Tách và thu nhận gen
Ngày nay, người ta có thể thu nhận gen để thực hiện kỹ thuật di truyền bằng
ba phương pháp: tách các đoạn DNA từ bộ gen; tổng hợp gen bằng phương
pháp hoá học; sinh tổng hợp từ mRNA.
1. Tách các đoạn DNA từ bộ gen
Đây là phương pháp sử dụng rộng rãi ngay từ buổi đầu tiên của sự phát triển
kỹ thuật DNA tái tổ hợp. Toàn bộ phân tử DNA của một sinh vật được cắt
nhỏ thành những đoạn có kích thước 1,5 → 2kb bằng restriction
enzyme (RE). Điện di hoặc sắc kí để tách đoạn DNA tinh khiết, sau đó gắn
vào vector chuyển gen, tạo plasmid DNA tái tổ hợp.
Nhược điểm là tốn nhiều công sức và thời gian nhưng ngày nay người ta vẫn
sử dụng để tạo ngân hàng DNA bộ gen (genonic DNA libraries).
2. Sự tổng hợp gen bằng phương pháp hoá học
Năm 1969, gen nhân tạo đầu tiên được tổng hợp do nhóm nghiên cứu
Khorama, đó là gen mã hoá tổng hợp tRNA vận chuyển amino axit (alamin)
ở nấm men gồm 77 cặp nucleotide. Gen đầu tiên không được biểu hiện vì
không có các trình tự điều hoà.
Về sau, chính nhóm này đã tổng hợp được gen có hoạt tính: đó là gen mã hóa
cho chất ức chế tRNA vận chuyển tyrosine ở E. Coli, có chiều dài khoảng
200 cặp nucleotide.
Vào năm 1977, K. Itakura và Boyer đã tổng hợp được gen mã hóa sinh tổng
hợp hormone somatostatin của động vật có vú được biểu hiện ở E. Coli. và từ
đó, nòi E. Coli mang gen tổng hợp hóa học được tạo ra. Sau này, người ta
tổng hợp hóa học gen mã hóa hormone tăng trưởng của người dài 584pb.
Phương pháp tổng hợp hóa học gen cũng được sử dụng để tạo ra nòi vi khuẩn
tổng hợp insulin, một loại hormone chữa bệnh tiểu đường cho người. Gen
insuline được tổng hợp từ hơn 40 đoạn oligonucleotide khác nhau, sau đó,
được nối lại nhờ enzyme lygase để tạo ra hai chuỗi polynucleotide dài 271 và
286bp mã hóa, tổng polypeptide A có 21 aminoaxit, polypeptide B có 30
aminoaxit.
Qua các kết quả thu được, các nhà khoa học đã khẳng định rằng: muốn tổng
hợp được gen bằng phương pháp hoá học cần phải biết trình tự của axit amin
ở protein mà gen đó chịu trách nhiệm tổng hợp.
3. Sinh tổng hợp gen từ mRNA
Tổng hợp cDNA từ mRNA nhờ kỹ thuật của Gubler và Hoffman với sự có
mặt của enzyme phiên mã ngược (Rever transcriptase). Sau đó, cDNA
(complementary) gắn vào plasmid và biến nạp vào vi khuẩn để tạo dòng
cDNA.
Sơ đồ tổng hợp gen từ mRNA
Ưu điểm là: Gen thu nhận bằng phương pháp này đã loại bỏ được những
trình tự không mã hoá. Bằng con đường này, người ta đã tạo dòng gen mã
hoá tổng hợp globine của người, động vật và chim, protein thủy tinh thể mắt
bò, ovalbumine (protein lòng trắng trứng) và fibroin tơ tằm.
Vào năm 1992 các nhà khoa học Mỹ đã tạo được dòng cDNA của 2.375 gen
của bộ não người. Phương pháp tổng hợp gen từ mRNA ngày càng được phát
triển, nó kết hợp với các phương pháp khác của sinh học phân tử và được ứng
dụng trong nhiều lĩnh vực.
Phương pháp tách RNA tổng số và mRNA
Tách RNA tổng số
RNA được tiến hành chiết tách gồm các bước cơ bản tương tự như DNA (bao
gồm phá vỡ màng tế bào, loại protein, tủa RNA) nhưng ở đây ta dùng
enzyme desoxyribonuclease (DNase) để phân huỷ DNA. Do RNA kém bền
và dể bị phân huỷ bởi enzyme ribonuclease (RNase) có nhiều ở khắp
nơi, hoạt tính cao lại bền với nhiệt (trên 90°C), vì vậy, điều kiện thao tác để
chiết tách phải được tiến hành trong môi trường vô cùng nghiêm ngặt.
Phương pháp chung để tách RNA tổng số được tiến hành như sau:
- Tế bào được nghiền với chất tẩy rửa SDS, sarcocyl nồng độ cao, nitơ lỏng
để biến tính protein. Đồng thời mẫu cũng được nghiền với chất khử (2-
mercaptoethanol) để ức chế RNase. Nước sử dụng cũng được xử lý với
DEPC (Diethylpyrocarbonat) cũng để loại bỏ RNase.
- Các protein, DNA được loại bỏ qua xử lý mẫu với hỗn hợp dung môi Trizol
(phenol pH=4, guanidinium thiocyanate, glycerol, sodium acetate), khi ly
tâm, ta tách được RNA trong pha nước. DNA ở pH=4 bị hấp phụ vào pha
dưới cùng với phenol, protein biến tính nằm giữa hai pha cũng bị loại cùng
với DNA cùng với pha phenol. RNA trong pha nước được hút ra sau đó
tủa bằng izopropanol để -20°C, li tâm và rửa lại bàng ethalnol 79%, thu hồi
RNA tinh khiết, bảo quản lạnh để làm các thí nghiệm tiếp theo. Chất lượng
của RNA tổng số được đánh giá sơ bộ qua điện di trên gel agarose.
Tách từng loại RNA khác nhau
Dựa vào kích thước trọng lượng phân tử, người ta có thể tiến hành sắc kí,
điện di hoặc ly tâm để tách từng loại RNA. Phương pháp tách mRNA:
Do kích thước bé lại chiếm lượng nhỏ (1÷ 5%) RNA tổng số, có cấu trúc đa
dạng nên không thể tách bằng phương pháp trên.
Nhờ đặc điểm mRNA có đuôi polyA, do đó, người ta tách mRNA ra khỏi
mẫu bằng phương pháp sắc ký ái lực oligodt-xenlulose.
Ngày nay trên thị trường có loại viên bi từ, trên bề mặt có gắn oligodt. Sau
khi mRNA bám trên bề mặt các viên bi từ, thông qua liên kết bổ sung với
oligodt, các viên bi này thu nhận và đem ly tâm ta thu được mRNA tinh
khiết.
Lưu ý rằng, để tách mRNA, người ta đi từ tế bào biệt hoá, lượng mRNA
nhiều và đây cũng là con đường nghiên cứu cấu trúc gen mã hoá. Ngày nay
người ta đã tổng hợp được ngân hàng mRNA.