Các loại enzim tổng hợp axit nuclêic
Enzyme sao chép một axit nucleic: Quá trình sao chép chuỗi axit nucleic tức
là tổng hợp một chuỗi DNA hoặc RNA được tiến hành theo nguyên tắc bổ
sung và đối song song. Việc thêm một nucleotide mới được tiến hành theo
hướng 5’ → 3’.
1- Enzyme sao chép DNA → DNA
Là các enzyme DNA-polymerase I, enzyme T4 DNA-polymerase, Taq
polymerase tổng hợp chuỗi DNA từ một khuôn DNA hay còn gọi "enzyme
phụ thuộc DNA".
1.1- Enzyme DNA - polymerase I
Enzyme DNA-polymerase có nguồi gốc được tách từ vi khuẩn E. Coli, chúng
có ba hoạt tính:
- Hoạt tính tổng hợp DNA theo hướng 5’ → 3’ và sửa chữa trong
sao chép,
- Hoạt tính exonuclease theo hướng 3’ → 5’,
- Hoạt tính exonuclease theo hướng 5’ → 3’.
Ngày nay enzyme DNA-polymerase được dùng chủ yếu để xác định trình tự
DNA bằng phương pháp didesoxynucleotide của Sanger, ngoài ra, còn dùng
để tổng hợp mẫu dò có độ phóng xạ cao, hoặc xây dựng các vector từ DNA
mạch đơn.
Trong thực tế người ta hay sử dụng đoạn Klenow là sản phẩm thủy phân của
enzyme DNA-polymerase I, có hoạt tính exonuclease theo hướng 3’ → 5’ và
hoạt tính tổng hợp.
1.2- Enzyme T4 DNA - polymerase
Có nguồn gốc từ phage T4 xâm nhiễm E. Coli có hoạt tính exonuclease theo
hướng 3’ → 5’ . Enzyme này mạnh nên được sử dụng nhiều để tổng hợp
mẫu dò có độ phóng xạ cao.
1.3- Enzyme Taq - polymerase
Trích li từ vi khuẩn Thermocellus aquaticus, là enzyme chịu nhiệt cao, có tác
dụng khuyếch đại tổng hợp DNA. Enzyme này chủ yếu sử dụng để nhân
dòng gen trong phản ứng PCR.
2- Enzyme phiên mã ngược (Reverse transferase)
Là enzyme có khả năng sao chép bộ gen RNA của retrovirus khi ký sinh
trong tế bào chủ tạo ra cDNA, theo chiều 5’ → 3’ cần có mặt của mồi. Đây là
giai đoạn cần thiết để tạo ra ngân hàng cDNA.
Hiện nay trên thị trường enzyme phiên mã ngược có nguồn gốc từ AMV
(Avian Myeloblastosis Virus). Enzyme phiên mã ngược là một DNA-
polymerase 5’ → 3’, có các đặc tính sau:
- Là enzyme phụ thuộc RNA,
- Tổng hợp DNA theo hướng 5’ → 3’,
- Có hoạt tính RNase.
Chúng được ứng dụng để thiết lập ngân hàng cDNA hoặc tiến hành phản ứng
PCR trên mRNA, ngoài ra, chúng còn được sử dụng để xác định trình tự
DNA bằng phương pháp sử dụng các didesoxynucleotide của Sanger.
3- Các enzyme tổng hợp RNA (RNA-polymerase)
Có ba loại RNA polymerase được sử dụng nhiều nhất hiện nay là SP6 RNA-
polymerse có nguồn gốc từ phage xâm nhiễm Salmonella typhimurium. T3,
T7 RNA-polymerase được trích ly từ phage T3 và T7 xâm nhiễm E. Coli.
Các enzyme này hoạt động trên sợi khuôn DNA xúc tác sự tổng hợp RNA
theo hướng 5’ → 3’. Quá trình tổng hợp không cần mồi nhưng khuôn DNA
phải mang promoter đặc trưng của phage. Các enzyme này được ứng dụng
để:
- Để tổng hợp các mẫu dò RNA đánh dấu phóng xạ trong phòng thí nghiệm.
- Nghiên cứu bản phiên mã RNA của một DNA đã được dòng hóa
nhờ phương pháp PCR.
- Xác định trình tự DNA được gắn trong một vector có mang các
promoter đặc trưng của phare SP6, T3 , T7.
Ngoài ra người ta còn dùng enzyme này tổng hợp lượng lớn RNA từ DNA
được nối ngay sau promoter thích hợp.
4- Enzyme terminal - transferase
Enzyme này được trích ly từ tuyến ức bê. Có các đặc tính:
- Terminal-transferase xúc tác gắn cùng một loại nucleotide vào đầu
3’−OH tự do của phân tử DNA để tạo đuôi polynucleotide.
Chúng được ứng dụng để:
- Thêm đuôi polynucleotide để tạo đầu sole cho phân tử DNA dùng trong kỹ
thuật tạo dòng.
- Đánh dấu đầu 3’ (OH) của phân tử DNA để xác định trình tự axit nucleic
theo Manxam và Gilbert.