyclophosphamide ®−îc m« t¶ trong c¸c D−îc ®iÓn 2.1.1.3.

• Trong D−îc ®iÓn ViÖt Nam, lÇn xuÊt b¶n thø 3, Nhµ xuÊt b¶n Y häc,

n¨m 2002 chóng t«i kh«ng thÊy cã cyclophosphamide.

• Trong D−îc ®iÓn Anh BP 2001 trang 510, nh÷ng tiªu chuÈn chÝnh cña

cyclophosphamide ®−îc m« t¶ nh− sau:

− Cyclophosphamide cã hµm l−îng kh«ng d−íi 98,0% vµ kh«ng qu¸

®−¬ng l−îng cña 102,0% (RS)- 2- [bis (2- chloroethyl) amino]

tetrahydro- 2H- 1, 3, 2- oxaphosphorin- 2- oxit tÝnh theo chÊt khan.

− Lµ bét tinh thÓ mµu tr¾ng hoÆc gÇn tr¾ng, tan trong n−íc, tan hoµn

toµn trong cån, tan Ýt trong ete.

oC.

− §iÓm nãng ch¶y 51 oC. Chªnh lÖch ®iÓm nãng ch¶y kh«ng ®−îc qu¸ 2

− pH: Dung dÞch cña 0,50 gam cyclophosphamide trong 25 ml n−íc ®·

khö CO2 sÏ cã pH tõ 4,0 ®Õn 6,0, ®o ngay sau khi pha.

− Cl- (chlorid): Hoµ tan 0,15 gam cyclophosphamide trong 15 ml n−íc

®· khö CO2. Hµm l−îng ion Cl- cña dung dÞch võa pha chÕ kh«ng ®−îc

3- (phosphat): Hoµ tan 0,10 gam cyclophosphamide trong 100 ml

v−ît qu¸ 330 ppm.

− PO4

n−íc ®· khö CO2. Hµm l−îng ion phosphat cña dung dÞch kh«ng ®−îc

v−ît qu¸ 100 ppm.

− Kim lo¹i nÆng: Kh«ng ®−îc qu¸ 20 ppm tÝnh theo ch×.

− N−íc: Tõ 6,0 ®Õn 7,0% x¸c ®Þnh víi l−îng 0,300 gam

cyclophosphamide theo ph−¬ng ph¸p b¸n vi l−îng.

• D−îc ®iÓn ch©u ¢u (EP 1997) trang 697: còng ®−a ra c¸c ph−¬ng

ph¸p x¸c ®Þnh vµ c¸c tiªu chuÈn cña cyclophosphamide t−¬ng tù nh−

D−îc ®iÓn Anh BP 2001.

• D−îc ®iÓn Mü (USP 25) trang 491 n¨m 2002:

− Cyclophosphamide cã hµm l−îng kh«ng d−íi 97,0% vµ kh«ng nhiÒu

qu¸ 103,0% tÝnh theo s¶n phÈm khan.

− L−u ý: RÊt thËn träng khi lµm viÖc víi cyclophosphamide v× ®ã lµ chÊt

g©y ®éc tÕ bµo m¹nh.

− §ãng gãi vµ b¶o qu¶n: B¶o qu¶n trong thïng kÝn, ë nhiÖt ®é trong

kho¶ng tõ 2 oC ®Õn 30 oC.

− pH: n»m gi÷a 3,9 vµ 7,1 trong mét dung dÞch (1 trong 100), ®o 30' sau

khi pha.

− N−íc: Tõ 5,7 ®Õn 6,8%.

− Kim lo¹i nÆng: Hoµ tan 1,0 gam cyclophosphamide trong 25 ml n−íc,

nÕu cÇn thiÕt th× läc l¹i dung dÞch. Hµm l−îng kim lo¹i nÆng kh«ng

®−îc v−ît qu¸ 0,002%.

• D−îc ®iÓn NhËt B¶n JP XIII trang 314:

− Cyclophosphamide cã hµm l−îng kh«ng d−íi 97,0%

− Tinh thÓ tr¾ng hoÆc bét tinh thÓ.

− Tan rÊt tèt trong axit acetic b¨ng, tan hoµn toµn trong cån, trong

anhydrit acetic vµ trong CHCl3, tan trong n−íc vµ ete.

− §iÓm nãng ch¶y 45 oC - 53 oC.

− Mµu s¾c dung dÞch: Hoµ tan 0,20 gam cyclophosphamide trong 10 ml

n−íc, dung dÞch ph¶i trong suèt vµ kh«ng mµu.

− Cl-: KiÓm tra víi dung dÞch cña 0,40 gam cyclophosphamide ë nhiÖt

®é kh«ng qu¸ 20 oC. Dung dÞch chuÈn lµ: 0,40 ml 0,01 mol/ lit axit

HCl. Hµm l−îng ion Cl- kh«ng qu¸ 0,036%.

− Kim lo¹i nÆng: KiÓm tra víi 1,0 gam cyclophosphamide. Dung dÞch so

s¸nh ®−îc pha víi 2,0 ml dung dÞch ch× tiªu chuÈn. Hµm l−îng kim

lo¹i nÆng kh«ng qu¸ 20 ppm.

− N−íc: Tõ 5,7 ®Õn 7,0% (0,5 gam, chuÈn ®é trùc tiÕp).

− §ãng thïng vµ b¶o qu¶n: Thïng kÝn, b¶o qu¶n ë d−íi 30 oC.

T×nh h×nh nghiªn cøu, sö dông cyclophosphamide t¹i ViÖt Nam 2.1.1.4.

Khoa Ho¸ häc tr−êng §¹i häc Tæng hîp Hµ Néi ®· tiÕn hµnh nghiªn cøu c¸c

ph−¬ng ph¸p ®iÒu chÕ vµ c¬ chÕ t¸c dông cña c¸c hîp chÊt c¬ phèt pho nh»m phôc

vô n«ng nghiÖp vµ y tÕ [13-15].

Cyclophosphamide ®· qua b−íc nghiªn cøu c¬ b¶n trong ®Ò tµi ''Tæng hîp

mét sè hîp chÊt c¬ kim cã ho¹t tÝnh sinh lý m¹nh'' cÊp Bé §¹i häc, Trung häc

chuyªn nghiÖp, m· sè 149/Q§ ngµy 01/3/1972, nghiÖm thu ngµy 30/10/1975 vµ ®Ò

tµi cÊp nhµ n−íc '' Tæng hîp c¸c chÊt chèng virus'' m· sè 510801, Hµ Néi 2002.

HiÖn nay cyclophosphamide ®· vµ ®ang ®−îc sö dông trong ch−¬ng tr×nh ®a

hoÆc ®¬n ho¸ trÞ liÖu ®Ó ch÷a c¸c chøng bÖnh sau:

• C¸c bÖnh b¹ch cÇu: BÖnh b¹ch cÇu d¹ng lymph« bµo vµ dßng tuû bµo cÊp

hay m·n.

• U h¹ch ¸c tÝnh: BÖnh Hodgkin, ung th− h¹ch kh«ng Hodgkin, u t−¬ng bµo.

• U t¹ng ®Æc ¸c tÝnh cã di c¨n vµ kh«ng di c¨n: Ung th− buång trøng, ung th−

cæ tö cung, néi m¹c tö cung, ung th− tinh hoµn, ung th− vó, ung th− phæi tÕ

bµo nhá, u nguyªn bµo thÇn kinh, u nguyªn bµo vâng m¹c, sarcoma Ewing.

• C¸c bÖnh tù miÔn tiÕn triÓn: Viªm khíp d¹ng thÊp, bÖnh khíp do vÈy nÕn,

lupus ban ®á hÖ thèng, s¬ cøng b×, viªm m¹ch m¸u hÖ thèng (kÌm héi

chøng thËn h−), mét sè thÓ viªm cÇu thËn (kÌm héi chøng thËn h−), bÖnh

nh−îc c¬ nÆng, thiÕu m¸u t¸n huyÕt tù miÔn, bÖnh ng−ng kÕt tè l¹nh.

• §iÒu trÞ øc chÕ miÔn dÞch trong ghÐp t¹ng.

Cyclophosphamide cã thÓ dïng ®−îc c¶ hai ®−êng uèng hoÆc tiªm. Sau khi

uèng, thuèc ®−îc hÊp thô tíi 75% qua ®−êng tiªu ho¸, nã ph©n bè réng r·i ë kh¾p

c¸c m« vµ ®i qua hµng rµo m¸u n·o. Cyclophosphamide cßn ®i qua c¶ rau thai vµ

s÷a mÑ.

Thêi gian b¸n huû cña cyclophosphamide lµ tõ 4 ®Õn 8 giê. Thuèc ®¹t nång

®é ®Ønh trong huyÕt thanh trong vßng 1 giê sau khi uèng. Nã ®−îc th¶i trõ qua n−íc

tiÓu ë d¹ng kh«ng biÕn ®æi d−íi 10% vµ d¹ng chuyÓn ho¸ tõ 85- 90%.

Cyclophosphamide cã thÓ g©y ra c¸c t¸c dông phô. Tuy nhiªn c¸c t¸c dông

ngo¹i ý th−êng phô thuéc vµo liÒu dïng vµ hÇu hÕt c¸c tr−êng hîp bÞ t¸c dông phô

®Òu cã thÓ håi phôc ®−îc.

+ VÒ huyÕt häc: Gi¶m b¹ch cÇu kÌm theo nguy c¬ bÞ nhiÔm trïng; gi¶m tiÓu

C¸c t¸c dông phô cã thÓ cã cña cyclophosphamide:

cÇu kÌm t¨ng nguy c¬ xuÊt huyÕt; thiÕu m¸u kÌm gi¶m Hemoglobine (trªn

2g/ 100ml so víi gi¸ trÞ ban ®Çu).

+ VÒ tiªu ho¸: Buån n«n vµ ãi möa

+ §−êng niÖu sinh dôc: Viªm bµng quang

+ §èi víi gan: Ýt gÆp

+ Rông tãc

C¸c d¹ng s¶n phÈm chÝnh cña cyclophosphamide vµ nhu cÇu vÒ 2.1.1.5.

thuèc cyclophosphamide

• Trªn thÞ tr−êng trong n−íc vµ quèc tÕ hiÖn nay cã c¸c th−¬ng phÈm chÝnh

− Endoxan d¹ng viªn bao vµ d¹ng bét pha tiªm cña h·ng Asta Medica [17],

− Cytoxan d¹ng viªn nÐn vµ bét pha tiªm cña h·ng Bristol - Myers Squibb.

− Neosar d¹ng bét pha tiªm cña h·ng Pharmacia & Upjohn.

chøa ho¹t chÊt cyclophosphamide nh− sau:

• Theo thèng kª cña Bé Y tÕ, hµng n¨m n−íc ta cã kho¶ng 150.000 ng−êi míi

m¾c bÖnh ung th− cÇn ®−îc ®iÒu trÞ [16]. Sè l−îng bÖnh nh©n ngµy cµng t¨ng

do tû lÖ sèng kÐo dµi cña nh÷ng bÖnh nh©n ung th− ®· m¾c tõ 3 ®Õn 5 n¨m.

Trong sè ®ã kho¶ng 30% cÇn ®−îc ®iÒu trÞ tiÕp ë giai ®o¹n cuèi vµ giai ®o¹n

di c¨n.

Nh− vËy, trong 1 n¨m cã kho¶ng 50.000 bÖnh nh©n cÇn dïng

cyclophosphamide ®¬n ®éc hay phèi hîp víi c¸c lo¹i thuèc kh¸c. Mçi ®ît ®iÒu trÞ

cÇn sö dông 500mg/ m2 da; trung b×nh cÇn 6 ®ît ®iÒu trÞ cho mét bÖnh nh©n. DiÖn

tÝch bÒ mÆt da trung b×nh cña ng−êi ViÖt Nam lµ 1,6m2.

+ Mét ®ît ®iÒu trÞ cÇn : 500mg/m2 da x 1,6 m2 = 800mg

+ S¸u ®ît ®iÒu trÞ cÇn: 800mg/m2 da x 6 = 4800mg

+ Sè thuèc cÇn dïng cho ViÖt Nam trong 1 n¨m sÏ lµ: 4800mg x 50.000 ng−êi

Nh− vËy:

= 240.000.000mg (240kg).

Gi¸ thuèc hiÖn nay cña §øc lµ: ≈ 45.000®/ 200mg; cña Hµn Quèc lµ: ≈

22.000®/ 200mg. Nh− vËy nÕu chØ tÝnh theo gi¸ thuèc cña Hµn Quèc th× sè tiÒn ViÖt

Nam cÇn ph¶i chi ®Ó mua thuèc ®· lµ: 22.000® x 240.000.000 : 200 =

26.400.000.000® (hai m−¬i s¸u tû bèn tr¨m triÖu ®ång).

Sè liÖu trªn cho thÊy, cÇn gÊp rót tæ chøc nghiªn cøu s¶n xuÊt

cyclophosphamide trong n−íc ®Ó ®iÒu trÞ ung th− vµ c¸c bÖnh kh¸c. Ngoµi viÖc sö

dông ®Ó ®iÒu trÞ ung th− th× cyclophosphamide cßn ®−îc dïng nhiÒu ®Ó ®iÒu trÞ c¸c

bÖnh kh¸c nh− chèng th¶i ghÐp (dïng cho c¸c ca ghÐp gan, thËn, da, v.v...), c¸c bÖnh

thuéc vÒ øc chÕ miÔn dÞch nh− lupót ban ®á, vÈy nÕn, viªm khíp thÓ nhÑ ....

§iÒu ®Æc biÖt quan träng n÷a lµ: cyclophosphamide cã thÓ ®−îc bµo chÕ b»ng

c¸ch ®ãng viªn nÐn dïng ®−êng uèng gi¸ rÎ, dÔ b¶o qu¶n vµ vËn chuyÓn ®Ó phôc vô

®ång bµo vïng s©u, vïng xa, ng−êi nghÌo bÞ m¾c bÖnh ung th− vµ mét sè bÖnh kh¸c.

TrÝch dÉn néi dung thuyÕt minh cña ®Ò tµi 2.1.2.

• Giíi thiÖu vÒ chñ nhiÖm ®Ò tµi vµ c¬ quan qu¶n lý ®Ò tµi:

"Nghiªn cøu x©y dùng quy tr×nh tæng hîp Tªn ®Ò tµi:

cyclophosphamide lµm thuèc ®iÒu trÞ ung th−"

M∙ sè: KC.10. 25

Thêi gian thùc hiÖn: 24 th¸ng (Tõ 1/ 1/ 2004 ®Õn 31/ 12 / 2005)

CÊp qu¶n lý: Nhµ n−íc

Kinh phÝ: Tæng sè: 2.900 triÖu ®ång

Trong ®ã, tõ Ng©n s¸ch SNKH: 1.900 triÖu ®ång

Thuéc ch−¬ng tr×nh: Khoa häc vµ C«ng nghÖ träng ®iÓm cÊp nhµ n−íc giai ®o¹n

2001-2005: "Khoa häc vµ C«ng nghÖ phôc vô b¶o vÖ vµ

ch¨m sãc søc kháe céng ®ång".

Chñ nhiÖm ®Ò tµi: Hä vµ tªn: TrÇn V¨n Sung

Häc hµm/häc vÞ: GS. TSKH.

Chøc danh khoa häc: Nghiªn cøu viªn cao cÊp (NCVCC)

§iÖn tho¹i: (CQ)/ 04-7564794; (NR) 04-8570894;

Fax: 04-8361283; Mobile: 0913210527

E-mail: tvs@ich.ncst.ac.vn

§Þa chØ c¬ quan: ViÖn Ho¸ häc, ViÖn KH & CNVN

18 §−êng Hoµng Quèc ViÖt, CÇu GiÊy, Hµ Néi

§Þa chØ nhµ riªng: Sè nhµ 35, Ngâ 198, phè Th¸i Hµ, Hµ Néi

C¬ quan chñ tr× ®Ò tµi: ViÖn Ho¸ häc, ViÖn Khoa häc vµ C«ng nghÖ ViÖt Nam

§iÖn tho¹i: 04-7564312; Fax: 04- 8361283

E-mail: vpvhoa@ich.ncst.ac.vn

§Þa chØ: 18 §−êng Hoµng Quèc ViÖt, QuËn CÇu GiÊy, Hµ Néi

Môc tiªu cña ®Ò tµi: X©y dùng ®−îc quy tr×nh c«ng nghÖ tæng hîp vµ tinh chÕ

thuèc cyclophosphamide ®¹t tiªu chuÈn D−îc ®iÓn Anh

(BP- 2001).

• Néi dung nghiªn cøu:

+ Nghiªn cøu quy tr×nh tæng hîp vµ tinh chÕ cyclophosphamide

+ KiÓm tra ®é tinh khiÕt cña c¸c ho¸ chÊt, dung m«i sö dông

+ Tinh chÕ c¸c ho¸ chÊt, dung m«i sö dông

+ Nghiªn cøu quy tr×nh tæng hîp vµ tinh chÕ s¶n phÈm trung gian I

+ Nghiªn cøu quy tr×nh tæng hîp vµ tinh chÕ s¶n phÈm trung gian II

+ Nghiªn cøu quy tr×nh ®iÒu chÕ cyclophosphamide trong c¸c ®iÒu kiÖn ph¶n

øng kh¸c nhau (dung m«i, t¸c nh©n)

+ Nghiªn cøu tinh chÕ cyclophosphamide trong c¸c ®iÒu kiÖn kh¸c nhau.

+ X¸c ®Þnh cÊu tróc vµ kiÓm tra ®é tinh khiÕt cña cyclophosphamide: KiÓm

tra ®é tinh khiÕt b»ng c¸c ph−¬ng ph¸p s¾c ký nh− s¾c ký líp máng, s¾c ký

khÝ, s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao (HPLC), s¾c ký láng g¾n khèi phæ (LC/ MS)

vµ ph©n tÝch nguyªn tè.

+ X¸c ®Þnh cÊu tróc cña cyclophosphamide b»ng c¸c ph−¬ng ph¸p phæ nh−

IR, MS, NMR, so s¸nh víi phæ cña chÊt chuÈn.

+ KiÓm nghiÖm cyclophosphamide: Theo tiªu chuÈn D−îc ®iÓn Anh BP-

2001.

+ Nghiªn cøu x©y dùng tiªu chuÈn c¬ së cña cyclophosphamide.

+ X¸c ®Þnh ®éc tÝnh cña cyclophosphamide: X¸c ®Þnh ®éc tÝnh cÊp trªn chuét

nh¾t tr¾ng vµ chã; LD50 trªn chuét nh¾t tr¾ng, ®éc tÝnh b¸n tr−êng diÔn.

+ B¸o c¸o s¬ kÕt

• Bµo chÕ ®ãng lä bét thuèc cyclophosphamide vµ èng n−íc cÊt pha tiªm:

+ §ãng 15.000 lä thuèc bét pha tiªm ®¹t tiªu chuÈn trªn d©y chuyÒn GMP t¹i

xÝ nghiÖp d−îc phÈm TW1.

+ §ãng 15.000 èng n−íc cÊt ®Ó pha thuèc tiªm ®¹t tiªu chuÈn t¹i xÝ nghiÖp

d−îc phÈm TW1.

• Nghiªn cøu t¸c dông l©m sµng cña cyclophosphamide:

+ X©y dùng ®Ò c−¬ng tr×nh Héi ®ång ®¹o ®øc cña Bé Y tÕ cho phÐp thö

nghiÖm l©m sµng.

+ Lùa chän bÖnh nh©n ®¹t tiªu chuÈn ®Ó thö nghiÖm nh− sau.

- Kh¸m l©m sµng

- C¸c xÐt nghiÖm cËn l©m sµng ( ph¶i cã xÐt nghiÖm m« bÖnh häc)

- ChÈn ®o¸n x¸c ®Þnh bÖnh

- ChÈn ®o¸n giai ®o¹n bÖnh

- C¸c tiªu chuÈn lùa chän bÖnh nh©n

+ TiÕn hµnh thö nghiÖm l©m sµng giai ®o¹n I sau khi ®· ®−îc sù cho phÐp cña

Bé Y tÕ.

- TiÕn hµnh ®iÒu trÞ bÖnh nh©n theo ph¸c ®å

- §¸nh gi¸ kÕt qu¶ ®¸p øng cña bÖnh

- Theo dâi c¸c t¸c dông phô vµ ®éc tÝnh cña thuèc

- B¸o c¸o kÕt qu¶ thö l©m sµng.

TT C¸c b−íc/c«ng ®o¹n thùc hiÖn

S¶n phÈm ph¶i ®¹t

Thêi gian

• TiÕn ®é thùc hiÖn

1 2 3 4

B¶n thuyÕt minh chi tiÕt 1 X©y dùng thuyÕt minh chi tiÕt cña ®Ò tµi 1/ 1/ 2004 - 15/ 1/ 2004

Quy tr×nh tæng hîp giai ®o¹n I 2 Nghiªn cøu quy tr×nh tæng hîp giai ®o¹n I (chÊt VIII) 1/ 2004 - 6/ 2004

Quy tr×nh tæng hîp giai ®o¹n II 3 Nghiªn cøu quy tr×nh tæng hîp giai ®o¹n II (chÊt IX) 6/ 2004 - 12/ 2004

cyclophosphamide th« 4 Nghiªn cøu quy tr×nh tæng hîp cyclophosphamide 6/ 2004 - 12/ 2004

5 4250g cyclophosphamide Nghiªn cøu quy tr×nh tinh chÕ cyclophosphamide 1/ 2004 - 12/ 2004

Bé phæ chuÈn KiÓm tra ®é tinh khiÕt, x¸c ®Þnh cÊu tróc c¸c s¶n phÈm 6 6/ 2004 - 12/ 2004

nghiÖm 7 Theo tiªu chuÈn cña BP2001 KiÓm cyclophosphamide 6/ 2004 - 1/ 2005

tÝnh cña B¸o c¸o kÕt qu¶ 8 Thö ®éc cyclophosphamide 6/ 2004 - 1/ 2005

TCCS 9 X©y dùng tiªu chuÈn c¬ së cña cyclophosphamide 8/ 2004 - 12/2004

10 B¸o c¸o s¬ kÕt 12/ 2004

11 Tiªu chuÈn GMP 12/ 2004 - 1/ 2005 §ãng lä thuèc bét vµ èng n−íc pha tiªm ®Ó thö l©m sµng

12 Hå s¬ X©y dùng ®Ò c−¬ng thö l©m sµng 1/2005 - 3/2005

13 Thö l©m sµng giai ®o¹n I B¸o c¸o kÕt qu¶ 3/2005 - 11/2005

14 B¸o c¸o tæng kÕt ®Ò tµi ViÕt b¸o c¸o tæng kÕt ®Ò tµi, nghiÖm thu 11/2005 - 12/2005

Møc chÊt l−îng

• Yªu cÇu kü thuËt, chØ tiªu chÊt l−îng ®èi víi s¶n phÈm t¹o ra

TT

Tªn s¶n phÈm vµ chØ tiªu chÊt l−îng chñ yÕu

§¬n vÞ ®o

CÇn ®¹t

Trong n−íc

ThÕ giíi

Dù kiÕn sè l−îng s¶n phÈm t¹o ra

H2O

CH2 CH2 Cl CH2 CH2 Cl

Cyclophosphamide O

C7H15Cl2N2O2P. H2O CAS [6055 - 19 - 2]

1 gram 4250g

Träng l−îng ph©n tö

C 30,12 % H 6,14 % 279,10 279,10 - ®¬n vÞ khèi Cl 25,40 % N 10,04 %

O 17,20 % P 11,10 %

- §iÓm ch¶y 40-45 41-45

§é tan g/l 40 40 - Trong n−íc

mg/kg - 350 94 350 94-95 LD50 chuét nh¾t chuét cèng

2 Thuèc tiªm cyclophosphamide

- D¹ng bét tr¾ng Bét tr¾ng Bét tr¾ng

l−îng cyclophosphamide mg 200 200 15.000 lä - Hµm khan

ml 10 10 - 15.000 èng N−íc cÊt pha thuèc. Khi soi d−íi bãng ®iÖn 40W trªn nÒn ®en ph¶i trong suèt. Mèi hµn èng kh«ng ®−îc cã vÖt ®en

• Kinh phÝ thùc hiÖn ®Ò tµi ph©n theo c¸c kho¶n chi

Trong ®ã

TT Nguån kinh phÝ

Tæng sè

Chi kh¸c

Hîp t¸c quèc tÕ

ThiÕt bÞ m¸y mãc

Nguyªn, vËt liÖu, n¨ng l−îng

Thuª kho¸n chuyªn m«n

X©y dùng, söa ch÷a nhá

§¬n vÞ tÝnh: TriÖu ®ång

Tæng kinh phÝ

2.900

720

767,614

698,386

500

214

B Nguån kinh phÝ

1 Ng©n s¸ch SNKH

1.900

650

350

200

1.000

117,614

348,386

450

C¸c nguån vèn kh¸c + Tù cã

2 3 4 5 6 7 8 1 9

C¸c kÕt qu¶ nghiªn cøu cña §Ò tµi: 2.2.

2.2.1. Nghiªn cøu quy tr×nh tæng hîp cyclophosphamide:

Qua c«ng t¸c s−u tÇm vµ tham kh¶o tµi liÖu vÒ c¸c ph−¬ng ph¸p tæng hîp cyclophosphamide cña c¸c nhµ khoa häc trªn thÕ giíi [18 - 24], th× viÖc tæng hîp cyclophosphamide dùa theo b¶n quyÒn s¸ng chÕ cña c¸c nhµ khoa häc §øc [22 - 24] lµ t−¬ng ®èi thuËn lîi vµ cã tÝnh kh¶ thi cao.

C¸c c¸n bé khoa häc cña ViÖn Ho¸ häc, ViÖn Khoa häc vµ C«ng nghÖ ViÖt Nam vµ cña tr−êng §¹i häc Khoa häc Tù nhiªn thuéc §¹i häc Quèc gia Hµ Néi ®· tiÕn hµnh nghiªn cøu tæng hîp cyclophosphamide ë quy m« phßng thÝ nghiÖm theo mét sè quy tr×nh tæng hîp sau:

C¸c quy tr×nh tæng hîp cyclophosphamide ®· ®−îc nghiªn cøu:

Quy tr×nh I:

HOCH2CH2

ClCH2CH2

NH . HCl

SOCl2

CHCl3

HOCH2CH2

ClCH2CH2

a/ Tæng hîp bis - (2 - chloroethyl) amine hydrochloride

100 ml SOCl2 trong 100 ml CHCl3 ®−îc nhá tõ tõ (kho¶ng 30 phót) vµo hçn hîp gåm 50 ml diethanol amine trong 100 ml CHCl3. Hçn hîp ph¶n øng tù s«i lªn,

sau ®ã chuyÓn dÇn vÒ d¹ng trong suèt. §un håi l−u nhÑ cho bay hÕt khÝ SO2 vµ HCl (kho¶ng 30 phót); gi÷ hçn hîp ph¶n øng ë nhiÖt ®é phßng trong 1 giê; h¹ l¹nh xuèng 10 oC; s¶n phÈm ph¶n øng tù kÕt tinh, läc, röa s¶n phÈm b»ng ete lµm kh« ë ¸p suÊt thÊp. KÕt tinh l¹i s¶n phÈm trong dung m«i lµ aceton thu ®−îc 50g s¶n phÈm tinh: §nc = 216 - 217 oC, hiÖu suÊt 59%.

2 Et3N

2 Et3N . HCl

NH2

POCl3 + HO CH2CH2CH2

CH2Cl2

b/ Tæng hîp cyclophosphamide

(S¶n phÈm trung gian I)

CH2CH2Cl

2 Et3N

2 Et3N . HCl

HCl . HN

CH2CH2Cl

CH2Cl2

CH2CH2Cl

(Cyclophosphamide)

+ Tæng hîp "S¶n phÈm trung gian I"

Dung dÞch gåm 76g (1 mol) 3-amino-1-propanol vµ 222g (2,2 mol) triethyl amine trong 1000 ml CH2Cl2 ®−îc lµm l¹nh tíi -10 oC b»ng hçn hîp ®¸ muèi. Sau ®ã võa khuÊy võa nhá vµo dung dÞch trªn tõng giät dung dÞch gåm 153g (1 mol)

POCl3 trong 500 ml CH2Cl2 ®· ®−îc lµm l¹nh tr−íc. Qu¸ tr×nh nhá giät diÔn ra trong kho¶ng 2 giê, sao cho ph¶n øng ®−îc duy tr× ë nhiÖt ®é kh«ng v−ît qu¸ -10 oC. TiÕp

tôc khuÊy thªm 3 giê n÷a, ngõng khuÊy, ®Ó qua ®ªm.

+ Tæng hîp cyclophosphamide tõ "S¶n phÈm trung gian I"

Võa khuÊy võa cho tõ tõ dung dÞch ®· ®−îc lµm l¹nh tíi -5 oC b»ng hçn hîp

®¸ muèi cña 178,5g bis-(2-chloroethyl) amine hydrochloride hoµ tan trong 1000 ml

CH2Cl2 vµo hçn hîp ph¶n øng trªn. Sau ®ã tiÕp tôc nhá thªm tõng giät cña 222 g Et3N. Qu¸ tr×nh nhá giät diÔn ra trong kho¶ng 2 giê, sao cho ph¶n øng ®−îc duy tr× ë nhiÖt ®é kh«ng v−ît qu¸ -5 oC. TiÕp tôc khuÊy ë nhiÖt ®é phßng thªm 3 giê n÷a,

ngõng khuÊy, lµm l¹nh. Läc bá kÕt tña Et3N.HCl, röa l¹i víi 500 ml CH2Cl2, thu lÊy phÇn n−íc läc, c« quay d−íi ¸p suÊt thÊp. PhÇn cÆn thu ®−îc ®−îc hoµ tan trong 600 ml H2O, ®Ó qua ®ªm ë + 5 oC. Läc, röa kÕt tña b»ng n−íc l¹nh, thu ®−îc 218 g (78%) cyclophosphamide s¹ch: §nc = 41 - 45 oC.

+ Nghiªn cøu ¶nh h−ëng cña dung m«i ®Õn hiÖu suÊt ph¶n øng

Ph¶n øng ®· ®−îc tiÕn hµnh thö nghiÖm víi c¸c lo¹i dung m«i kh¸c nhau ®Ó

t×m ®−îc dung m«i thÝch hîp cho ph¶n øng. KÕt qu¶ ®−îc chØ ra ë b¶ng 1.

B¶ng 1: KÕt qu¶ nghiªn cøu lùa chän dung m«i thÝch hîp ®Ó tæng hîp bis - (β -

chloroethyl) amine hydrochloride.

TT NhiÖt ®é s«i oC Tªn Dung m«i ph¶n øng Thêi gian ph¶n øng (h) HiÖu suÊt %

1 Dichloromethane 40 - 41 3 50

2 Chloroform 61 - 62 2,5 59

3 Tetrachlorocarbon 77 2,5 40

4 1,2-dichloroethane 83 - 84 2,5 40

KÕt luËn: Chloroform lµ lo¹i dung m«i thÝch hîp nhÊt ®Ó tæng hîp bis - (β -

chloroethyl) amine hydrochloride.

B¶ng 2.1: KÕt qu¶ nghiªn cøu lùa chän dung m«i thÝch hîp ®Ó tæng hîp s¶n phÈm

trung gian I

TT Lo¹i dung m«i dïng cho ph¶n øng HiÖu suÊt (%)

1 Dichloromethane 89

2 Chloroform 87

3 1,2-dichloroethane 80

4 Diethyl ether 80

5 Tetrahydrofurane 82

KÕt luËn: Dichloromethane lµ lo¹i dung m«i thÝch hîp nhÊt ®Ó tæng hîp s¶n

phÈm trung gian I.

+ Nghiªn cøu kh¶o s¸t t×m ®iÒu kiÖn tèi −u cña ph¶n øng

TiÕn hµnh kh¶o s¸t ¶nh h−ëng cña viÖc thay ®æi tû lÖ mol cña c¸c chÊt tham

gia ph¶n øng víi nhau, vµ thay ®æi tû lÖ gi÷a l−îng chÊt tham gia ph¶n øng víi

l−îng dung m«i ®−îc dïng cho ph¶n øng ®Õn hiÖu suÊt thu håi s¶n phÈm

cyclophosphamide. KÕt qu¶ ®−îc chØ ra ë c¸c b¶ng 2.2 vµ 2.3.

B¶ng 2.2: KÕt qu¶ nghiªn cøu kh¶o s¸t ¶nh h−ëng cña tû lÖ (mol : mol) gi÷a c¸c

chÊt tham gia ph¶n øng víi nhau tíi hiÖu suÊt thu håi s¶n phÈm.

TT ChÊt tham gia ph¶n øng Tû lÖ (mol / mol) HiÖu suÊt (%)

1 1 : 1 89

2 1 : 1,05 88 POCl3 : 3-amino-1-propanol

1 : 1,10 86 3

KÕt luËn: Tû lÖ gi÷a c¸c chÊt tham gia ph¶n øng víi nhau lµ 1:1 (mol / mol)

lµ thÝch hîp nhÊt ®Ó tæng hîp s¶n phÈm trung gian I.

B¶ng 2.3: KÕt qu¶ nghiªn cøu kh¶o s¸t ¶nh h−ëng cña tû lÖ (mol / mol) gi÷a c¸c

chÊt tham gia ph¶n øng víi dung m«i dïng cho ph¶n øng.

TT ChÊt tham gia ph¶n øng Tû lÖ (mol / mol) HiÖu suÊt (%)

1 1 : 2,10 88

2 1 : 2,20 89 L−îng chÊt tham gia ph¶n øng : L−îng dung m«i dïng cho ph¶n øng

3 1 : 2,30 89

Nh− vËy: NÕu dïng tû lÖ gi÷a c¸c chÊt tham gia ph¶n øng víi dung m«i dïng

cho ph¶n øng lµ 1:2,20 lµ thÝch hîp nhÊt bëi hiÖu suÊt cao, tiÕt kiÖm ®−îc dung m«i.

Nghiªn cøu kh¶o s¸t ¶nh h−ëng cña dung m«i vµ t¸c nh©n ph¶n øng tíi hiÖu

suÊt thu håi s¶n phÈm. KÕt qu¶ ®−îc chØ ra ë c¸c b¶ng 3.1 vµ 3.2.

B¶ng 3.1: Nghiªn cøu lùa chän dung m«i thÝch hîp ®Ó tæng hîp cyclophosphamide.

TT Lo¹i dung m«i dïng cho ph¶n øng HiÖu suÊt (%)

1 Dichloromethane 78

2 Chloroform 74

3 n-hexan 70

4 Ben zen 70

5 Toluen 72

KÕt luËn: Dichloromethane lµ lo¹i dung m«i thÝch hîp nhÊt.

B¶ng 3.1: KÕt qu¶ nghiªn cøu lùa chän t¸c nh©n thÝch hîp ®Ó tæng hîp

cyclophosphamide.

TT Lo¹i t¸c nh©n HiÖu suÊt (%) Ghi chó

1 Triethylamine 78 ThÝch hîp nhÊt cho ph¶n øng

2 Pyridine 70

3 N,N-dimethylaniline 72

Quy tr×nh II:

a/ Tæng hîp bis - (2 - chloroethyl) amine hydrochloride

§−îc tæng hîp t−¬ng tù nh− ë quy tr×nh I

CH2CH2Cl

ClCH2CH2

2 Et3N

HCl . HN

POCl3

2 Et3N . HCl

CH2Cl2

CH2CH2Cl

ClCH2CH2

b/ Tæng hîp cyclophosphamide

(S¶n phÈm trung gian II)

CH2CH2Cl

ClCH2CH2

2 Et3N

+ 2 Et3N . HCl

HO CH2CH2CH2

NH2

CH2CH2Cl

CH2Cl2

ClCH2CH2

(Cyclophosphamide)

+ Tæng hîp "S¶n phÈm trung gian II"

153 g POCl3 ®−îc cho thªm vµo dung dÞch huyÒn phï cña 178 g bis-(2- chloroethyl) amine hydrochloride trong 1500 ml CH2Cl2, lµm l¹nh tíi -5 oC b»ng hçn hîp ®¸ muèi. Sau ®ã võa khuÊy võa nhá vµo huyÒn phï trªn tõng giät dung dÞch

cña 300 ml triethyl amine. Qu¸ tr×nh nhá giät diÔn ra trong kho¶ng 2 giê, sao cho

ph¶n øng ®−îc duy tr× ë nhiÖt ®é kh«ng v−ît qu¸ -5 oC. KhuÊy tiÕp 3 giê ë nhiÖt ®é

phßng.

+ Tæng hîp cyclophosphamide tõ "S¶n phÈm trung gian II"

Hçn hîp ph¶n øng tæng hîp "S¶n phÈm trung gian II" ®−îc lµm l¹nh xuèng

-10 oC. Sau ®ã võa khuÊy võa nhá vµo dung dÞch trªn tõng giät cña dung dÞch gåm

76 g (1mol) 3-amino-1-propanol trong 300 ml Et3N. Qu¸ tr×nh nhá giät diÔn ra trong kho¶ng 3 giê, sao cho ph¶n øng ®−îc duy tr× ë nhiÖt ®é kh«ng v−ît qu¸ -5 oC. TiÕp

tôc khuÊy ë nhiÖt ®é phßng thªm 3 giê n÷a, ngõng khuÊy, lµm l¹nh, ®Ó qua ®ªm.

Läc bá kÕt tña Et3N.HCl, thu lÊy phÇn n−íc läc, c« quay d−íi ¸p suÊt thÊp. PhÇn cÆn thu ®−îc ®−îc chiÕt b»ng 4000 ml Et2O, b·o hoµ n−íc ®Ó qua ®ªm ë + 5 oC. Läc, röa s¶n phÈm kÕt tinh b»ng Et2O l¹nh, thu ®−îc 212 g (76%) cyclophosphamide s¹ch: §nc = 41 - 45 oC.

+ Kh¶o s¸t ¶nh h−ëng cña thêi gian vµ nhiÖt ®é tíi hiÖu suÊt ph¶n øng

Nghiªn cøu kh¶o s¸t t×m ®iÒu kiÖn tèi −u ®Ó thu ®−îc s¶n phÈm trung gian II

víi hiÖu suÊt cao, dÔ xö lý b»ng c¸ch thay ®æi nhiÖt ®é ph¶n øng vµ thêi gian ph¶n

øng. KÕt qu¶ ®−îc nªu ë c¸c b¶ng 4.1 vµ 4.2.

B¶ng 4.1: KÕt qu¶ nghiªn cøu kh¶o s¸t ¶nh h−ëng cña nhiÖt ®é ph¶n øng tíi hiÖu

suÊt thu håi s¶n phÈm.

HiÖu suÊt (%) Ghi chó TT NhiÖt ®é ph¶n øng (o C)

tõ -15 ®Õn 25 85 1

tõ -5 ®Õn 25 90 2

tõ 0 ®Õn 25 89 3

tõ 25 ®Õn 40 88 4

KÕt luËn: NhiÖt ®é thÝch hîp lµ tõ -5 ®Õn 25 o C, tuy vËy nÕu triÓn khai s¶n

xuÊt lín th× nhiÖt ®é ph¶n øng nªn gi÷ trong kho¶ng tõ 0 ®Õn 25 o C bëi qu¸ tr×nh

khèng chÕ nhiÖt ®é cña ph¶n øng sÏ ®¬n gi¶n h¬n.

B¶ng 4.2: KÕt qu¶ nghiªn cøu kh¶o s¸t ¶nh h−ëng cña thêi gian tiÕn hµnh ph¶n øng

tíi hiÖu suÊt qu¸ tr×nh tæng hîp s¶n phÈm trung gian II.

TT Thêi gian ph¶n øng (giê) HiÖu suÊt (%) Ghi chó

4 86 1

5 90 TiÕt kiÖm ®−îc thêi gian 2

6 89 3

10 88 4

B¶ng 5.1: KÕt qu¶ nghiªn cøu lùa chän dung m«i thÝch hîp ®Ó tæng hîp

cyclophosphamide tõ s¶n phÈm trung gian II.

TT Lo¹i dung m«i dïng cho ph¶n øng HiÖu suÊt (%)

76 1 Dichloromethane

70 2 n-hexan

73 3 Ben zen

72 4 Toluen

KÕt luËn: Dichloromethane lµ dung m«i thÝch hîp cho qu¸ tr×nh tæng hîp

cyclophosphamide.

B¶ng 5.2: KÕt qu¶ nghiªn cøu kh¶o s¸t ¶nh h−ëng cña thêi gian tiÕn hµnh ph¶n øng

tíi hiÖu suÊt thu håi s¶n phÈm.

Thêi gian ph¶n øng (giê) HiÖu suÊt (%) Ghi chó TT ë nhiÖt ®é phßng ë -5 o C

1 2 3 76

2 3 3 75

3 2 5 75

4 2 qua ®ªm 72

KÕt luËn: Thêi gian thÝch hîp cho qu¸ tr×nh tæng hîp cyclophosphamide

chØ nªn kÐo dµi kh«ng qu¸ 5 giê: 2 giê ë -5 o C vµ 3 giê ë nhiÖt ®é phßng.

Quy tr×nh III:

PhÇn tæng hîp bis - (2 - chloroethyl) amine hydrochloride ®−îc thùc

hiÖn t−¬ng tù quy tr×nh I.

2 Et3N

2 Et3N . HCl

NH2

POCl3 + HO CH2CH2CH2

CH2Cl2

b/ Tæng hîp s¶n phÈm trung gian I

(S¶n phÈm trung gian I)

POCl3 trong 500 ml CH2Cl2 ®· ®−îc lµm l¹nh tr−íc. Qu¸ tr×nh nhá giät diÔn ra trong 25

kho¶ng 2 giê, sao cho ph¶n øng ®−îc duy tr× ë nhiÖt ®é kh«ng v−ît qu¸ -10 oC. TiÕp

tôc khuÊy thªm 3 giê n÷a, ngõng khuÊy, ®Ó qua ®ªm. Läc bá kÕt tña Et3N.HCl, röa l¹i víi 500 ml CH2Cl2, thu lÊy phÇn n−íc läc, c« quay d−íi ¸p suÊt thÊp. KÕt tinh l¹i trong benzene, thu ®−îc 135g s¶n phÈm tinh: §nc = 80 - 82 oC, hiÖu suÊt 89%.

CH2CH2Cl

2 Et3N

2 Et3N . HCl

HCl . HN

CH2CH2Cl

CH2Cl2

CH2CH2Cl

c/ Tæng hîp cyclophosphamide

(Cyclophosphamide)

155 g s¶n phÈm trung gian I vµ 178,5g bis-(2-chloroethyl) amine hydro-

chloride ®−îc hoµ tan trong 1000 ml CH2Cl2, lµm l¹nh tíi -5 oC b»ng hçn hîp ®¸ muèi. Sau ®ã võa khuÊy võa nhá vµo dung dÞch trªn tõng giät cña 222 g Et3N. Qu¸

tr×nh nhá giät diÔn ra trong kho¶ng 2 giê, sao cho ph¶n øng ®−îc duy tr× ë nhiÖt ®é

kh«ng v−ît qu¸ -5 oC. TiÕp tôc khuÊy ë nhiÖt ®é phßng thªm 3 giê n÷a, ngõng

khuÊy, lµm l¹nh. Läc bá kÕt tña Et3N.HCl, röa l¹i víi 500 ml CH2Cl2, thu lÊy phÇn n−íc läc, c« quay d−íi ¸p suÊt thÊp. PhÇn cÆn thu ®−îc ®−îc hoµ tan trong 600 ml H2O, ®Ó qua ®ªm ë + 5 oC. Läc, röa kÕt tña b»ng n−íc l¹nh, thu ®−îc 192,5 g (69%) cyclophosphamide s¹ch: §nc = 41 - 45 oC.

Quy tr×nh IV:

HOCH2CH2

ClCH2CH2

NH . HCl

SOCl2

CHCl3

HOCH2CH2

ClCH2CH2

a/ Tæng hîp bis - (β - chloroethyl) amine hydrochloride

100 ml SOCl2 trong 100 ml CHCl3 ®−îc nhá tõ tõ (kho¶ng 30 phót) vµo hçn hîp gåm 50 ml diethanol amine trong 100 ml CHCl3. Hçn hîp ph¶n øng tù s«i lªn,

sau ®ã chuyÓn dÇn vÒ d¹ng trong suèt. §un håi l−u nhÑ cho bay hÕt khÝ SO2 vµ HCl

(kho¶ng 30 phót); gi÷ hçn hîp ph¶n øng ë nhiÖt ®é phßng trong 1 giê; h¹ l¹nh

xuèng 10 oC; s¶n phÈm ph¶n øng tù kÕt tinh, läc, röa s¶n phÈm b»ng ete lµm kh« ë

¸p suÊt thÊp. KÕt tinh l¹i s¶n phÈm trong dung m«i lµ aceton thu ®−îc 50g s¶n phÈm

tinh: §nc = 216 - 217 oC, hiÖu suÊt 59%.

CH2CH2Cl

ClCH2CH2

2 Et3N

HCl . HN

POCl3

2 Et3N . HCl

CH2Cl2

CH2CH2Cl

ClCH2CH2

b/ Tæng hîp s¶n phÈm trung gian II

(S¶n phÈm trung gian II)

153 g POCl3 ®−îc cho thªm vµo dung dÞch huyÒn phï cña 178 g bis-(2- chloroethyl) amine hydrochloride trong 1000 ml CH2Cl2, lµm l¹nh tíi -5 oC b»ng hçn hîp ®¸ muèi. Sau ®ã võa khuÊy võa nhá vµo huyÒn phï trªn tõng giät dung dÞch

cña 300 ml triethyl amine. Qu¸ tr×nh nhá giät diÔn ra trong kho¶ng 2 giê, sao cho

ph¶n øng ®−îc duy tr× ë nhiÖt ®é kh«ng v−ît qu¸ -5 oC. Sau 3 giê ngõng khuÊy, ®Ó

qua ®ªm. Läc bá kÕt tña Et3N.HCl, röa l¹i víi 500 ml CH2Cl2, thu lÊy phÇn n−íc läc, c« quay d−íi ¸p suÊt thÊp. KÕt tinh l¹i trong hçn hîp dung m«i lµ acetone vµ ete dÇu

má, läc thu ®−îc 232g s¶n phÈm trung gian II: §nc = 54 - 56 oC, hiÖu suÊt 90%.

CH2CH2Cl

ClCH2CH2

2 Et3N

+ 2 Et3N . HCl

HO CH2CH2CH2

NH2

CH2CH2Cl

CH2Cl2

ClCH2CH2

c/ Tæng hîp cyclophosphamide tõ s¶n phÈm trung gian II

(Cyclophosphamide)

259 g (1mol) s¶n phÈm trung gian II ®−îc hoµ tan trong 1000 ml CH2Cl2, lµm l¹nh tíi -5 oC b»ng hçn hîp ®¸ muèi. Sau ®ã võa khuÊy võa nhá vµo dung dÞch trªn

tõng giät cña dung dÞch gåm 76 g (1mol) 3-amino-1-propanol trong 300 ml Et3N.

Qu¸ tr×nh nhá giät diÔn ra trong kho¶ng 2 giê, sao cho ph¶n øng ®−îc duy tr× ë nhiÖt

®é kh«ng v−ît qu¸ -5 oC. TiÕp tôc khuÊy ë nhiÖt ®é phßng thªm 3 giê n÷a, ngõng

khuÊy, lµm l¹nh. Läc bá kÕt tña Et3N.HCl, thu lÊy phÇn n−íc läc, c« quay d−íi ¸p suÊt thÊp. PhÇn cÆn thu ®−îc ®−îc chiÕt b»ng 4000 ml Et2O, b·o hoµ n−íc ®Ó qua ®ªm ë + 5 oC. Läc, röa s¶n phÈm kÕt tinh b»ng Et2O l¹nh, thu ®−îc 191 g (68,5%) cyclophosphamide s¹ch: §nc = 41 - 45 oC.

So víi c¸c c«ng tr×nh khoa häc ®· ®−îc c«ng bè bëi c¸c nhµ khoa häc §øc,

th× c¸c quy tr×nh tæng hîp cyclophosphamide mµ §Ò tµi ®· nªu ë trªn ®· ®−îc thay

®æi ë mét sè ®iÓm cho phï hîp víi ®iÒu kiÖn nãng, Èm vµ thiÕu trang thiÕt bÞ chuyªn

dông cña ViÖt Nam. 27

§Ò tµi ®· tiÕn hµnh thö nghiÖm lÆp l¹i nhiÒu lÇn tõng quy tr×nh tæng hîp

cyclophosphamide ®· nªu ë trªn. C¸c kÕt qu¶ thu ®−îc lµ c¬ së cho viÖc ph©n tÝch,

so s¸nh vµ ®¸nh gi¸ ®é æn ®Þnh vµ tÝnh lÆp l¹i cña tõng quy tr×nh, tõ ®ã ®óc kÕt kinh

nghiÖm vµ x©y dùng Quy tr×nh c«ng nghÖ tèi −u cã thÓ ¸p dông cho s¶n xuÊt ®Ó

tæng hîp l−îng lín cyclophosphamide.

Quy tr×nh tinh chÕ s¶n phÈm cyclophosphamide:

§Ó thu ®−îc cyclophosphamide d−îc dông th× vÉn cÇn ph¶i tinh chÕ l¹i s¶n

phÈm cyclophosphamide mµ §Ò tµi ®· tæng hîp ®−îc.

Qua qu¸ tr×nh nghiªn cøu thö nghiÖm §Ò tµi ®· chän ®−îc gi¶i ph¸p tèi −u ®Ó

tinh chÕ cyclophosphamide:

− Lo¹i bá t¹p chÊt

− KÕt tinh l¹i cyclophosphamide trong hçn hîp dung m«i ethanol/ n−íc víi tû

lÖ 3 : 5 (v/v)

− Lµm kh« ë nhiÖt ®é phßng d−íi ¸p suÊt gi¶m (400 mm Hg).

Cô thÓ nh− sau: 100 g cyclophosphamide ®−îc hoµ tan trong 300 ml hçn hîp

dung m«i [ethanol : n−íc (3: 5)], cho thªm vµo dung dÞch 1g than ho¹t tÝnh (®−îc

lµm tõ x−¬ng ®éng vËt), võa khuÊy võa ®un nãng trªn bÕp c¸ch thuû ë nhiÖt ®é 50 -

55 o C trong kho¶ng 15 phót, läc bá than ho¹t tÝnh. PhÇn n−íc c¸i ®−îc ®Ó kÕt tinh

qua ®ªm ë +5 o C, läc, lµm kh« d−íi ¸p suÊt thÊp, thu ®−îc 60 g cyclophosphamide

d−îc dông: §nc = 41 - 44 o C.

KÕt luËn:

• Qua c¸c thö nghiÖm trªn, §Ò tµi ®· chän Quy tr×nh I lµ quy tr×nh cã ®é æn

®Þnh cao, Ýt s¶n phÈm phô, dÔ tinh chÕ, thêi gian ph¶n øng ng¾n vµ cho hiÖu

suÊt thu håi cao ®Ó tæng hîp cyclophosphamide.

• Quy tr×nh nµy cã thÓ ¸p dông ®Ó tæng hîp cyclophosphamide ë l−îng lín.

• §· chän ®−îc quy tr×nh tinh chÕ s¶n phÈm ®¬n gi¶n ®Ó thu ®−îc

cyclophosphamide ®¹t tiªu chuÈn nguyªn liÖu ®Ó bµo chÕ thuèc pha tiªm.

• Gi¸ thµnh cña s¶n phÈm cyclophosphamide nÕu s¶n xuÊt trong n−íc theo

Quy tr×nh I sÏ vµo kho¶ng 50 - 60 % gi¸ thµnh cña thuèc nhËp khÈu (ë ®©y

chØ tÝnh gi¸ nguyªn liÖu).

2.2.2. Nghiªn cøu kh¼ng ®Þnh cÊu tróc ho¸ häc cña s¶n phÈm

cyclophosphamide tæng hîp ®−îc:

• ViÖn Ho¸ häc, ViÖn KH vµ CNVN ®· tiÕn hµnh x¸c ®Þnh c¸c th«ng sè vËt

lý vµ ®o c¸c phæ cña cyclophosphamide tæng hîp ®−îc, cã so s¸nh víi

cyclophosphamide chuÈn cña CHLB §øc nh− sau:

- §iÓm ch¶y cña cyclophosphamide: §nc: = 42 - 44 oC, ®−îc ®o trªn m¸y

®o ®iÓm ch¶y IA 9200 do h·ng Electrothermal (§an M¹ch) s¶n xuÊt.

- KiÓm tra ®é tinh khiÕt b»ng s¾c ký líp máng: Trªn b¶n máng tr¸ng s½n

cña h·ng Merck GF254 víi hÖ dung m«i lµ: acid formic : aceton : n−íc : methylethylketon (2 : 4 : 12 : 80). S¶n phÈm chØ cho mét vÖt vµ hoµn toµn

trïng víi vÖt cña cyclophosphamide chuÈn cña §øc.

- Phæ khèi va ch¹m electron (EI-MS) ®−îc ®o trªn m¸y Hewlett Packard

5989B MS Engine: Phæ (EI-MS) cho c¸c ®Ønh: m/z = 260 [M]+; 211 [M - CH2Cl]+ ; 120 [M - Cl2C4H8N]+ ; 92 [M - ClC3H6N]+; 56 [C3H6N]+. Phæ

nµy hoµn toµn trïng víi phæ cña cyclophosphamide chuÈn.

Phæ khèi (EI-MS) cña cyclophosphamide do §Ò tµi tæng hîp ®−îc

- Ngoµi ra, ®Ó kiÓm tra ®é tinh khiÕt cña cyclophosphamide tæng hîp ®−îc chóng t«i ®· tiÕn hµnh nghiªn cøu phæ LC/ MS (S¾c ký láng ghÐp nèi khèi phæ: LC/ MS ®−îc ®o trªn m¸y 1100 LC/ MSD Trap do h·ng Agilent (Mü) s¶n xuÊt: Trªn phæ ®å cã mét pic víi thêi gian l−u 18,4 phót, sè khèi m/z = 260,9. Pic 260,9 lµ pic cña ion ph©n tö cña cyclophosphamide. Cyclophosphamide cña §Ò tµi vµ cyclophosphamide chuÈn cho cïng thêi gian l−u vµ phæ khèi.

S¾c ký láng/ khèi phæ (LC/ MS) cña cyclophosphamide do §Ò tµi tæng hîp ®−îc

- Phæ hång ngo¹i (IR): §o d¹ng viªn nÐn KBr trªn m¸y IMPACT - 410 cña h·ng Carl Zeiss Jena (CHLB §øc). Phæ IR cho c¸c ®Ønh ë ν*max = 3479, 3436, 3193, 2965, 1454, 1223, 1186, 1051, 743 cm -1, trïng víi phæ cña chÊt chuÈn.

Phæ hång ngo¹i (IR) cña cyclophosphamide tæng hîp ®−îc

- Phæ céng h−ëng tõ h¹t nh©n ph©n gi¶i cao 1H - vµ 13C - NMR ®−îc ®o

trong dung m«i CDCl3; trªn m¸y Bruker AVANCE 500 MHz.

+ 1H - NMR: δ (ppm): 4,44 m (1H); 4,29 m (1H); 3,62 m (4H); 3,48 m

(5H); 3,40 m (1H); 2,64 s br (1H); 1,95 m (1H);

Phæ 1H - NMR cña cyclophosphamide do §Ò tµi tæng hîp ®−îc

+ 13C - NMR: δ (ppm): 67,4; 48,7; 42,3; 41,5; 25,8 (m = ®a béi; sbr = ®¬n

béi tï).

Phæ 13C - NMR cña cyclophosphamide do §Ò tµi tæng hîp ®−îc

+ KÕt luËn: TÊt c¶ c¸c phæ cña s¶n phÈm cyclophosphamide tæng hîp ®−îc

®· ®−îc so s¸nh víi phæ cña thuèc Endoxan (cyclophosphamide) do h·ng

Baxter Oncology GmbH - CHLB §øc s¶n xuÊt, hiÖn ®ang ®−îc BÖnh viÖn

K sö dông trong ®iÒu trÞ bÖnh ung th−. KÕt qu¶ cho thÊy, c¸c phæ cña c¶ 2

s¶n phÈm nµy lµ hoµn toµn gièng nhau (Xem phÇn phô lôc).

2.2.3. KiÓm nghiÖm s¶n phÈm cyclophosphamide theo tiªu chuÈn D−îc ®iÓn

Anh, BP 2001:

ViÖn KiÓm nghiÓm, Bé Y tÕ ®· tiÕn hµnh ph©n tÝch s¶n phÈm

cyclophosphamide cña §Ò tµi theo tiªu chuÈn cña D−îc ®iÓn Anh, BP 2001.

STT

Yªu cÇu

KÕt qu¶

1 M« t¶: Tinh thÓ mµu tr¾ng

§óng

§Þnh tÝnh: Ph¶i thÓ hiÖn phÐp thö ®Þnh tÝnh cña cyclophosphamide

3 §é trong vµ mµu s¾c cña dung dÞch: Ph¶i ®¹t quy ®Þnh

§¹t

4 Kim loai nÆng: Kh«ng qu¸ 20ppm

§¹t

5 Hµm l−îng n−íc: tõ 6,0 ®Õn 7,0%

§¹t (6,3%)

pH:

tõ 4,0 ®Õn 6,0 (dung dÞch 2% kl/ tt)

§¹t (5,3)

§¹t

KÕt qu¶ ®−îc nªu d−íi ®©y:

§¹t (99,3%)

T¹p chÊt liªn quan: tõng t¹p chÊt ≤ 1,0%

§Þnh l−îng: Hµm l−îng cyclophosphamide ph¶i ®¹t tõ 98,0 ®Õn 102,0% tÝnh theo chÊt khan.

9 Clorid:

§¹t

10 Phosphat: Kh«ng qu¸ 10ppm

§¹t

Kh«ng qu¸ 330ppm

KÕt qu¶ kiÓm nghiÖm cho thÊy: S¶n phÈm cyclophosphamide do ®Ò tµi tæng

hîp ®−îc ®· ®¹t tiªu chuÈn D−îc ®iÓn Anh, BP 2001.

2.2.4. Nghiªn cøu ®éc tÝnh cÊp vµ b¸n cÊp cña s¶n phÈm cyclophosphamide:

S¶n phÈm cyclophosphmide do §Ò tµi tæng hîp ®−îc ®· ®−îc tiÕn hµnh

nghiªn cøu tiÒn l©m sµng (t×m LD50, thö ®éc tÝnh cÊp, b¸n cÊp, quan s¸t ®¹i thÓ, soi

vi thÓ gan, thËn cña ®éng vËt thÝ nghiÖm) t¹i ViÖn KiÓm nghiÖm - Bé Y tÕ vµ t¹i Bé

m«n Gi¶i phÉu bÖnh, thuéc tr−êng §¹i häc Y Hµ Néi.

KÕt qu¶ thu ®−îc nh− sau:

a/ §éc tÝnh cÊp:

• Thö trªn chuét nh¾t, ®· x¸c ®Þnh ®−îc liÒu g©y chÕt 50% (LD50) lµ 485 mg/kg (414,5 -567,5 mg/kg) víi P = 0,05 (theo c¸ch tÝnh cña Litchfield-

Wilcoxon).

• Thö trªn chã ®Ó th¨m dß liÒu tèi ®a dung n¹p vµ liÒu g©y chÕt. ¸p dông

ph−¬ng ph¸p c¶i tiÕn "Up and Down" ®Ó t×m liÒu tèi ®a dung n¹p trªn chã.

KÕt qu¶ (khi tiªm tÜnh m¹ch trªn chã) ®· x¸c ®Þnh ®−îc:

+ LiÒu tèi ®a kh«ng g©y chÕt (dung n¹p): 35 mg/kg.

+ LiÒu g©y chÕt chã: 50 mg/kg.

+ C¸c triÖu chøng ngé ®éc trªn chã quan s¸t ®−îc chñ yÕu lµ n«n, buån n«n,

ch¸n ¨n, mÖt mái. Møc liÒu cao g©y triÖu chøng nÆng h¬n kÌm theo xuÊt

huyÕt ®−êng tiªu hãa, ®−êng niÖu, xØu dÇn råi chÕt.

b/

§éc tÝnh b¸n cÊp:

Ph−¬ng ph¸p thö:

+ ThÝ nghiÖm ®−îc tiÕn hµnh trªn 30 con thá, chia lµm 3 nhãm, mét nhãm

chøng vµ hai nhãm thö, mçi nhãm 10 con thá.

+ Thö b»ng c¸ch tiªm dung dÞch thuèc víi nång ®é kh¸c nhau vµo tÜnh

m¹ch tai thá, mçi tuÇn mét lÇn, liªn tôc trong 4 tuÇn. Thá ë c¶ 3 nhãm

®−îc nu«i trong cïng ®iÒu kiÖn vµ cïng chÕ ®é dinh d−ìng.

+ Theo dâi, ®¸nh gi¸ c¸c chØ tiªu cña thá tr−íc vµ sau khi thÝ nghiÖm.

+ Sau 4 tuÇn mæ thá quan s¸t ®¹i thÓ c¸c tæ chøc gan, thËn, phæi, tim vÒ

h×nh d¹ng, mµu s¾c, thÓ chÊt, t×nh tr¹ng xung huyÕt.

+ Tiªu b¶n vi thÓ tæ chøc gan, thËn ®−îc thùc hiÖn t¹i Bé m«n Gi¶i phÉu

bÖnh, §¹i häc Y Hµ Néi.

+ So s¸nh thèng kª theo test t c¸c kÕt qu¶ tr−íc thÝ nghiÖm vµ sau mçi tuÇn

cña c¸c nhãm thö, so s¸nh tr−íc, gi÷a vµ sau thÝ nghiÖm gi÷a nhãm chøng

vµ tõng nhãm thö.

KÕt qu¶:

+ Víi hai møc liÒu 20mg/ kg/ lÇn vµ 100mg/ kg/ lÇn so víi nhãm chøng

ch−a nhËn thÊy biÓu hiÖn sù kh¸c nhau ®¸ng kÓ ë nhãm thá dïng liÒu thÊp

(20mg/ kg).

+ Víi nhãm dïng liÒu cao (100 mg/kg), hÇu hÕt c¸c chØ sè huyÕt häc ®Òu

thay ®æi vµ kh¸c biÖt râ rÖt, ®iÓn h×nh lµ c¸c chØ sè tiÓu cÇu, hång cÇu,

huyÕt s¾c tè.

+ C¸c chØ sè sinh ho¸ thay ®æi kh«ng ®¸ng kÓ hoÆc thÊt th−êng ë c¶ nhãm

thö 1 vµ nhãm thö 2. HÇu hÕt thá nhãm thö 2 ®Òu cã biÓu hiÖn rông l«ng.

+ Quan s¸t ®¹i thÓ c¸c tæ chøc tim, gan, thËn sau khi thÝ nghiÖm nhËn

thÊy:

− Cã sù xung huyÕt nhÑ ë thËn trªn mét sè thá ë nhãm 2. Nh−ng sù kh¸c

biÖt gi÷a nhãm thö vµ nhãm chøng lµ ch−a râ rµng.

+ Quan s¸t vi thÓ cho thÊy:

− Thá thùc nghiÖm bÞ nhiÔm bÖnh tõ tr−íc ë gan lµ 10 con (l« 1: 4 con,

l« 2: 3 con, l« 3: 3 con).

Trong ®ã:

− TÕ bµo gan ngoµi vïng tæn th−¬ng b×nh th−êng: 5 con (l« 1: 2 con, l«

2: 1 con, l« 3: 2 con).

− TÕ bµo gan tho¸i ho¸ thòng ®ôc vµ tho¸i ho¸ h¹t nhÑ: 5 con (l« 1: 2

con, l« 2: 2 con, l« 3: 1 con).

− Sè thá cßn l¹i 20 con (l« 1: 6 con, l« 2: 7con, l« 3: 7 con)

Cô thÓ nh− sau:

Gan:

− TÕ bµo gan kh«ng cã tæn th−¬ng: 16 con (l« 1: 5/6, l« 2: 6/7, l« 3: 5/7).

− TÕ bµo gan tho¸i ho¸ h¹t: 4 con (l«1: 1 con, l« 2: 1 con, l« 3: 2 con).

Nh− vËy:

Gan: Kh«ng cã tæn th−¬ng ë c¶ 3 l« (16 con) t−¬ng tù nhau, chØ gÆp tæn

th−¬ng tho¸i ho¸ thòng ®ôc, tho¸i ho¸ h¹t ë møc ®é nhÑ: 4 con vµ kh«ng cã

sù kh¸c biÖt gi÷a 3 l«. (Chi tiÕt xem phÇn phô lôc)

ThËn: Ph©n tÝch c¶ 30 con, kÕt qu¶ nh− sau:

− CÇu thËn, èng thËn kh«ng cã tæn th−¬ng: 24 con (l« 1: 8 con, l« 2: 7

con, l« 3: 9 con).

− Xung huyÕt cÇu thËn vµ m« kÏ: 5 con (l« 1: 2 con, l« 2: 2 con, l« 3: 1

con).

− Viªm cÇu thËn m·n tÝnh: 1 con (l« 2).

Nh− vËy:

ThËn: Kh«ng cã biÓu hiÖn tæn th−¬ng, 3 l« t−¬ng tù nhau, xung huyÕt cÇu

thËn vµ m« kÏ gi÷a 3 l« còng kh«ng cã sù kh¸c biÖt. Mét con ë l« 2 cã viªm

cÇu thËn m·n tÝnh. (Chi tiÕt xem phÇn phô lôc)

2.2.5. Nghiªn cøu bµo chÕ thuèc cyclophosphamide pha tiªm:

S¶n phÈm cyclophosphamide do §Ò tµi tæng hîp ®−îc ®· ®−îc nghiªn cøu

bµo chÕ thµnh thuèc bét pha tiªm 200mg/ lä vµ n−íc cÊt pha tiªm 10ml/lä trªn d©y

chuyÒn GMP cña XÝ nghiÖp D−îc phÈm TWI theo s¬ ®å I vµ II:

KÕt qu¶:

S¶n phÈm thuèc bét cyclophosphamide pha tiªm cña §Ò tµi sau khi bµo chÕ

®· ®−îc kiÓm nghiÖm l¹i t¹i ViÖn kiÓm nghiÖm Bé Y tÕ vµ ®¹t tiªu chuÈn thuèc

thµnh phÈm ®−îc quy ®Þnh trong D−îc ®iÓn Anh (BP 2001), cã thÓ ®−a vµo thö

nghiÖm l©m sµng trªn bÖnh nh©n t×nh nguyÖn t¹i BÖnh viÖn K Hµ Néi.

¶nh s¶n phÈm thuèc cyclophosphamide vµ

n−íc cÊt pha tiªm cña §Ò tµi KC 10. 25

S¬ ®å I: giai ®o¹n ®ãng lä bét thuèc cyclophosphamide

Röa nót cao su röa lä& n¾p nh«m ChuÈn bÞ m¸y vµ nguyªn liÖu

SÊy kh« N¹p Nguyªn liÖu (bét thuèc cyclophosphamidE) HÊp 120oC/30 phót

®ãng lä C©n KiÓm tra SÊy 125oC/ 2,5 giê

®Ëy nót cao su

®Ëy n¾p nh«m

siÕt n¾p

soi

d¸n nh∙n

N−íc cÊt tiªm 10 ml ®ãng gãi

KiÓm nghiÖm thµnh phÈm

S¶n xuÊt d−íi LAF ( cÊp s¹ch d−íi 100) nhËp kho

S¶n xuÊt trong phßng v« trïng cÊp II (cÊp s¹ch d−íi 10. 000)

èng 10 ml

Röa ngoµi

Läc trong Röa trong

KiÓm nghiÖm b¸n thµnh phÈm SÊy kh«

§ãng èng Hµn èng

TiÖt trïng 100 oC / 45 phót

Soi

D¸n Nh∙n

§ãng gãi

KiÓm nghiÖm thµnh phÈm

NhËp kho CyclophosphamidE

S¬ ®å II: giai ®o¹n ®ãng èng n−íc cÊt tiªm 10 ml N−íc cÊt pha tiªm

2.2.6. Nghiªn cøu thö nghiÖm l©m sµng thuèc cyclophosphamide pha tiªm:

2.2.6.1. §Ò c−¬ng nghiªn cøu thö nghiÖm l©m sµng

§−îc sù cho phÐp cña Bé Y tÕ, BÖnh viÖn K Hµ Néi ®· tiÕn hµnh thö l©m

sµng chÕ phÈm thuèc bét cyclophosphamide pha tiªm trªn c¸c bÖnh nh©n t×nh

nguyÖn.

§èi t−îng vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu

+ Tiªu chuÈn chän bÖnh nh©n. Chän 9 bÖnh nh©n trong sè c¸c bÖnh nh©n

vµo viÖn tho¶ m∙n c¸c tiªu chuÈn sau:

− BÖnh nh©n tù nguyÖn tham gia nghiªn cøu (ký b¶n cam kÕt)

− Tuæi tõ 18-70

− Cã chÈn ®o¸n m« bÖnh häc: Ulympho ¸c tÝnh kh«ng Hodgkin ®é ¸c tÝnh

trung b×nh.

− Cã chÈn ®o¸n Ulympho ¸c tÝnh kh«ng Hodgkin giai ®o¹n 3-4 hoÆc t¸i ph¸t.

− XÐt nghiÖm chøc n¨ng gan, thËn cßn trong giíi h¹n b×nh th−êng.

− BÖnh ch−a x©m lÊn tuû x−¬ng.

− Kh«ng ®iÒu trÞ ph¸c ®å cã CPM tr−íc ®ã mét n¨m.

− Ýt nhÊt 3 tuÇn tr−íc ®ã kh«ng ®iÒu trÞ ho¸ chÊt hoÆc tia x¹.

− Kh«ng cßn kh¶ n¨ng ®iÒu trÞ b»ng c¸c ph−¬ng ph¸p kh¸c.

+ Nghiªn cøu pha 1 gåm c¸c b−íc sau (xem S¬ ®å III):

B−íc 1:

− Chän 3 bÖnh nh©n ®ñ tiªu chuÈn, ®iÒu trÞ Cyclophosphamide liÒu 250

mg/m2, pha trong 250ml HTN 5%, truyÒn tÜnh m¹ch 60 giät/phót.

− Sau ®iÒu trÞ nÕu d−íi 33.3% bÖnh nh©n (tøc d−íi 2 bÖnh nh©n) cã ®éc tÝnh

d−íi ®é 2 th× nghiªn cøu sÏ ®−îc chuyÓn sang b−íc 2.

− Sau ®iÒu trÞ nÕu cã trªn 33.3% sè bÖnh nh©n (tøc trªn 2 bÖnh nh©n) cã biÓu

hiÖn ngé ®éc trªn ®é 2, sÏ chän l¹i 3 bÖnh nh©n kh¸c vµ lµm l¹i nh− trªn.

− NÕu sau lÇn chän thø 2, kÕt qu¶ vÉn nh− lÇn chän thø nhÊt th× ngõng nghiªn

cøu.

− NÕu kh«ng cã ®éc tÝnh trªn 2 bÖnh nh©n th× chuyÓn sang ®iÒu trÞ b−íc 2.

S¬ ®å III: nghiªn cøu thö nghiÖm l©m sµng

thuèc cyclophosphamide

Chän 3 bÖnh nh©n x CPM 250 mg/m2

> 2/3BN cã ®éc tÝnh trªn ®é 2 ≤ 2/3BN cã ®éc tÝnh trªn ®é 2

Lµm l¹i lÇn 2

Dõng nghiªn cøu ChuyÓn sang b−íc 2

Chän 3 bÖnh nh©n x CPM 500mg/m2

> 2/3BN cã ®éc tÝnh trªn ®é 2 ≤ 2/3BN cã ®éc tÝnh trªn ®é 2

Lµm l¹i lÇn 2

Dõng nghiªn cøu ChuyÓn sang b−íc 3

Chän 3 bÖnh nh©n x 3 CK CPM 750mg/m2/21ng

> 6/9 CK cã ®éc tÝnh trªn ®é 2 ≤ 6/9CK cã ®éc tÝnh trªn ®é 2

Lµm l¹i lÇn 2

Dõng nghiªn cøu KÕt luËn

B−íc 2:

− Chän 3 bÖnh nh©n kh¸c ®ñ tiªu chuÈn, n©ng liÒu 500mg/m2 da c¬ thÓ, pha trong

250ml HTN 5%, truyÒn tÜnh m¹ch 60 giät/phót. Sau ®iÒu trÞ nÕu d−íi 33.3%

bÖnh nh©n (tøc d−íi 2 bÖnh nh©n) cã ®éc tÝnh d−íi ®é 2 th× nghiªn cøu sÏ ®−îc

chuyÓn sang b−íc 3.

−

Sau ®iÒu trÞ nÕu cã trªn 33.3% sè bÖnh nh©n (tøc trªn 2 bÖnh nh©n) cã biÓu hiÖn

ngé ®éc trªn ®é 2, sÏ chän l¹i 3 bÖnh nh©n kh¸c vµ lµm l¹i nh− trªn.

− NÕu sau lÇn chän thø 2, kÕt qu¶ vÉn nh− lÇn chän thø nhÊt th× ngõng nghiªn

cøu.

− NÕu kh«ng cã ®éc tÝnh trªn 2 bÖnh nh©n th× chuyÓn sang ®iÒu trÞ b−íc 3.

B−íc 3:

− Chän 3 bÖnh nh©n kh¸c ®ñ tiªu chuÈn, n©ng liÒu 750mg/m2 da c¬ thÓ, pha trong

250ml HTN5%, truyÒn tÜnh m¹ch 60g/p, chu kú 21 ngµy, mçi bÖnh nh©n ®iÒu

trÞ 3 chu kú, tæng céng 9 chu kú.

−

Sau 9 chu kú nÕu trªn 33.3% sè chu kú (trªn 6 chu kú) cã biÓu hiÖn ngé ®éc

trªn ®é 2 sÏ chän l¹i 3 bÖnh nh©n kh¸c vµ lµm nh− trªn.

− NÕu sau lÇn chän thø 2, kÕt qu¶ vÉn nh− lÇn chän thø nhÊt th× ngõng nghiªn

cøu.

− Ghi nhËn ®éc tÝnh cÊp x¶y ra ngay sau mçi lÇn tiªm truyÒn, sau 3 chu kú cña c¶

3 bÖnh nh©n.

− §¸nh gi¸ vµ ghi nhËn c¸c t¸c dông phô trªn hÖ t¹o huyÕt (chØ sè HC, BC vµ TC),

hÖ tiªu ho¸ (n«n, buån n«n, tiªu ch¶y...) vµ c¸c chØ sè men gan, chøc n¨ng thËn,

cÊp ®é theo WHO. ViÖc ghi nhËn ®−îc thùc hiÖn tr−íc, sau mçi ®ît ®iÒu trÞ vµ

trong thêi gian gi÷a 2 chu kú cho b−íc 3.

− §èi víi bÖnh nh©n cã biÓu hiÖn t¸c dông phô, sau khi ghi nhËn ®Òu ®−îc sö trÝ

kÞp thêi.

− Thu thËp d÷ liÖu: Theo mÉu bÖnh ¸n in s½n, ®¸nh sè bÖnh nh©n tõ 1-9

− C¸c chØ sè ®−îc ghi cô thÓ cña tõng bÖnh nh©n

2.2.6.2. KÕt qu¶ nghiªn cøu thö nghiÖm l©m sµng

B¶ng 6: §Æc ®iÓm bÖnh nh©n cña c¶ 3 b−íc

250mg

500mg

750mg

§Æc ®iÓm bÖnh nh©n

Céng

Theo tuæi

≥60 tuæi

<60 tuæi

Theo Karnofsky

80%

90%

Giai ®o¹n III B

Giai ®o¹n IV A

Giai ®o¹n IV B

T¸i ph¸t

B¶ng 7: C¸c chØ sè huyÕt häc vµ ho¸ sinh ë liÒu 250mg/m2 tr−íc vµ sau ®iÒu trÞ

Tr−íc ®iÒu trÞ

Sau ®iÒu trÞ

ChØ sè

BN1

BN2

BN3

BN1

BN2

BN3

BC (G/l)

4,4

5,4

6,0

5,0

6,0

5,2

BCH (G/l)

2,1

3,8

3,3

3,6

3,7

2,6

Hb (G/l)

119

123

128

120

TC (G/l)

325

278

279

295

218

Ure (mmol/l)

2,3

8,9

5,1

4,4

5,6

Cre (mmol/l)

121

113

120

GOT (U/l)

GPT (U/l)

C¸c chØ sè hÇu nh− Ýt biÕn ®éng vµ ®Òu n»m trong giíi h¹n b×nh

NhËn xÐt: th−êng.

B¶ng 8: C¸c chØ sè huyÕt häc vµ ho¸ sinh ë liÒu 500mg/m2 tr−íc vµ sau ®iÒu trÞ

Tr−íc ®iÒu trÞ

Sau ®iÒu trÞ

ChØ sè

BN4

BN5

BN6

BN4

BN5

BN6

BC (G/l)

7,6

5,6

6,8

7,7

3,4

1,8

2,6

4,4

3,8

BCH (G/l)

4,4

9,6

Hb (G/l)

141

125

120

141

107

118

TC (G/l)

221

371

256

206

511

221

Ure (mmol/l)

3,8

4,3

5,3

4,4

5,9

7,0

Cre (mmol/l)

100

GOT (U/l)

BC (G/l)

NhËn xÐt: víi liÒu 500mg/m2 c¸c t¸c dông phô vÒ huyÕt häc b¾t ®Çu xuÊt hiÖn

nh−ng ®Òu ë møc ®é nhÑ chñ yÕu lµ ®é 1, cã 1/3 CK h¹ BC vµ 1/3 CK h¹ BCH ë ®é 1,

®Òu ë mét bÖnh nh©n .

HiÖu qu¶: ChØ cã 1 BN ®¹t ®¸p øng mét phÇn

B¶ng 9: C¸c chØ sè huyÕt häc vµ ho¸ sinh ë liÒu 750mg/m2 tr−íc vµ sau ®iÒu trÞ

Tr−íc ®iÒu trÞ

Sau 1chu kú

Sau 2 chu kú

Sau 3 chu kú

ChØ sè

BN7 BN8 BN9 BN7 BN8 BN9 BN7 BN8 BN9 BN7 BN8 BN9

3,5

3,8

4,0

4,4

4,0

4,1

BC (G/l)

4,3

5,7

3,7

4,1

4,2

5,2

1,5

1,9

1,4

BCH (G/l)

2,5

3,9

3,8

2,1

2,6

3,5

2,3

2,0

Hb (G/l)

140

125

117

135

123

118

136

126

115

120

119

112

TC (G/l)

228

294

270

220

256

150

240

190

189

238

178

160

Ure (mmol/l)

3,9

4,3

6,5

5,6

7,0

7,5

6,1

6,8

7,4

6,5

7,3

6,9

Cre (mmol/l)

100

49

67

50

GOT (U/l)

GPT (U/l)

NhËn xÐt: Víi møc liÒu 750 mg cyclophosphamide/ m2 da c¬ thÓ, c¸c t¸c dông

phô cña cyclophosphamide hÇu nh− ®Òu xuÊt hiÖn víi møc ®é nÆng h¬n vµ nhiÒu h¬n.

Cã 2/9 CK h¹ BCH ®é 1; 1/9 CK h¹ BC ®é 2; 2/9 CK h¹ BC ®é 1; 4/9 CK t¨ng GOT

®é 1, TC kh«ng cã sù thay ®æi. HC vµ Hb biÕn ®æi Ýt vµ n»m trong giíi h¹n b×nh th−êng

ChØ sè GOT vµ GPT biÕn ®æi nhÑ cã 4/9 CK t¨ng GOT ®é 1.

HiÖu qu¶: c¶ 3 BN ®Òu ®¹t ®−îc ®¸p øng mét phÇn

B¶ng 10: C¸c t¸c dông phô kh¸c víi c¶ 3 møc liÒu ®iÒu trÞ

LiÒu thuèc

250mg

N=3

500mg

N=3

750mg

N=3

Sè CK

Møc ®é

Sè CK

Møc ®é

Sè CK

Møc ®é

®é 1

Buån n«n

®é 1

N«n

Viªm BQ

Viªm n/m

®é 1

Rông tãc

NhËn xÐt:

+ Víi liÒu 250mg/m2 kh«ng cã bÖnh nh©n nµo biÓu hiÖn t¸c dông phô .

+ Víi liÒu 500mg/m2 cã 1/3 CK biÓu hiÖn buån n«n ®é 1; 3/3 CK rông tãc ®é 1.

+ Víi liÒu 750mg/ m2 cã 6/9 CK buån n«n ®é 1; 1/9 CK n«n ®é 1; 9/9 CK rông

tãc ®é 1.

• §éc tÝnh cña thuèc

Theo khuyÕn c¸o vµ kinh nghiÖm khi sö dông cyclophosphamide nhËp ngo¹i cña

§øc, chóng t«i th−êng tËp trung vµo quan s¸t vµ ghi nhËn nh÷ng t¸c dông phô hay gÆp

nh− : øc chÕ tuû x−¬ng, ¶nh h−ëng tíi chøc n¨ng gan thËn, buån n«n, n«n, tiªu ch¶y vµ

®Æc biÖt lµ g©y viªm bµng quang nÕu dïng liÒu cao... §Ó viÖc ®¸nh gi¸ c¸c t¸c dông phô

cña thuèc ®−îc kh¸ch quan, lµm t¨ng tÝnh gi¸ trÞ nghiªn cøu, khi truyÒn thuèc

cyclophosphamide cho bÖnh nh©n chóng t«i kh«ng dïng thªm mét lo¹i thuèc nµo ®Ó

®iÒu trÞ dù phßng c¸c t¸c dông phô nh− thuèc chèng n«n, thuèc cã t¸c dông h¹ men

gan... ChØ khi c¸c t¸c dông phô ®−îc quan s¸t vµ ghi nhËn th× bÖnh nh©n míi ®−îc dïng

c¸c thuèc ®iÒu trÞ triÖu chøng ®· ®−îc khuyÕn c¸o còng nh− theo kinh nghiÖm cña

chóng t«i khi sö dông.

+ Cyclophosphamide nhËp ngo¹i: Trªn tÊt c¶ 9 bÖnh nh©n ngay khi tiªm truyÒn

kh«ng thÊy x¶y ra ®éc tÝnh cÊp nh− c¶m gi¸c khã chÞu, sèc, cho¸ng.....Trong

nghiªn cøu bÖnh nh©n cã ®é tuæi tõ 38 ®Õn 71 vµ cã chØ sè Karnofsky chñ yÕu

lµ 90%.

Víi møc liÒu khëi ®Çu cho nghiªn cøu lµ 250mg/ m2 da c¬ thÓ :

+ C¸c chØ sè vÒ huyÕt häc vµ sinh ho¸ ®Òu n»m trong giíi h¹n b×nh th−êng. C¸c

t¸c dông phô kh¸c nh− buån n«n, n«n, viªm niªm m¹c, rông tãc, viªm bµng

quang hÇu nh− kh«ng x¶y ra. KÕt qu¶ nµy còng n»m trong dù ®o¸n cña chóng

t«i khi chän møc 250mg/ m2 lµm liÒu khëi ®Çu cho nghiªn cøu.

Víi møc liÒu 500mg/ m2 da c¬ thÓ :

+ C¸c t¸c dông phô vÒ huyÕt häc b¾t ®Çu xuÊt hiÖn nh−ng ®Òu ë møc ®é nhÑ chñ

yÕu lµ ®é 1, cã 1/3 CK h¹ BC vµ 1/3 CK h¹ BCH ë ®é 1, ®Òu ë mét bÖnh nh©n.

+ ChØ sè TC vµ Hb thay ®æi Ýt nh−ng vÉn n»m trong giíi h¹n b×nh th−êng . Qua

theo dâi chóng t«i thÊy c¸c chØ sè nµy trë vÒ møc b×nh th−êng sau khi bÖnh

nh©n ®−îc nghØ 1 tuÇn.

+ ChØ sè vÒ chøc n¨ng gan SGOT, SGPT biÕn ®æi møc ®é nhÑ, hai chØ sè nµy t¨ng

chøng tá cã sù tæn th−¬ng huû ho¹i tÕ bµo gan, ë møc liÒu nµy cã 1/3 CK t¨ng

GOT ®é 1. Víi møc t¨ng nµy kh«ng cã chèng chØ ®Þnh ®iÒu trÞ ho¸ chÊt.

+ ChØ sè vÒ chøc n¨ng thËn: Ure, Creatinin hÇu nh− kh«ng biÕn ®æi.

+ C¸c t¸c dông phô kh¸c biÓu hiÖn nhiÒu h¬n ë møc liÒu nµy, buån n«n gÆp 1/3

CK møc ®é 1, triÖu chøng nµy hÕt khi bÖnh nh©n ®−îc dïng thuèc chèng n«n.

Rông tãc gÆp 3/3 CK ë møc ®é 1. N«n, viªm niªm m¹c, viªm bµng quang ch−a

thÊy xuÊt hiÖn.

+ Nh− vËy kÕt qu¶ nghiªn cøu ë møc liÒu 500mg/ m2 cho thÊy ë tÊt c¶ c¸c chØ sè

nghiªn cøu ®Òu cã ®éc tÝnh ®é 1. Do ®ã chóng t«i chuyÓn sang nghiªn cøu tiÕp

b−íc 3.

Víi møc liÒu 750mg/ m2 da c¬ thÓ :

+ C¸c t¸c dông phô cña Cyclophosphamide hÇu nh− ®Òu xuÊt hiÖn víi møc ®é

nÆng h¬n vµ nhiÒu h¬n.

+ XuÊt hiÖn ®éc tÝnh cña thuèc trªn tÊt c¶ c¸c bÖnh nh©n ë nhiÒu møc ®é nÆng nhÑ

kh¸c nhau. Dßng BC vµ BCH vÉn thÓ hiÖn sù nh¹y c¶m víi thuèc nhưng kh«ng

cã xu h−íng gi¶m theo sè chu kú ®iÒu trÞ .

+ VÒ chØ sè BC, cã 2/9 CK h¹ BCH ®é 1; 1/9 CK h¹ BC ®é 2; 2/9 CK h¹ BC ®é

1; 4/9 CK t¨ng GOT ®é 1, TC kh«ng cã sù thay ®æi. HC vµ Hb biÕn ®æi Ýt vµ

n»m trong giíi h¹n b×nh th−êng.

+ ChØ sè GOT vµ GPT biÕn ®æi nhÑ cã 4/9 CK t¨ng GOT ®é 1, nh÷ng bÖnh nh©n

nµy sau dïng thuèc bæ gan mét tuÇn c¸c chØ sè ®Òu trë vÒ b×nh th−êng.

+ Hai chØ sè Ure vµ Creatinin ®Òu trong giíi h¹n b×nh th−êng . C¸c triÖu chøng

kh¸c còng xuÊt hiÖn nÆng h¬n vµ nhiÒu h¬n. Cã 6/9 CK buån n«n ®é 1; 1/9 CK

n«n ®é 1; 9/9 CK rông tãc ®é 1. Viªm bµng quang vµ viªm niªm m¹c hÇu nh−

kh«ng x¶y ra.

• HiÖu qu¶ ®iÒu trÞ:

MÆc dï môc tiªu cña Pha 1 ®Æt ra chñ yÕu lµ ®Ó ®¸nh gi¸ ®éc tÝnh vµ t×m ra liÒu

khuyÕn c¸o cho c¸c thö nghiÖm tiÕp theo, song trong khi tiÕn hµnh chóng t«i còng ®·

quan s¸t vµ nhËn thÊy thuèc Ýt nhiÒu cã hiÖu qu¶ ®iÒu trÞ.

Cô thÓ nh− sau:

+ B¾t ®Çu tõ liÒu 500mg/m2 da, ®· cã ®¸p øng mét phÇn ë bÖnh nh©n thö nghiÖm.

+ KÕt qu¶ nµy ®−îc thÊy râ h¬n ë møc liÒu 750mg/ m2 diÖn tÝch da c¬ thÓ vµ nhÊt lµ

ë nh÷ng chu kú sau.

+ §iÒu nµy còng kh«ng n»m ngoµi dù ®o¸n cña chóng t«i bëi trong nghiªn cøu nµy

th×: Ph¸c ®å ®iÒu trÞ cho bÖnh nh©n t×nh nguyÖn sÏ chØ dïng mét lo¹i thuèc lµ

cyclophosphamide do §Ò tµi KC 10. 25 cung cÊp mµ kh«ng dïng thªm c¸c lo¹i

thuèc kÕt hîp kh¸c nh−: cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine vµ

prednisone (Ph¸c ®å CHOP).

KÕt luËn:

• C¶ 3 b−íc thö nghiÖm chØ cÇn tiÕn hµnh 1 lÇn.

• Trªn c¶ 9 bÖnh nh©n kh«ng x¶y ra ®éc tÝnh cÊp khi truyÒn thuèc nh− næi ban ®á,

sèc, cho¸ng ph¶n vÖ…

• Tõ liÒu 500 mg/m2 da trë lªn thÊy cã ®éc tÝnh nhÑ ë hÖ t¹o huyÕt (gi¶m b¹ch cÇu

®é 1), t¨ng men gan (®é 1). C¸c ®éc tÝnh nµy xuÊt hiÖn nhiÒu h¬n ë liÒu b−íc 2,

nh−ng vÉn n»m trong giíi h¹n cho phÐp.

• C¶ 3 bÖnh nh©n cã ®¸p øng mét phÇn khi dïng liÒu 750mg/ m2 da c¬ thÓ.

• S¶n phÈm thuèc Cyclophosphamide cña §Ò tµi KC 10. 25 víi liÒu 750 mg/ m2

diÖn tÝch da c¬ thÓ lµ liÒu sö dông an toµn.

KiÕn nghÞ:

• CÇn tiÕp tôc lµm thö nghiÖm l©m sµng Pha II ®Ó ®¸nh gi¸ hiÖu qu¶ chèng ung

th− cña thuèc.

2.2.7. Nghiªn cøu ®é bÒn cña cyclophosphamide

2.2.7.1. Nghiªn cøu ®é bÒn cña nguyªn liÖu cyclophosphamide:

• ChuÈn bÞ mÉu thö

Nguyªn liÖu cyclophosphamide cña ®Ò tµi KC 10. 25 tr−íc khi ®em ®ãng lä

®−îc b¶o qu¶n ë c¸c nhiÖt ®é kh¸c nhau (15 - 30 oC); trong lä nót kÝn, trong

phßng kÝn (cã sö dông thiÕt bÞ lµm kh« kh«ng khÝ). KiÓm tra b»ng ph−¬ng ph¸p

s¾c ký líp máng, s¾c ký láng ghÐp nèi khèi phæ (LC/MS) so s¸nh víi c¸c mÉu

chuÈn nh−: thuèc cyclophosphamide (lµ s¶n phÈm ®· ®−îc bµo chÕ cña ®Ò tµi);

so víi thuèc chuÈn (thuèc Endoxan cña CHLB §øc); vµ nguyªn liÖu

cyclophosphamide cña §Ò tµi ®· ®−îc b¶o qu¶n ®Æc biÖt (®Ó trong buång l¹nh,

lä tèi mµu ®Ó ng¨n ngõa t¸c dông cña ¸nh s¸ng).

• KÕt qu¶:

Nguyªn liÖu cyclophosphamide cña ®Ò tµi KC 10. 25 sau thêi gian thö 03 th¸ng

(90 ngµy) kh«ng bÞ biÕn ®æi so víi c¸c mÉu so s¸nh.

- Trªn s¾c ký líp máng kh«ng xuÊt hiÖn c¸c pic l¹; chØ xuÊt hiÖn 1 vÕt cã Rf

trïng víi Rf cña dung dÞch so s¸nh.

- S¾c ký láng ghÐp nèi khèi phæ cho 01 pic cã thêi gian l−u trung b×nh lµ 18,4

phót; sè khèi m/z = 260,9 phï hîp víi mÉu so s¸nh.

• KÕt luËn:

Cyclophosphamide lµ t−¬ng ®èi bÒn ë ®iÒu kiÖn b×nh th−êng. §Ó b¶o qu¶n

nguyªn liÖu cyclophosphamide tr−íc khi bµo chÕ chØ cÇn ¸p dông c¸c ph−¬ng

ph¸p b¶o qu¶n th«ng th−êng nh−: b¶o qu¶n trong chai, lä kÝn, ®Ó n¬i tho¸ng

m¸t, kh«ng cÇn ph¶i ¸p dông c¸c ph−¬ng ph¸p b¶o qu¶n ®Æc biÖt.

2.2.7.2. Nghiªn cøu ®é bÒn cña cyclophosphamide ë trong dung dÞch n−íc:

• ChuÈn bÞ mÉu thö

Dung dÞch mÉu thö ®−îc chuÈn bÞ nh− sau: Dïng b¬m tiªm lÊy 10 ml n−íc cÊt

pha tiªm (s¶n phÈm cña XN DPTW I), b¬m vµo lä ®ùng thuèc bét

cyclophosphamide, l¾c m¹nh cho tíi khi thuèc ®−îc hoµ tan hoµn toµn, b¶o qu¶n

trong lä kÝn ë nhiÖt ®é 15 - 30 oC;

Chu kú lÊy "MÉu thö":

0,5ml/ 3 ngµy/ lÇn.

KiÓm tra b»ng c¸c ph−¬ng ph¸p s¾c ký líp máng, s¾c ký láng ghÐp nèi khèi phæ

so s¸nh víi dung dÞch thuèc cyclophosphamide cña §Ò tµi vµ thuèc

cyclophosphamide chuÈn võa míi ®−îc hoµ tan.

• KÕt qu¶:

ChÕ phÈm cyclophosphamide cña §Ò tµi ë trong dung dÞch n−íc sau thêi gian thö

03 th¸ng (90 ngµy) kh«ng bÞ biÕn ®æi so víi mÉu so s¸nh.

- Trªn s¾c ký líp máng chØ xuÊt hiÖn 1 vÕt cã Rf trïng víi Rf cña dung dÞch so

s¸nh.

- S¾c ký láng ghÐp nèi khèi phæ cho 01 pic cã thêi gian l−u trung b×nh lµ 18,4

phót; sè khèi m/z = 260,9 phï hîp víi mÉu so s¸nh.

• KÕt luËn:

Cyclophosphamide lµ t−¬ng ®èi bÒn trong dung dÞch n−íc.

2.2.8. C¸c kÕt qu¶ kh¸c

• VÒ ®µo t¹o:

Hai häc viªn cao häc hiÖn ®ang sö dông chÕ phÈm cña §Ò

tµi lµm nguyªn liÖu nghiªn cøu cho luËn v¨n tèt nghiÖp.

• B¸o c¸o khoa häc: 01 b¸o c¸o khoa häc "Cyclophosphamide, thuèc ®iÒu trÞ ung

th−" ®· ®−îc ®¨ng trªn TuyÓn tËp b¸o c¸o Héi nghÞ khoa

häc cña ViÖn Ho¸ häc n¨m 2005, trang 9 -14.

• Bµi b¸o:

01 bµi b¸o "Tæng hîp cyclophosphamide" ®−îc ®¨ng trªn

§Æc san ung th− häc, Quý III n¨m 2005, trang 298-301.

01 bµi b¸o vÒ kÕt qu¶ nghiªn cøu ®éc

tÝnh cña

cyclophosphamide cña §Ò tµi sÏ göi ®¨ng trªn t¹p chÝ KiÓm

nghiÖm thuèc.

KÕt luËn vµ kiÕn nghÞ

3. 3.1. KÕt luËn

• §Ò tµi ®· hoµn thµnh tèt c¸c môc tiªu ®· ®Ò ra:

• §· nghiªn cøu ®−a ra quy tr×nh kh¶ thi vµ cã tÝnh kinh tÕ ®Ó tæng hîp

cyclophosphamide. Quy tr×nh nµy cã thÓ ¸p dông ®Ó tæng hîp l−îng lín.

• §· tæng hîp ®−îc 4250 gam cyclophosphamide ®¹t tiªu chuÈn D−îc ®iÓn Anh

BP 2001.

• §· nghiªn cøu ®éc tÝnh cÊp vµ b¸n cÊp cña cyclophosphamide tæng hîp ®−îc.

• §· bµo chÕ cyclophosphamide pha tiªm trªn d©y chuyªn GMP t¹i xÝ nghiÖp

D−îc phÈm TW I. Thuèc bét pha tiªm bµo chÕ ra ®¹t tiªu chuÈn thuèc tiªm theo

BP 2001.

• §· nghiªn cøu l©m sµng giai ®o¹n I thuèc cyclophosphamide trªn bÖnh nh©n ung

th− t×nh nguyÖn. KÕt qu¶ liÒu 750mg/ m2 diÖn tÝch da c¬ thÓ lµ liÒu sö dông an

toµn vµ cã t¸c dông.

• Thanh quyÕt to¸n tµi chÝnh ®óng dù to¸n vµ theo quy ®Þnh cña nhµ n−íc.

3.2. kiÕn nghÞ

• §Ò nghÞ Bé Khoa häc vµ C«ng nghÖ phª duyÖt giai ®o¹n 2 cña §Ò tµi ®Ó tæng hîp

l−îng lín cyclophosphamide cho viÖc nghiªn cøu t¸c dông ®iÒu trÞ ung th− vµ

mét sè bÖnh cã nguyªn nh©n tù miÔn kh¸c.

• TiÕn hµnh nghiªn cøu bµo chÕ thuèc cyclophosphamide d¹ng viªn nÐn dïng

®−êng uèng ®Ó tiÖn dïng cho c¸c vïng n«ng th«n vµ miÒn nói.

Hµ Néi, ngµy / / 2006 C¬ quan chñ tr× §Ò tµi KC 10. 25 Chñ nhiÖm ®Ò tµi ViÖn Ho¸ häc

GS.TSKH. TrÇn V¨n Sung

Môc lôc

Bµi tãm t¾t

1. 2.

PhÇn chÝnh b¸o c¸o

2.1.

PhÇn tæng quan

2.1.1.

Cyclophosphamide

2.1.1.1.

C¬ chÕ t¸c dông cña cyclophosphamide

2.1.1.2.

2.1.1.3.

2.1.1.4.

2.1.1.5.

2.1.2.

TrÝch dÉn néi dung thuyÕt minh cña §Ò tµi

2.2.

C¸c kÕt qu¶ nghiªn cøu cña §Ò tµi

2.2.1.

Nghiªn cøu quy tr×nh tæng hîp cyclophosphamide

Quy tr×nh tinh chÕ s¶n phÈm cyclophosphamide

2.2.2.

2.2.3.

2.2.4.

2.2.5.

Nghiªn cøu bµo chÕ thuèc cyclophosphamide pha tiªm

2.2.6.

2.2.6.1.

2.2.6.2.

2.2.7.

Nghiªn cøu ®é bÒn cña cyclophosphamide

2.2.7.1.

2.2.7.2.

Nghiªn cøu ®é bÒn cña nguyªn liÖu cyclophosphamide Nghiªn cøu ®é bÒn cña cyclophosphamide ë trong dung dÞch n−íc

2.2.8.

C¸c kÕt qu¶ kh¸c

KÕt luËn vµ kiÕn nghÞ

B¸o c¸o quyÕt to¸n tµi chÝnh

Lêi c¶m ¬n

Tµi liÖu tham kh¶o

viÖn ho¸ häc

viÖn khoa häc vµ c«ng nghÖ viÖt nam

18 §−êng Hoµng Quèc ViÖt - CÇu GiÊy - Hµ Néi B¸o c¸o tãm t¾t ®Ò tµi

GS. TSKH. TrÇn V¨n Sung Hµ Néi, 4 - 2006

Môc lôc Néi dung

Môc

PhÇn chÝnh b¸o c¸o

§Æt vÊn ®Ò

1.1.

1.1.1.

Cyclophosphamide

1.1.1.1.

C¬ chÕ t¸c dông cña cyclophosphamide

Nh÷ng nghiªn cøu ®· cã xung quanh cyclophosphamide

1.1.1.2.

1.1.1.3.

1.1.1.4.

T×nh h×nh nghiªn cøu, sö dông cyclophosphamide t¹i ViÖt Nam C¸c d¹ng s¶n phÈm chÝnh cña cyclophosphamide vµ nhu cÇu vÒ thuèc cyclophosphamide

TrÝch dÉn néi dung thuyÕt minh cña ®Ò tµi

1.1.2.

C¸c kÕt qu¶ nghiªn cøu cña §Ò tµi

1.2.

Nghiªn cøu quy tr×nh tæng hîp cyclophosphamide

1.2.1.

1.2.2.

1.2.3.

1.2.4.

Quy tr×nh tinh chÕ s¶n phÈm cyclophosphamide Nghiªn cøu kh¼ng ®Þnh cÊu tróc ho¸ häc cña s¶n phÈm cyclophosphamide tæng hîp ®−îc KiÓm nghiÖm s¶n phÈm cyclophosphamide theo tiªu chuÈn D−îc ®iÓn Anh, BP 2001 Nghiªn cøu ®éc tÝnh cÊp vµ b¸n cÊp cña s¶n phÈm cyclophosphamide

1.2.5.

1.2.6.

1.2.6.1.

1.2.6.2.

Nghiªn cøu ®é bÒn cña cyclophosphamide

1.2.7.

1.2.8.

C¸c kÕt qu¶ kh¸c

KÕt luËn vµ kiÕn nghÞ

Tµi liÖu tham kh¶o

PhÇn chÝnh b¸o c¸o 1.

1.1. §Æt vÊn ®Ò

1.1.1. Cyclophosphamide

Cyclophosphamide cã tªn khoa häc lµ (RS)-2-[bis(2-chloroethyl) amino]

tetrahydro-2H-1,3,2-oxazo phosphorine 2-oxide hoÆc N,N-bis-[2-chloroethyl] N,O-

trimethylendiamidophosphat (I); c«ng thøc tæng lµ C7H15Cl2N2O2P. H2O, khèi l−îng

C«ng thøc cÊu t¹o lµ:

O

Cl

H2C

O

N

P

. H2O

Cl

H2C

HN

Tinh thÓ cyclophosphamide cã mµu tr¾ng hoÆc gÇn tr¾ng, tan trong n−íc, rÊt

dÔ tan trong cån, tan võa ph¶i trong ete.

1.1.1.1. C¬ chÕ t¸c dông cña cyclophosphamide

HiÖn nay cyclophosphamide lµ lo¹i thuèc chèng ung th− ®−îc sö dông nhiÒu

nhÊt trong ®iÒu trÞ ho¸ chÊt liÒu cao víi tæng liÒu l−îng dïng lµ 500 -700mg/m2 da

ng−êi trong 1 ®Õn 4 ngµy. Lµ mét lo¹i ho¹t chÊt dÔ mÊt nit¬, cyclophosphamide

®ãng vai trß ankyl ho¸ ADN lµm cho ADN kh«ng th¸o rêi ®−îc, do vËy kh«ng t¹o

thµnh ARN do ®ã dÉn tíi viÖc t¸i s¶n xuÊt tÕ bµo bÞ k×m h·m, tr−íc hÕt lµ ®èi víi

c¸c hÖ tÕ bµo ph¸t triÓn nhanh nh− c¸c tuyÕn tiÕt, da, tuû x−¬ng vµ ®Æc biÖt lµ c¸c u

¸c tÝnh [1,2].

C¸c hîp chÊt cã tÝnh ankyl ho¸ sÏ tÊn c«ng vµo qu¸ tr×nh trao ®æi chÊt cña a

xÝt nucleic vµ k×m h·m sù ph¸t triÓn hoÆc tiªu diÖt nh÷ng tÕ bµo bÞ bÖnh. Tuy nhiªn,

chóng còng tÊn c«ng c¶ tÕ bµo lµnh vµ ë liÒu hiÖu dông chóng còng cã ®éc tÝnh ®¸ng

kÓ.

Theo nguyªn lý vÒ ''d¹ng vËn chuyÓn" (transport) vµ '' d¹ng ho¹t tÝnh '' (active

form) cña mét biÖt d−îc ®èi víi c¸c chÊt cã t¸c dông ankyl ho¸ th× mét ho¹t chÊt

cÇn ®−îc ®−a vµo c¬ thÓ ë ''d¹ng vËn chuyÓn'' tøc lµ ë d¹ng ch−a cã ho¹t tÝnh. D¹ng

nµy sÏ chuyÓn thµnh ''d¹ng ho¹t tÝnh'' trong c¬ thÓ vµ nÕu cã thÓ th× ngay t¹i vÞ trÝ

cÇn ®iÒu trÞ cã nghÜa lµ lµm t¨ng ®é chän läc cña thuèc. VÝ dô: §èi víi c¸c chÊt dÔ

bÞ lo¹i nit¬ th× hîp chÊt chøa nhãm oxit nit¬ (N→O) lµ mét '' d¹ng vËn chuyÓn''

thùc thô. Nguyªn lý nµy ®· ®−îc ¸p dông víi lo¹i thuèc ch÷a ung th− tiÒn liÖt tuyÕn

lµ stilbeoestroldiphosphate.

Nh− ®· biÕt th× trong c¬ thÓ ng−êi bÖnh, t¹i bé phËn bÞ ung th− cã tån t¹i mét

phosphamide vµ este cña axit phosphoric.

Víi ý t−ëng lµ: ®é chän läc cña thuèc sÏ t¨ng ®¸ng kÓ, nÕu ''d¹ng ho¹t tÝnh''

®−îc t¹o thµnh trùc tiÕp t¹i vÞ trÝ cÇn ®iÒu trÞ, ng−êi ta ®· tæng hîp ra chÊt

phosphamide este II.

NH

Cl

H2C

R1

N P

O

Cl

H2C

R2

1.1.1.2. Nh÷ng nghiªn cøu ®∙ cã xung quanh cyclophosphamide

Cyclophosphamide ®· ®−îc Arnold, Bourseaux vµ Hirsch [3,4] t×m ra lÇn ®Çu

tiªn n¨m 1956 trong phßng nghiªn cøu cña nhµ m¸y Asta víi ký hiÖu lµ B518. ViÖc

tæng hîp ra chÊt nµy lµ kÕt qu¶ cña sù mong muèn ¸p dông nguyªn lý ''d¹ng vËn

chuyÓn" vµ '' d¹ng ho¹t tÝnh ''.

Arnold, Bourseaux vµ Brock [7] ®· nghiªn cøu mèi quan hÖ gi÷a cÊu tróc vµ

ho¹t tÝnh kh¸ng ung th− cña hîp chÊt nµy. KÕt qu¶ thu ®−îc ë chÊt

C¬ chÕ biÕn ®æi cña cyclophosphamide trong c¬ thÓ ®· ®−îc C.L. Roux vµ

céng sù tiÕp tôc nghiªn cøu [6].

Mét dÉn xuÊt kh¸c cña cyclophosphamide cã nhãm thÕ ë m¹ch vßng còng ®·

®−îc tæng hîp ®Ó nghiªn cøu ho¹t tÝnh chèng ung th− [7,8].

Cyclophosphamide cßn ®−îc sö dông lµm ®éc tè cho s¬n chèng hµ dïng cho

c¸c tµu biÓn [9].

®−îc tiÕp tôc nghiªn cøu [10,11,12].

1.1.1.3. T×nh h×nh nghiªn cøu, sö dông cyclophosphamide t¹i ViÖt Nam

Khoa Ho¸ häc tr−êng §¹i häc Tæng hîp Hµ Néi ®· tiÕn hµnh nghiªn cøu c¸c

ph−¬ng ph¸p ®iÒu chÕ vµ c¬ chÕ t¸c dông cña c¸c hîp chÊt c¬ phèt pho nh»m phôc

vô n«ng nghiÖp vµ y tÕ [13-15].

Cyclophosphamide ®· qua b−íc nghiªn cøu c¬ b¶n trong ®Ò tµi ''Tæng hîp

mét sè hîp chÊt c¬ kim cã ho¹t tÝnh sinh lý m¹nh'' cÊp Bé §¹i häc, Trung häc

chuyªn nghiÖp, m· sè 149/Q§ ngµy 01/3/1972, nghiÖm thu ngµy 30/10/1975 vµ ®Ò

tµi cÊp nhµ n−íc '' Tæng hîp c¸c chÊt chèng virus'' m· sè 510801, Hµ Néi 2002.

HiÖn nay cyclophosphamide ®· ®−îc sö dông trong ch−¬ng tr×nh ®a hoÆc ®¬n

ho¸ trÞ liÖu ®Ó ch÷a c¸c bÖnh sau: