Kỹ thuật di truyền-RFLP

ề ậ ỹ K  thu t di truy n ­ RFLP

Ỹ

Ậ K  THU T RFLP

(Restriction Fragment Length Polymorphisms)

Ớ

Ệ

a. GI

I THI U

ủ ề ậ ậ ỹ ỹ ứ K  thu t RFLP là k  thu t nghiên c u tính đa hình chi u dài c a các phân

ự ể ạ ắ ớ ạ đo n DNA d a trên đi m c t các enzim gi i h n (Restriction Enzyme, RE). Khi ủ

ớ ợ ở ị ệ ộ DNA v i enzim gi ớ ạ ở i h n ệ  dung d ch đ m thích h p pH, nhi t đ  thích h p s ợ ẽ

ữ ạ ớ ướ ệ ớ ẽ ạ s  t o ra nh ng phân đo n DNA v i kích th c khác nhau trên l p gel đi n di, t ừ

ậ ậ ả ỹ ượ ử ụ ổ ế ừ ậ ồ đó l p nên các b n đ  gen. K  thu t này đ c s  d ng ph  bi n t th p niên 80

ế đ n nay.

ể ượ ơ ị Phân tích RFLP có th  đ c chia thành mô hình thăm dò v  trí đ n (SLP) và

ườ ươ ượ ề đa     (MLP). Thông th ng, ph ng pháp SLP đ ơ c dùng nhi u h n MLP vì nó

ể ả ễ ạ ả ơ ả ẫ ỗ nh y c m h n, d  dàng đ  gi ợ   i thích và có kh  năng phân tích các m u h n h p

ữ ệ ể ượ ữ ơ ư ả ị DNA. H n n a, d  li u có th  đ c đ a ra ngay c  khi DNA b  suy thoái (ví d ụ

ư ượ ươ nh  khi nó đ ấ c tìm th y trong x ng.)

Ắ

b. NGUYÊN T C CHUNG

ủ ủ ệ ổ ộ ự ậ ự sai khác c a ph  băng đi n di và đ  dài c a các Kĩ thu t RFLP d a trên s

ạ ố ượ ạ ắ ượ ị ắ ở phân đo n b  c t b i enzyme gi i h n ớ ạ . S  l ng đo n c t khác nhau đ c phân

ệ ằ ệ ồ ượ ư ừ ặ ấ d u vân tay bi t b ng đi n di đ  nên còn đ ọ c g i là đ c tr ng cho t ng phân t ử

ử ằ ẫ ộ ớ ệ ạ AND. Khi x  lý các m u DNA b ng cùng m t enzyme gi i  h n thì các h  enzyme

ẽ ạ ề ạ ắ ấ có c u trúc khác nhau s  t o nên các đo n c t có chi u dài khác nhau. Ng ượ ạ   c l i,

ẽ ạ ệ ạ ắ ấ ố ố ế n u các h  enzyme có c u trúc gi ng nhau s  t o nên các đo n c t gi ng nhau và

ể ệ ệ ố ồ th  hi n gi ng nhau trên đi n di đ .

Ớ Ạ

c. CÁC ENZIM GI

I H N (RE)

ớ

ệ

d.  Gi

i thi u

ớ ạ ượ ấ ở ẩ Enzim gi i h n đ c Werner Arber tìm th y vi khu n vào năm 1962. Ông

ấ ặ ằ ả ệ ả ậ ế ủ cho r ng các RE có kh  năng r t đ c bi t đó là kh  năng nh n bi t DNA ch  và

ạ ủ ạ ạ ậ DNA l ế ự . Enzim này h n ch  s  nhân lên c a DNA l khi chúng xâm nh p vào t ế

ừ ệ ế ạ ặ ẩ ằ ắ ộ bào vi khu n b ng cách c t chúng ra thành t ng đo n m t cách đ c hi u, vì th  ông

Page | 1

ề

ế ạ ộ ỹ K  thu t di truy n ­ RFLP ọ g i là ự ậ ớ restriction  có nghĩa là h n ch . V i phát minh này ông cùng các c ng s

ả ưở (Daniel Nathans và Hamilton O. Smith) đã giành gi i th ng Nobel vào năm 1978.

ệ ố ả ợ ơ ộ Các RE h p thành h  th ng b o v ệ ở ế  t bào  nhân s  (procaryote), m t câu

ỉ ắ ủ ắ ỏ ặ h i đ t ra là vì sao các RE ch  c t DNA c a các phage mà không c t DNA c a t ủ ế

ả ờ ẩ bào   vi   khu n?   Câu   tr l i   là   nh ờ Methylase  đây   là   enzym   giúp

vi

3)

ệ ắ ẩ ả ị khu n có kh  năng này, chính enzim này ch u trách nhi m g n nhóm metyl (CH

ở ị ắ ủ ế ả ủ ẩ vào các nucleotides v  trí c t c a các RE trên DNA c a vi khu n vì th  b o v ệ

ỏ ự ủ ậ ẩ ắ ủ DNA c a vi khu n kh i s  phân c t c a RE. Tuy v y đôi lúc methylase l ạ ắ   i g n

ủ ề ầ ả ả nh m c  nhóm metyl vào chính DNA c a phage, đi u này gi ố ớ   i thích vì sao đ i v i

ẫ ẩ ế ủ ị các dòng vi khu n kháng phage v n có các t bào b  phân h y.

Page | 2

ỹ

ề ắ ượ ế ậ ậ K  thu t di truy n ­ RFLP ớ ạ Enzim c t gi ầ i h n đ u tiên đ c phân l p vào năm 1968, cho đ n nay đã

ể ớ ế ệ ứ ả ớ ượ ố phát tri n t i th  h  th  3 v i kho ng 3.400 RE đ c khám phá. Trong s  này có

ả ượ ươ kho ng 540 RE đã đ c th ạ ng m i hóa.

ọ ủ

ắ ớ ạ

e. Tên g i c a enzim c t gi

i h n

ế ữ ầ ẩ ừ ượ ữ ầ Ch  đ u vi t hoa là ch  đ u tên vi khu n t đó RE đ c ly trích. Hai ch  k ữ ế

ế ươ ươ ủ ữ ề ả ớ ế không vi t hoa t ng đ ẩ ng v i tên loài c a vi khu n. C  3 ch  này đ u vi t in

ỉ ứ ự ế ế ữ ố ượ ườ nghiêng. K  đ n là ch  s  la mã ch  th  t RE đ ệ c phát hi n trong tr ợ   ng h p

ề ượ ữ ế ẩ ấ ộ nhi u RE đ c tìm th y trong cùng m t vi khu n. Đôi khi còn có thêm ch  vi t hoa

ế ể ỉ ủ ẳ (vi ẩ ử ụ . t th ng) đ  ch  ch ng vi khu n s  d ng

ấ ẩ ầ Ví dụ: EcoRI: là enzym đ u tiên tìm th y trên vi khu n E. Coli

ứ ẩ ấ EcoRV: enzym th  5 tìm th y trên vi khu n E.coli

ắ ớ ạ

ạ

f. Các lo i enzim c t gi

i h n

ạ ậ ế ự ẽ ử Lo i I: khi enzym nh n bi t trình t ể  nó s  di chuy n trên phân t DNA cách đó

ả ụ ộ 1000­5000 nu và gi i phóng đ  vài ch c nu.

ạ ậ ế ự ắ ị Lo i II: enzym nh n bi t trình t và c t ngay v  trí đó.

ạ ậ ế ự ắ ở ị Lo i III: enzym nh n bi t trình t và c t DNA v  trí cách đó 20 nu.

Page | 3

ề ậ ỹ K  thu t di truy n ­ RFLP

Ệ

Ỹ

Ồ

Ự

Ậ

g. QUY TRÌNH TH C HI N K  THUY T RFLP BAO G M CÁC

B

C:ƯỚ

ế Tách chi ạ t và tinh s ch DNA

ắ ẫ ở ầ C t các m u DNA c n phân tích b i RE

Phân tách DNA trên gel agarose

Southern Blotting:

ể + Chuy n DNA sang màng nylon

ấ ạ ạ ọ + Ch n đo n dò (probes), đánh d u đo n dò

+ Lai ghép gen (Hybridization)

ậ ả ồ + L p b n đ  gen (phân tích đa hình)

Page | 4

ề ậ ỹ K  thu t di truy n ­ RFLP

h. Trích DNA

i. Nguyên t c:ắ

ế ấ ẩ ỡ ằ ơ ọ ệ ạ ị Thành t bào b  phá v  b ng bi n pháp c  h c và các ch t t y m nh. DNA

ượ ả ấ ạ ượ ế ủ đ c gi ạ i phóng và làm s ch t p ch t Rnase. DNA đ c k t t a trong Ethanol

ạ ờ 100% và thu l i nh  ly tâm.

j. Quy trình:

ự ệ ượ ả ở Th c hi n theo qui trình đ c mô t b i Rogers và Bendich (1988) (qui trình

ướ ồ CTAB) g m các b c sau:

ủ ố ượ ấ ứ ầ ­ L y mô c a đ i t ng c n nghiên c u.

ề ặ ử ẹ ằ ồ ượ ­ Kh  trùng b  m t mô b ng c n 70%, sau đó dùng kéo và k p (đã đ c kh ử

ỏ ồ ừ ẫ ắ ả ỗ trùng) c t lá thành t ng m nh nh  r i cho riêng vào các tuýp (m i m u riêng

ả ộ m t tuýp kho ng 0,1g).

ụ ụ ề ẫ ơ ỏ ­ Ngâm các tuýp và d ng c  nghi n m u vào nit l ng trong 10 phút.

ầ ố ậ ạ ề ầ ẫ ả ầ ­ Cho m u vào máy nghi n, có t n s  27l n/giây, l p l i kho ng 3 l n.

β ­ Cho thêm 1.000µl Extraction buffer (10ml EB +7µl  ­Mercaptoethanol).

­ Cho thêm 50µl SDS 10%.

Ủ ướ ở ặ ộ ầ ẫ ­ trong n c 65oC trong 30 phút. Sau 5 phút tr  m t m u m t l n.

­ Ly tâm 13.000 rpm trong 10 phút.

ấ ị ở ầ ặ ớ ỏ ­ L y 800µl d ch trong trên cho vào tuýp m i (b  ph n c n)

ắ ề ỗ ­ Cho 800µl Isopropanol vào m i tuýp, l c đ u.

­ Ủ ẫ ở  m u ­20oC trong 2 gi ờ .

ỏ ướ ấ ặ ­ Ly tâm 13.000rpm trong 10 phút, b  n c, l y c n.

ủ ở ­ Cho thêm 400µl TE 0,1 vào, thêm 10µl RNase, 20 phút 37oC.

ủ ở ­ Cho 400µl CTAB vào, 15 phút 65oC.

ẹ ả ­ Cho 800µl Chloroform/Isoamylalcohol, đ o nh  (12ml Chloroform: 0,5ml

Isoamylalcohol)

­ Ly tâm 13.000rpm trong 5 phút.

ể ấ ầ ớ ­ L y 700µl ph n trong chuy n sang tuýp m i.

ẹ ể ắ ở ạ ­  Cho 1,4ml  Ethanol 96%  làm  l nh  vào,  l c  nh ,   đ  15 phút nhi ệ ộ  t  đ

phòng.

ỏ ướ ấ ặ ­ Ly tâm 13.000rpm trong 10 phút, b  n c, l y c n.

Page | 5

ỹ ề K  thu t di truy n ­ RFLP

ạ ắ ậ ẹ ­ Cho 700µl Ethanol 70% làm l nh vào, l c nh .

ỏ ướ ấ ặ ­ Ly tâm 13.000rpm trong 10 phút, b  n c, l y c n.

ặ ạ ầ ữ ớ ệ ấ ấ ­ L p l ạ i l n n a v i Ethanol 70% làm l nh, th m mi ng tuýp trên gi y.

ấ ở ­ S y chân không 45oC trong 10 phút.

ữ ẫ ở ­ Cho 200µl TE 0,1 vào, tr  m u ­20oC.

ằ ồ ị ươ ổ k. ộ  Xác đ nh n ng đ  DNA b ng ph ng pháp đo quang  ph

Nguyên t c: ắ

ụ ạ ự ấ ự ử ­ D a vào s  h p th  m nh ánh sáng t ngo i ạ ở ướ  b c sóng 260 nm và 280

ủ ơ nm c a các baz  purin và pyrimidin.

ơ ị ươ ứ ồ ộ ộ ị ­ Đ n v  OD260 nm t ng  ng n ng đ  50mg/ml cho m t dung d ch DNA

ẫ ồ ộ ượ ứ ợ s i   đôi.   Do   đó   n ng   đ   DNA   trong   m u   đ c   tính   theo   công   th c   sau:

ộ [DNA]   (mg/ml)   =   OD260nm   x   50   x   Đ   pha loãng

ể ể ủ ể ạ ộ ị ị ­ Đ  ki m tra đ  tinh s ch c a dung d ch có th  đo thêm giá tr  OD 280nm.

ị ượ ạ ẫ ­ Dung d ch axit nucleic đ c xem là s ch (không l n protein) khi t ỷ ố    s  :

ằ OD260nm/OD280nm n m trong không 1.8 – 2.

ớ ạ ắ

l. Dùng enzim gi

i h n c t DNA

ả ử ụ ủ ệ ế ề ồ ộ ồ ộ ị N ng đ  NaCl c a dung d ch đ m, n u ph i s  d ng nhi u RE có n ng đ  NaCl

ắ ớ ệ ồ ộ ị ấ   ủ c a dung d ch đ m khác nhau thì nên c t v i RE có n ng đ  NaCl th p

ướ ồ ế ầ ồ ộ ơ tr c r i đ n RE c n NaCl n ng đ  cao h n.

ượ ệ ả ả ở RE đ ị c b o qu n trong dung d ch đ m có 50% glycerol ­200C, nên thêm vào

ả ứ ể ắ ờ ố ph n  ng sau cùng, th i gian đ  bên ngoài càng ng n càng t t.

ả ứ ể ế ả ỏ ớ ệ Th  tích ph n  ng càng nh  càng có hi u qu  vì RE và DNA ti p xúc v i nhau

ố ả ả ể ể ả càng t ả   t tuy nhiên ph i b o đ m th  tích RE không quá 1/10 th  tích ph n

ứ ề ẽ ạ ộ ứ ủ ế ng vì glycerol nhi u s  gây  c ch  ho t đ ng c a RE.

m.  Southern Blot

ể n. Chuy n DNA sang màng nylon

ỏ ằ ắ ạ ớ ạ ợ ­ C t DNA thành các đo n nh  b ng enzim gi i h n thích h p.

ệ ể ạ ả ẩ ắ ­ Ði n di s n ph m c t trên gel Agarose đ  tách các đo n DNA theo kích

th c.ướ

Page | 6

ỹ K  thu t di truy n ­ RFLP

ề ế ề ằ ị ậ ­ Làm bi n tính DNA, khi DNA còn trên gel b ng dung d ch ki m.

ụ ể ị Ví d : có th  nhúng DNA vào trong dung d ch NaOH 0.5M : NaCl 1.5M, DNA

ẽ ượ ợ ơ ợ s i kép s  đ c tách thành DNA s i đ n.

ợ ơ ể ể ớ ỉ ế   ể ­ Ch  DNA s i đ n m i có th  chuy n lên màng lai.Chuy n DNA đã bi n

tính lên màng lai.

ượ ử ụ ườ ­ Màng lai đ c s  d ng là màng nitrocellulose. Ng i ta cũng có th  s ể ử

ể ế ả ậ ụ d ng màng nylon. Màng nitrocellulose đi n hình có kh  năng ti p nh n 100µg

ế ậ ặ   ả DNA/cm2, trong khi màng nylon có kh  năng ti p nh n 500µg DNA/cm2. M t

ả ữ ứ ắ ơ ơ khác   màng  nylon  có  kh   năng   gi ệ     DNA   ch c   h n   và   ít   đ t  gãy   h n.   Vi c

ể ườ ượ ế ằ ạ ẫ ả chuy n DNA th ng đ c ti n hành b ng ho t tính mao d n trong kho ng vài

ờ ặ ộ ế ị ấ ế gi ể  ho c có th  dùng m t thi t b  th m chân không. N u dùng thi ế ị ấ   t b  th m

ỉ ấ ẽ ả ộ ờ ơ chân không thì s  nhanh h n, ch  m t kho ng m t gi ể   . Trong quá trình chuy n,

ẫ ượ ữ ổ ạ ị v  trí các đo n DNA v n đ c gi nguyên không thay đ i.

ượ ờ ự ể ẫ ­ Acid nucleic đ c chuy n lên màng lai nh  l c mao d n.

ạ ọ o. Cách ch n đo n dò (probes)

ạ Probe (đo n dò) là m t s i ộ ợ nucleic acid (ho c ặ ribonucleic acid) có trình t xácự

ượ ấ ằ ươ ể ệ ậ ị đ nh và đ c đánh d u b ng các ph ng pháp khác nhau dùng đ  nh n di n các

ạ ự ổ ự ớ đo n nucleic acid khác có trình t b  sung v i nó. Quá trình này d a trên nguyên

ủ ử ượ ử ế t c ắ bi n tính ồ  và h i tính c a phân t DNA, đ ọ c g i là lai phân t DNA . Các

ươ ổ ể ử ụ ệ ậ ph ng pháp c  đi n có s  d ng probe là Northern Blot (nh n di n b n ả RNA

ệ ậ phiên mã), Southern Blot (nh n di n các phiên b n c a ả ủ gene). Công ngh  ệ DNA

ượ ế ế ự ắ ử ụ chip và cDNA micro­arrays đ c thi t k  d a trên nguyên t c s  d ng các probe

ươ ử ư ứ ạ ồ ủ c a các ph ng pháp lai phân t nh ng cho phép nghiên c u đ ng lo t hàng

nghìn gene khác nhau.

ể ượ ế ế ự ữ ự ụ ẵ ỳ + Probe có th  đ c thi t k  d a trên nh ng trình t có s n tu  vào m c đích

ệ ủ ừ c a t ng thí nghi m và các thông tin đã có.

ự ự ố ượ ủ ứ ể ệ ậ + D a trên trình t genome c a đ i t ả   ng nghiên c u đ  nh n di n các b n

ặ ả ủ ủ ẩ sao c a gen ho c s n ph m RNA c a gen.

Page | 7

ỹ ậ ề

ự ự ệ ầ ủ ậ K  thu t di truy n ­ RFLP + D a trên trình t genome c a các sinh v t có quan h  g n gũi v i đ i t ớ ố ượ   ng

ứ ứ ế ằ ượ ả ồ nghiên c u nh m tìm ki m gen ch c năng đ ế   c b o t n qua quá trình ti n

hoá.

ự ự ủ ủ ừ ẩ + D a trên trình t ả  amino acid c a protein là s n ph m c a gene. T  đó tìm

ế ự ọ ẹ ủ ki m trình t tr n v n c a gene mã hoá cho protein đó trên genome.

ế ế ế ố ạ ầ ả ả Trong quá trình thi t k  đo n dò c n b o đ m các y u t ặ    sau: 1) tính đ c

ệ ượ ư ủ ặ ạ ữ tr ng c a probe, 2) không có hi n t ấ   ng lai chéo gi a các probe ho c t o c u

ộ ạ ị ệ ộ ế ả trúc không gian n i t i trong probe, 3) giá tr  nhi t đ  bi n tính (Tm) ph i phù

ự ệ ề ộ ợ h p khi th c hi n phép lai nhi u probe m t lúc.

ạ ươ p. Cách ghi nhãn đo n dò cho ph ng pháp lai Southern

Cách ghi phóng xạ

ườ Th ng dùng: 3 H,  32P,  33P,  S 35

ẫ ượ ờ ộ ả ứ ấ ộ M u dò đ c đánh d u trong m t ph n  ng sao chép DNA nh  m t dNTP mang

ấ ị ạ ch t đòng v  phóng x

ạ ự ế ả Xem k t qu : phóng x  t ghi (autoradiograph)

ỳ Cách ghi hu nh quang

ẫ ượ ờ ộ ả ứ ấ ộ M u dò đ c đánh d u trong m t ph n  ng sao chép DNA nh  m t dNTP mang

ấ ỳ ch t phát hu nh quang

ế ả ỳ Xem k t qu : máy đo hu nh quang

ủ ỹ ế ể ậ  u đi m và khuy t đi m c a k  thu t RFLP Ư ể

ư ể ồ ộ ­ RFLP có  u đi m là marker đ ng tr i cho phép phân bi ệ ượ t đ ể ồ   c cá th  đ ng

ị ợ ướ ả ậ ớ ợ h p và d  h p. Do kích th c DNA kh o sát trong RFLP l n vì v y s  l ố ượ   ng

ử ề ủ ứ ứ ầ ạ ấ d u phân t (marker) t o ra nhi u đ  đáp  ng nhu c u nghiên c u.

ố ớ ứ ứ ạ ự ệ ể ­ Tuy nhiên do qui trình th c hi n ph c t p, nguy hi m đ i v i s c kho ẻ

ườ ử ụ ứ ạ ấ ầ ng i nghiên c u (s  d ng phóng x  đánh d u), và DNA yêu c u có ch t l ấ ượ   ng

ậ ạ ỹ ế ệ ử ụ cao đã làm h n ch  vi c s  d ng k  thu t này.

ớ ự ể ậ ậ ả ở ơ ỹ ỹ ơ   ­ Cùng v i s  phát tri n k  thu t PCR, k  thu t RFLP tr  nên đ n gi n h n.

ộ ặ ể ế ạ ầ ồ ộ ả   M t c p m i oligonucleotide có th  dùng khu ch đ i m t vùng DNA c n kh o

Page | 8

ỹ ậ

ề ạ ượ ạ ượ ắ ằ ệ ế K  thu t di truy n ­ RFLP sát, sau đó đo n DNA đ c khu ch đ i đ c c t b ng các RE, đi n di và phân

ặ ạ ộ ỏ ướ tích trên gel nhu m ethidium bromide ho c b c. PCR­RFLP b  qua b c lai nên

ẻ ơ ể ơ ươ giá thành r  h n và ít nguy hi m h n ph ng pháp RFLP.

Ứ

q.

ụ ng d ng:

ử ệ ệ r. Th  nghi m quan h  cha con

ủ ứ ử ụ ẻ ệ ể ả ị S  d ng công ngh  RFLP đ  xác đ nh Jack  có ph i là cha c a đ a tr  có tên

là Payle.

ượ ế ế ắ ệ Trong thí nghi m này, DNA đ c chi t xu t t ấ ừ các t bào máu tr ng t ừ ả   c

ả ượ ế ị ướ ể ba cá nhân và phân tích RFLP. Các k t qu  đ c hi n th  d i đây:

ườ ừ ưở ợ ả Trong tr ể ng h p này, Jack có th  là cha, vì Payle th a h ng m nh 12,4 kb

ạ ừ ể ộ ườ ừ t Jill và 4,3 đo n t Jack. Tuy nhiên, có th  là m t ng ớ i đàn ông v i mô hình

ươ ự ư ế ứ ể ẻ ể ắ ắ ơ RFLP t ng t nh  th  cũng có th  là cha đ a tr . Đ  ch c ch n h n, m t s ộ ố

ẽ ượ ế ể ị v  trí RFLP s  đ c ti n hành ki m tra.

ử ệ ộ ượ ế ế Trong m t th  nghi m khác, DNA đ c chi t xu t t ấ ừ các t ắ    bào máu tr ng

ườ ả ượ ị ướ ể ủ c a 3 ng i và phân tích RFLP. ế  Các k t qu  đ c hi n th  d i đây:

Page | 9

ỹ K  thu t di truy n ­ RFLP

ầ ể ượ ủ ằ ị ậ ề L n này, nó có th  đ c xác đ nh r ng Jack là không cha c a Payle vì Payle

ạ ả ộ có m t đo n kho ng 6 kb còn Jack thì không có.

ệ ơ ị s. Xác đ nh nguy c  mang b nh

ệ ặ ơ ườ ắ ệ ộ Alen x  nang (CF) là m t alen l n gây b nh. Ng ể   ẽ i m c b nh s  mang ki u

ợ ử ặ ả ệ ừ ồ ườ ị gen đ ng h p t l n. T  thông tin ph  h , chúng ta th ể ng có th  xác đ nh

ữ ườ ộ ườ ệ ử ụ ỹ nh ng ng i trong gia đình này là m t ng i mang gen b nh. ậ    S  d ng k  thu t

ơ ắ ệ ể ở ế ệ ữ ủ ườ RFLPs đ  phân tích nguy c  m c b nh CF th  h  con c a nh ng tr ợ   ng h p

ườ ợ ử ộ ệ ể ồ ộ ườ sau: ng i thu c ki u đ ng h p t tr i ko mang alen b nh( WT ), ng i mang

ể ườ ể ệ ắ ồ ki u d  h p t ị ợ ử CARIERS), và ng ( i m c b nh mang ki u gen đ ng h p t ợ ử ặ    l n

(CF)

ẹ ề ế ả ồ ấ ả ủ N u c  cha và m  đ u đ ng h p t ợ ử WT, sau đó t t c  các con cái c a h ọ

ị ệ ẽ ồ cũng s  là đ ng h p t ợ ử WT và ko b  b nh

ẹ ề ị ợ ể ế ả ọ ộ ớ N u c  cha và m  đ u d  h p, h  có th  có con v i m t trong

ỉ ệ ể ị ắ ẽ ba ki u gen, t  l ệ  con sinh ra b  m c b nh CF s  là ¼, ½ mang

ị ợ ệ ể ki u gen d  h p và ¼ là WT không mang gen b nh

ớ ự ệ ề ỗ V i s  gia tăng thông tin chu i gen, ngày càng có nhi u b nh di

ể ượ ự ề ằ truy n có th  đ c d  đoán b ng phân tích RFLP.

ề ả ậ ồ t. L p b n đ  di truy n

ụ ơ ả ở ồ ứ ạ ớ Ví d  đ n gi n ru i gi m. ấ  Hai locus  ng v i hai đo n RFLP có th  t ể ạ   i

ỗ ị m i v  trí:

Page | 10

ề ậ ỹ K  thu t di truy n ­ RFLP

ể ươ ễ ắ ằ ở Các locus n m trên nhi m s c th  t ồ ng đ ng ự    con cái (trái) và con đ c

ạ ượ ọ ể ạ (bên ph i).ả  Locus trên có th  t o ra hai đo n khác nhau đ c g i là 1 và 3.

ẽ ạ ợ ử ự ặ ạ ấ ơ ồ Locus th p h n s  t o ra các đo n là 2 ho c 4. Con đ c là đ ng h p t cho

ạ ợ ử ồ ạ ở ạ đo n 1 t i locus  phía trên và đ ng h p t cho đo n 2 các locus phía d ướ    i.

ị ợ ử ở ả ủ ả Con cái là d  h p t c  hai locus. RFLP c a chúng là mô hình d i có th  đ ể ượ   c

ấ ướ nhìn th y trên Southern blot d i đây:

ể ả ự ấ ạ ộ ỉ ử ư Con đ c ch  có th  s n xu t m t lo i giao t (1 và 2) nh ng con cái có th ể

ử ể ượ ấ ừ ọ ố sinh ra b n giao t khác nhau. ố ố  Hai trong s  b n có th  đ c g i là l y t cha

ẹ ả ạ ừ ể ươ ễ ừ m  vì chúng mang c  hai đo n RFLP t ắ  nhi m s c th  t ng t ự  1 và 2 t ; trái

ặ ừ ễ ể ể ễ ắ ổ ợ ho c 3 và 4 t nhi m s c th  bên ph i. ắ ả  Hai nhi m s c th  khác là tái t h p do

ổ ợ ữ ạ ả ượ ộ ẫ ự s  tái t h p đã x y ra gi a hai locus và do đó đo n RFLP đ ể   c tr n l n đ  1

ượ ế ớ ế ớ đ c liên k t v i 4 và 3  liên k t v i 2.

ế ệ ể ồ ố ầ ố ủ ố Khi hai con ru i này giao ph i, t n s  c a b n th  h  con cháu có th  có th ể

ượ ừ ữ ề ả đo đ c và t các thông tin này, kho ng cách di truy n gi a hai locus RFLP (trên

ướ ể ượ ị và d i) có th  đ c xác đ nh.

Page | 11

ề ậ ỹ K  thu t di truy n ­ RFLP

ế ệ ủ ụ ả ẩ ừ ể ủ Trong ví d  này, 70% c a th  h  con cháu là s n ph m t ki u gen c a cha

ẹ ượ ả ấ ừ ể ổ ợ ứ ậ m  và 30% đ c s n xu t t ki u gen tái t ủ  h p c a tr ng. Vì v y, hai locus

RFLP xa nhau 30 centiMorgans

Ả

Ệ

u. TÀI LI U THAM KH O

ề

ạ

ọ

ổ

­ Di truy n h c –Ph m Thành H

ử

ươ

ồ

ỳ

ọ ­ Sinh h c phân t

­ H  Hu nh Thùy D ng

ệ

ọ

ử

ụ

­ Công ngh  sinh h c phân t

ứ . Nguyên lý và  ng d ng c a

ủ  DNA tái tổ

ợ h p ­ Bernard R. Glick­Jack J Pasternak

­ http://highered.mheducation.com/olc/dl/120078/bio20.swf

­ http://vi.wikipedia.org/wiki/K%E1%BB%B9_thu%E1%BA%ADt_R

FLP

­ http://www.bio.davidson.edu/genomics/method/RFLP.html

­ http://hortsci.ashspublications.org/content/27/2/160.short

­ http://www.fastbleep.com/biology­notes/41/169/967

­ http://congnghesinhhoc24h.com/tai­lieu/tach­chiet­dna­

330.html#sthash.QM8TePtQ.dpu

ệ

ự Nhóm Th c Hi n:

ễ

Nguy n Văn Liêu

61203300

ườ

ị

61203450

Lê Tr

ng Th nh

Page | 12

ề ậ ỹ K  thu t di truy n ­ RFLP

ề

ặ

ị

61203297

Đ ng Th  Thanh Ki u

Page | 13