PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH DẤU ACID NUCLEIC

B CÔNG TH

TR

ƯỜ

Ộ Ạ Ọ

NG Ệ

Ồ

ƯƠ NG Đ I H C CÔNG NGHI P TP. H CHÍ MINH Vi n: Công Ngh Sinh H c và Th c Ph m ọ

ự

ệ

ẩ

ộ

B môn: Hóa sinh đ ng v t ậ 

GVHD: Th.S Tr n H ng B o

ồ

ầ

ả

Quyên

DANH SÁCH NHÓM DANH SÁCH NHÓM

TT H TÊN SINH VIÊN Ọ

1 Tr ươ ng Văn Hi n ề

2 Nguy n Xuân Giang ễ

3 Hoàng Th L c ị ộ

4 Tr ng Th Thúy Nga ươ ị

5 Mai Nguy n B o Ngân ễ ả

6 Bùi Th ị H ng Ng c ọ ồ

7 Nguy n Ki u Oanh ễ ề

Ộ

ỘN I DUNG CHÍNH N I DUNG CHÍNH

ụ

ươ

I. M c đích đánh d u ấ II. Tác nhân đánh d uấ ng pháp đánh d u III. Ph ấ IV. Các enzyme tham gia

I. M C ĐÍCH ĐÁNH D U I. M C ĐÍCH ĐÁNH D U

Ụ Ụ

Ấ Ấ

ử ể

ạ ệ

ắ ặ

ủ

đ xác nh n s T o m u dò cho lai phân t ậ ự ẫ đ c hi u c a sinh v t hi n di n c a y u t ệ ủ ế ố ặ ậ ệ ủ đích d a vào đ c tính b t c p b sung c a ổ ặ ự acid nucleic.

Ị

II. TÁC NHÂN ĐÁNH D UẤ II. TÁC NHÂN ĐÁNH D UẤ Ằ

Ạ

ị

ươ ườ

ườ ng cao. Vi c phát hi n các m u dò

ng pháp đánh d u b ng đ ng v phóng ồ ằ 32P, 35S, 3H phát ra tia i ta th ượ

ệ

c ti n hành nh kĩ thu t phóng x t

ẫ ghi.

2.1. B NG Đ NG V PHÓNG X Ồ 2.1.1. Nguyên t c làm vi c ệ ắ V i ph ấ ớ ng dùng x , ng ạ Beta năng l ệ đ ượ ế

ạ ự

ậ

ờ

Ạ

Ị c đi m ể

ờ

ớ

Nh

ượ

ỏ ủ

 Có h i cho s c kh e c a con ng  Đòi h i nhi u bi n pháp an toàn, t n kém trong thao

i ườ ố

ệ

ử

ấ

ả

II. TÁC NHÂN ĐÁNH D UẤ II. TÁC NHÂN ĐÁNH D UẤ 2.1. B NG Đ NG V PHÓNG X Ồ Ằ 2.1.2. u – nh ượ Ư  u đi m Ư ể :  Có đ nh y cao ộ ạ  Cho tín hi u m nh v i th i gian ph i sáng ng n ắ ạ ệ ể : c đi m ứ ạ ề ỏ tác và x lí ch t th i.  Các m u dò không dùng đ

c trong th i gian dài do

ượ

ẫ

ờ chu kì bán rã c a các đ ng vi phóng x . ạ

ủ

ồ

NG PHÁP HÓA H C

Ọ

ộ

ượ ắ ộ

ả ứ

c g n vào DNA nh ph n ng hóa

ượ ắ

ả ứ

c t ng h p t

ờ nh ng nucleotide ợ ừ ữ

ượ ổ

II. TÁC NHÂN ĐÁNH D UẤ II. TÁC NHÂN ĐÁNH D UẤ 2.2. B NG PH ƯƠ Ằ 2.2.1. S d ng avidine – biotine: ử ụ Avidine đ c g n v i m t nhóm phát huỳnh ớ quang hay m t enzim xúc tác cho ph n ng t o ạ màu. Biotine đ h c ho c DNA đ ặ ọ có g n biotine

ắ

NG PHÁP HÓA H C

Ọ

ử ụ

lai đ

ử

ng. K t qu là nh ng tín hi u màu nh n đ

ậ ượ

ữ

ệ

II. TÁC NHÂN ĐÁNH D UẤ II. TÁC NHÂN ĐÁNH D UẤ 2.2. B NG PH ƯƠ Ằ 2.2.1. S d ng avidine – biotine: Sau đó, biotine hi n di n trong phân t c ượ ệ ệ phát hi n khi cho ligand c a nó là avidine vào ph n ệ ả ủ ả ế ứ trên màng lai.

ƯƠ ự

ấ

ẫ

ầ

ộ ơ ấ ủ

ế

ả

ẽ

ả

II. TÁC NHÂN ĐÁNH D UẤ II. TÁC NHÂN ĐÁNH D UẤ 2.2. B NG PH NG PHÁP HÓA H C Ọ Ằ 2.2.2. D a trên s phát quang sinh h c: ọ ự Đ u tiên m u dò đ c đánh d u b ng peroxidase ằ ượ Sau đó cho ti p xúc v i m t c ch t c a ớ peroxidase có kh năng phát sáng khi b bi n đ i. ổ ị ế Ánh sáng s phát sáng lên phim và k t qu thu ế nh n là nh ng ch m trên phim.

ữ

ậ

ấ

NG PHÁP HÓA H C

Ọ

ƯƠ ượ

c đi m: ể

ỏ ủ

ườ

ứ

ạ

đ nh y kém ộ ạ

Nh

II. TÁC NHÂN ĐÁNH D UẤ II. TÁC NHÂN ĐÁNH D UẤ 2.2. B NG PH Ằ 2.2.3. u – nh Ư  u đi m: Ư ể  Không gây h i cho s c kh e c a con ng  Ít t n kém ố c đi m: ể ượ

III. PH III. PH

ƯƠ ƯƠ

NG PHÁP DÁNH NG PHÁP DÁNH D UẤD UẤ

3.1. PH

NG PHÁP NICK – TRANSLATION

ƯƠ

III. PH III. PH

ƯƠ ƯƠ

NG PHÁP DÁNH NG PHÁP DÁNH D UẤD UẤ

3.2. PH

NG PHÁP RANDOM PRIMING

ƯƠ

III. PH III. PH

ƯƠ ƯƠ

NG PHÁP DÁNH NG PHÁP DÁNH D UẤD UẤ NG PHÁP ĐÁNH D U CÁC

Ấ

ƯƠ

3.3. PH OLIGONUCLEOTIDE

III. PH III. PH

ƯƠ ƯƠ

NG PHÁP T O M U DÒ RNA

3.4. PH

NG PHÁP DÁNH NG PHÁP DÁNH D UẤD UẤ Ạ

Ẫ

ƯƠ

(a)G n DNA vào vùng PCS ắ

(b)C t plasmid v trí ngay sau

ắ ạ

ở ị đo n gene (so v i promoter ớ đ nh s d ng), t o d ng th ng ẳ ạ ạ ị ử ụ

ự

(c)Thêm SP6 ho c T7 RNA pol và ặ các nucleotide t do, trong đó có 1 lo i nucleotide đánh d u ạ ấ

(d)Ch n l ấ

đánh d u i các phân t ử c mong và kích th ướ ự

ọ ạ có trình t mu nố

ạ

ạ ỗ ứ ậ ấ

ạ ạ ẫ ể

IV. CÁC ENZYME THAM GIA IV. CÁC ENZYME THAM GIA DNAse I có tác d ng:ụ •Lo i DNA t p nhi m trong các phân đo n RNA hay protein ễ •T o các ch đ t (nick) trên DNA trong kĩ thu t đánh d u m u dò ki u Nick – translation. •Phát hi n các gen ho t đ ng trên nhi m s c ch t.

ạ ộ ệ ễ ắ ấ

IV. CÁC ENZYME THAM GIA IV. CÁC ENZYME THAM GIA

i d n liên k t gi a các nucleotide t ữ ế ừ ạ ả ầ

DNA theo 2 chi u 5’ – 3’ và 3’ – 5’ ề

ề ổ

ủ

ạ

DNA polymerase I có ho t tính: •Exonuclease: th y gi ủ đ u phân t ử ầ •Polymerase: t ng h p theo chi u 5’ – 3’ ợ Klenow c a DNA pol I •Có ho t tính polymerase và exonuclease •M t đi ho t tính 5’ – 3’ không mong mu n ố ạ ấ

IV. CÁC ENZYME THAM GIA IV. CÁC ENZYME THAM GIA

ể ự

ầ ủ

ể

c chuy n đ n đ u 5’ c a m t ầ ủ ế ể ộ

ng th a ADP, DNA chuy n nhóm phosphate ừ ể

Enzim t4 polynucleotid kinase: xúc tác s chuy n nhóm gama-phosphate c a ATP cho đ u 5’ c a DNA hay RNA. Có ủ hai ki u ph n ng: ả ứ •Nhóm gama- phosphate đ ượ DNA đã m t nhóm phosphate ấ •Khi có m t l ộ ượ cho ADP và nh n nhóm gama- phosphate ậ T4 DNA ligase: n i 2 trình t DNA đ u b ng ầ ự ằ ố

IV. CÁC ENZYME THAM GIA IV. CÁC ENZYME THAM GIA

ồ ố ừ ừ ộ ợ phage xâm nhi m m t m ch c a m t phân ủ ễ ộ ạ

DNA m ch đôi theo chi u 5’ – 3’. T7 RNA polymerase: có ngu n g c t E.coli, xúc tác s t ng h p RNA t ự ổ t ử ề ạ

phage xâm nhi m ễ

SP6 RNA polymerase: có ngu n g c t Salmonella Typhimurium, có ch c năng gi ng v i T7 ồ ố ừ ứ ố ớ

PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH DẤU ACID NUCLEIC

Tạo mẫu dò cho lai phân tử để xác nhận sự hiện diện của yếu tố đặc hiệu của sinh vật đích dựa vào đặc tính bắt cặp bổ sung của acid nucleic.

B CÔNG TH

TR

ƯỜ

Ộ Ạ Ọ

NG Ệ

Ồ

ƯƠ NG Đ I H C CÔNG NGHI P TP. H CHÍ MINH Vi n: Công Ngh Sinh H c và Th c Ph m ọ

ự

ệ

ệ

ẩ

ộ

ộ

B môn: Hóa sinh đ ng v t ậ 

GVHD: Th.S Tr n H ng B o

ồ

ầ

ả

Quyên

DANH SÁCH NHÓM DANH SÁCH NHÓM

Ộ

ỘN I DUNG CHÍNH N I DUNG CHÍNH

ụ

ươ

I. M C ĐÍCH ĐÁNH D U I. M C ĐÍCH ĐÁNH D U

Ụ Ụ

Ấ Ấ

ử ể

ạ ệ

ắ ặ

ủ

đ xác nh n s T o m u dò cho lai phân t ậ ự ẫ đ c hi u c a sinh v t hi n di n c a y u t ệ ủ ế ố ặ ậ ệ ủ đích d a vào đ c tính b t c p b sung c a ổ ặ ự acid nucleic.

Ị

II. TÁC NHÂN ĐÁNH D UẤ II. TÁC NHÂN ĐÁNH D UẤ Ằ

Ạ

2.1. B NG Đ NG V PHÓNG X Ồ 2.1.1. Nguyên t c làm vi c ệ ắ V i ph ấ ớ ng dùng x , ng ạ Beta năng l ệ đ ượ ế

Ạ

Ị c đi m ể

NG PHÁP HÓA H C

Ọ

II. TÁC NHÂN ĐÁNH D UẤ II. TÁC NHÂN ĐÁNH D UẤ 2.2. B NG PH ƯƠ Ằ 2.2.1. S d ng avidine – biotine: ử ụ Avidine đ c g n v i m t nhóm phát huỳnh ớ quang hay m t enzim xúc tác cho ph n ng t o ạ màu. Biotine đ h c ho c DNA đ ặ ọ có g n biotine

NG PHÁP HÓA H C

Ọ

ử ụ

II. TÁC NHÂN ĐÁNH D UẤ II. TÁC NHÂN ĐÁNH D UẤ 2.2. B NG PH ƯƠ Ằ 2.2.1. S d ng avidine – biotine: Sau đó, biotine hi n di n trong phân t c ượ ệ ệ phát hi n khi cho ligand c a nó là avidine vào ph n ệ ả ủ ả ế ứ trên màng lai.

ƯƠ ự

NG PHÁP HÓA H C

Ọ

ƯƠ ượ

c đi m: ể

II. TÁC NHÂN ĐÁNH D UẤ II. TÁC NHÂN ĐÁNH D UẤ 2.2. B NG PH Ằ 2.2.3. u – nh Ư  u đi m: Ư ể  Không gây h i cho s c kh e c a con ng  Ít t n kém ố c đi m: ể ượ

III. PH III. PH

ƯƠ ƯƠ

NG PHÁP DÁNH NG PHÁP DÁNH D UẤD UẤ

3.1. PH

NG PHÁP NICK – TRANSLATION

ƯƠ

III. PH III. PH

ƯƠ ƯƠ

NG PHÁP DÁNH NG PHÁP DÁNH D UẤD UẤ

3.2. PH

NG PHÁP RANDOM PRIMING

ƯƠ

III. PH III. PH

ƯƠ ƯƠ

NG PHÁP DÁNH NG PHÁP DÁNH D UẤD UẤ NG PHÁP ĐÁNH D U CÁC

Ấ

ƯƠ

3.3. PH OLIGONUCLEOTIDE

III. PH III. PH

ƯƠ ƯƠ

NG PHÁP T O M U DÒ RNA

3.4. PH

NG PHÁP DÁNH NG PHÁP DÁNH D UẤD UẤ Ạ

Ẫ

ƯƠ

IV. CÁC ENZYME THAM GIA IV. CÁC ENZYME THAM GIA DNAse I có tác d ng:ụ •Lo i DNA t p nhi m trong các phân đo n RNA hay protein ễ •T o các ch đ t (nick) trên DNA trong kĩ thu t đánh d u m u dò ki u Nick – translation. •Phát hi n các gen ho t đ ng trên nhi m s c ch t.

IV. CÁC ENZYME THAM GIA IV. CÁC ENZYME THAM GIA