Proteomics
ả
GVHD: Th.s L u Th o Nguyên ư PHÂN TÍCH MICROVESICLES B NG KĨ THU T PROTEOMICS Ậ Ằ
Nhóm th c hi n: ệ ự L p: ĐHSH 6B ớ
ươ
ừ
ư
Danh sách nhóm 6 • T Nh Ph ng 10284811
10057141
• Bùi Th L ị ệ
10257781
• Nguy n Th Thùy Dung ị
ễ
10057121
• Hà Th Lýị
• Đinh Th M n
10055101
ị ế
• Võ Th Hòa
ị
• Đ ng Thùy M
ặ
ỵ
• Nguy n Đăng Hùng
10058681
ễ
• Ngô Ki n Phát
10058301
ế
• Võ Th C m Giang
10060401
ị ẩ
ng pháp
1.T ng quan ổ 2.Ph ươ 3.K t quế 4.Th o lu n ả
ả ậ
• Microvesicles là gì?
ọ
ượ
bào khác nhau, sinh ra t
ế
ừ ầ
h u nh t ệ
ể ậ
ộ ể
ộ
c g i là exosomes) là nh ng m nh c a Microvesicles (đôi khi đ ủ ả ữ t c các lo i t màng t bào. ạ ế ư ấ ả Microvesicles đóng m t vai trò trong vi c truy n thông tin n i bào ộ ề và có th v n chuy n mRNA và protein gi a các t bào. ế Microvesicles đã có liên quan trong quá trình c a m t hi u ng ệ ứ đ o ng
c ch ng kh i u đáng chú ý trong ung th
ượ
ả
ố
ố
ị
ố
ế
ễ
ố
ấ
ề
ạ
ộ
ệ
ồ ự ng c a các t ủ
ế
ủ ế
ạ ỏ
ể
ấ
bào.
ữ ủ ư, c ch mi n d ch kh i u, di căn, ứ ng tác kh i u ch t n n và hình t ươ thành m ch cùng v i vi c có m t vai ệ ớ trò chính trong vi c tái t o mô. Chúng ạ b t ngu n tr c ti p t màng bào ừ ế ắ bào và mang thông t ươ bào. Chúng tin kháng nguyên c a t lo i b protein misfolded, ch t đ c t ấ ộ ế bào và chuy n hóa ch t th i ra kh i ỏ ả t ế
• T ng quan
ổ
v Th nghi m kh năng c a t
ả
ệ
ử
ườ
ố
bào g c phôi ng ộ
ủ ế ợ
ấ
ằ
ấ
ạ
i (hESC) và nuôi c y b ng nguyên bào s i phôi chu t (MEF) đ s n xu t MV. ể ả ấ Chúng tôi đã tìm th y r ng hESC t o ra MV là nhi u nh t, trong ề khi phân bào MEF b b t ho t không s n xu t b t kỳ MV nào.
ấ ằ ị ấ
ấ ấ
ạ
ả
ươ
v S d ng ph ử ụ
ử ạ
ị
t o c duy trì trong
hESC đ
ượ
ủ
ng pháp proteomics đ xác đ nh các phân t ể nên các thành ph n chính c a MV t ừ ầ m t môi tr
ng tiêu chu n.
ườ
ẩ
ộ
ạ
ệ
ộ
ơ
ủ
ề
ễ
ị
ư môi tr
=> MV đ i di n cho m t c ch thông tin cho hESC, tuy nhiên, ế chúng cũng đóng vai trò nh là ch t mang ti m năng c a mi n d ch ấ và h p ch t gây b nh t ng. ấ
ườ
ừ
ệ
ợ
PH
NG PHÁP: 4 b
c chính
ƯƠ
ướ
1. Môi tr
ng nuôi c y c a hESC
ườ
ủ
ấ
2. Phân l p MV có ngu n g c t
hESC
ố ừ
ậ
ồ
3. Phân l p MV có ngu n g c t
ti u c u
ố ừ ể
ậ
ầ
ồ
ng
iườ
4. Phân tích b ng proteomics ằ
ng nuôi c y
ườ
ấ
Môi tr c a hESC ủ
ượ
• Hai dòng hESC , CCTL-12 và c nuôi trên môi ạ ự
ng b t ho t s phân bào các chu t CF- ộ
ể ừ
CCTL-14 đ tr ấ ườ t bào trung chuy n t ế 1.
ồ
Phân l p MV có ngu n g c t
ậ hESC
ố ừ
c l u gi
• Sau 1 s giai đo n c th ly tâm ạ ẫ
ụ ể ượ ư
ữ
ố và tinh s ch, m u đ ạ trong PBS
ti u c u
ồ
ậ
ố ừ ể
ầ
Phân l p MV có ngu n g c t ng
iườ
• Ti u c u c a con ng
t đ s n
c bi
i, đ
ủ
ượ
ế ể ả c s d ng song song đ ể
ườ ử ụ
ầ xu t MV, đã đ ượ ki m tra s tách protocols MV.
ể ấ ể
ự
•
Nhu m MV v i ch t k t n i màng PKH67
ấ ế ố
ớ
ộ
Phân tích b ng proteomics ằ
• S d ng ph ử ụ
ươ
ng pháp đi n di 2 chi u ệ
ề
• M u đ ẫ
ượ
ng. MALDI-TOF MS phân tích đ
c
ổ ượ
ệ
ạ
c phân tích v i song song ớ MALDI-TOF và MALDI-TOF TOF ph kh i ố l ượ th c hi n trên m t Bruker Reflex IV. Ho t ự đ ng trong ch đ ph n x tích c c. ộ
ộ ế ộ
ự
ạ
ả
ng pháp đi n di 2
ệ
ể
ợ
ợ
ể ng phân t
ẳ . ử
•
Ph ươ chi u: ề Dùng đ phân tách h n h p protein. ỗ K t h p gi a đi n di theo đi m đ ng ệ ữ đi n và điên di theo kh i l ổ ượ ẳ
ể
ệ
ệ
ọ
ẳ
ậ
ệ
ệ
ị
ệ
ế
ng phân t
ử
ị
ớ
ể
ệ
ủ
ệ
ấ ớ
ể
ế
ạ
ủ
ậ
ằ
ọ
ượ
ử
protein đã đ ộ
ể
ẽ ng t
ườ
ự
ế ệ Đi n di theo đi m đ ng đi n hay còn g i là đi n di t p trung đ ng đi n (gradient pH). Trong dung d ch đ m có pH bi n thiên liên t c, các protein s ẽ ụ ph Đi n di theo kh i l ổ ố ượ ệ phân ly đ n v trí t ng thích v i đi m ươ ế bi n là SDS-PAGE, SDS cho phép ế đăng đi n c a mình. protein có kh i phân ly các phân t ố ử ng khác nhau, SDS có đi n tích l ượ âm r t l n và có kh năng liên k t v i ế ớ ả m ch peptide đ bi n tính các c u ấ trúc b c hai và b c ba c a protein ậ b ng cách b c xung quanh khung polypeptide. Khi cho dòng đi n đi ệ c b c qua, phân t ọ SDS s chuy n đ ng trong đi n ệ tr c c (-) sang c c (+) và ừ ự phân tách theo kh i l
ng
ố ượ
ng pháp ph kh i
ố
ổ
ậ ụ
ằ ợ
ỹ
ự
ờ
ể
ớ ớ
ằ
ị ị
ị
ố
ổ
ầ
ẫ
ộ
ỉ
ủ ề ự
ắ
ờ
ự ộ
Ph ươ ngượ : l MALDI laser :“Matrix-assisted desorption/ionization”, là k thu t ion hóa ỹ b ng ph ng pháp kh h p ph laser h ỗ ử ấ ươ tr matrix. TOF :“Time-of-flight” là k thu t phân ậ tách các ion d a trên th i gian bay. Autoflex ki u TOF/TOF m i cho phép xác đ nh protein v i s l ng l n b ng cách xác ớ ố ượ ng các peptit, sau đó là đ nh đ nh kh i l ố ượ danh protein s d ng phép đo kh i ph kép ử ụ MALDI-TOF/TOF. Thông tin đ y đ v m u đo ch trong m t kho ng th i gian c c ng n (trong vòng vài ả giây).
ế
ử ụ ấ
ng d ng
ụ
ọ
ủ
ề
ệ
ể ạ
ẫ
ồ
T đ ng hoàn toàn t k Autoflex TOF/TOF s d ng thi ế MALDI-TOF năng su t cao cho các trong sinh h c công ứ nghi p.ệ Autoflex TOF/TOF tích h p công ợ ngh b n quy n Anchorchip c a ả Bruker Daltonics đ t o m u đ ng nh t và có v trí chính xác. ị
ấ
•
ế c nuôi d ề ệ màng t ượ
ẩ ồ ố ừ hESC đ ậ ừ ộ ớ
.
K t qu : ả ế bào c a hESC S n xu t MV có ngu n g c t ủ ả ấ i đi u ki n MV phân l p t ướ tiêu chu n trên m t l p feeder MEF s không b ị ẽ nhi m MV t
ễ ừ
ộ
ng hESC đ ầ ậ
ể ả ế ế ả
ị c gi ượ ằ i phóng t ự
ừ ậ ứ ầ
ứ c cô l p b ng ly tâm ằ ượ ằ bào này. Đ gi ớ ộ ế ượ ủ ồ ủ
ứ ớ ệ ấ
MEF • Qua vi c đo n ng đ protein trong MV mà có ch a ồ ệ ph n nh môi tr ở ườ ỏ 40 000 đv , chúng tôi xác đ nh r ng 3.2390.32 mg / ml ị các t MV đã đ i quy t kh năng r ng s phân l p c a MV v i đ ly tâm này là ủ ả không đ y đ , tăng m c đ ly tâm đ n 100 000 đv ị ộ .Tuy nhiên, n ng đ protein c a MV đ c phân l p v i ớ ậ ộ t đáng giao th c này là 3.2690mg / ml thì không khác bi ệ k so v i nghi m th c đ u tiên,cho th y c ng đ ly ộ ườ ầ ứ ể tâm th p h n là đ đ cô l p MV m t cách th a đáng. ỏ ậ ủ ể ấ ơ ộ
ể
ấ bào ly tâm t
ạ ế ườ
ế ạ
ượ ổ
ồ ề ẫ
ườ ễ ấ
ộ ủ ỏ ằ ồ
i k t qu cho th y: Ki m tra l ả ng không có t i 100 • Khi trong môi tr c n ng đ c a protein t ng s là 000 đv , thu đ ộ ủ ố ị 3.0290.31 mg /ml. Đi u này ch ra r ng các m u đã b ỉ ị ằ ng nuôi c y, ô nhi m cao v i các protein t môi tr ừ ớ ch ng t r ng n ng đ c a MV trong đi u ki n môi ệ ề ứ tr ườ
• Sau đó lo i b các protein gây ô nhi mt
ng hESC ch kho ng 0,2 mg / ml. ả ỉ
ườ
ớ ằ ạ ỏ ử
ở 40 000g ho c 100 000 g đ ặ ễ ừ ị ẫ ượ ử
ị
ổ ử
ộ ằ ậ ế
môi tr ng c b ng cách r a v i PBS. Trong các m u b cô l p đ ượ ậ ly tâm c r a hai l n v i ớ ầ 10 ml dung d ch PBS, n ng đ protein t ng s là ố ồ 0.290.1 mg / ml (N010), ch ra r ng PBS r a lo i b ạ ỏ ỉ c protein gây ô nhi m và xác nh n các k t qu tr ả ướ ễ đây c a chúng tôi. ủ
tích
Phân Proteomics
ớ ề ấ
ộ
ư
cho ặ ề
các t ố ừ
ệ ằ ớ
ữ
• Hòa tan MV tách sang 2- DE. Đi u này phân tích cho th y ph n l n các ầ protein có đ linh đ ng ộ đ c tr ng c a albumin. ủ th y Đi u này ấ protein có th có ngu n ồ ể bào n p có g c t ạ ế liên quan ch t ch v i ẽ ớ ặ các ph n MV có ngu n ồ ầ ng hESC. S l g c t ố ượ ố ừ l n albumin có th can ể ớ thi p v i 2-DE b ng tách ly protein, nh ng đi m ể c tìm trên b n gel đã đ ả th y đ bi u di n cho s ự ễ ể ể
ượ
ấ
phân tán albumin.
ộ
ẩ ạ
ớ
ộ
ế
ượ
ộ
ấ
́ ế
ả ỉ
ồ
ườ
ụ
ố
ậ
ừ
ượ
ớ
ượ
150 đ n 300 nm.
ể
ở ự ế ộ
ủ
Hình 1. hESC đ
c t o ra b i MV r t nhi u.
ượ ạ
ề
ấ
ở
ầ
ượ
c ướ c nhu m màu v i ớ i (B) và (D)
ạ
(A) khu n l c c a hESC nhu m ủ màu v i PKH67 (màu xanh lá c nhu m bào đ cây). Nhân t v i DAPI (màu xanh). S không ớ ự đ ng nh t, b ng nhu m co v t ồ lâm châm ch ra r ng hESC có ằ ngu n g c khác th ng có tác ố d ng ngăn s h p nh t c a ự ấ ủ ợ thu c nhu m v i màng t bào. ế ớ ộ (B) MV đ u tiên có ngu n g c t ố ừ ồ ầ c phân l p t hESC đ CM, ượ c c đ nh trên kính hi n vi và đ ể ố ị dán nhãn v i PKH67. Đ ng ườ c đo i thi u là 200 MV đ kính t ể ố và tìm th y t ấ ừ ế (C) ti u c u nhu m màu v i ớ ầ ộ PKH67 sau khi c m ng b i m t ộ ả ứ l ng canxi. L u ý s k t h p ượ ợ ư đ ng nh t c a ch t nhu m so ấ ấ ồ v i các c m hESC. ụ ớ (D) MV đ b i ti u c u mà tr ổ ở ể đây đã đ ộ PKH67. Hình vuông t cho th y ki m soát âm tính. ể
ấ
́ ́
ể ướ
hESC có ồ ố ừ
hESC kích ồ ố ừ
Ả ộ ố ướ ộ ố c t ướ ừ ế
i kính hi n vi Hình 2. nh d (A) M t s hình c a các MV có ngu n g c t ủ c 150-1200 nm. kích th (B) M t s hình c a các Mv có ngu n g c t ủ th 50 đ n 100 nm. Thanh 1000 nm (A) và 100 nm (B).
