Ngân hàng cDNA
1. Thiết kế ngân hàng cDNA
Ngân hàng cDNA là tập hợp các bản sao cDNA từ tất cả các mDNA của một
tế bào. Như vậy, ngân hàng được thiết lập từ một loại tế bào xác định (tế bào
biệt hóa), vì thế, cDNA mang tính tế bào rất cao.
Quá trình chuẩn bị ngân hàng cDNA bao gồm các bước sau đây:
- Chiết tách RNA tổng số, ta phải chọn những tế bào có chứa nhiều
mRNA cần thiết và sau đó, làm sạch mRNA.
- Chọn lựa các mRNA chứa nhiều A (polyA) bằng cách tách trên cột
xenlulose oligo dT.
- Tổng hợp cDNA sợi kép đầu bằng từ mRNA dưới tác dụng của enzyme sao
chép ngược nhờ kỹ thuật nuclease S1 hoặc kỹ thuật Gubler-Hoffman.
- Metyl hóa các vùng hạn chế (có trong đoạn cDNA sợi đôi) được nhận biết
bởi enzyme EcoRI để bảo vệ vùng này không bị cắt khi thao tác với EcoRI.
- Tạo đầu dính bằng cách sử dụng đoạn nối linker có chứa trình tự nhận biết
bởi EcoRI, sau đó, cắt bằng enzyme EcoRI. Trong trường hợp này, chỉ có
đoạn nối bị cắt còn cDNA vẫn còn nguyên vẹn (do được metyl hóa). Đưa
cDNA vào vector tạo DNA tái tổ hợp.
- Ghép cDNA đầu dính vào vector thích hợp đã được mở EcoRI và đã
khử nhóm phosphat,
- Hàn kín mạch nhờ enzyme phosphoryl hóa và enzyme ligase để tạo vector
tái tổ hợp,
- Đưa vector tái tổ hợp vào tế bào chủ và nuôi cấy trong các điều kiện thích
hợp để tạo dòng,
- Xác định dòng cần tìm và thành lập ngân hàng cDNA.
Mục đích của việc thiết lập ngân hàng cDNA là nhằm nghiên cứu sự biểu
hiện của một gen xác định cùng với những vấn đề liên quan đến sự điều hòa
biểu hiện gen cũng như mối tương tác giữa các gen trong một quá trình sống.
Chú ý: Khi phân tích kết quả thu được ngân hàng cDNA, cần chú ý tác dụng
sinh lí từng thời điểm thí nghiệm.
2. Sàng lọc ngân hàng cDNA
Một phương pháp phổ biến nhằm sàng lọc ngân hàng cDNA được bắt đầu từ
việc tạo canh trường nuôi cấy chứa đựng nhiều khuẩn lạc từ ngân hàng
cDNA. DNA plasmid từ mỗi mẻ cấy vi khuẩn gắn với mảnh nhỏ nitro-
xenlulose (màng lai) sẽ bị biến tính và lai với mRNA tổng số. Mỗi mRNA
khác nhau sẽ được lai trên nitroxelulose với thứ tự cDNA bổ sung của nó.
Các mRNA bám vào màng lọc được tách ra và dùng để tổng hợp protein mà
nó mã hóa bằng hệ thống dịch mã invitro. Protein hình thành được đem phân
tích xem có phải là sản phẩm của mRNA cần tìm hay không, và từ đó, xác
định vi sinh vật nuôi cấy chứa gen mong muốn. Sàng lọc tất cả các mẻ nuôi
cấy theo cách trên để xác định dòng đơn thể hiện gen tìm kiếm.
Ngân hàng gen (Genomic library)
Ngân hàng bộ gen của một sinh vật là tập hợp các trình tự DNA cấu thành bộ
gen được gắn vào vector, nó chỉ biểu diễn tổng số của gen. Ngân hàng này
được tạo ra từ một bộ sưu tập DNA tái tổ hợp cả các chuỗi mã hóa lẫn các
chuỗi không mã hóa. Khác với ngân hàng cDNA, ngân hàng bộ gen có thể
được thiết lập bất kỳ loại tế bào nào của sinh vật nghiên cứu.
Các bước thiết lập ngân hàng gen:
- Tách và làm sạch DNA của sinh vật
- Cắt DNA thành những đoạn có kích thước xác định bằng enzyme RE loại II
- thông thường, người ta sử dụng EcoRI,
- Vector được chọn để tạo dòng gen thường là cosmid hoặc phage λ
cũng được xử lý bởi EcoRI,
- Tạo vector tái tổ hợp và đóng gói trong vỏ phage
- Đưa vector tái tổ hợp vào tế bào chủ và tạo dòng,
- Xác định đặc tính và biểu hiện của dòng vi khuẩn vừa lập
- Tiến hành sàng lọc, nghĩa là phải tách những vector nào có đoạn DNA ưa
chuộng, từ đó xây dựng ngân hàng bộ gen.
Đặc điểm và ứng dụng:
- Ngân hàng gen chứa các đoạn DNA lớn hơn 100 lần so với cDNA.
- Giải mã thông tin di truyền chứa trong bộ gen, đặc biệt là cấu trúc intron và
exon của một gen xác định.
- Tạo dòng những trình tự DNA không mã hóa nằm cạnh các gen mã hóa và
đóng vai trò quyết định trong sự điều hòa biểu hiện của gen.