CÁC PHẢN ỨNG SINH HÓA

1. KIỂM TRA KHẢ NĂNG LÊN MEN CARBOHYDRATE

1.1. Nguyên tắc: Xác định khả năng lên men của vi sinh vật đối với

nguồn carbohydrate cụ thể (Glucose, Lactose, Xylose…) kết hợp

với môi trường kiểm tra khả năng sinh acid hoặc sinh acid và sinh

hơi.

1.2. Sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men carbohydrates:

các loại acid như: lactic acid, acetic acid,…, •

một vài loại rượu như: ethyl alcohol…, •

Xêton •

• và hai loại hơi là: carbon dioxide, hydrogen.

1. KIỂM TRA KHẢ NĂNG LÊN MEN CARBOHYDRATE

1.3. Môi trường: Carbohydrate fermentation broth

Chứa 3 thành phần căn bản:

(cid:190) (0.5 - 1.0)% carbohydrate kiểm tra (ví dụ: lactose hoặc

glucose…),

(cid:190) Chất chỉ thị pH (Xem phần 1.4).

(cid:190) Môi trường dinh dưỡng để hầu hết các vi sinh vật có thể tăng trưởng dù vi sinh vật đó có khả năng lên men đường hay không.

1. KIỂM TRA KHẢ NĂNG LÊN MEN CARBOHYDRATE

1.4. Chất chỉ thị pH:

pH acid

pH kiềm

Thành phần hóa học

Chất chỉ thị pH

pH môi trường

Andrade’s

5.0 - hồng

8.0 – vàng nhạt

Acid fuchsin

7.2 – không màu

6.3 –tím

5.2 - vàng

6.8 - tím

Bromcresol purple

Dibromo-o- cresolsulfonphthalein (C21H16O5SBr2)

6.0 - vàng

7.6 – Xanh đậm

Dibromophenolsulfonphthalein (C27H28O5SBr2)

Bromthymol blue

7.0 – xanh lá cây

Methyl red

5.0

4.4 - đỏ

6.0 - vàng

Neutral red

7.5

6.8 - đỏ

8.0 - vàng

Phenol red

7.9

6.8 - vàng

8.4 – đỏ hồng nhạt

4’ – Dimethylaminoazobenzene- 2-carboxylic acid (C15H15N3O2) 2- Methylamiophenazine (C15H17N4Cl) Phenolsulfonphthalein (C19H14O5S)

2. MÔI TRƯỜNG KLIGLER’S IRON AGAR (KIA)/ MÔI TRƯỜNG TRIPLE SUGAR IRON AGAR TESTS (TSI)

2.1. Nguyên tắc: Xác định khả năng sử dụng nguồn carbohydrate cụ thể kết hợp với môi trường tăng trưởng căn bản, có hoặc không có sinh hơi và hydrogen sulfide (H2S).

2.2. Môi trường

KIA

TSI

•1% Lactose

•1% Lactose

1% Sucrose

• 0.1% Glucose

• 0.1% Glucose

Chất chỉ thị pH: Phenol red

2.3. Sinh hóa

n ê i h g N

β - Galactosidase

Glucose + Galactose

Lactose

Đáy

lactose •• SSửử ddụụngng lactose

Chu trình Krebs

Glucose hay Galactose

CO2 + H2O + năng lượng

Hiếu khí

•• SSửử ddụụngng glucose ( nghiên)) glucose (điđiềềuu kikiệệnn hihiếếuu khkhíí -- mmặặtt nghiên

2. MÔI TRƯỜNG KLIGLER’S IRON AGAR (KIA)/ MÔI TRƯỜNG TRIPLE SUGAR IRON AGAR TESTS (TSI)

2. MÔI TRƯỜNG KLIGLER’S IRON AGAR (KIA)/ MÔI TRƯỜNG TRIPLE SUGAR IRON AGAR TESTS (TSI)

Con đường Embden-Meyerhof

Glucose hoặc Galactose

Kỵ khí

Các acid hữu cơ Các aldehyde Các loại rượu CO2 + H2 Năng lượng

•• SSửử ddụụngng glucose ( glucose (điđiềềuu kikiệệnn kkỵỵ khkhíí –– đđááyy) )

Con Con đưđườờngng Embden

Meyerhof Embden--Meyerhof

2. MÔI TRƯỜNG KLIGLER’S IRON AGAR (KIA)/ MÔI TRƯỜNG TRIPLE SUGAR IRON AGAR TESTS (TSI)

Peptone

Ammonia (NH3) (cid:198) Kiềm

Hiếu khí Kỵ khí

•• Không Không lênlên men lactose glucose men lactose vvàà glucose

Vi khuẩn (môi trường acid) + Sodium thiosulfate

H2S gas

Sắt sulfide

(không tan tạo tủa màu đen)

H2S + ion sắt

•• SinhSinh hydrogen sulfide (H hydrogen sulfide (H22S)S)

2. MÔI TRƯỜNG KLIGLER’S IRON AGAR (KIA)/ MÔI TRƯỜNG TRIPLE SUGAR IRON AGAR TESTS (TSI)

• Màu vàng: glucose dương tính (lên men glucose)

• Màu đỏ/không đổi màu: glucose âm tính (không lên men glucose)

• Màu đen: sinh H2S

• Vỡ thạch: sinh hơi từ glucose

2.4. Đọc kết quả Đáy ống nghiệm

Mặt nghiên:

• Màu vàng: lactose và/hoặc sucrose dương tính (lactose và/hoặc sucrose

được sử dụng)

• Màu đỏ/không đổi màu: lactose và sucrose âm tính (lactose và sucrose

không được sử dụng)

3. DECARBOXYLASE TEST (LTSINE-ORNITHINE-

ARGININE) VÀ DEHYDROLASE TEST (ARGININE)

3.1. Decarboxylase test (lysine-ornithine-arginine).

3.1.1. Nguyên tắc:

Sử dụng để phát hiện vi khuẩn sinh các ezyme decarboxylase, các

enzyme này tương tác với các amino acid có gốc carboxyl (-

COOH) ở cuối, tạo thành amine hay diamine và carbon dioxide (CO2).

3. DECARBOXYLASE TEST (LTSINE-ORNITHINE-

ARGININE) VÀ DEHYDROLASE TEST (ARGININE)

R-CH2-NH2 (amine)

Kiềm

+ CO2

R-CH-NH2-COOH (amino acid)

hoặc 2HN-R-NH2 (diamine)

Chỉ thị pH Bromcresol purple

Lysine decarboxylase

L-Lysine

Cadaverine (diamine) + CO2

-CO2

Ornithine decarboxylase

L- Ornithine

Putrescine (diamine) + CO2

-CO2

Cadaverine và Putrescine ổn định khi được tạo ra dưới điều kiện kỵ khí vì

thế vi khuẩn phải được nuôi cấy trong điều kiện kỵ khí bằng cách phủ một lớp

paraffin hay dầu khoáng lên trên bề mặt môi trường.

3.1. Decarboxylase test (lysine-ornithine-arginine). 3.1.2. Cơ sở sinh hóa:

3. DECARBOXYLASE TEST (LYSINE-ORNITHINE-

ARGININE) VÀ DEHYDROLASE TEST (ARGININE)

Urease

Agmatine

Putrescine + Urea

2NH3 + CO2

3.2. Arginine decarboxylase test và arginine dehydrolase test. Cơ sở sinh hóa: L-arginine được sử dụng bởi hai hệ thống xảy ra đồng thời hoặc riêng lẽ. Hai con đường đó là:

ureoehydrolase

Agmatine y la s e

x

o

L-Arginine

A

e A r g i n i n e c a r b

d

r

d

e

h

g i n i n

y

e

d

r

2NH3

Citrulline

o l a

CO2

s

e L-Citrulline +

CO2

ureidase

Putrescine

NH3

L-Ornithine

Nếu chỉ thị pH thay đổi sang kiềm nhanh và mạnh thì đó là do hệ thống arginine dehydrolase phân hủy arginine.

3. DECARBOXYLASE TEST (LYSINE-ORNITHINE-

ARGININE) VÀ DEHYDROLASE TEST (ARGININE)

3.3. Môi trường:

– Decarboxylase Basal medium

– pH=6.0

– Bromocresol purple

3.4. Đọc kết quả:

– Kiểm tra dương tính: màu tím đục tới màu tím nhạt (sinh

cadaverine)

– Kiểm tra âm tính: màu vàng sáng, trong (chỉ glucose được lên

men)

4. INDOLE TEST

4.1. Nguyên tắc: phát hiện khả năng oxi hóa tryptophan thành các dạng của indol: Indole, Skatole (methyl indole) và indole-acetate

4.2. Môi trường: Tryptophan hoặc peptone broth

4.3. Thuốc thử: Kovacs’s

Tryptophanase

Indole + Pyruvic acid + NH3

L-Tryptophan + H2O

HCl, alcohol

+ Indole

P-Dimethylamino- benzaldehyde (DMABA)

Red color

(Thuốc thử Kovacs)

Warmed condensation

Phản ứng:

4.4. Đọc kết quả. – Dương tính: xuất hiện vòng màu đỏ trên bề mặt môi trường. – Âm tính: màu vàng (màu của thuốc thử Kovacs’s)

5. UREASE TEST

5.1. Nguyên tắc: sử dụng để phát hiện khả năng phân cắt urea thành ammonia do hoạt tính của urease từ vi sinh vật và kết quả là môi trường bị kiềm hóa do NH3 được tạo ra. 5.2. Môi trường: Urea broth (hoặc Urea agar)

Urease

H2N

CO2 + H2O+2NH3 ↔ (NH4)2CO3

+ 2 HOH

C=O

Phenol red

H2N Urea

5.3. Phản ứng:

5.4. Đọc kết quả.

– Dương tính: môi trường có màu hồng

– Âm tính: môi trường không đổi màu (vàng cam)

6. METHYL RED (MR) TEST

6.1. Nguyên tắc: kiểm tra khả năng tạo và duy trì acid được tạo ra từ

quá trình lên men glucose của vi sinh vật.

6.2. Môi trường: MR-VP Broth.

6.3. Thuốc thử: chỉ thị pH Methyl

6.4. Phản ứng:

(-)

(+)

2 Glucose + H2O (cid:198) 2 Lactic acid + acetic acid + ethanol + 2 CO2 + 2H2

(Formic acid (cid:198) H2+CO2)

6.5. Đọc kết quả:

– Dương tính: môi trường chuyển màu đỏ (pH=4.4)

– Âm tính: môi trường không đổi màu (pH=6.0)

7. VOGES-PROSKAUER (VP) TEST

7.1. Nguyên tắc: Xác định khả năng sinh acetylmethylcarbinol

(acetoin) trong quá trình lên men glucose của một số vi sinh vật.

7.2. Môi trường: MR-VP Broth.

7.3. Thuốc thử:

- Naphtol, (chất tăng cường màu)

- KOH 40%, (chất oxi hóa)

Glucose + ½ O2 (cid:198) 2,3-butanediol + H2O + 2 CO2

Oxi hóa

Acetoin

2,3-butanediol

2,3-butanediol dehydrogenase

7.4. Phản ứng:

Diacetyl

Acetoin + α - Naphthol

40%KOH O2 (oxidized)

Diacetyl + Guanidine nucleus

Màu đỏ hồng nhạt

(Thuốc thử O’Meara and Coblentz)

7. VOGES-PROSKAUER (VP) TEST

7.4. Đọc kết quả:

– Dương tính: Màu đỏ - hồng nhạt trên bề mặt môi trường (có

acetoin)

– Âm tính: Màu vàng trên bề mặt môi trường (như màu của thuốc

thử)

8. MALONATE TEST

8.1. Nguyên tắc: Xác định khả năng sử dụng sodium malonate là nguồn carbon duy nhất cùa vi sinh vật và kết quả là tạo môi trường kiềm.

8.2. Môi trường: Malonate broth.

8.3. Thuốc thử: Bromthymol blue – chất chỉ thị pH

Succinic dehydrogenase

Fumaric acid

(Enzyme-E)

Succinic acid (Cơ chất - S)

E + S

Phức ES

E + P (sản phẩm)

Bị khóa bởi malonate

8.4. Phản ứng:

Pyruvate

Acetyl CoA

Oxaloacetate

cis-Aconitate

Malate

Citrate

Fumarate

Isocitrate

8. MALONATE TEST

Succinate

α - ketoglutarate

Malonate ức chế phản ứng

Phá vở tạm thời chu trình Krebs (cid:198) Không có khả năng tăng trưởng trừ khi vi sinh vật có thể sử dụng malonate là nguồn carbon duy nhất.

ChuChu trtrììnhnh KrebsKrebs

8. MALONATE TEST

8.5. Đọc kết quả:

– Dương tính: Màu xanh dương đậm (kiềm)

– Âm tính: Màu xanh lá cây

9. CITRATE TEST

9.1. Nguyên tắc: Xác định khả năng sử dụng citrate như là nguồn carbon duy nhất trong quá trình biến dưỡng của vi sinh vật.

9.2. Môi trường: Simmons citrate medium.

9.3. Thuốc thử: Bromthymol blue – chất chỉ thị pH

Citrate (cid:198) oxalacetate + acetate

Oxalacetate (cid:198) Pyruvate + CO2

Phản ứng:

pH kiềm

Pyruvate (cid:198) acetate + formate

pH acid

2 pyruvate (cid:198) acetate + CO2 + lactate

2 pyruvate (cid:198) acetoin + 2CO2

9. CITRATE TEST

9.4. Cơ sở sinh hóa: Môi trường có chứa muối ammonium vô cơ.

Vi sinh vật có khả năng sử dụng citrate làm nguồn Carbon duy

nhất thì có khả năng sử dụng muối Amonium làm nguồn Nitơ và sinh NH3 làm môi trường trở nên kiềm.

9.5. Đọc kết quả:

– Dương tính: Màu xanh dương đậm (kiềm)

– Âm tính: Màu xanh lá cây

10. POTASSIUM CYANIDE TEST

10.1. Nguyên tắc: Xác định khả năng sống và tái sinh của vi sinh

vật trong môi trường chứa potassium cyanide.

10.2. Môi trường: KCN broth.

10.3. Cơ sở sinh hóa:

- Hầu hết các vi sinh vật hiếu khí đều có enzyme cytochrome

oxidase, nhờ enzyme này mà vi sinh vật sử dụng oxygen là chất

nhận điện tử cuối cùng để khử oxygen phân tử thành hydrogen peroxide (H2O2)

- Vi sinh vật kỵ khí không có khả năng sống khi có sự hiện diện

của oxygen trong không khí vì không có hệ thống cytochrome

oxidase.

10. POTASSIUM CYANIDE TEST

– Ion cyanide (CN-) có thể ức chế quá trình hô hấp, quá trình ức chế xẩy ra trên hệ thống cytochrom. Cyanide là chất ức chế cytochrome oxidase.

– Một vài vi sinhvật hiếu khí không nhạy với cyanide, chúng có khả năng kháng với chất ức chế khi chúng có hệ thống hô hấp flavoprotein hoặc cyanide-insensitive khử diphosphopyridine nucleotide (DPNH) và triphosphopyridine nucleotide (TPNH) oxidases.

10.4. Đọc kết quả:

– Dương tính: Tăng trưởng trên môi trường nuôi cấy (gây đục)

– Âm tính: Không tăng trưởng (trong)

11. OXIDASE TEST

10.1. Nguyên tắc: Xác định sự hiện diện của enzyme oxidase

(cytochrome oxidase system).

10.2. Thuốc thử: p-phenylenediamine.

Cytochrome-Fe++

+ e-

Cytochrome-Fe+++

(chất bị khử - đã nhận điện tử) (Sắt (II)

(chất bị oxi hóa – đã mất điện tử) (Sắt (III))

2 cytochrome c bị oxi hóa

2 cytochrome c bị khử + 2 H + + ½ O2

Cytochrome oxidase

+ H2O

bị oxi hóa

2 cytochrome c bị oxi hóa + thuốc thử

Hợp chất có màu (xanh indophenol)

10.3. Cơ sở sinh hóa:

11. OXIDASE TEST

11.5. Đọc kết quả:

– Dương tính: Màu xanh

– Âm tính: Không đổi màu khuẩn lạc

12. STRING TEST

Giống như phản ứng nhuộm gram, string test dựa trên sự khác nhau về

cấu trúc hóa học của vách tế bào. Vách tế bào của vi khuẩn gram âm

dễ vỡ khi tiếp xúc với dung dịch kiềm. String test bước đầu có thể

String test dương tính

Màng tế bào

phân loại được vi khuẩn gram âm và gram dương.

13. KIỂM TRA LÀM TAN CHẢY GELATIN

13.1. Nguyên tắc: Xác định khả năng sinh enzyme gelatinase làm tan chảy môi trường gelatine. Biến dưỡng protein bởi enzyme gelatinase có hai bước và kết quả là tạo hổn hợp các amino acids riêng lẽ.

Gelatinases

13.2. Môi trường: Nutrient gelatin stab medium

Polypeptides

Protein (gelatin) + H2O

Proteinase

Gelatinases

Các amino acid riêng lẽ

Polypeptides + H2O

Peptidase

Phản ứng:

Chú ý: Gelatin ở dạng rắn khi ủ ở 200C hoặc thấp hơn và dạng lỏng khi ủ ở 350C hoặc lớn hơn. Gelatin chuyển từ dạng (trạng thái rắn) thành dạnh lỏng khi ủ ở 280C. Vì thế, nếu ống gelatin được ủ ở 350C hoặc lớn hơn thì chúng phải được đặt vào tủ lạnh hay tủ mát trước khi đọc kết quả.

13. KIỂM TRA LÀM TAN CHẢY GELATIN

13.3. Đọc kết quả:

– Dương tính: Tan chảy môi trường

– Âm tính: môi trường ở dạng rắn (không tan chảy)

14. KIỂM TRA KHỬ NITRATE

14.1. Nguyên tắc: Xác định khả năng khử nitrate thành nitrite hoặc

sinh hơi nitrogen tự do của vi sinh vật.

14.2. Môi trường: Nitrate broth 14.3. Thuốc thử:

Thuốc thử A: - α-Naphthylamine

- Dimethyl-α-naphthylamine

Thuốc thử B: Sulfanilic acid

Nitratase

- + 2 e- + 2 H+

NO3

NO2

- + H2O

(Nitrate)

(Nitrite)

- + 10 e- + 12 H+

Nitratase

2NO3

N2+ 6 H2O

(Nitrate)

Sulfanilic acid (không màu) + HNO2 (cid:198) sulfanilic acid bị diazo hóa + H2O

Phản ứng:

Kết hợp

+ H2O

+ α – Naphthylamine (không màu)

sulfanilic acid bị diazo hóa (không màu)

p-Sulfobenzene-azo- α-naphthylamine (màu đỏ)

14. KIỂM TRA KHỬ NITRATE

-

Bột kẽm

- (Nitrite)

NO2

NO3 (Nitrate)

Vì sulfanilic acid bị diazo hóa có thể bị gãy thành dẫn xuất của hydroxy – azo hoặc nitrate bị khử thành N2, hiện tượng không có màu có thể xảy ra, do đó khẳng định kiểm tra này bằng cách bổ sung bột kẽm vào.

GiaiGiai đođoạạnn 22: Khử kẽm

• Dương tính: không hình thành màu.

( 1-2) phút

• Âm tính: màu hồng tới đỏ đậm trong

• Âm tính: không màu

(5-10) phút

14.4. Đọc kết quả: GiaiGiai đođoạạnn 1:1: • Dương tính: có màu đỏ đậm trong

15. THỬ NGHIỆM CATALASE

15.1. Nguyên tắc: Phát hiện enzyme catalase của vi sinh vật, catalase thủy phân hydrogen peroxide (H2O2) thành H2O và O2.

15.2. Thuốc thử: hydrogen peroxide (H2O2) 30%

15.3. Tiến hành:

Dùng que cấy lấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc thuần đặt lên một phiếm kính sạch. Nhỏ một giọt H2O2 30% lên sinh khối vi sinh vật trên phiếm kính, ghi nhận sự sủi bọt nếu có.

15.4. Đọc kết quả:

- Dương tính: Sủi bọt (do O2)

- Âm tính: không sủi bọt

16. THỬ NGHIỆM COAGULASE

16.1. Nguyên tắc: Phát hiện vi sinh vật có sinh enzyme coagulase, coagulase có tác dụng làm ngưng kết các thành phần của huyết tương tạo thành các khối đông huyết tương.

16.2. Thuốc thử: Huyết tương thỏ 16.3. Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 0,5 mL huyết tương thỏ không pha loãng, bổ

sung 0,5 mL dịch nuôi cấy chủng thuần hoặc một lượng lớn sinh khối khuẩn lạc.

Xoay nhẹ ống để trộn đếu vi sinh vật. Ủ ống nghiệm ở 370C trong 4h. Quan sát sự ngưng kết mỗi 30 phút. 16.4. Đọc kết quả:

- Dương tính: có sự kết tụ huyết tương - Âm tính: không có sự kết tụ

17. THỬ NGHIỆM CAMP

17.1. Nguyên tắc: Phản ứng CAMP là phản ứng phối hợp giữa nhân tố protein tiết ra bởi vi sinh vật với nhân tố β-hemolysin tiết ra bởi chủng Staphylococcus aureus gây ra hiện tượng làm tan hồng cầu của cừu trên môi trường thạch máu. Nhân tố CAMP có vai trò tăng cường hoạt tính phospholipase C xúc tác thủy phân thành phần chủ yếu của mảng hồng cầu cừu là sphingomyelin của β-hemolysin.

Trong thử nghiệm CAMP, cấy chủng kiểm nghiệm cùng với chủng

Staphylococcus tạo nhiều β-hemolysin lên môi trường thạch máu được bổ sung máu cừu.

17.2. Môi trường: Blood agar

17.3. Chủng chuẩn: Staphylococcus aureus

17. THỬ NGHIỆM CAMP

17.4. Tiến hành:

17.5. Đọc kết quả:

- Dương tính: có sự hình thành vùng cộng

hưởng tan huyết tại vùng tiếp giáp giữa hai

đường cấy của L.monocytogenes và

S.aureus.

18. THỬ KHẢ NĂNG DI ĐỘNG

18.1. Nguyên tắc: Dựa vào sự quan sát khả năng tăng trưởng và di

động của vi sinh vật trong môi truờng thạch.

18.2. Môi trường: Môi trường thạch mềm chứa 0,5% agar.

18.3. Tiến hành:

Dùng que cấy thẳng thu lấy sinh khối từ khuẩn lạc thuần, cấy đâm sâu

xuyên vào giữa môi trường trong ống nghiệm chứa môi trường thạch mềm. Ủ ở nhiệt độ thích hợp.

18.4. Đọc kết quả:

- Dương tính: vi sinh vật mọc lan

khỏi đường cấy và làm đục môi trường xung quanh.

- Âm tính: vi sinh vật chỉ mọc quanh đường cấy trong khi môi trường xung quanh vẫn trong.