Định enotyp HBV và phát hiện đột biến YMDD kháng lamivudine bằng kỹ thuật giải trình tự vùng gene rt HBV

Đ nh genotype và phát hi n đ t bi n YMDD kháng lamivudine c a HBV b ng k thu t gi iị ệ ộ ế ủ ằ ỹ ậ ả

trình t vùng gene ựrt c a HBVủ

Ph m Hùng Vân*ạ(1), Nguy n Th Minh Thễ ị ư(2), Võ Đ c Xuyên Anứ(2), Lê Th Phi Y nị ế (2), Đ Th Thanh Th yỗ ị ủ (1)

Tóm t tắ

Đ t v n đ :ặ ấ ề Th t b i trong đi u tr nhi m ấ ạ ề ị ễ HBV b ng lamivudine là do virus có đ t bi n g n và/hay ngay t iằ ộ ế ầ ạ

YMDD chính là v trí tác đ ng thu c trên gene polymerase c a ị ộ ố ủ HBV. Có 4 đ t bi n giúp ộ ế HBV kháng lamuvidine đã

đ c ch ng minh; đó là rtV173L, rtL180M, rtM204I/V, và rtV207I.ượ ứ

M c tiêu nghiên c u:ụ ứ Xây d ng k thu t gi i trình t đ đ nh genotype ự ỹ ậ ả ự ể ị HBV và phát hi n đ t bi n YMDD khángệ ộ ế

lamivudine c a ủHBV

Ph ng pháp nghiên c u:ươ ứ Các tác gi đã thi t k đ c k thu t PCR nhân b n m t đ an DNA c a gen rt vàả ế ế ượ ỹ ậ ả ộ ọ ủ

gi i trình t đ an DNA này nh đó phát hi n đ c các đ t bi n trên. Ngòai ra, các tác gi cũng đã xây d ng đ cả ự ọ ờ ệ ượ ộ ế ả ự ượ

m t th vi n ộ ư ệ HBV-DNA đ xác đ nh đ c genotype c a ể ị ượ ủ HBV khi truy c p đ an trình t đã gi i trên th vi n này. ậ ọ ự ả ư ệ

K t qu nghiên c u:ế ả ứ Áp d ng vào ch n đóan, trong th i gian t 10/7/2006 đ n 7/10/2006, các tác gi đã gi iụ ẩ ờ ừ ế ả ả

đ c trình t 87m u huy t thanh l y t b nh nhân nhi m ượ ự ẫ ế ấ ừ ệ ễ HBV đáp ng kém v i đi u tr lamivudine, k t qu choứ ớ ề ị ế ả

th y 57 tr ng h p thu c genotype B, 30 tr ng h p thu c genotype C. Có 54% đ c ghi nh n có đ t bi n t i vấ ườ ợ ộ ườ ợ ộ ượ ậ ộ ế ạ ị

trí 204 và/ho c 180 là hai đ t bi n quan tr ng nh t đ c ghi nh n là giúp ặ ộ ế ọ ấ ượ ậ HBV kháng lamivudine. Xét v t n sề ầ ố

các ki u gen đ t bi n; ể ộ ế 2.3% (2/87) mang m t ki u gen đ t bi n v i 1.1% (1/87) rtM204I, 1.1% rtM204Ih; ộ ể ộ ế ớ 31%

(27/87) mang hai ki u gene đ t bi n v i 4.6% (4/87) rtL180M-rtM204V, 1.1% rtL180M-M204I, 9.2% (8/87)ể ộ ế ớ

rtL180Mh-rtM204I, 2.3% (2/87) rtL180Mh-rtM204Vh, 1.1% rtL180Mh-rtM204Ih, 3.4% (3/87) rtV173Lh-M204I, và

9.2% rtV173Lh-rtM204Ih; 20.7% (18/87) mang ba ki u gene đ t bi n v i 1.1% rtV173L-rtL180M-rtM204V, 1.1%ể ộ ế ớ

rtV173Lh-rtL180M-rtM204I, 12.6% (11/87) rtV173Lh-rtL180M-rtM204V, 1.1% rtV173Lh-rtL180Mh-rtM204I, 4.6%

(4/87) rtV173Lh-rtL180M-rtM204Ih. Chúng tôi không ghi nh n có đ t bi n rtV207I. Có 40 tr ng h p không ghiậ ộ ế ườ ợ

nh n có đ t bi n nào, v i 23 thu c genotype B và 17 thu c genotype C. ậ ộ ế ớ ộ ộ

K t lu n:ế ậ Các k t qu nghiên c u cho phép các tác gi nh n đ nh là hi n nay tình tr ng ế ả ứ ả ậ ị ệ ạ HBV kháng lamivudine

t i Vi t Nam có l khá cao do virus t nhiên kháng thu c trong quá trình đi u tr và cũng có th do b nh nhânạ ệ ẽ ự ố ề ị ể ệ

không tuân th quá trình đi u tr b ng lamivudine do bác sĩ đ a ra. Nh ng dù th nào đi n a thì v i tình tr ng này,ủ ề ị ằ ư ư ế ữ ớ ạ

các nhà đi u tr ph i nghĩ đ n ph ng án thay th lamivudine b ng thu c kháng virus khác trong đi u tr b nhề ị ả ế ươ ế ằ ố ề ị ệ

nhân HBV.

Abstract

Sequencing the rt gene of HBV for genotyping and detecting YMDD mutations that help HBV resistant to

lamivudine.

Background: Lamivudine failed in the treatment of HBV infection was caused by the mutations that happened in or

near the YMDD of the rt region of polymerase gene. Four mutations related to lamivudine resistance were

demonstrated: rtV173L, rtL180M, rtM204I/V, and rtV207I.

Objectives: Set up the sequencing method for genotyping of HBV and detecting YMDD mutations resistant to

lamuvidine.

Methods: The authors have developed the PCR that can amplify one fragment of DNA of the rt gene and then

sequence this PCR product to detect these mutation thank to the aligment to the referent sequence collected from the

wild type in the gene bank. Besides the mutation detection, the authors have constructed the HBV genotype library that

can help the user to detect the genotype of the HBV by submitted the collected sequence to this library.

Results: Apply on the clinical sera collected from HBV infected patients who were poorly responded to lamivudine

treatment, from 10 of July 2006 to 07 October 2006, the authors sequenced 87 samples and the received results

reported that 57 were belong to genotype B and 30 genotype C. Fouty-seven HBV (54%) with mutations were reported

at the 180 and/or 204 position. Analyze the prevalene of the mutation patterns, the results reported: 2.3% carried one

mutation with 1.1% (1/87) rtM204I, and 1.1% rtM204Ih; 31% carried two mutations with 4.6% (4/87) rtL180M-

rtM204V, 1.1% rtL180M-M204I, 9.2% (8/87) rtL180Mh-rtM204I, 2.3% (2/87) rtL180Mh-rtM204Vh, 1.1%

rtL180Mh-rtM204Ih, 3.4% (3/87) rtV173Lh-M204I, và 9.2% rtV173Lh-rtM204Ih; 20.7% carried three mutations

with 1.1% rtV173L-rtL180M-rtM204V, 1.1% rtV173Lh-rtL180M-rtM204I, 12.6% rtV173Lh-rtL180M-rtM204V,

1.1% rtV173Lh-rtL180Mh-rtM204I, and 4.6% rtV173Lh-rtL180M-rtM204Ih. No rtV207I was reported. Forty cases

were reported without any mutations with 23 were belong to genotype B and 17 were belong to genotype C.

Conclusions: From these results, the authors can alarm the ratio of lamivudine resistance among HBV in Vietnam, and

this high ratio may be came from the selectivity effect of the lamivudine treatment that occurs naturally or because of

the not-compliance of the treatment from the patients. However, with this situation, the physicians should think to

another antiviral drug to replace lamivudine for the treatment of patients with HBV infection.

Đ t v n đặ ấ ề

1*Tác gi chính, ả()Đ i H c Y D c, ạ ọ ượ (2)Công ty Nam Khoa

Trên b n đ d ch t c a t ch c y t th gi i,ả ồ ị ễ ủ ổ ứ ế ế ớ

t l dân s Vi t Nam manh kháng nguyênỷ ệ ố ệ

HBsAg (ch ng tó nhi m ứ ễ HBV) là trên 8%, x pế

vào hàng các qu c gia có t l nhi m ố ỷ ệ ễ HBV cao

nh t th gi iấ ế ớ [1]. Nh n đ nh này cũng đ c m tậ ị ượ ộ

s công trình nghiên c u v d ch t h c trong vàố ứ ề ị ễ ọ

ngòai n c xác nh nướ ậ [2,3,4]. Tuy r ng không ph iằ ả

t t c các tr ng h p nhi m ấ ả ườ ợ ễ HBV đ u c n ph iề ầ ả

đ c đ t ra v n đ ph i đi u tr vì đa s b nhượ ặ ấ ề ả ề ị ố ệ

nhân đ u có th t kh i nh c th có th t o raề ể ự ỏ ờ ơ ể ể ạ

đáp ng mi n d ch b ng kháng th b o v làứ ễ ị ằ ể ả ệ

kháng th kháng kháng nguyên b m t c a virus.ể ề ặ ủ

Tuy nhiên v n có m t t l ng i nhi m ẫ ộ ỷ ệ ườ ễ HBV

c n ph i đ c đi u tr đ c hi u b ng thu cầ ả ượ ề ị ặ ệ ằ ố

kháng virus m t khi có d u hi u viêm gan m nộ ấ ệ ạ

tính và l ng virus tăng cao. T nh ng năm đ uượ ừ ữ ầ

c a th p niên 2000, các nhà lâm sàng c a chúngủ ậ ủ

ta đã b t đ u ch đ nh lamivudine đi u tr trên cácắ ầ ỉ ị ề ị

b nh nhân b viêm gan B m n tính, và cũng nhệ ị ạ ư

trên th gi i li u pháp đi u tr kéo dài cũng đãế ớ ệ ề ị

d n đ n tình tr ng kháng lamivudine. Công trìnhẫ ế ạ

nghiên c u này c a chúng tôi nh m m c đíchứ ủ ằ ụ

dùng k thu t gi i trình t vùng rt c a ỹ ậ ả ự ủ HBV để

đ nh genotype c a ị ủ HBV đ ng th i tìm hi u cácồ ờ ể

đ t bi n đã đ c th gi i ghi nh n trên geneộ ế ượ ế ớ ậ

polymerase c a virus có hi n di n trên ủ ệ ệ HBV mà

chúng tôi phát hi n trên b nh nhân nhi m ệ ệ ễ HBV

và đáp ng lâm sàng kém v i đi u tr lamivudineứ ớ ề ị

hay không?

V t li u và ph ng pháp nghiên c uậ ệ ươ ứ

M u huy t thanh th nghi m:ẫ ế ử ệ Đây là nghiên

c u đ c thi t k theo mô hình ti n c u c tứ ượ ế ế ề ứ ắ

ngang v i các m u huy t thanh đ c các bác sĩớ ẫ ế ượ

l y t các b nh nhân d ng tính ấ ừ ệ ươ HBV-DNA và

trên lâm sàng không đáp ng hay đáp ng kémứ ứ

v i đi u tr lamivudine. Các m u này đ c g iớ ề ị ẫ ượ ử

t nhi u phòng thí nghi m lâm sàng t i thànhừ ề ệ ạ

ph H Chí Minh đ n phòng thí nghi m R&Dố ồ ế ệ

c a công ty Nam Khoa.ủ

Trích bi t HBV-DNA t các m u huy tệ ừ ẫ ế

thanh: Các m u huy t thanh th nghi m ngayẫ ế ử ệ

sau khi g i đ n phòng thí nghi m đ c đ a vàoử ế ệ ượ ư

trích bi t DNA theo ph ng pháp Boom b ng bệ ươ ằ ộ

thu c th DNAPREP-BOOM do công ty Namố ử

Khoa s n xu t (s đăng kí ch t l ng:ả ấ ố ấ ượ

03200/2001/CBTC-TĐC). Ph ng pháp trích bi tươ ệ

đ c th c hi n theo h ng d n c a nhà s nượ ự ệ ướ ẫ ủ ả

xu t. ấ

Phát hi n và đ nh l ng HBV-DNA: ệ ị ượ 10ul

trích bi t DNA đ c cho vào 40ul ệ ượ HBV SYBR

PCR mix (PCR mix đ đ nh l ng ể ị ượ HBV-DNA

b ng k thu t real-time PCR v i SYBR Green Iằ ỹ ậ ớ

do công ty Nam Khoa s n xu t) và ch y ch ngả ấ ạ ươ

trình real-time PCR dùng SYBR nh là h ngư ướ

d n c a nhà s n xu t đ phát hi n và đ nhẫ ủ ả ấ ể ệ ị

l ng ượ HBV-DNA có trong huy t thanh b nhế ệ

nhân.

Gi i trình t đ nh genotype HBV và phátả ự ị

hi n các đ t bi n liên quan đ n khángệ ộ ế ế

lamivudine: Đ ng th i 10ul trích bi t DNA cũngồ ờ ệ

đ c cho vào 40ul PCR mix đ khu ch đ i m tượ ể ế ạ ộ

đ an DNA dài 564bp trong ph n ọ ầ rt c a geneủ

polymerase c a ủHBV. PCR mix này đ c pha tượ ừ

PCR master mix do công ty Nam Khoa s n xu tả ấ

(t các hóa ch t c a Biorad, Roche, và Promega)ừ ấ ủ

có thêm c p m i xuôi 264F ặ ồ và c a m i ng củ ồ ượ

827R (trình t các m i đ c gi trong tài li uự ồ ượ ữ ệ

nghiên c u c p I t i phòng RD c a công ty Namứ ấ ạ ủ

Khoa) đ c thi t k b ng ph n m m Primerượ ế ế ằ ầ ề

premier đ c hi u đ an DNA nêu trên. M i đ cặ ệ ọ ồ ượ

cho vào PCR mix v i hàm l ng 15pm cho m tớ ượ ộ

PCR mix. Th c hi n PCR theo chu kỳ nhi t nhự ệ ệ ư

sau: 1 chu kỳ 95oC trong 5 phút; sau đó là 40 chu

kỳ 94oC trong 30 giây, 55oC trong 30 giây và

72oC trong 1 phút; và cu i cùng là 1 chu kỳ 72oCố

trong 7 phút. Sau khi hòan t t PCR, phát hi n s nấ ệ ả

ph m khu ch đ i b ng đi n di trong th chẩ ế ạ ằ ệ ạ

1.5%. Sau khi đi n di và xác đ nh có s n ph mệ ị ả ẩ

khu ch đ i đ c hi u dài 567bp, s n ph m PCRế ạ ặ ệ ả ẩ

đ c tinh s ch b ng v i b th nghi m tinhượ ạ ằ ớ ộ ử ệ

s ch s n ph m PCR (PCR clean-up kit) doạ ả ẩ

Promega s n xu t (Cat. #A9281). S n ph mả ấ ả ẩ

PCR sau khi tinh s ch đ c đ nh l ng n ng đạ ượ ị ượ ồ ộ

DNA b ng máy Genquant c a Pharmacia. Sauằ ủ

đó, th c hi n ph n ng gi i trình t s n ph mự ệ ả ứ ả ự ả ẩ

PCR đã tinh s ch và xác đ nh n ng đ trên v iạ ị ồ ộ ở ớ

PCR sequencing mix c a Becman (DTCS: Dyeủ

Terminator Cycle Sequencing) v i primer 827R.ớ

S n ph m gi i trình t đ c làm t a và tinhả ẩ ả ự ượ ủ

s ch b ng ph ng pháp t a v i ethanol. Cu iạ ằ ươ ủ ớ ố

cùng th c hi n gi i trình t trên máy sequencerự ệ ả ự

CEQ8000 c a Becman Coulter. K t qu gi iủ ế ả ả

trình t đ c phân tích trên ch c năng analysisự ượ ứ

c a CEQ8000 có ch n thêm thông sủ ọ ố

heterozygote. Sau đó dùng ch c năng investigatorứ

c a CEQ8000 đ th c hi n đ i chi u so sánhủ ể ự ệ ố ế

trình t gi i đ c v i trình t tham chi u đ cự ả ượ ớ ự ế ượ

thành l p t trình t c a gene polymerase ậ ừ ự ủ HBV

c a các dòng không đ t bi n đ phát hi n các vủ ộ ế ể ệ ị

trí đ t bi n, đ c bi t quan tâm các v trí đã đ cộ ế ặ ệ ị ượ

th a nh n là có đ t bi n liên quan đ n khángừ ậ ộ ế ế

lamivudine: rtV173L, rtL180M, rtM204I/V, và

rtV207I. K t qu phân tích đ t bi n đ c ghiế ả ộ ế ượ

nhân là đ t bi n hòan tòan khi acid amin t i m tộ ế ạ ộ

trong các v trí trên b thay th b ng acid aminị ị ế ằ

đ t bi n, đ c ghi nh n là đ t bi n m t ph nộ ế ượ ậ ộ ế ộ ầ

(heterozygote) khi t i m t trong các v trí trên t nạ ộ ị ồ

t i c hai acid amin v a c a dòng hoang d i v aạ ả ừ ủ ạ ừ

c a dòng đ t bi n. Đ đ nh genotype c a ủ ộ ế ể ị ủ HBV,

đăng nh p trình t đã gi i đ c lên local blastậ ự ả ượ

c a ph n m m mi n phí Bio-edit trong đó chúngủ ầ ề ễ

tôi có cài m t th vi n genotype c a ộ ư ệ ủ HBV, sau đó

truy c p d so sánh trình t đã gi i đ c v iậ ể ự ả ượ ớ

trình t trong th vi n, nh v y xác đ nh đ cự ư ệ ờ ậ ị ượ

genotype HBV c a m u th .ủ ẫ ử

Phát hi n đ t bi n rtL180M, rtM204I/Vệộế

b ng ph ng phápằ ươ PCR-RFLP: M t s m u cóộ ố ẫ

k t qu ghi nh n là có đ t bi n m t ph n vế ả ậ ộ ế ộ ầ ở ị

trí 180 và/hay 204 đ c th c hi n thêm k thu tượ ự ệ ỹ ậ

PCR-RFLP đ xác đ nh l i xem k t qu có trùngể ị ạ ế ả

h p đ c v i k t qu ghi nh n t ph ng phápợ ượ ớ ế ả ậ ừ ươ

gi i trình t hay không. Trong ph ng phápả ự ươ

PCR-RFLP này, đ phát hi n đ t bi n 180, choể ệ ộ ế

10ul trích bi t DNA c a huy t thanh vào 40ulệ ủ ế

PCR mix A ch a m i xuôi 180F và m i ng cứ ồ ồ ượ

180/204R; đ phát hi n đ t bi n 204, cho 10ulể ệ ộ ế

trích bi t DNA c a huy t thanh vào PCR mix Bệ ủ ế

ch a m i xuôi 204F và m i ng c 180/204Rứ ồ ồ ượ

(trình t các m i đ c gi trong tài li u nghiênự ồ ượ ữ ệ

c u c p I t i phòng RD c a công ty Nam Khoaứ ấ ạ ủ ).

Ti n hành PCR theo chu kỳ nhi t nh sau: 1 chuế ệ ư

kỳ 95oC trong 5 phút; sau đó là 40 chu kỳ 94oC

trong 30 giây, 55oC trong 30 giây và 72oC trong

30 giây. S n ph m PCR mix A đ c c t b ngả ẩ ượ ắ ằ

men c t ắNlaIII (Bio New England), s n ph mả ẩ

PCR mix B đ c c t b ng c hai men c t ượ ắ ằ ả ắ NdeI

(Bio New England) và NlaIII sau đó đ c đi n diượ ệ

trên agarose 2.5%. Nh m i 180F đ c thi t kờ ồ ượ ế ế

có đ u 3’ n m đúng v trí 180 mà khi có đ tầ ằ ị ộ

bi n ếrtL180M xãy ra thì s hình thành m t trìnhẽ ộ

t nh n bi t b i ự ậ ế ở NlaIII do v y mà s n ph mậ ả ẩ

PCR mix A s b c t ng n di m t đ an 24bp soẽ ị ắ ắ ộ ọ

v i tr ng h p không đ t bi n. Trong phát hi nớ ườ ợ ộ ế ệ

đ t bi n ộ ế rtM204V và rtM204I, nh m i xuôiờ ồ

204F đ c thi t k có đ u 3’ n m đúng v tríượ ế ế ầ ằ ị

204 mà khi không có đ t bi n xãy ra thì s t o raộ ế ẽ ạ

m t trình t b nh n bi t b i ộ ự ị ậ ế ở NdeI mà không bị

nh n bi t b i ậ ế ở NlaIII do v y s n ph m PCR mixậ ả ẩ

B s b ẽ ị NdeI c t ng n đi 24bp trong khi đó khôngắ ắ

b ịNlaIII c t; khi có đ t bi n ắ ộ ế rtM204V thì s t oẽ ạ

ra trình t b nh n bi t b i ự ị ậ ế ở NlaIII mà không bị

nh n bi t b i ậ ế ở NdeI do v y s n ph m PCR mix Bậ ả ẩ

s b ẽ ị NlaIII c t ng n đi 24bp mà không b ắ ắ ị NdeI

c t; và khi có đ t bi n ắ ộ ế rtM204I thì s t o ra trìnhẽ ạ

t không b c hai enzyme trên n n bi t nên s nự ị ả ậ ế ả

ph m PCR mix B s không b c t ng n đi b iẩ ẽ ị ắ ắ ở

hai enzyme này. Trong t t c các phân tích trên,ấ ả

ghi nh n đ t bi n hòan tòan khi ch có ki u hìnhậ ộ ế ỉ ể

đ t bi n, và đ t bi n không hòan tòan khi xu tộ ế ộ ế ấ

hi n c hai ki u hình đ t bi n và không đ t bi nệ ả ể ộ ế ộ ế

hi n th trên gel. ể ị

K t quế ả

Trong th i gian t 10/7/2006 đ n 7/10/2006, đãờ ừ ế

có 87 m u huy t thanh đ c chúng tôi th c hi nẫ ế ượ ự ệ

th nghi m đ nh l ng ử ệ ị ượ HBV-DNA, đ nhị

genotype và phát hi n các đ t bi n rtV173L,ệ ộ ế

rtL180M, rtM204I/V, và rtV207I. B ng 1ả trình

bày l ng ượ HBV-DNA và genotype c a ủHBV trong

các m u huy t thanh th nghi m.ẫ ế ử ệ

Các đ t bi n t i các v trí 173, 180, 204 và 207ộ ế ạ ị

đ c phân tích b ng ch c năng investigator c aượ ằ ứ ủ

ph n m m kèm theo máy CEQ8000. Trong ch cầ ề ứ

năng này, chúng tôi so sánh trình t gi i đ cự ả ượ

v i trình t tham chi u do chúng tôi thành l pớ ự ế ậ

b ng cách thu th p các trình t ph n ằ ậ ự ầ rt c a geneủ

polymerase c a các ch ng ủ ủ HBV không đ t bi nộ ế

(wild type). Các ví d minh h a trong ụ ọ hình 1 cho

th y cách đ chúng tôi k t lu n nh th nào làấ ể ế ậ ư ế

có đ t bi n hòan tòan và nh th nào là có đ tộ ế ư ế ộ

bi n không hòan tòan t i các v trí acid amin trên:ế ạ ị

(A) là đ t bi n ộ ế rtM204V hòan tòan v i ATG bớ ị

thay th b ng GTG, trong khi đó (B) là đ t bi nế ằ ộ ế

rtM204Vh (không hòan tòan) vì ch ng lên tínồ

hi u c a base A c a mã ATG là tín hi u G doệ ủ ủ ệ

v y máy v n ghi nh n là ATG nh ng th t ra cóậ ẫ ậ ư ậ

thêm mã đ t bi n GTG; (C) là đ t bi n ộ ế ộ ế rtL180M

hòan tòan v i TTG b thay th b ng ATG, trongớ ị ế ằ

khi đó (D) là đ t bi n ộ ế rtL180M không hòan tòan

vì bên d i tín hi u T c a TTG, có tín hi u A doướ ệ ủ ệ

v y mà máy ghi nh n là TTG nh ng th t ra cóậ ậ ư ậ

thêm mã đ t bi n là ATG; (E) là đ t bi nộ ế ộ ế

rtV173L v i GTG b thay th h u nh hòan tòanớ ị ế ầ ư

b i CTG, trong khi đó (F) là đ t bi n ở ộ ế rtV173L

không hòan tòan do d i tín hi n G c a GTG làướ ệ ủ

có tín hi u C do v y máy ghi nh n là GTGệ ậ ậ

nh ng th t ra có thêm mã đ t bi n CTG n a. ư ậ ộ ế ữ

Đ có th ch c ch n các phân tích d a vào cácể ể ắ ắ ự

tín hi u gi i trình t nh đó phát hi n có các đ tệ ả ự ờ ệ ộ

bi n không hòan tòan t i hai v trí 180 và 204 làế ạ ị

chính xác, chúng tôi đã th c hi n k thu t PCR-ự ệ ỹ ậ

RFLP trên 20 m u mà khi phân tích k t qu gi iẫ ế ả ả

trình t có ghi nh n đ c đ t bi n không hòanự ậ ượ ộ ế

tòan v trí 180 và/hay 204. PCR-RFLP trên cácở ị

m u này cho k t qu phát hi n đ t bi n khôngẫ ế ả ệ ộ ế

hòan tòan t i các v trí này hòan tòan trùng kh pạ ị ớ

v i k t qu gi i trình t . ớ ế ả ả ự Hình 2 và hình 3 trình

bày k t qu trên m t s m u mà chúng tôi đãế ả ộ ố ẫ

th c hi n PCR-RFLP. ự ệ

B ng 1ả: K t qu đ nh genotype và đ nh l ng HBV trong huy tế ả ị ị ượ ế

thanh b nh nhânệ

Quantitation of HBV-

DNA (copies/ml)

Genotype

<103* 2 1

103 - <1047 5

104 - <10513 5

105 - <1069 5

106 - <1076 6

107 - <10815 7

108 - <109** 5 1

57 30

*S l ng th p nh t là 429 copies/ml. ố ượ ấ ấ **S l ng cao nh t làố ượ ấ

822,401,747 copies/ml

Trong 87 m u gi i trình t phân tích đ t bi n,ẫ ả ự ộ ế

54% (47/87) đ c ghi nh n có đ t bi n 204ượ ậ ộ ế

và/ho c 180 là hai đ t bi n quan tr ng nh tặ ộ ế ọ ấ

đ c ghi nh n là giúp ượ ậ HBV kháng lamivudine.

Xét v t n s các ki u gen đ t bi n; ề ầ ố ể ộ ế 2.3%

(2/87) mang m t ki u gen đ t bi n v i 1.1%ộ ể ộ ế ớ

(1/87) rtM204I, 1.1% rtM204Ih; 31% (27/87)

mang hai ki u gene đ t bi n v i 4.6% (4/87)ể ộ ế ớ

rtL180M-rtM204V, 1.1% rtL180M-M204I, 9.2%

(8/87) rtL180Mh-rtM204I, 2.3% (2/87)

rtL180Mh-rtM204Vh, 1.1% rtL180Mh-rtM204Ih,

3.4% (3/87) rtV173Lh-M204I, và 9.2%

rtV173Lh-rtM204Ih; 20.7% (18/87) mang ba

ki u gene đ t bi n v i 1.1% ể ộ ế ớ rtV173L-rtL180M-

rtM204V, 1.1% rtV173Lh-rtL180M-rtM204I,

12.6% (11/87) rtV173Lh-rtL180M-rtM204V,

1.1% rtV173Lh-rtL180Mh-rtM204I, 4.6% (4/87)

rtV173Lh-rtL180M-rtM204Ih. Chúng tôi không

ghi nh n có đ t bi n ậ ộ ế rtV207I. Có 40 tr ng h pườ ợ

không ghi nh n có đ t bi n nào, trong đó có 23ậ ộ ế

tr ng h p đ c xác đ nh là genotype B và 17ườ ợ ượ ị

đ c xác đ nh là genotype C v i s l ng đ cượ ị ớ ố ượ ượ

đ nh l ng th p nh t là 748 copies/ml và caoị ượ ấ ấ

nh t là 215.451.964 copies/ml. ấB ng 2ả trình bày

chi ti t các ki u gene đ t bi n đ c phát hi nế ể ộ ế ượ ệ

trong 47 m u trong m i liên quan v i genotypeẫ ố ớ

và s l ng ố ượ HBV có trong m u th .ẫ ử

(A) (B)

(E) (F)

Hình 1: Hình nh tín hi u các base đ c máy hi n th khi phân tích k t qu gi i trình t và d a vào có hay không có tín hi u base chèn vào màả ệ ượ ể ị ế ả ả ự ự ệ

có th ghi nh n đ t bi n hòan tòan hay đ t bi n không hòan tòan. (A) đ t bi n ể ậ ộ ế ộ ế ộ ế rtM204V hòan tòan, (B) đ t bi n ộ ế rtM204V không hòan

tòan, (C) đ t bi n ộ ế rtL180M hòan tòan, (D) đ t bi n ộ ế rtL180M không hòan tòan, (E) đ t bi n ộ ế rtV173L g n nh hòan tòan, (F) đ t bi nầ ư ộ ế

rtV173L không hòan tòan

S n ph m PCR mix Bả ẩ S n ph m PCR mix Bả ẩ

Hình 2: Phân tích đ t bi n v trí 204; S n ph m PCR c a các m u 5718, 5648 không b ộ ế ở ị ả ẩ ủ ẫ ị NlaIII c t, và v a b c t v a không b c t b i ắ ừ ị ắ ừ ị ắ ở NdeI, do

v y đây là đ t bi n ậ ộ ế rtM204Ih (không hòan tòan). Các m u 5646, 5650 không có đ t bi n vì s n ph m PCR không b ẫ ộ ế ả ẩ ị NlaIII c t nh ng bắ ư ị

NdeI c t. Các m u 5647 và 5570 không b c hai enzyme này c t nên đây là đ t bi n ắ ẫ ị ả ắ ộ ế rtM204I hòan tòan. M u 5649 có đ t bi nẫ ộ ế

rtM204V hòan tòan vì s n ph m PCR b NlaIII c t mà không b NdeI c t. M u 5525 có s n ph m PCR v a b c t v a không b c t b iả ẩ ị ắ ị ắ ẫ ả ẩ ừ ị ắ ừ ị ắ ở

hai enzyme này nên kh năng cao nh t là có đ t bi n ả ấ ộ ế rtM204Vh (không hòan tòan)

Bi n lu nệ ậ

M c dù đã có vaccin ng a an tòan và hi u quặ ừ ệ ả

nhi m ễHBV, nh ng viêm gan m n tính do ư ạ HBV

v n còn là m t trong 10 nguyên nhân gây t vongẫ ộ ử

hàng đ u trên th gi iầ ế ớ [5]. T năm 1998,ừ

lamivudine đã đ c công nh n là thu c u ng đượ ậ ố ố ể

đi u tr ề ị HBV[6]. Nhi u d li u lâm sàng đã choề ữ ệ

th y lamivudine đã làm gi m ng an m c l ngấ ả ọ ụ ượ

virus và c i thi n đáng k s t n h i mô gan doả ệ ể ự ổ ạ

virus[7,8]. Tuy nhiên, cho đ n ngày nay v n ch aế ẫ ư

có m t nhà lâm sàng nào có th kh ng đ nh choộ ể ẳ ị

đ n khi nào thì có th ng ng đi u tr lamivudineế ể ư ề ị

mà không b tái phát dù tr c đây ng i ta choị ướ ườ

r ng ch c n nghĩ đ n ph ng án đi u trằ ỉ ầ ế ươ ề ị

lamivudine lâu dài khi sau 52 tu n đi u trầ ề ị

lamivudine mà b nh nhân v n không có chuy nệ ẫ ể

Hình 3: Phân tích đ t bi n v trí 180; S n ộ ế ở ị ả

ph m PCR c a các m u 5718, 5646, 5647, 5648 và ẩ ủ ẫ

5650 không b ịNlaIII c t, do v y không có đ t ắ ậ ộ

bi n v trí 180; s n ph m PCR c a m u 5649 b ế ở ị ả ẩ ủ ẫ ị

NlaIII c t, do v y có đ t bi n ắ ậ ộ ế rtL180M; hai m u ẫ

5525 và 5570 (không có trên hình này vì gel không

còn gi ng) có các s n ph m PCR v a b ế ả ẩ ừ ị NlaIII c t ắ

v a không b c t, do v y có th k t lu n có đ t ừ ị ắ ậ ể ế ậ ộ

bi n ếrtL180Mh (không hòan tòan).

B ng 2ả: K t qu các ki u gene đ t bi n trong m i liên quan v i genotype và s l ng HBV trong các m u huy t thanh b nh nhânế ả ể ộ ế ố ớ ố ượ ẫ ế ệ

2A: Mang m t ki u gene đ t bi nộ ể ộ ế

đ t bi nộ ế M204Ih M204I

Genotype B C B C T ngổ

<103

103 - <10411

104 - <105

105 - <106

106 - <107

107 - <10811

108 - <109

0 1 1 0 2

2B: Mang hai ki u gene đ t bi nể ộ ế

đ t bi nộ ế V173Lh

M204Ih

V173Lh

M204I

L180Mh

M204Ih

L180Mh

M204Vh

L180Mh

M204I

L180M

M204I

L180M

M204V

Genotype B C B C B C B C B C B C B C T ngổ

<1031 1 2

103 - <1041 1 1 3

104 - <1051 1 1 1 4

105 - <1062 1 3

106 - <107 1 1 1 1 1 1 6

107 - <1082 1 1 1 1 1 7

108 - <109 2 2

7 1 1 2 1 0 2 0 6 2 0 1 3 1 27

2C: Mang ba ki u gene đ t bi nể ộ ế

đ t bi nộ ế

V173Lh

L180Mh

M204Ih

V173Lh

L180Mh

M204I

V173Lh

L180M

M204V

V173Lh

L180M

M204I

V173L

L180M

M204V

Genotype B C B C B C B C B C T ngổ

<103

103 - <1041 1 2

104 - <10533

105 - <10611

106 - <1071 1 2

107 - <1081 6 2 9

108 - <10911

3110831001 18

Định enotyp và phát hiện đột biến YMDD kháng lamivudine của HBV bằng kỹ thuật giải trình tự vùng gene rt của HBV

Chủ đề:

Tài liệu liên quan

Tài liêu mới

AI tóm tắt

Giới thiệu tài liệu

Đối tượng sử dụng

Từ khoá chính

Nội dung tóm tắt

Hỗ trợ

Phương thức thanh toán

Theo dõi chúng tôi