CHƯƠNG VII. CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN THỰC VẬT

Chia sẻ: đinh Văn Thao Thao | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:13

Thêm vào BST

Báo xấu

133
lượt xem 15
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Giải quyết được những vấn đề trong chương trình tạo giống cổ điển. Nhờ xác định và dòng hóa những gene chuyên biệt cho tính trạng mong muốn...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: CHƯƠNG VII. CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN THỰC VẬT

4/6/2011 Quá trình chọn lọc tự nhiên CHƯƠNG VII. • Trao đổi vật liệu di truyền  tạo ra những tính trạng mong muốn  gia CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN tăng sản lượng cây trồng. THỰC VẬT • Tính trạng chỉ được tạo ra từ những dòng hữu thụ. • Không loại trừ được những tính trạng không mong muốn. Kỹ thuật tái tổ hợp DNA Kỹ thuật tái tổ hợp DNA • Mục đích thay đổi di truyền • Nguồn, chức năng và khả năng tiếp hợp • Giải quyết được những vấn đề trong bền vững của gene chuyển chương trình tạo giống cổ điển. • Phân tích thành phần thực phẩm (hàm • Nhờ xác định và dòng hóa những gene lượng dinh dưỡng, độc tố tích lũy,…) chuyên biệt cho tính trạng mong muốn VD: tính trạng chịu rét, chịu mặn, kháng thuốc diệt cỏ, chín chậm, … Overview genetic engineering Kỹ thuật tái tổ hợp DNA Dòng hóa gene đích • Nguồn gene đích có thể là DNA nhiễm • Cây trồng chuyển gene thương mại đầu sắc thể hay cDNA từ mRNA tiên: FLAVRSAVR tomato (Calgene Inc. ) • Enzyme công cụ • Ức chế gene tạo enzyme polygalactu- • Vector tạo dòng ronase (PG) phân hủy pectin nhờ chuyển antisense gene 1
4/6/2011 Các enzyme công cụ • Restriction enzymes (Enzyme cắt giới hạn) • Ligase (Enzyme nối) Các vector tạo dòng Cho trình tự DNA:  Phage λ: 5’… CCTAGATCTTTAACC…TAGATCTAA…3’ • DNA sợi đôi thẳng 3’…GGATCTAGAAATTGG…ATCTAGATT…5’ • Kích thước: 48,5 kb A) Xử lý DNA trên với enzyme giới hạn BgIII (A/GATCT). Sẽ thu được mấy đoạn • Chèn DNA có kích thước 18-25 kb DNA trong 2 trường hợp DNA đã cho là mạch thẳng và mạch vòng. Vẽ các đoạn DNA được phóng thích (nếu có) B) Có thể xen đoạn DNA được phóng thích vào vector được cắt bởi enzyme BamHI (G/GATCC) hay không? Vẽ hình minh họa Electron micrograph of bacterial phage from the host E. coli Các vector tạo dòng Các vector tạo dòng  Phage M13:  Plasmid: • DNA sợi đơn vòng • DNA vòng sợi kép, nằm ngoài NST VK • Kích thước: 6,4 kb • Chèn DNA có kích thước 18-25 kb • Nhiều dạng biến đổi của M13 có mang các polylinker (hay MCS) ppBR322 p BR322 BR322 4361 bp 4361 bp 2
4/6/2011 Các vector tạo dòng Các vector tạo dòng  Cosmid:  Phagemid: • Là vector plasmid chứa gene cos của • Là sự kết hợp giữa phage M13 với phage λ Tái bản giống plasmid plasmid • Chèn được đoạn DNA lớn (35-45 kb) Tạo plasmid tái tổ hợp Xây dựng DNA library • Việc lựa chọn DNA hay cDNA phụ thuộc vào tính trạng mong muốn chuyên biệt và vào hệ phương pháp • Tập hợp những đoạn DNA hay cDNA được gắn vào vector thích hợp Xây dựng (plasmid hay phage) DNA library • Chuyển vector vào vi khuẩn để nhân số lượng và chọn lọc  DNA library Sàng lọc gene mục tiêu Sàng lọc gene mục tiêu 1. Chọn lọc: 2. Sàng lọc: • Vector mang gene kháng kháng sinh • Gene lacZ’ sản xuất β-galactosidase (tetracyclin, penicillin hay ampicillin) thủy giải X-gal tạo sản phẩm có màu xanh lam • Chỉ có dòng nào chứa vector mới sống được trên môi trường chọn lọc có chứa • Nếu có DNA gắn xen vào lacZ’  mất chất kháng sinh khả năng thủy phân X-gal  khuẩn lạc không có màu xanh 3
4/6/2011 Sàng lọc gene mục tiêu 3. Xác định gene đích: • Chuyển vi khuẩn lên giấy lọc • Rửa giấy lọc với dung dịch làm biến tính DNA có chứa các probe đánh dấu phóng xạ • Tìm vết phóng xạ • So sánh với đĩa Petri ban đầu Xây dựng DNA library Screening DNA library Chuyển gene gián tiếp nhờ Agrobacterium Các phương pháp chuyển gene: • Agrobacterium sống lân cận hay ngay • Gián tiếp qua trên bộ rễ  xuyên Agrobacterium qua các vết thương • Trực tiếp: PEG,  tổ chức tế bào xung điện, bắn thực vật phát sinh gene bướu 4
4/6/2011 Chuyển gene gián tiếp nhờ Chuyển gene gián tiếp nhờ Agrobacterium Agrobacterium • Gene tạo bướu nằm trên đoạn T-DNA • Tác nhân gây tạo bướu là Plasmid Ti của • Sự di chuyển của T-DNA vào tế bào vi khuẩn thực vật chịu sự quy định của gene vir Chuyển gene gián tiếp nhờ Chuyển gene gián tiếp nhờ Agrobacterium Agrobacterium • Loại bỏ các gen gây khối u và gen mã hoá opine của T-DNA và thay thế vào đó là các marker • Khi DNA vi khuẩn được hợp nhất với chọn lọc. Gen chuyển được xen vào giữa các nhiễm sắc thể thực vật, nó sẽ tấn công vùng bờ của T-DNA. vào hệ thống tổ chức của tế bào một cách có hiệu quả và sử dụng nó để đảm bảo cho sự sinh sôi của quần thể vi khuẩn. Chuẩn bị Agrobacterium mang plasmid Ti chứa gene đích: • Sàng lọc E.coli chứa gene đích • Tiếp hợp giữa E.coli và Agrobacterium • Tái tổ hợp tương đồng giữa 2 plasmid 5
4/6/2011 Quy trình chuyển gene nhờ Agrobacterium • Chuẩn bị mô cấy và dịch huyền phù VK • Ngâm chung mô với vi khuẩn • Nuôi chung mô với vi khuẩn (2 ngày) • Rửa mô bằng dung dịch kháng sinh • Cấy chuyền mô sang môi trường có tác nhân chọn lọc • Tái sinh cây chuyển gene Một vài yếu tố ảnh hưởng Chuyển gene gián tiếp nhờ Agrobacterium đến hiệu quả biến nạp • Loại mô được biến nạp • Hệ thống chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium là có hiệu quả đối với một số • Giai đoạn phát triển của mô loài nhưng không phải tất cả thực vật có thể • Mức độ khởi đầu của vi khuẩn A. tumefaciens sử dụng được biến nạp bằng con đường này. • Môi trường để nuôi cấy mô sau khi biến nạp • Ðặc biệt, lớp một lá mầm bao gồm các cây • Marker được sử dụng để chọn lọc thể biến ngũ cốc chính trên thế giới như lúa, lúa mì nạp và ngô là không được biến nạp dễ dàng nhờ A. tumefaciens. • Loại vector sử dụng • Kiểu gen của thực vật. • Để DNA dễ xâm nhập được vào tế bào Các phương pháp thực vật, phải loại bỏ vách tế bào tạo chuyển gene: protoplast  Chuyển gene trực tiếp • Gián tiếp qua bằng cơ chế vật lý đơn giản, không cần Agrobacterium có vector. • Trực tiếp: PEG, • Để nâng cao hiệu quả biến nạp, xử lý xung điện, bắn protoplast với PEG hoặc dùng xung gene điện. 6
4/6/2011 Chuyển gene bằng xung điện • Kỹ thuật xung điện dựa trên trạng thái tương đối yếu của các tương tác kỵ nước • Là một phương pháp cơ học của phospholipid kép và khả năng tập hợp • Màng tế bào không cho các phân tử lại một cách tự động của nó sau khi bị rối phân cực như DNA tự do đi qua loạn.  Xung điện chớp nhoáng có thể gây rối loạn ở các vị trí của màng một cách nhất thời, làm cho các phân tử phân cực có thể đi qua nhưng sau đó màng có thể đóng kín lại nhanh chóng và tế bào không bị ảnh hưởng gì cả. Chuyển gene bằng xung Chuyển gene bằng xung điện điện • B1: Các tế bào chủ và DNA ngoại lai • B2: Tạo xung điện bằng máy xung gene được tạo thành dịch huyền phù và cho (gene pulser) vào trong một cuvette nhựa có điện cực Chuyển gene bằng xung điện • CT1 đóng: tụ điện nạp điện • Xung điện cần thiết: 200 - 600 v/cm2 (thay đổi tùy theo kích thước của tế bào) trong và tích một vài phần triệu giây đến một phần ngàn giây điện áp cao  tạo ra các lỗ tạm thời • CT2 đóng: điện • Các phân tử đã được nạp điện đi qua màng tế áp phóng qua bào thông qua các lỗ bằng cách thức tương dịch huyền phù tự như điện di tế bào 7
4/6/2011 Ưu điểm • Với một số cây một lá mầm quan trọng (loài lúa phụ Japonica, ngô, lúa mì) mà không thể thể thực hiện được bằng phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium thì người ta đã thành công với phương pháp này. Hiệu quả biến nạp cao. • Ðoạn DNA ngoại lai được biến nạp có kích thước lớn. Nhược điểm Nhược điểm • Nếu các xung điện có cường độ và • Một hạn chế nữa là sự vận chuyển DNA chiều dài không đúng thì một số lỗ của ngoại lai vào và ra khỏi tế bào trong tế bào sẽ trở nên quá lớn hoặc bị hỏng suốt thời gian điện biến nạp là tương không thể đóng lại sau khi tế bào đối không đặc hiệu. Điều này dẫn đến phóng điện, làm cho tế bào bị tổn kết quả là không cân bằng ion mà sau thương hoặc bị thủng đó sẽ làm rối loạn chức năng của tế bào và tế bào chết Chuyển gene bằng PEG Nhược điểm • Phải tạ o protoplast, tái sinh • PEG tạo ra các lỗ tạm thời trên màng protoplast không đơn giản, tốn nhiều tế bào  giúp DNA thấm vào trong tế công sức, bị ảnh hưởng của nhiều yếu bào. tố môi trường. • Tần số chuyển gene bằng phương pháp này không cao • PEG còn gây kết dính tế bào trần  ảnh hưởng đến tỉ lệ sống của tế bào 8
4/6/2011 Chuyển gene bằng súng bắn gene Các phương pháp • Tên chính xác: hệ thống phân phối hạt chuyển gene: biolistic (biolistic particle delivery • Gián tiếp qua system; biolistics = biology + ballistics). Agrobacterium • Là một thiết bị sử dụng để đưa thông • Trực tiếp: PEG, tin di truyền vào tế bào, được thiết kế xung điện, bắn đầu tiên cho biến nạp DNA ngoại lai gene vào tế bào thực vật. Chuyển gene bằng súng Chuyển gene bằng súng bắn gene bắn gene • Gồm 2 buồng bằng thép không gỉ nối • Nguyên lý chung của phương pháp này với 2 bơm chân không là sử dụng áp lực xung của khí helium để gia tốc các hạt. • Ðạn sử dụng cho loại súng này là các hạt kim loại nặng cơ bản được bao bọc DNA. Chuyển gene bằng súng bắn gene • DNA được gắn vào các hạt tungsten (vàng, bạc) có đường kính khoảng 1μm • Các hạt này được đặt bên trên một cái đĩa ở mặt bên trong của súng • Sự bùng nổ khí ở 1000psi làm cho đĩa bắn về phía trước • Một tấm chắn làm dừng đĩa lại và các hạt tungsten được phóng về các tế bào đích 9
4/6/2011 Chuyển gene bằng súng bắn gene • Mục tiêu của súng bắn gene thường là callus nuôi trên đĩa petri • Khi hạt tungsten va chạm vào đĩa, gel và callus bị phá hủy nhiều nhưng cũng có một số tế bào tiếp nhận hạt tungsten được bao bọc DNA  DNA xâm nhập và hợp nhất vào NST Xác nhận gene chuyển Ưu điểm (nhờ reporter gene) • Gene mã hóa β-glucuronidase (GUS) • Thao tác dễ dàng phân giải X-glucuronide (X-gluc) là • Có thể chuyển gene vào nhiều loại tế một reporter gene hữu hiệu bào, mô • Mô thực vật được chuyển gene có màu • Các tế bào được biến nạp có tỉ lệ sống xanh sót cao • Cho phép đưa các gene vào tế bào ở vị trí mong muốn 10
4/6/2011 Phương pháp phát hiện • Khi gene đã được dòng hóa và chuyển và tế bào chủ, cần phải xác nhận xem gene lạ có được sát nhập vào NST vật chủ hay không • Có thể sử dụng 2 phương pháp Southern blot hay Northern blot Phương pháp Southern blot Phương pháp Southern blot • DNA được cắt bởi một hay vài • DNA được gắn lên màng là bản sao của DNA trên gel restriction enzyme  tạo ra các phân đoạn DNA • Lai với probe có đánh dấu phóng xạ và • Tách các phân đoạn DNA nhờ điện di có trình tự bổ sung với DNA ngoại lai trên gel agarose • Loại bỏ probe không gắn lên màng • DNA trên gel được biến tính tạo mạch • Xác nhận sự hiện diện của DNA ngoại đơn lai trong cây được chuyển gene • Chuyển lên màng nitrocellulose nhờ lực mao dẫn Phương pháp Northern blot • Điểm bất lợi lớn nhất của tất cả các phương pháp chuyển gene trực tiếp là các DNA ngoại lai có xu hướng tái sắp • Tương tự như Southern blot xếp, tái tổ hợp dẫn tới hiện tượng sát • Sử dụng mRNA thay vì DNA nhập nhiều đoạn DNA và tái sắp xếp • mRNA mạch đơn  không cắt bằng các đoạn gene chuyển. restriction enzyme • Những cụm gene này dễ dẫn đến hiện • Probe là các cDNA bổ sung với mRNA tượng tái tổ hợp nội tại  transgene của gene được chèn silencing.  Sử dụng vật liệu chuyển gene trực tiếp là đoạn DNA thuần 11
4/6/2011 Nghiên cứu chuyển gene trên thế giới • Chuyển gene chịu mặn từ các loài cây Đước (Rhizophoraceae) vào cây lúa. • Chuyển gene Bt vào nhiều loại cây trồng như lúa, bông, ngô, đậu tương,… • Chuyển các gene tham gia vào quá trình quang hợp của cây C4 vào cây C3 để tăng hiệu suất quang hợp • Chuyển gene cố định đạm (nif gene) vào cây lúa Nghiên cứu chuyển gene Một số nghiên cứu chuyển trên thế giới gene ở Việt Nam • Chuyển gene kháng thuốc diệt cỏ vào cây lúa • Chuyển gene chín chậm (ripening delay gene) vào cây cà chua • Chuyển gene mang nhiều đặc tính chữa bệnh và có tác dụng làm dược phẩm: gene tổng hợp insulin, gene tổng hợp vitamin A,…  Tăng năng suất cây trồng, tăng chất lượng sản phẩm, không gây ô nhiễm môi trường Chuyển gene kháng sâu đục • Vật liệu: giống lúa Nàng Hương Chợ Đào thân vào cây lúa • Môi trường nuôi cấy mô lúa: MS có bổ sung 2,4-D (tạo mô sẹo) hoặc NAA, Kinetin (tái sinh cây) Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển, Karabi Datta, • Chủng VK Agrobacterium tumerfasiens: Swapan Kumar Datta (Viện sinh học nhiệt đới, LBA4404 mang plasmid pBIN-BAR- Viện lúa Quốc tế) UBI-IB-AB mang gene Bt tổng hợp giữa cryIA và cryIB, gene Bar 12
4/6/2011 • Chuẩn bị dịch vi khuẩn: duy trì vi khuẩn • Gây nhiễm: mô sẹo có khả năng phát trên môi trường thạch LB có chứa 50 sinh phôi được gây nhiễm với dịch vi mg/l Kanamycin và 50 mg/l Rifampicin. khuẩn (OD=2) có chứa Acetosyringone Tăng sinh trên môi trường AB lỏng lắc • Chọn lọc: cụm mô được rửa lại bằng nước có chất kháng sinh trước khi gây nhiễm cất vô trùng có bổ sung 500 mg/l cho tế bào lúa Cefotaxime  Nuôi cấy trên môi • Chuẩn bị vật liệu chuyển gene: hạt lúa đã trường chọn lọc có Phosphinothricin (3 khử trùng được nuôi cấy trên môi mg/l)  Cấy chuyền mô kháng PPT sang trường MS có bổ sung 2 mg/l 2,4-D  môi trường chọn lọc từ 3-4 lần mô sẹo có khả năng phát sinh phôi • Tái sinh cây: môi trường MS có bổ sung • Tái sinh cây: môi trường MS có bổ sung 0,2 mg/l NAA, 2 mg/l Kinetin, 500 mg/l 0,2 mg/l NAA, 2 mg/l Kinetin, 500 mg/l Cefotaxim, có hoặc không có PPT Cefotaxim, có hoặc không có PPT • Phân tích PCR: dùng mồi đặc hiệu cho • Phân tích PCR: dùng mồi đặc hiệu cho gene bar, sau đó chạy điện di trên gel gene bar, sau đó chạy điện di trên gel agarose agarose • Thử nghiệm enzyme Phosphinothricin • Thử nghiệm enzyme Phosphinothricin Acetyltransferase (PAT): sử dụng đồng Acetyltransferase (PAT): sử dụng đồng vị phóng xạ [1-14C] Acetyl-coenzymA vị phóng xạ [1-14C] Acetyl-coenzymA • Trắc nghiệm nhanh ELISA: phát hiện • Trắc nghiệm nhanh ELISA: phát hiện protein cryIAb/cryIAc protein cryIAb/cryIAc • Thí nghiệm Southern blot: sử dụng enzyme giới hạn Hind III đối với gen cryIA(b)-cryIB, enzyme Sma I đối với gen bar. • Thử tính kháng thuốc diệt cỏ thương mại Basta: theo dõi hiện tượng cháy lá • Thử tính kháng sâu: Cắt đốt thân (8 cm) cho vào đĩa petri, đặt 6 con sâu đục thân lên đoạn thân  tính tỉ lệ số sâu chết + số sâu thất lạc / tổng số sâu cho vào đĩa 13