ủ ộ ệ ế ằ ậ ỹ ả i Đ nh genotype và phát hi n đ t bi n YMDD kháng lamivudine c a HBV b ng k thu t gi ị trình t ự vùng gene ủ (1), Nguy n Th Minh Th Ph m Hùng Vân* rt c a HBV ễ
ạ
ị
ư(2), Võ Đ c Xuyên An ứ
(2), Lê Th Phi Y n ị
ế (2), Đ Th Thanh Th y ị
ủ (1)
ỗ
ị
ộ
ầ
ằ
ế
ề
ề Th t b i trong đi u tr nhi m
ạ i HBV kháng lamuvidine đã
ộ
ế
ấ ạ ị
ủ HBV. Có 4 đ t bi n giúp
ễ HBV b ng lamivudine là do virus có đ t bi n g n và/hay ngay t ộ
ứ
i trình t
đ đ nh genotype
ả
ậ
ế
ệ
ự
ự ể ị
ứ Xây d ng k thu t gi
HBV và phát hi n đ t bi n YMDD kháng ộ
ố c ch ng minh; đó là rtV173L, rtL180M, rtM204I/V, và rtV207I. ỹ
ng pháp nghiên c u:
ả
ậ
ả
ủ
đã thi đ an DNA này nh đó phát hi n đ
cũng đã xây d ng đ
ự ọ
ỹ ế
ứ Các tác gi ờ
ệ ượ c genotype c a
ộ ọ ả đã gi
ị
ể
ư ệ HBV-DNA đ xác đ nh đ
ậ
ả
ọ
ụ
ừ
ứ Áp d ng vào ch n đóan, trong th i gian t ẫ
c các đ t bi n trên. Ngòai ra, các tác gi ủ HBV khi truy c p đ an trình t ự 10/7/2006 đ n 7/10/2006, các tác gi ế ứ
ế ớ
ị
ộ
ợ
ộ
ế
ợ ấ ượ ể
ể
ộ
ộ
ộ
ớ
ượ ẩ ờ b nh nhân nhi m ng h p thu c genotype C. Có 54% đ ộ c ghi nh n là giúp ậ ế 2.3% (2/87) mang m t ki u gen đ t bi n v i 1.1% (1/87) rtM204I, 1.1% rtM204Ih; ế ể
ế
ộ
ớ
ể
ế
ộ
ớ
ườ
ế
ậ
ộ
ợ
ế
ớ ả
ộ ứ
ộ ả
ậ
ị
khá cao do virus t
ự
ề
ị
ậ Các k t qu nghiên c u cho phép các tác gi ế t Nam có l ẽ ệ ủ
ể ớ
ệ ạ
ư
ư
ữ
ề
ế
ươ
ế
ế
ề
ả
ằ
ố
ị
tắ Tóm t Đ t v n đ : ặ ấ YMDD chính là v trí tác đ ng thu c trên gene polymerase c a đ ượ M c tiêu nghiên c u: ụ lamivudine c a ủ HBV c k thu t PCR nhân b n m t đ an DNA c a gen rt và t k đ Ph ế ế ượ ươ ượ c gi i trình t ự ộ ả i trên th vi n này. m t th vi n ư ệ ộ ả đã gi i K t qu nghiên c u: ả ế ả ễ HBV đáp ng kém v i đi u tr lamivudine, k t qu cho c trình t 87m u huy t thanh l y t đ ả ề ượ ấ ừ ệ ế ự ế ạ ị i v c ghi nh n có đ t bi n t ng h p thu c genotype B, 30 tr th y 57 tr ậ ượ ườ ườ ấ ề ầ ố HBV kháng lamivudine. Xét v t n s trí 204 và/ho c 180 là hai đ t bi n quan tr ng nh t đ ọ ộ ặ 31% các ki u gen đ t bi n; (27/87) mang hai ki u gene đ t bi n v i 4.6% (4/87) rtL180M-rtM204V, 1.1% rtL180M-M204I, 9.2% (8/87) rtL180Mh-rtM204I, 2.3% (2/87) rtL180Mh-rtM204Vh, 1.1% rtL180Mh-rtM204Ih, 3.4% (3/87) rtV173Lh-M204I, và 9.2% rtV173Lh-rtM204Ih; 20.7% (18/87) mang ba ki u gene đ t bi n v i 1.1% rtV173L-rtL180M-rtM204V, 1.1% rtV173Lh-rtL180M-rtM204I, 12.6% (11/87) rtV173Lh-rtL180M-rtM204V, 1.1% rtV173Lh-rtL180Mh-rtM204I, 4.6% (4/87) rtV173Lh-rtL180M-rtM204Ih. Chúng tôi không ghi nh n có đ t bi n rtV207I. Có 40 tr ng h p không ghi nh n có đ t bi n nào, v i 23 thu c genotype B và 17 thu c genotype C. ậ ộ ạ HBV kháng lamivudine K t lu n: nh n đ nh là hi n nay tình tr ng ế ệ nhiên kháng thu c trong quá trình đi u tr và cũng có th do b nh nhân i Vi t ố ạ không tuân th quá trình đi u tr b ng lamivudine do bác sĩ đ a ra. Nh ng dù th nào đi n a thì v i tình tr ng này, ị ằ các nhà đi u tr ph i nghĩ đ n ph ị ệ ng án thay th lamivudine b ng thu c kháng virus khác trong đi u tr b nh ề nhân HBV.
Abstract Sequencing the rt gene of HBV for genotyping and detecting YMDD mutations that help HBV resistant to lamivudine. Background: Lamivudine failed in the treatment of HBV infection was caused by the mutations that happened in or near the YMDD of the rt region of polymerase gene. Four mutations related to lamivudine resistance were demonstrated: rtV173L, rtL180M, rtM204I/V, and rtV207I. Objectives: Set up the sequencing method for genotyping of HBV and detecting YMDD mutations resistant to lamuvidine. Methods: The authors have developed the PCR that can amplify one fragment of DNA of the rt gene and then sequence this PCR product to detect these mutation thank to the aligment to the referent sequence collected from the wild type in the gene bank. Besides the mutation detection, the authors have constructed the HBV genotype library that can help the user to detect the genotype of the HBV by submitted the collected sequence to this library. Results: Apply on the clinical sera collected from HBV infected patients who were poorly responded to lamivudine treatment, from 10 of July 2006 to 07 October 2006, the authors sequenced 87 samples and the received results reported that 57 were belong to genotype B and 30 genotype C. Fouty-seven HBV (54%) with mutations were reported at the 180 and/or 204 position. Analyze the prevalene of the mutation patterns, the results reported: 2.3% carried one mutation with 1.1% (1/87) rtM204I, and 1.1% rtM204Ih; 31% carried two mutations with 4.6% (4/87) rtL180M- rtM204V, 1.1% rtL180M-M204I, 9.2% (8/87) rtL180Mh-rtM204I, 2.3% (2/87) rtL180Mh-rtM204Vh, 1.1% rtL180Mh-rtM204Ih, 3.4% (3/87) rtV173Lh-M204I, và 9.2% rtV173Lh-rtM204Ih; 20.7% carried three mutations with 1.1% rtV173L-rtL180M-rtM204V, 1.1% rtV173Lh-rtL180M-rtM204I, 12.6% rtV173Lh-rtL180M-rtM204V, 1.1% rtV173Lh-rtL180Mh-rtM204I, and 4.6% rtV173Lh-rtL180M-rtM204Ih. No rtV207I was reported. Forty cases were reported without any mutations with 23 were belong to genotype B and 17 were belong to genotype C. Conclusions: From these results, the authors can alarm the ratio of lamivudine resistance among HBV in Vietnam, and this high ratio may be came from the selectivity effect of the lamivudine treatment that occurs naturally or because of the not-compliance of the treatment from the patients. However, with this situation, the physicians should think to another antiviral drug to replace lamivudine for the treatment of patients with HBV infection. Đ t v n đ ặ ấ
1*Tác gi
ề
chính,
()Đ i H c Y D c,
ả
ượ (2)Công ty Nam Khoa
ạ
ọ
1
c a t ng ệ HBV-DNA có trong huy t thanh b nh ế
ố l ỷ ệ l ượ nhân. Gi ả ệ ự ị ế ị ấ ậ ờ i trình t ộ ồ ề ị ể ướ ượ ả ờ ơ ể ừ ễ ứ ồ ặ ể và c a m i ng c gi ấ ủ ồ các m i đ
ả ể ả ề ặ ủ ườ ệ i nhi m ằ ề ề
ượ ữ ượ t nh ệ ệ ủ ị ề ỉ ị ạ ề ấ ụ ằ ằ ẩ ế ậ ị ạ ệ vùng rt c a ờ c th gi ượ ậ ệ ằ ả ẩ ệ ạ ặ ạ ả ộ ử ệ ẩ ả ệ ả ứ ề ị ấ ạ ng n ng đ ồ ượ ế ế ớ i, th gi ch c y t Trên b n đ d ch t ễ ủ ổ ứ ồ ị ả t Nam manh kháng nguyên dân s t Vi l ệ ố ỷ ệ ễ HBV) là trên 8%, x pế HBsAg (ch ng tó nhi m ứ ễ HBV cao nhi m vào hàng các qu c gia có t ế ớ [1]. Nh n đ nh này cũng đ ộ c m t i nh t th gi ượ h c trong và s công trình nghiên c u v d ch t ễ ọ ứ ố ậ [2,3,4]. Tuy r ng không ph i c xác nh n ngòai n ả ằ ễ HBV đ u c n ph i ng h p nhi m t c các tr t ả ợ ầ ề ấ ả ườ ố ệ c đ t ra v n đ ph i đi u tr vì đa s b nh đ ị ề ề ặ ượ ấ kh i nh c th có th t o ra nhân đ u có th t ể ự ỏ ể ạ ề ệ đáp ng mi n d ch b ng kháng th b o v là ằ ị kháng th kháng kháng nguyên b m t c a virus. ễ HBV Tuy nhiên v n có m t t l ng ộ ỷ ệ ẫ c đi u tr đ c hi u b ng thu c c n ph i đ ố ị ặ ượ ầ kháng virus m t khi có d u hi u viêm gan m n ạ ệ ấ ộ ầ tính và l ng virus tăng cao. T nh ng năm đ u ừ c a th p niên 2000, các nhà lâm sàng c a chúng ậ ủ ta đã b t đ u ch đ nh lamivudine đi u tr trên các ắ ầ ư b nh nhân b viêm gan B m n tính, và cũng nh ị ệ trên th gi i li u pháp đi u tr kéo dài cũng đã ế ớ ệ ị d n đ n tình tr ng kháng lamivudine. Công trình ạ ế ẫ nghiên c u này c a chúng tôi nh m m c đích ủ ứ ủ HBV để dùng k thu t gi i trình t ự ả ỹ ủ HBV đ ng th i tìm hi u các đ nh genotype c a ể ồ ị đ t bi n đã đ i ghi nh n trên gene ế ớ ế ộ HBV mà polymerase c a virus có hi n di n trên ệ ủ ễ HBV chúng tôi phát hi n trên b nh nhân nhi m ệ và đáp ng lâm sàng kém v i đi u tr lamivudine ớ hay không? ằ ự ệ ả V t li u và ph ng pháp nghiên c u ứ c đ nh l ị ủ i trình t ồ ử ế ớ ế c thi ượ ớ các b nh nhân d ệ đ ự ượ ủ ự ị ẫ ế ả ệ ứ ọ ứ ệ t HBV-DNA t ậ ệ ươ ệ Đây là nghiên M u huy t thanh th nghi m: ẫ ắ t k theo mô hình ti n c u c t c u đ ứ ề ế ứ c các bác sĩ ngang v i các m u huy t thanh đ ượ ế ẫ HBV-DNA và ng tính l y t ươ ấ ừ trên lâm sàng không đáp ng hay đáp ng kém ứ ứ ử c g i v i đi u tr lamivudine. Các m u này đ ề ượ ớ nhi u phòng thí nghi m lâm sàng t t i thành ạ ề ừ ph H Chí Minh đ n phòng thí nghi m R&D ệ ế ố ồ c a công ty Nam Khoa. ủ Trích bi ệ ừ ự ế ử ế ẫ i đ trình t ệ ế ệ ng pháp Boom b ng b ệ ặ ộ ị ệ ộ ừ ế đăng kí ch t l ử ế t DNA theo ph ử ả ấ ố ươ ế ế ả ộ ướ ự ượ ạ ế ộ ế các m u huy t ẫ thanh: Các m u huy t thanh th nghi m ngay ệ c đ a vào sau khi g i đ n phòng thí nghi m đ ượ ư ộ trích bi ằ ươ thu c th DNAPREP-BOOM do công ty Nam ố ng: Khoa s n xu t (s ấ ượ t ng pháp trích bi 03200/2001/CBTC-TĐC). Ph ệ ả ng d n c a nhà s n c th c hi n theo h đ ủ ẫ ệ ượ xu t. ấ ị ng HBV-DNA: ượ ộ c cho vào 40ul Phát hi n và đ nh l ệ t DNA đ ệ ị ượ ạ ị ng ậ ỹ ộ ấ i đ ả ượ đ nh genotype HBV và phát hi n các đ t bi n liên quan đ n kháng ế t DNA cũng lamivudine: Đ ng th i 10ul trích bi ệ ộ c cho vào 40ul PCR mix đ khu ch đ i m t đ ượ ạ ế ầ rt c a gene đ an DNA dài 564bp trong ph n ủ ọ c pha t polymerase c a ủ HBV. PCR mix này đ ừ ấ PCR master mix do công ty Nam Khoa s n xu t ả các hóa ch t c a Biorad, Roche, và Promega) (t c có thêm c p m i xuôi 264F ượ ủ ệ 827R (trình t trong tài li u ữ ồ ượ ự i phòng RD c a công ty Nam nghiên c u c p I t ủ ạ ứ ấ t k b ng ph n m m Primer c thi Khoa) đ ượ ầ ế ằ ế c premier đ c hi u đ an DNA nêu trên. M i đ ồ ượ ọ ệ ặ cho vào PCR mix v i hàm l ộ ng 15pm cho m t ớ ư PCR mix. Th c hi n PCR theo chu kỳ nhi ự sau: 1 chu kỳ 95oC trong 5 phút; sau đó là 40 chu kỳ 94oC trong 30 giây, 55oC trong 30 giây và 72oC trong 1 phút; và cu i cùng là 1 chu kỳ 72oC ố ệ ả t PCR, phát hi n s n trong 7 phút. Sau khi hòan t ph m khu ch đ i b ng đi n di trong th ch ạ ệ ẩ 1.5%. Sau khi đi n di và xác đ nh có s n ph m khu ch đ i đ c hi u dài 567bp, s n ph m PCR ế c tinh s ch b ng v i b th nghi m tinh đ ớ ượ s ch s n ph m PCR (PCR clean-up kit) do ạ Promega s n xu t (Cat. #A9281). S n ph m ẩ ả PCR sau khi tinh s ch đ ộ ượ DNA b ng máy Genquant c a Pharmacia. Sau s n ph m đó, th c hi n ph n ng gi ẩ ự ả ả ứ ớ PCR đã tinh s ch và xác đ nh n ng đ trên v i ộ ở ị ạ PCR sequencing mix c a Becman (DTCS: Dye ủ Terminator Cycle Sequencing) v i primer 827R. c làm t a và tinh i trình t S n ph m gi ủ ả ẩ ả ố ng pháp t a v i ethanol. Cu i s ch b ng ph ớ ươ ằ ạ trên máy sequencer cùng th c hi n gi i trình t ả ệ ự ả i CEQ8000 c a Becman Coulter. K t qu gi ủ c phân tích trên ch c năng analysis trình t đ ự ượ ố c a CEQ8000 có ch n thêm thông s ủ heterozygote. Sau đó dùng ch c năng investigator c a CEQ8000 đ th c hi n đ i chi u so sánh ể ự ủ ế ố c c v i trình t gi trình t ượ tham chi u đ ớ ự ả ượ HBV c a gene polymerase thành l p t ự ủ ậ ừ c a các dòng không đ t bi n đ phát hi n các v ị ể ộ ủ ượ c t quan tâm các v trí đã đ trí đ t bi n, đ c bi ế th a nh n là có đ t bi n liên quan đ n kháng ế ậ lamivudine: rtV173L, rtL180M, rtM204I/V, và c ghi rtV207I. K t qu phân tích đ t bi n đ ộ nhân là đ t bi n hòan tòan khi acid amin t i m t trong các v trí trên b thay th b ng acid amin ế ằ ị c ghi nh n là đ t bi n m t ph n đ t bi n, đ ầ ậ ế ộ ượ ế ộ ồ i m t trong các v trí trên t n (heterozygote) khi t ộ i c hai acid amin v a c a dòng hoang d i v a t ạ ừ ừ ủ ạ ả ủ HBV, c a dòng đ t bi n. Đ đ nh genotype c a ể ị ế ủ đăng nh p trình t c lên local blast đã gi ự ậ c a ph n m m mi n phí Bio-edit trong đó chúng ễ ủ ề ầ 10ul HBV SYBR trích bi HBV-DNA PCR mix (PCR mix đ đ nh l ượ ể ị b ng k thu t real-time PCR v i SYBR Green I ớ ằ ng do công ty Nam Khoa s n xu t) và ch y ch ươ ả ướ ng trình real-time PCR dùng SYBR nh là h d n c a nhà s n xu t đ phát hi n và đ nh ị ẫ ạ ư ệ ủ ể ả ấ
2
ả ng ộ ể rtL180M, rtM204I/V, và rtV207I. B ng 1 bày l các m u huy t thanh th nghi m. ủ HBV, sau đó c v i ớ ượ c i đ ả ượ ị ự ờ ậ ậ ự ệ trình ượ HBV-DNA và genotype c a ủ HBV trong ẫ tôi có cài m t th vi n genotype c a ư ệ truy c p d so sánh trình t đã gi trong th vi n, nh v y xác đ nh đ trình t genotype HBV c a m u th . ử ư ệ ủ ẫ ộ ế ệ ươ ề gi ng pháp ậ ế ệ ế ự ph n ạ ậ ế ậ ừ ượ i trình t ể ớ ế ự ụ ộ ệ ể ấ ế ể ư ế ệ ộ ế ồ ồ ế ộ ế ể ớ ộ ượ ồ c gi ệ ồ ượ ủ ủ ạ ữ ủ ệ ậ ư ệ ư ẫ ộ ế ộ ế ằ ộ ả ượ ướ ệ ả ư ậ ệ ậ ộ ế ộ ượ ớ c thi ượ ầ ằ ế ầ ộ ệ ẽ ộ
:
ượ
ị
B ng 1ả
nh n bi ậ ế ả ử ế i các v trí 173, 180, 204 và 207 Các đ t bi n t ị ộ ế ạ ủ c phân tích b ng ch c năng investigator c a đ ứ ằ ượ ph n m m kèm theo máy CEQ8000. Trong ch c ứ ầ c năng này, chúng tôi so sánh trình t ự ả ượ i đ ậ tham chi u do chúng tôi thành l p v i trình t ớ ầ rt c a gene b ng cách thu th p các trình t ủ ự ằ ủ HBV không đ t bi n polymerase c a các ch ng ế ộ ủ hình 1 cho (wild type). Các ví d minh h a trong ọ th y cách đ chúng tôi k t lu n nh th nào là ậ ộ có đ t bi n hòan tòan và nh th nào là có đ t ư ế i các v trí acid amin trên: bi n không hòan tòan t ị ạ ị (A) là đ t bi n ế rtM204V hòan tòan v i ATG b ộ ế thay th b ng GTG, trong khi đó (B) là đ t bi n ế ằ rtM204Vh (không hòan tòan) vì ch ng lên tín hi u c a base A c a mã ATG là tín hi u G do ệ v y máy v n ghi nh n là ATG nh ng th t ra có ậ ậ thêm mã đ t bi n GTG; (C) là đ t bi n ế rtL180M hòan tòan v i TTG b thay th b ng ATG, trong ị ớ ế rtL180M không hòan tòan khi đó (D) là đ t bi n vì bên d i tín hi u T c a TTG, có tín hi u A do ủ v y mà máy ghi nh n là TTG nh ng th t ra có ậ ế thêm mã đ t bi n là ATG; (E) là đ t bi n rtV173L v i GTG b thay th h u nh hòan tòan ư ị ế rtV173L b i CTG, trong khi đó (F) là đ t bi n ở i tín hi n G c a GTG là không hòan tòan do d ủ ướ có tín hi u C do v y máy ghi nh n là GTG ậ ậ ệ K t qu đ nh genotype và đ nh l ế ng HBV trong huy t ả ị ế thanh b nh nhân ệ ộ ọ
Quantitation of HBV- DNA (copies/ml)
Genotype B
Genotype C
2
1
7
5
13
5
9
5
6
6
t b i ẽ ị ắ ợ ờ ồ c thi ế ế ằ ị ẽ ạ ộ b nh n bi ậ
15
7
<103* 103 - <104 104 - <105 105 - <106 106 - <107 107 - <108 108 - <109**
5
1
ắ
30
ẩ
ng th p nh t là 429 copies/ml.
57 **S l
ng cao nh t là
ố ượ
ấ
ố ượ
ấ
*S l ấ 822,401,747 copies/ml
ộ nh ng th t ra có thêm mã đ t bi n CTG n a. ư ữ ế ậ ộ ị ả ự ự ấ ả ế ể ỉ ậ ị ệ ế ẫ ế ộ ể ế ộ có ghi nh n đ ế ậ ộ Phát hi n đ t bi n rtL180M, rtM204I/V PCR-RFLP: M t s m u có b ng ph ộ ố ẫ ằ v ầ ở ị k t qu ghi nh n là có đ t bi n m t ph n ộ ộ ả ế ậ c th c hi n thêm k thu t trí 180 và/hay 204 đ ượ ỹ ự i xem k t qu có trùng PCR-RFLP đ xác đ nh l ả ị h p đ ng pháp c v i k t qu ghi nh n t ph ươ ả ợ hay không. Trong ph gi ng pháp ươ ả PCR-RFLP này, đ phát hi n đ t bi n 180, cho ế t DNA c a huy t thanh vào 40ul 10ul trích bi ế ủ ượ PCR mix A ch a m i xuôi 180F và m i ng c ứ 180/204R; đ phát hi n đ t bi n 204, cho 10ul ệ t DNA c a huy t thanh vào PCR mix B trích bi ế ủ ệ c 180/204R ch a m i xuôi 204F và m i ng ồ ồ ứ trong tài li u nghiên (trình t các m i đ ự ). c u c p I t i phòng RD c a công ty Nam Khoa ứ ấ Ti n hành PCR theo chu kỳ nhi t nh sau: 1 chu ế kỳ 95oC trong 5 phút; sau đó là 40 chu kỳ 94oC trong 30 giây, 55oC trong 30 giây và 72oC trong c c t b ng 30 giây. S n ph m PCR mix A đ ắ ằ ẩ men c t ắ NlaIII (Bio New England), s n ph m ẩ ắ NdeI c c t b ng c hai men c t PCR mix B đ ả ượ ắ ằ c đi n di (Bio New England) và NlaIII sau đó đ ệ ế ế trên agarose 2.5%. Nh m i 180F đ t k ờ ồ có đ u 3’ n m đúng v trí 180 mà khi có đ t ộ ị bi n ế rtL180M xãy ra thì s hình thành m t trình ẩ t ở NlaIII do v y mà s n ph m ậ ự PCR mix A s b c t ng n di m t đ an 24bp so ắ ệ v i tr ng h p không đ t bi n. Trong phát hi n ế ộ ớ ườ ế rtM204V và rtM204I, nh m i xuôi đ t bi n ộ 204F đ t k có đ u 3’ n m đúng v trí ầ ượ 204 mà khi không có đ t bi n xãy ra thì s t o ra ế ế ở NdeI mà không bị t b i m t trình t ự ị ộ t b i ế ở NlaIII do v y s n ph m PCR mix nh n bi ẩ ậ ả ậ B s b ẽ ị NdeI c t ng n đi 24bp trong khi đó không ắ b ị NlaIII c t; khi có đ t bi n ế rtM204V thì s t oẽ ạ ộ ắ t b i ra trình t ế ở NlaIII mà không bị b nh n bi ự ị ậ ế ở NdeI do v y s n ph m PCR mix B nh n bi t b i ậ ả ậ ị NdeI s b ẽ ị NlaIII c t ng n đi 24bp mà không b ắ ắ ế rtM204I thì s t o ra trình c t; và khi có đ t bi n ẽ ạ ắ t nên s n không b c hai enzyme trên n n bi t ả ậ ế ự ở ph m PCR mix B s không b c t ng n đi b i ắ ị ắ ẽ ẩ hai enzyme này. Trong t t c các phân tích trên, ghi nh n đ t bi n hòan tòan khi ch có ki u hình ậ ộ ấ đ t bi n, và đ t bi n không hòan tòan khi xu t ế ộ hi n c hai ki u hình đ t bi n và không đ t bi n ế ệ ả ộ hi n th trên gel. ị ể
K t quế ả ế ế ả ộ ừ Trong th i gian t ờ ế ị i trình t ẫ ượ ự ế ng ử ệ ị Đ có th ch c ch n các phân tích d a vào các ắ ể ắ ể ộ nh đó phát hi n có các đ t tín hi u gi i trình t ờ ệ ả ệ i hai v trí 180 và 204 là bi n không hòan tòan t ạ chính xác, chúng tôi đã th c hi n k thu t PCR- ỹ ự ả ả i RFLP trên 20 m u mà khi phân tích k t qu gi ế trình t c đ t bi n không hòan ự ượ tòan v trí 180 và/hay 204. PCR-RFLP trên các ở ị m u này cho k t qu phát hi n đ t bi n không ệ ẫ i các v trí này hòan tòan trùng kh p hòan tòan t ớ ạ ự Hình 2 và hình 3 trình . v i k t qu gi ả ả ớ ế bày k t qu trên m t s m u mà chúng tôi đã ộ ố ẫ ả ế th c hi n PCR-RFLP. ự ệ 10/7/2006 đ n 7/10/2006, đã ệ c chúng tôi th c hi n có 87 m u huy t thanh đ HBV-DNA, đ nhị th ượ genotype và phát hi n các đ t bi n rtV173L, ộ nghi m đ nh l ệ ế
3
i trình t ộ ộ ế Trong 87 m u gi ượ ọ ự ậ ế
ộ ế ề ầ ậ ế rtV207I. Có 40 tr ườ ế ộ ớ ế
ng đ ể ế ớ ớ ố ượ ị ộ ậ ng h p đ ượ ợ c xác đ nh là genotype C v i s l ấ ượ rtL180Mh-rtM204I, 2.3% ế
rtM204V, 1.1% rtV173Lh-rtL180M-rtM204I, 12.6% (11/87) rtV173Lh-rtL180M-rtM204V, 1.1% rtV173Lh-rtL180Mh-rtM204I, 4.6% (4/87) rtV173Lh-rtL180M-rtM204Ih. Chúng tôi không ợ ng h p ghi nh n có đ t bi n không ghi nh n có đ t bi n nào, trong đó có 23 ộ c xác đ nh là genotype B và 17 tr ị ườ ượ đ c ượ ng th p nh t là 748 copies/ml và cao đ nh l ấ ị trình bày B ng 2 nh t là 215.451.964 copies/ml. ả ấ ệ c phát hi n chi ti t các ki u gene đ t bi n đ ượ ế ộ ể trong 47 m u trong m i liên quan v i genotype ớ ố và s l ẫ ng ố ượ HBV có trong m u th . ử ẫ ế phân tích đ t bi n, ả ẫ c ghi nh n có đ t bi n 204 54% (47/87) đ và/ho c 180 là hai đ t bi n quan tr ng nh t ấ ặ ộ HBV kháng lamivudine. c ghi nh n là giúp đ ậ ượ 2.3% Xét v t n s các ki u gen đ t bi n; ể ố (2/87) mang m t ki u gen đ t bi n v i 1.1% ể ộ (1/87) rtM204I, 1.1% rtM204Ih; 31% (27/87) mang hai ki u gene đ t bi n v i 4.6% (4/87) ộ rtL180M-rtM204V, 1.1% rtL180M-M204I, 9.2% (8/87) (2/87) rtL180Mh-rtM204Vh, 1.1% rtL180Mh-rtM204Ih, 3.4% (3/87) và 9.2% rtV173Lh-M204I, rtV173Lh-rtM204Ih; 20.7% (18/87) mang ba rtV173L-rtL180M- ki u gene đ t bi n v i 1.1% ể ế ớ ộ
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
(F)
Hình 1: Hình nh tín hi u các base đ
c máy hi n th khi phân tích k t qu gi
ệ
ả ả
ượ
ế
ị
ự
ệ
ả ể
i trình t ộ
ế
ế
ậ
ộ
ế rtM204V hòan tòan, (B) đ t bi n
ế rtL180M hòan tòan, (D) đ t bi n
ộ
ế rtL180M không hòan tòan, (E) đ t bi n
ộ
và d a vào có hay không có tín hi u base chèn vào mà ế rtM204V không hòan ộ ế ế rtV173L g n nh hòan tòan, (F) đ t bi n ư
ầ
ộ
ự ể có th ghi nh n đ t bi n hòan tòan hay đ t bi n không hòan tòan. (A) đ t bi n ộ tòan, (C) đ t bi n ộ rtV173L không hòan tòan
S n ph m PCR mix B
S n ph m PCR mix B
ả
ẩ
ả
ẩ
Hình 2: Phân tích đ t bi n
ộ
ả
ế ở ị
ủ
ắ
ẫ
ẩ
ộ
v trí 204; S n ph m PCR c a các m u 5718, 5648 không b ị NlaIII c t, và v a b c t v a không b c t b i ừ ị ắ ừ ộ
ư
ế
ẫ
ả
ẩ
ắ
ộ
ắ
ắ
ẫ
ẩ
ẩ
ị
ị
ị ắ ở NdeI, do ị ế rtM204Ih (không hòan tòan). Các m u 5646, 5650 không có đ t bi n vì s n ph m PCR không b ị NlaIII c t nh ng b v y đây là đ t bi n ắ ậ ế rtM204I hòan tòan. M u 5649 có đ t bi n NdeI c t. Các m u 5647 và 5570 không b c hai enzyme này c t nên đây là đ t bi n ế ộ ẫ ắ ẫ ị ả ị ắ ở rtM204V hòan tòan vì s n ph m PCR b NlaIII c t mà không b NdeI c t. M u 5525 có s n ph m PCR v a b c t v a không b c t b i ừ ị ắ ừ ả hai enzyme này nên kh năng cao nh t là có đ t bi n
ế rtM204Vh (không hòan tòan)
ả ả
ấ
ộ
4
Hình 3:
ả
ế ở ị
ẩ
Phân tích đ t bi n ẫ ủ
ậ
ủ
ả
ế
ể ế
ị ắ
ậ
v trí 180; S n ộ ph m PCR c a các m u 5718, 5646, 5647, 5648 và 5650 không b ị NlaIII c t, do v y không có đ t ộ ắ v trí 180; s n ph m PCR c a m u 5649 b bi n ẩ ị ẫ ế ở ị ế rtL180M; hai m u ẫ NlaIII c t, do v y có đ t bi n ộ ậ ắ 5525 và 5570 (không có trên hình này vì gel không còn gi ng) có các s n ph m PCR v a b ừ ị NlaIII c t ắ ẩ ả v a không b c t, do v y có th k t lu n có đ t ộ ậ ừ bi n ế rtL180Mh (không hòan tòan).
ng HBV trong các m u huy t thanh b nh nhân
B ng 2ả
ả
ộ
ố
ớ
ố ượ
ế
ệ
ẫ
: K t qu các ki u gene đ t bi n trong m i liên quan v i genotype và s l ế 2A: Mang m t ki u gene đ t bi n ế ể
ể ộ
ế ộ
M204Ih
M204I
1 đ t bi n
ộ
ế
C
C
B
B
T ngổ
1
1
1
1
Genotype <103 103 - <104 104 - <105 105 - <106 106 - <107 107 - <108 108 - <109
0
1
0
2
1
2B: Mang hai ki u gene đ t bi n ế ể
ộ
2 đ t bi n
V173Lh M204Ih
V173Lh M204I
L180Mh M204Ih
L180Mh M204Vh
L180Mh M204I
L180M M204I
L180M M204V
ộ
ế
C
C 1
B 1
B 1 1 1 2 2
Genotype <103 103 - <104 104 - <105 105 - <106 106 - <107 107 - <108 108 - <109
C 1 1
B 1
B 1 1
C
B
C 1
B 1 1 1
C 1
T ngổ 2 3 4 3 6 7 2
C 1 1
B 1 1 1 1 2
0
1
1
7
2
1
2
0
0
1
3
1
27
2
6
2C: Mang ba ki u gene đ t bi n ế ể
ộ
3 đ t bi n
V173Lh L180Mh M204Ih
V173Lh L180Mh M204I
V173Lh L180M M204V
V173Lh L180M M204I
V173L L180M M204V
ộ
ế
C
B
B
C
B
C
C
B
C
B
T ngổ
1
1
3
1
1
1 2
Genotype <103 103 - <104 104 - <105 105 - <106 106 - <107 107 - <108 108 - <109
1 6 1
2 3 1 2 9 1
1
8
3
1
0
1
0
0
18
1
3
ậ ạ ả ệ ể ự ổ ế ệ M c dù đã có vaccin ng a an tòan và hi u qu ừ Bi n lu n ặ ộ ẫ ị ư ạ ể ề ể i ừ ẳ ị c đây ng ươ c công nh n là thu c u ng đ ượ ố ề ề ầ virus và c i thi n đáng k s t n h i mô gan do virus[7,8]. Tuy nhiên, cho đ n ngày nay v n ch a ư có m t nhà lâm sàng nào có th kh ng đ nh cho đ n khi nào thì có th ng ng đi u tr lamivudine ư ế i ta cho mà không b tái phát dù tr ị ườ ướ ị r ng ch c n nghĩ đ n ph ng án đi u tr ế ỉ ầ ằ ị lamivudine lâu dài khi sau 52 tu n đi u tr ể lamivudine mà b nh nhân v n không có chuy n ệ ẫ ệ nhi m ễ HBV, nh ng viêm gan m n tính do v n còn là m t trong 10 nguyên nhân gây t ử ộ ẫ hàng đ u trên th gi ế ầ lamivudine đã đ đi u tr ề th y lamivudine đã làm gi m ng an m c l ả HBV vong ớ [5]. T năm 1998, ể ố ậ ị HBV[6]. Nhi u d li u lâm sàng đã cho ữ ệ ụ ượ ng ả ề ấ ọ
5
ở ế ế ộ ề nh n có đ t bi n V173L không hòan tòan đi kèm ậ đ t bi n M204Ih (9.2%) và M204I (3.4%). ộ ế
ế l ỏ ị ộ ế K t lu n ậ ị ộ ị[8,10]. ế ớ ượ ệ ể ế ỷ đ i huy t thanh (HBeAg tr nên âm tính), và t ổ [9,10]. Đi u tr lamivudine này là kh ang 17-33% l ị ỏ ệ lâu dài thì s d n đ n đ kháng lamivudine và y ề ẽ ẫ kháng này là kh ang 17- h c đã ghi nh n t ậ ỷ ệ ọ 46% sau m t năm đi u tr , và 67-46% sau 3-4 ề năm đi u trề HBV đ kháng đ ề ế
ị ử ụ ệ ủ ủ ườ ủ ị ệ ế ạ ế ị ộ i trình t ả ậ ệ ả ệ ố ầ ủ ệ ệ ư ằ ấ ứ ả ị ấ c qua k t qu công trình nghiên c u này s ể ế ộ ị ệ ủ ạ ồ ệ ấ ậ ụ ồ ượ ầ i trình t ự ể ả ẫ ế ủ Xác đ nh đ t bi n trên gen polymerase c a ộ HBV giúp virus kháng đ c lamivudine là m t ượ t hi n nay đ i v i lâm sàng nhu c u r t c n thi ố ớ ệ ầ ấ ầ ị đ có th xem xét vi c ng ng đi u tr ề ư ể ế ng th c k t lamivudine hay s d ng các ph ứ ươ ả ng pháp gi h p đi u tr khác. Hi n nay ph i ươ ề ợ c các phòng c a Trugene là th trình t ng đ ự ủ ượ ể thí nghi m lâm sàng s d ng trong ch n đóan đ ử ụ ẩ ệ HBV đ ng th i phát hi n các xác đ nh genotype ờ ồ [23]. đ t bi n giúp virus kháng đ c lamivudine ượ ộ Tuy nhiên, các phòng thí nghi m có trang b máy ệ gi không ph i c a h th ng Trugene ự ả ả ủ c yêu c u này c a lâm v n có th th c hi n đ ượ ể ự ẫ sàng. Hy v ng r ng các thông tin mà chúng tôi có ọ ẽ đ ế ượ có th có m t s đóng góp h u d ng cho các nhà ộ ố ữ ụ lâm sàng đang ngiên c u và đi u tr b nh viêm ề ứ HBV, và đ ng th i cho các nhà gan m n tính do ờ t cho các phòng thí nghi m c n lâm sàng, đ c bi ệ ặ ậ có trang b máy gi ụ đ có th ng d ng ể ứ ị c.ượ đ ả ườ ứ ấ ộ
ệ
ớ ự ế
Tài li u tham kh o ả 1. WHO’ map of HBV infection prevalence. 2001 2. Trinh TT, Le HD. 2004. Int Conf AIDS Jul 11-16; 15:
(abstract no. C12748)
JOURNAL
3. Tran Thien-Tuan Huy et al. 2003. High Prevalence of Hepatitis B Virus Pre-S Mutant in Countries Where It Is Endemic and Its Relationship with Genotype and CLINICAL OF Chronicity. MICROBIOLOGY. 41(12): 5449–5455
4. David b. Hipgrave et al. 2003. Hepatitis B Infection In Rural Vietnam and The Implications For a National Program of Infant Immunization. Am. J. Trop. Med. Hyg., 69(3): 288–294
5. World Health Organization warns of growing “crisis of
suffering.”
6. 2. Gordon, D., and Walsh, J.H. 1998. Hepatitis drugs win
7.
approval. Gastroenterology. 116:235–236. Honkoop, P., de Man, R.A., Zondervan, P.E., and Schalm, S.W. 1997. Histological improvement in patients with chronic hepatitis B virus infection treated with lamivudine. Liver. 17:103–106.
ự ề ư ị ầ ự ế ằ ủ ẽ ạ ả ơ ộ ế ồ ầ ụ ả ệ ọ ế ả ộ c v i lamivudine là do đ t bi n thay th acid amin xãy ra trên domain B (L180M) và trên motif YMDD (M204V/I) c aủ [11-18]. Đ tộ domain C c a men polymerase c a virus bi n M204V/I là đ t bi n ngay trên v trí tác ế ị ộ ế đ ng c a lamivudine đ i v i men polymerase do ố ớ ộ vây đã làm cho HBV tr nên kháng Lamivudine, ở i làm cho men tuy nhiên đ t bi n này l ộ polymerase h at đ ng tr nên kém hi u qu h n, ả ơ ở ọ do v y làm gi m kh năng nhân b n c a ủ HBV ả ệ [19-21]. trên b nh nhân cũng nh trên thí nghi m C u trúc không gian c a men polymerase c a ủ ủ HBV cho th y v trí 180 trên domain B khá g n ầ ộ v i motif YMDD, do v y đ t bi n L180M m t ậ ớ khi xãy ra thì s làm cho c u hình c a YMDD có ẽ c, do v y giúp cho virus đã có th ph c h i đ ồ ượ ụ ể c ph n nào ch c đ t bi n M204V/I ph c h i đ ứ ế ộ nguyên hay th m năng sao chép nh ng v n gi ậ ữ ư [21]. Do v yậ chí tăng kh năng kháng lamivudine các nhà nghiên c u th ng th y đ t bi n L180M ế hay đi kèm v i M204V và cũng đôi khi đi kèm M204I[11-14,15]. Đ t bi n V173L t thân nó không ộ gây nên s đ kháng lamivudine, nh ng do v trí c a acid amin này cũng khá g n motif YMDD ủ nên s thay th Valine b ng Leucine trên acid amin 173 s làm cho men polymerase c a virus nên nh y h n trong h at đ ng nhân b n do tr ọ ở v y đã làm cho virus đã b đ t bi n M204V/I và ị ộ ậ L180M ph c h i g n nh hòan tòan kh năng ư ườ [16]. Trong thí nghi m, các nhân b n bình th ng ả nhà khoa h c đã ch ng minh là ch c n cho thêm ỉ ầ ứ ả HBV hoang d i s tăng kh đ t bi n V173L là ạ ẽ ộ năng nhân b n lên h n 40% so v i không có đ t ộ ớ ơ bi nế [22]. ượ ườ ế ng, trên m t b nh nhân đ ộ ệ ộ
8. Lai, C.L., et al. 1998. A one-year trial of lamivudine for chronic hepatitis B. Asia Hepatitis Lamivudine Study Group. N. Engl. J. Med. 339:61–68. 5. Omata, M. 1998. Treatment of chronic hepatitis B infection. N. Engl. J. Med. 339:114–115.
9. Omata, M. 1998. Treatment of chronic hepatitis B
infection. N. Engl. J. Med. 339:114–115.
10. Lai, C.L. 1999. Antiviral therapy for hepatitis B and C in Asians. J. Gastroenterol. Hepatol. 14(Suppl.):S19–S21. 11. Bartholomew, M.M., et al. 1997. Hepatitis-B-virus resistance to lamivudine given for recurrent infection after orthotopic liver transplantation. Lancet. 349:20–22.
ộ ể ả ắ ượ ộ c, ả ộ ẽ ể ộ ế ộ ế ậ ộ ả ườ ế ộ ỉ ế ứ ủ ớ
ế ớ t nh là có 12.6% (11/87) đ c đi u ề Thông th c ướ tr lamivudine lâu dài thì đ t bi n xãy ra tr ị ấ h t là M204I hay M204V, sau đó HBV s xu t ế ẽ hi n thêm đ t bi n L108M. Ít khi nào chúng ta ế ệ g p đ t bi n L180M đ n thu n. Sau đó đ có ặ ầ ơ ế ộ c tình tr ng suy gi m kh năng th bù đ p đ ạ ể ế nhân b n do các đ t bi n M204I/V mà đ t bi n ế ả ụ ồ ượ HBV s xãy ra L180M không th ph c h i đ ụ ồ ạ thêm đ t bi n V173L đ giúp virus ph c h i l i ể kh năng đ t bi n. Do v y đ t bi n V173L ế ng ch xãy trên hai ki u gen đ t bi n, đó là th ể ả ủ L180M-M204I hay L180M-M204V. K t qu c a ấ công trình nghiên c u này c a chúng tôi cho th y các ki u đ t bi n hòan tòan phù h p v i các ợ ế ể i ghi nh n, ch có ki u đ t bi n đ c th gi ượ ỉ ậ ộ c ghi m t khác bi ỏ ộ ế ệ ể ộ ượ
6
18. Bartholomeusz, A., Schinazi, R.F., and Locarnini, S.A. 1998. Significance of mutations in the hepatitis B virus polymerase selected by nucleoside analogues and implications for controlling chronic disease. Viral Hepatitis Reviews. 4:167–187.
12. Ling, R., et al. 1996. Selection of mutations in the hepatitis B virus polymerase during therapy of transplant recipients with lamivudine. Hepatology. 24:711–713. 13. Tipples, G.A., et al. 1996. Mutation in HBV RNA- dependent DNA polymerase confers resistance to lamivudine in vivo. Hepatology. 24:714–717. al.
14. Allen,
M.I.,
et
19. Ono-Nita, S.K., et al. 1999. YMDD motif in hepatitis B virus DNA polymerase influences on replication and lamivudine resistance: a study by in vitro full-length viral DNA transfection. Hepatology. 29:939–945.
to
Identification and 1998. characterization of mutations in hepatitis B virus resistant Lamivudine Clinical lamivudine. Investigation Group. Hepatology. 27:1670–1677.
20. Melegari, M., Scaglioni, P.P., and Wands, J.R. 1998. Hepatitis B virus mutants associated with 3TC and famciclovir administration are replication defective. Hepatology. 27:628–633.
15. Chayama, K., et al. 1998. Emergence and takeover of YMDD motif mutant hepatitis B virus during long-term lamivudine therapy and retakeover by wild type after cessation of therapy. Hepatology. 27:1711–1716.
21. Suzane Kioko Ono et al. 2001. The polymerase L528M mutation cooperates with nucleotide binding-site mutations, increasing hepatitis B virus replication and drug resistance. J. Clin. Invest. 107 (4):449–455
lamivudine
16. Yeh, C.T., Chien, R.N., Chu, C.M., and Liaw, Y.F. 2000. Clearance of the original hepatitis B virus YMDD-motif mutants with emergence of distinct lamivudine-resistant mutants during prolonged therapy. Hepatology. 31:1318–1326.
22. William E. Delaney IV et al. 2003. The Hepatitis B Virus Polymerase Mutation rtV173L Is Selected during Lamivudine Therapy and Enhances Viral Replication In Vitro Journal Of Virology, 77(21): 11833–11841
17. Benhamou, Y., et al. 1999. Long-term incidence of hepatitis B virus resistance to lamivudine in human immunodeficiency virus-infected patients. Hepatology. 30:1302–1306.
23. Harald H. Kessler et al. 2003. Detection of Mutations in the Hepatitis B Virus Polymerase Gene. Clinical Chemistry. 49(6): 989-992
