Ch
ng 6
PH
NG PHÁP LAI PHÂN T
ươ
ƯƠ
Ử
Ệ
, c ng ừ ừ ộ ả ạ ờ
1.KHÁI Ni M LAI PHÂN T Ử -Khi 2 m ch DNA tách r i, nhi t đ đ ệ ộ ượ v i đi u ki n thí nghi m thích h p, hai m ch s b t c p tr lai. ợ ớ c làm gi m t ẽ ắ ặ t ở ệ ạ
hoàn ệ ố : S tái b t c p ch x y ra gi a 2 trình t ắ ặ ỉ ả ự ữ ự
ệ -Đ c đi m: ể Đ c hi u tuy t đ i ệ toàn b sung v i nhau. ề ặ ặ ổ
Các trình t hình thành các ớ b sung có th là DNA ho c RNA ự ổ ể
phân t ử
ử ặ ng đ n lai phân t nh h . ế ố ả ế lai DNA-RNA. ử
ặ DNA-DNA, RNA-RNA, ho c phân t ưở ờ ả ứ
ng các trình t ồ nhi b sung càng nhi u ố ượ ự ổ ề
t đ nh t đ nh, s l thì xác su t b t c p càng tăng. 1.Các y u t N ng đ DNA và th i gian ph n ng: ộ Ở ệ ộ ấ ị ấ ắ ặ
Th i gian ph n ng càng dài, xác su t b t c p càng l n, đ ng ấ ắ ặ ớ ồ
lai tăng d n. ả ứ ng phân t ử ầ
ờ th i s l ờ ố ượ
Nhi t đệ ộ
T c đ ph n ng lai ph thu c nhi t đ . Thông th ả ứ ụ ố ộ ộ ệ ộ ườ ng t c đ ộ ố
ph n ng lai c c đ i nhi t đ th p h n Tm kho ng 25 %. ự ạ ở ả ứ ệ ộ ấ ả ơ
Đ dài các trình t ộ ự
T c đ lai tăng t l thu n v i căn bình ph ỉ ệ ố ộ ậ ớ ươ ng c a đ dài các ộ ủ
trình t b sung. ự ổ
L c ion ự
N ng đ NaCl 1M làm tăng t c đ ph n ng tăng lên t ố ộ ả ứ ồ ộ ừ 5 đ n 10 ế
t quá 1,2 M hoàn toàn không có tác d ng. l n. N ng đ NaCl v ầ ồ ộ ượ ụ
3. Kĩ thu t Southern Blot ậ
Ph ng pháp này đ c đ c ươ ượ s d ng đ đ nh v nh ng trình t ị ữ ử ụ ể ị ự ặ
bi c nh h n DNA tệ trên DNA b gene, hay nh ng DNA kích th ữ ộ ướ ỏ ơ
plasmid, phage…
C s : kĩ thu t chuy n DNA t gel lên màng lai. ơ ở ể ậ ừ
Đ u tiên, DNA đ c phân tách trên gel agarose và đ c tách thành ầ ượ ượ
dây đ n (s d ng mu i có n ng đ cao đ bi n tính) đ chuy n ể ế ử ụ ể ể ơ ố ộ ồ
gel lên màng lai. t ừ
• Cách ti n hành: ế
c c t thành nh ng đo n có kích th c khác - DNA b gene đ ộ ượ ắ ữ ạ ướ
nhau b i enzyme c t gi i h n ắ ở ớ ạ đi n di đ phân tách. ể ệ
- DNA đ c bi n tính ngay trên gel chuy n lên màng lai ượ ế ể (v trí ị
các đo n DNA đ c gi nguyên). ạ ượ ữ
- Ti n hành lai ế v i m u dò có đánh d u (phóng x , hóa h c…) ấ ạ ẫ ớ ọ
- Ti n hành r a ử lo i b m u dò không b t c p đ c hi u ệ ạ ỏ ẫ ắ ặ ế ặ
- Phát hi n tín hi u lai. ệ ệ
• Ứ ng d ng: ụ
i h n c a gene - L p b n đ gi ả ồ ớ ạ ủ ậ
- Phát hi n các đ t bi n m t đo n, đ t bi n đi m trên gene. ể ế ệ ế ạ ấ ộ ộ
Kĩ thu t Southern blot ậ
4. Kĩ thu t Northern blot. ậ
Ph ng pháp này đ c c và hàm ươ ượ s d ng đ xác đ nh kích th ể ử ụ ị ướ
ngượ c a m t mRNA đ c tr ng trong m t h n h p RNA. l ư ộ ỗ ủ ặ ộ ợ
Cách ti n hành: ế
- Đi n di RNA trên gel có ch t làm bi n tính ệ ế ấ phá v các liên ỡ
k t y u qui đ nh c u trúc b c 2 c a RNA. ế ế ủ ấ ậ ị
- Chuy n RNA lên mang lai ể
- Ti n hành lai v i m u dò có đánh d u. ế ẫ ấ ớ
- Phát hi n tín hi u lai ệ ệ
Kĩ thu t Northern blot. ậ
5. Kĩ thu t Western blot. ậ
Ph ng pháp phát hi n protein trên gel polyacrylamide chuy n đ n ươ ế ể ệ
m t môi tr ộ ườ ng b n v ng h n và c đ nh ơ ố ị ữ ề (ví d : màng ụ
nitrocellulose) v i nh ng nguyên t c t ng t nh Southern blot. ắ ươ ữ ớ ự ư
Cách ti n hành: ế
Thu nh n protein t bào nuôi c y ậ t ừ ế ấ x lý protein (s d ng SDS, ử ụ ử
nhi t đ , DTT đ bi n tính protein). ệ ộ ể ế
Ti n hành đi n di SDS-PAGE phân tách protein. ế ệ
Chuy n lên màng lai ể
Ti n hành lai v i kháng th có đánh d u. ế ể ấ ớ
Phát hi n tín hi u lai. ệ ệ
Kĩ thu t Western blot ậ
Thu nh n và đi n di protein
ệ
ậ
Lai và phát hi nệ
ệ ố ấ
6. Các h th ng đánh d u H th ng đánh d u không dùng đ ng v phóng x : ạ ệ ố ấ ồ ị
- Horseradish peroxydase (HRP) và chemiluminescence
) c ch t
tr ng thái kích thích, phát sáng
ơ ấ
ơ ấ ở ạ
đ ở ộ
HRP oxi hóa c ch t (Luminol dài sóng 425 nm.
ệ ố
ng phân t ớ
H th ng biotin – streptavidin Streptavidin là m t protein có tr ng l ọ ộ ỗ ể ơ ị ồ ử ể ắ ượ ơ ấ ộ ớ ị
60.000 Da, v i 4 ti u đ n v đ ng nh t, m i ti u đ n v có th g n v i m t phân ể t biotin. ử
H th ng đánh d u phóng x ệ ố ấ ạ
Trong ph ng pháp này ng ươ ườ i ta s d ng m t lo i phim đ phát hi n ạ ử ụ ệ ể ộ
32 , phim này r t nh y c m ấ
“m u dò”(probe) đ ẫ ượ c đánh d u b ng P ấ ằ ạ ả
v i b c x . ớ ứ ạ
