PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH DẤU ACID NUCLEIC

Chia sẻ: Tulip_12 Tulip_12 | Ngày: | Loại File: PPT | Số trang:18

Thêm vào BST

Báo xấu

225
lượt xem 36
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tạo mẫu dò cho lai phân tử để xác nhận sự hiện diện của yếu tố đặc hiệu của sinh vật đích dựa vào đặc tính bắt cặp bổ sung của acid nucleic.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH DẤU ACID NUCLEIC

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP. HỒ CHÍ MINH Viện: Công Nghệ Sinh Học và Thực Phẩm Bộ môn: Hóa sinh động vật  GVHD: Th.S Trần Hồng Bảo Quyên
DANH SÁCH NHÓM TT HỌ TÊN SINH VIÊN 1 Trương Văn Hiền 2 Nguyễn Xuân Giang 3 Hoàng Thị Lộc 4 Trương Thị Thúy Nga 5 Mai Nguyễn Bảo Ngân 6 Bùi Thị Hồng Ngọc 7 Nguyễn Kiều Oanh
NỘI DUNG CHÍNH I. Mục đích đánh dấu II. Tác nhân đánh dấu III. Phương pháp đánh dấu IV. Các enzyme tham gia
I. MỤC ĐÍCH ĐÁNH DẤU Tạo mẫu dò cho lai phân tử để xác nhận sự hiện diện của yếu tố đặc hiệu của sinh vật đích dựa vào đặc tính bắt cặp bổ sung của acid nucleic.
II. TÁC NHÂN ĐÁNH DẤU 2.1. BẰNG ĐỒNG VỊ PHÓNG XẠ 2.1.1. Nguyên tắc làm việc Với phương pháp đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ, người ta thường dùng 32P, 35S, 3H phát ra tia Beta năng lượng cao. Việc phát hiện các mẫu dò được tiến hành nhờ kĩ thuật phóng xạ tự ghi.
II. TÁC NHÂN ĐÁNH DẤU 2.1. BẰNG ĐỒNG VỊ PHÓNG XẠ 2.1.2. Ưu – nhược điểm Ưu điểm:  Có độ nhạy cao  Cho tín hiệu mạnh với thời gian phơi sáng ngắn Nhược điểm:  Có hại cho sức khỏe của con người  Đòi hỏi nhiều biện pháp an toàn, tốn kém trong thao tác và xử lí chất thải.  Các mẫu dò không dùng được trong thời gian dài do chu kì bán rã của các đồng vi phóng xạ.
II. TÁC NHÂN ĐÁNH DẤU 2.2. BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC 2.2.1. Sử dụng avidine – biotine: Avidine được gắn với một nhóm phát huỳnh quang hay một enzim xúc tác cho phản ứng tạo màu. Biotine được gắn vào DNA nhờ phản ứng hóa học hoặc DNA được tổng hợp từ những nucleotide có gắn biotine
II. TÁC NHÂN ĐÁNH DẤU 2.2. BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC 2.2.1. Sử dụng avidine – biotine: Sau đó, biotine hiện diện trong phân tử lai được phát hiện khi cho ligand của nó là avidine vào phản ứng. Kết quả là những tín hiệu màu nhận được trên màng lai.
II. TÁC NHÂN ĐÁNH DẤU 2.2. BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC 2.2.2. Dựa trên sự phát quang sinh học: Đầu tiên mẫu dò được đánh dấu bằng peroxidase Sau đó cho tiếp xúc với một cơ chất của peroxidase có khả năng phát sáng khi bị biến đổi. Ánh sáng sẽ phát sáng lên phim và kết quả thu nhận là những chấm trên phim.
II. TÁC NHÂN ĐÁNH DẤU 2.2. BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC 2.2.3. Ưu – nhược điểm: Ưu điểm:  Không gây hại cho sức khỏe của con người,  Ít tốn kém Nhược điểm: độ nhạy kém
III. PHƯƠNG PHÁP DÁNH DẤU 3.1. PHƯƠNG PHÁP NICK – TRANSLATION
III. PHƯƠNG PHÁP DÁNH D Ấ U 3.2. PHƯƠNG PHÁP RANDOM PRIMING
III. PHƯƠNG PHÁP DÁNH D Ấ U 3.3. PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH DẤU CÁC OLIGONUCLEOTIDE
III. PHƯƠNG PHÁP DÁNH D Ấ U 3.4. PHƯƠNG PHÁP TẠO MẪU DÒ RNA (a)Gắn DNA vào vùng PCS (b)Cắt plasmid ở vị trí ngay sau đoạn gene (so với promoter định sử dụng), tạo dạng thẳng (c)Thêm SP6 hoặc T7 RNA pol và các nucleotide tự do, trong đó có 1 loại nucleotide đánh dấu (d)Chọn lại các phân tử đánh dấu có trình tự và kích thước mong muốn
IV. CÁC ENZYME THAM GIA DNAse I có tác dụng: •Loại DNA tạp nhiễm trong các phân đoạn RNA hay protein •Tạo các chỗ đứt (nick) trên DNA trong kĩ thuật đánh dấu mẫu dò kiểu Nick – translation. •Phát hiện các gen hoạt động trên nhiễm sắc chất.
IV. CÁC ENZYME THAM GIA DNA polymerase I có hoạt tính: •Exonuclease: thủy giải dần liên kết giữa các nucleotide từ đầu phân tử DNA theo 2 chiều 5’ – 3’ và 3’ – 5’ •Polymerase: tổng hợp theo chiều 5’ – 3’ Klenow của DNA pol I •Có hoạt tính polymerase và exonuclease •Mất đi hoạt tính 5’ – 3’ không mong muốn
IV. CÁC ENZYME THAM GIA Enzim t4 polynucleotid kinase: xúc tác sự chuyển nhóm gama-phosphate của ATP cho đầu 5’ của DNA hay RNA. Có hai kiểu phản ứng: •Nhóm gama- phosphate được chuyển đến đầu 5’ của một DNA đã mất nhóm phosphate •Khi có một lượng thừa ADP, DNA chuyển nhóm phosphate cho ADP và nhận nhóm gama- phosphate T4 DNA ligase: nối 2 trình tự DNA đầu bằng
IV. CÁC ENZYME THAM GIA T7 RNA polymerase: có nguồn gốc từ phage xâm nhiễm E.coli, xúc tác sự tổng hợp RNA từ một mạch của một phân tử DNA mạch đôi theo chiều 5’ – 3’. SP6 RNA polymerase: có nguồn gốc từ phage xâm nhiễm Salmonella Typhimurium, có chức năng giống với T7