Tối ưu phương pháp xử lý mẫu nước bọt để nâng cao độ nhạy trong chẩn đoán bệnh dịch tả lợn Châu Phi

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:9

Thêm vào BST

Báo xấu

3
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nghiên cứu này được thực hiện nhằm cải tiến phương pháp xử lý mẫu nước bọt để tăng độ nhạy trong chẩn đoán bệnh. Semi-alkaline proteinase (SAP) và Polyethylene glycol (PEG) đã được sử dụng để xử lý mẫu nước bọt.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tối ưu phương pháp xử lý mẫu nước bọt để nâng cao độ nhạy trong chẩn đoán bệnh dịch tả lợn Châu Phi

Vietnam J. Agri. Sci. 2025, Vol. 23, No. 1: 27-35 Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2025, 23(1): 27-35 www.vnua.edu.vn TỐI ƯU PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ MẪU NƯỚC BỌT ĐỂ NÂNG CAO ĐỘ NHẠY TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH DỊCH TẢ LỢN CHÂU PHI Lê Trần Hoàng Anh, Bùi Lệ Thủy, Đặng Thị Hằng, Trần Thị Mỹ An, Đàm Quốc Khánh, Nguyễn Thị Thảo, Mai Thị Ngân* Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam * Tác giả liên hệ: mtngan@vnua.edu.vn Ngày nhận bài: 05.10.2024 Ngày chấp nhận đăng: 17.01.2024 TÓM TẮT Dịch tả lợn châu Phi (African swine fever - ASF) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm với tỷ lệ tử vong lên đến 100%. Phương pháp thu thập mẫu nước bọt trong chẩn đoán để giám sát ASF có nhiều ưu điểm nhưng tải lượng virus trong mẫu nước bọt thấp nên ảnh hưởng đến độ nhạy của các phương pháp chẩn đoán. Nghiên cứu này được thực hiện nhằm cải tiến phương pháp xử lý mẫu nước bọt để tăng độ nhạy trong chẩn đoán bệnh. Semi-alkaline proteinase (SAP) và Polyethylene glycol (PEG) đã được sử dụng để xử lý mẫu nước bọt. Tỷ lệ tối ưu về thể tích của dung dịch SAP và PEG so với mẫu nước bọt tương ứng là 1:3 và 1:0,4. Kết quả chẩn đoán ASFV từ mẫu nước bọt sau khi xử lý bằng SAP và PEG cho thấy đã cải thiện độ nhạy của phản ứng realtime PCR, cụ thể từ 12 mẫu thực địa có 7/12 mẫu cho kết quả dương tính sau khi xử lý bằng SAP và PEG, chỉ có 4/12 mẫu dương tính khi không xử lý bằng SAP và PEG. Như vậy, việc ứng dụng phương pháp xử lý mẫu nước bọt đã làm tăng độ nhạy của phương pháp real-time PCR trong chẩn đoán ASF, hứa hẹn là công cụ hỗ trợ hữu ích cho công tác giám sát ASF. Từ khoá: ASF, real-time PCR, mẫu nước bọt, phương pháp xử lý. Optimization of Saliva Sample Processing to Increase Sensitivity in Diagnosis of African Swine Fever ABSTRACT African swine fever (ASF) is a dangerous infectious disease with a mortality rate of up to 100%. Collecting saliva samples for diagnosis to monitor ASF has many advantages, but the low viral load in saliva samples, it affects the sensitivity of diagnostic methods. This study improved the saliva sample processing to increase the sensitivity of the diagnosis method. Semi-alkaline proteinase (SAP) and Polyethylene glycol (PEG) were used to process saliva samples. The optimal volume ratio of SAP and PEG solutions to saliva samples was 1:3 and 1:0.4, respectively. The results of ASFV diagnosis from saliva samples after processing with SAP and PEG showed increased sensitivity of real-time PCR reaction. Of 12 field samples, 7/12 samples gave positive results after processing with SAP and PEG compared to only 4/12 positive samples when not processed with SAP and PEG. Thus, applying the saliva sample processing increased the sensitivity of the real-time PCR method in ASF diagnosis, promising to be a useful support tool for ASF surveillance. Keywords: African swine fever, real-time PCR, saliva samples, processing method. lan ra một số quốc gia chåu Phi. Tính đến tháng 1. ĐẶT VẤN ĐỀ 8 nëm 2019, nông dån ć 51 quốc gia đã phâi Bệnh dðch tâ lĉn chåu Phi (African swine gánh chðu tác động cûa ASF, vĆi khoâng một fever - ASF) do virus ASF (ASFV) gây ra, là phæn tþ số lĉn trên toàn thế giĆi bð tiêu hûy bệnh truyền nhiễm nguy hiểm vĆi tČ lệ tā vong (Gregorio, 2020). Täi Việt Nam, să bùng phát cao lên đến 100% (Dixon & cs., 2013). ASF xuçt cûa ASF vào nëm 2019 đã gåy tổn thçt nặng nề hiện læn đæu ć Kenya nëm 1921 và nhanh chòng đối vĆi ngành chën nuôi. Chî sau nëm tháng 27
Tối ưu phương pháp xử lý mẫu nước bọt để nâng cao độ nhạy trong chẩn đoán bệnh dịch tả lợn châu Phi xuçt hiện, bệnh đã xây ra ć 62 tînh thành vĆi 1999; Sakashita & cs., 2020; Wang & cs., 2020). gæn 6 triệu con lĉn bð tiêu huČ, chiếm hĄn 20% Bên cänh đò, polyethylene glycol (PEG) một hĉp tổng đàn cûa câ nþĆc (Nguyen-Thi & cs., 2021). chçt cò khâ nëng kết tûa protein cüng đã đþĉc sā Vì ASFV cò sĀc đề kháng cao nên nguy cĄ tái dýng nhìm làm sa líng các hät virus để bâo tồn phát và låy lan trên diện rộng vén luôn hiện lþĉng virus cò trong méu trong chèn đoán hĂu, tÿ đò ânh hþćng nghiêm trọng đến việc tổ SARS-CoV-2 tÿ nþĆc thâi (Hata & cs., 2021; chĀc tái đàn, tëng đàn và bâo đâm nguồn cung. Kumar & cs., 2020; Torii & cs., 2021; Wu & cs., Mặc dù hiện nay đã cò hai loäi vacxin phñng 2020). Tuy nhiên, chþa cò nghiên cĀu nào câi bệnh là NAVET-ASFVAC cûa Công ty Cổ phæn tiến quy trình xā lċ méu nþĆc bọt trong chèn Thuốc thú y Trung þĄng NAVETCO và AVAC đoán ASF. Do đò, mýc tiêu nghiên cĀu cûa chúng tôi là phát triển phþĄng pháp xā lċ méu nþĆc bọt ASF LIVE cûa Công ty Cổ phæn AVAC Việt nhìm tëng độ nhäy trong chèn đoán ASF có ý Nam đã đþĉc lþu hành, tuy nhiên tČ lệ tiêm nghïa lĆn và rçt cæn thiết, hỗ trĉ cho công tác phñng cñn thçp (Nguyễn Hþćng, 2024) nên việc chèn đoán sĆm để giám sát bệnh, gòp phæn giâm chèn đoán sĆm và chính xác là rçt cæn thiết cho thiểu tác động cûa bệnh đối vĆi ngành chën nuôi. việc giám sát và tiến tĆi khống chế bệnh. Mặc dù hiện täi việc chèn đoán ASF chû yếu thông qua các loäi méu xåm lçn nhþ méu 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU máu, méu mô, méu huyết thanh„ cò độ chính 2.1. Nguyên vật liệu xác cao nhþng cñn tồn täi nhiều hän chế nhþ gåy cëng thîng cho động vêt khi thu méu Virus dðch tâ lĉn chåu Phi chûng (Martínez-Miró & cs., 2016), khó khën và cò thể ASF/HY01/2019 (GenBank mã số: MK554698) nguy hiểm cho cán bộ lçy méu (do nguy cĄ tÿ phån lêp tÿ lĉn bệnh trong đĉt dðch ASF đæu xilanh) và khâ nëng phát tán mæm bệnh do tâi tiên täi Việt Nam vào tháng 2 nëm 2019 (Le & lþĉng virus trong các loäi méu này cao. Trong cs., 2019), đã đþĉc sā dýng cho các thí nghiệm tối þu vĆi hiệu giá là 106,5 TCID50. khi đò, thąi điểm phát hiện ASFV ć nþĆc bọt là cùng thąi điểm phát hiện ASFV trong máu, Méu nþĆc bọt đþĉc thu thêp tÿ lĉn khoẻ thêm chí cò thể sĆm hĄn tĆi 3 ngày (Gallardo & mänh tÿ hai träi lĉn thðt täi Phú Thọ và Thái cs., 2021). Do đò, việc chèn đoán sĆm bệnh khi Bình nëm 2022-2023 đã cò xác nhên nhiễm dðch lĉn chþa cò triệu chĀng låm sàng tÿ méu không tâ lĉn chåu Phi tÿ một ô chuồng trong träi và xåm lçn (nþĆc bọt) cò ċ nghïa lĆn trong công tác đþĉc bâo quân ć tû -80C cho đến khi sā dýng. giám sát ASF, giúp giâm thiểu cëng thîng cho Hòa chçt để xā lċ méu nþĆc bọt bao gồm động vêt. Một số nghiên cĀu đã sā dýng méu Sputazyme - Semi-alkaline proteinase (SAP) nþĆc bọt trong chèn đoán ASF (Beemer & cs., (Kyokuto, Tokyo, Nhêt Bân) và Polyethylene 2019; Goonewardene & cs., 2021; Joseph & cs., glycol (PEG) (Nacalai Tesque, Kyoto, Nhêt Bân). 2024), tuy nhiên, độ nhäy cûa việc chèn đoán Dung dðch PEG đþĉc pha bìng cách hòa tan 30g bệnh tÿ méu nþĆc bọt chþa cao vì tâi lþĉng PEG 6000 và 14,61g NaCl trong 100ml nþĆc cçt virus trong nþĆc bọt thçp, đồng thąi cñn bð ânh rồi khuçy nhiệt ć 70C đến khi tan hoàn toàn và hþćng bći să hiện diện cûa nhiều täp chçt nhþ hçp tiệt trùng ć 121C trong 15 phút. thĀc ën, enzyme tiêu hòa„ (Czumbel & cs., Hoá chçt dùng cho tách chiết DNA là bộ kit 2020; Patricia & cs., 2008). DNeasy (Qiagen, Maryland, Hoa KĊ) và hoá Một số nghiên cĀu đã Āng dýng các hoá chçt chçt dùng cho phþĄng pháp real-time PCR là bộ khác nhau để xā lċ méu nþĆc bọt nhþ sā dýng kit qPCR mix (Takara Bio Inc., Otsu, Japan). enzyme ly giâi đąm semi-alkaline proteinase (SAP) để cít liên kết S-S trong chçt nhæy cûa 2.2. Phương pháp nghiên cứu đąm và nþĆc bọt, tÿ đò làm giâm tính nhæy cûa dung dðch, giúp nång cao độ nhäy trong chèn 2.2.1. Chiết tách DNA đoán SARS-CoV-2 (Yamazaki & cs., 2021) và Quy trình chiết tách DNA đþĉc thăc hiện Mycobacterium tuberculosis (Saitoh & Yamane, theo nghiên cĀu trþĆc đåy đã công bố nhìm 28
Lê Trần Hoàng Anh, Bùi Lệ Thủy, Đặng Thị Hằng, Trần Thị Mỹ An, Đàm Quốc Khánh, Nguyễn Thị Thảo, Mai Thị Ngân giâm độ nhĆt cûa méu nþĆc bọt và ngën ngÿa DNA theo quy trình giống nhau nhþ đã đþĉc mô tíc nghẽn cột chiết tách DNA (Yamazaki & cs., tâ ć trên. DNA thu đþĉc tÿ các ống méu cò thể 2021). Cý thể 150µl méu nþĆc bọt đþĉc pha tích khác nhau đþĉc sā dýng để chèn đoán loãng theo tČ lệ 1:3 vĆi 450µl dung dðch PBS, ly ASFV bìng phþĄng pháp real-time PCR. tåm ć 15.600g trong 30 phút và thu 150µl dðch Tối ưu tỷ lệ hóa chất SAP nổi để chiết tách DNA bìng bộ kit DNeasy theo Quy trình tối þu tČ lệ méu và SAP đþĉc thăc hþĆng dén cûa nhà sân xuçt (Qiagen, Maryland, hiện nhþ sau: trộn đều 1ml dung dðch virus Hoa KĊ). DNA tổng số đþĉc hoà tan trong 50µl chûng ASFV ASF/HY01/2019 vào méu nþĆc bọt nþĆc không cò nuclease và bâo quân ć -80C. và chia thành ba ống cò thể tích méu giống nhau là 10ml. Nghiên cĀu cûa Yamazaki & cs. (2021) 2.2.2. Xử lý mẫu nước bọt đã sā dýng tČ lệ méu và SAP là 1:3 để chèn đoán Để bâo tồn lþĉng virus cò trong méu nþĆc SARS-CoV-2 tÿ méu nþĆc bọt, tuy nhiên chúng bọt và tëng tâi lþĉng ASFV trong chèn đoán, tôi muốn đánh giá các tČ lệ nþĆc bọt: méu khác chúng tôi đã tiến hành xā lċ méu nþĆc bọt trþĆc nhau để lăa chọn tČ lệ tối þu vĆi độ nhày méu khi chiết tách DNA. Quá trình này bao gồm việc nþĆc bọt cûa lĉn nên các méu tiếp týc đþĉc trộn tối þu lþĉng méu chèn đoán cüng nhþ tČ lệ giĂa vĆi SAP theo các tČ lệ khác nhau là 1:1, 1:2 và méu và các hòa chçt SAP, PEG nhìm nång cao 1:3. Sau đò, các méu đều đþĉc xā lċ và chiết tách hiệu suçt thu hồi virus. ASFV chûng DNA theo quy trình giống nhau nhþ đã đþĉc mô ASF/HY01/2019 đã đþĉc pha loãng vào méu tâ ć trên. DNA thu đþĉc tÿ các ống méu cò tČ lệ nþĆc bọt sau đò đþĉc sā dýng cho việc tối quy khác nhau đþĉc sā dýng để chèn đoán ASFV trình xā lċ méu. Méu nþĆc bọt sā dýng trong bìng phþĄng pháp real-time PCR. các nội dung tối þu đþĉc thu ć lĉn khoẻ mänh tÿ träi lĉn thðt täi Hoà Bình, bìng cách treo dåy Tối ưu tỷ lệ hóa chất PEG thÿng säch ć đæu ô chuồng ć vð trí ngang vĆi vai Quy trình tối þu tČ lệ méu và PEG đþĉc cûa lĉn vào buổi sáng, để cho lĉn nhai tÿ 20-30 thăc hiện nhþ sau: 30ml dung dðch méu nþĆc phút sau đò sā dýng túi và ống säch để thu dðch bọt đþĉc trộn đều vĆi 1ml ASFV chûng nþĆc bọt tÿ dåy thÿng. ASF/HY01/2019 và xā lċ bìng SAP vĆi tČ lệ đã Quy trình xā lċ méu nþĆc bọt đþĉc thăc đþĉc tối þu, sau đò tiến hành ly tåm và chuyển hiện theo các bþĆc sau: 10ml méu nþĆc bọt đþĉc 32ml dðch nổi sang ba ống cò chĀa PEG vĆi tČ lệ trộn vĆi 30ml dung dðch SAP 1X và û ć nhiệt độ méu và PEG khác nhau læn lþĉt là 1:0,5; 1:0,4 phñng trong 15 phút. Sau đò, ly tåm ć 15.557g và 1:0,333 dăa theo nghiên cĀu cûa Yamazaki & cs. (2021) đã sā dýng tČ lệ méu và SAP là 1:0,4 trong 30 phút. Tiến hành thu 32ml dðch nổi và để chèn đoán SARS-CoV-2 tÿ méu nþĆc bọt. trộn đều vĆi 12,8ml PEG rồi ly tåm ć 8.000g Sau đò, các ống méu đều đþĉc xā lċ và chiết trong 20 phút. Sau khi ly tåm, bó phæn dung tách DNA theo quy trình giống nhau nhþ đã dðch nổi và giĂ läi cặn. Cuối cùng, bổ sung 150µl đþĉc mô tâ ć trên. DNA thu đþĉc tÿ các ống PBS 1X để hña tan cặn, thu dðch sau khi đã hoà méu cò tČ lệ khác nhau đþĉc sā dýng để chèn tan để chiết tách DNA bìng bộ kit DNeasy theo đoán ASFV bìng phþĄng pháp real-time PCR. hþĆng dén cûa nhà sân xuçt. DNA tổng số đþĉc hoà tan trong 50µl nþĆc không cò nuclease và 2.2.3. Phương pháp real-time PCR đþĉc bâo quân ć -80C cho đến khi sā dýng. Phân Āng real-time PCR đþĉc thăc hiện Tối ưu thể tích mẫu nước bọt bìng hệ thống real-time PCR LineGene Mini S Quy trình tối þu thể tích méu đþĉc thăc (Bioer, Trung Quốc). Quy trình này sā dýng hai hiện nhþ sau: trộn đều 1ml dung dðch virus đoän mồi và một đæu dñ, bao gồm: mồi xuôi chûng ASFV ASF/HY01/2019 vào 20ml méu (5’-TGCTCATGGTATCAATCTTATCG -3’), mồi nþĆc bọt và chia thành ba ống vĆi thể tích khác ngþĉc (5’-CCACTGGGTTGGTATTCCTC-3’) và nhau læn lþĉt là 1ml, 5ml và 10ml méu. Sau đò, đæu dñ (5’-FAM-TTCCATCAAAGTTCTGCAGCT tçt câ các ống méu đều đþĉc xā lċ và chiết tách CTT-TAMRA-3’) theo nghiên cĀu cûa Tignon & 29
Tối ưu phương pháp xử lý mẫu nước bọt để nâng cao độ nhạy trong chẩn đoán bệnh dịch tả lợn châu Phi cs. (2011). Chu trình nhiệt cûa phân Āng thçp hĄn, vĆi Ct læn lþĉt là 30,43 và 29,7 (đþąng real-time PCR nhþ sau: 95C trong 3 phút, 45 khuếch đäi màu đó và màu đen), trong khi ống chu kĊ ć 95C trong 10 giây và 60C 35 giây. Sau méu cò thể tích là 1ml cò giá trð Ct cao hĄn quá trình khuếch đäi, giá trð chu kĊ ngþĈng 33,56 (đþąng khuếch đäi màu xanh) (Hình 1). (Ct - cycle threshold) đþĉc xác đðnh. Trong Nồng độ virus ć hai ống méu cò thể tích là 5ml nghiên cĀu này, các méu đþĉc xác đðnh là dþĄng và 10ml cò să sai khác không lĆn mặc dù lþĉng tính khi giá trð trung bình cho giá trð Ct < 37,0. méu là gçp đôi. Do đò, việc sā dýng 5-10ml méu nþĆc bọt để chèn đoán ASF là hoàn toàn phù 3. KẾT QUÂ VÀ THÂO LUẬN hĉp và khâ thi vì lþĉng méu nþĆc bọt thu đþĉc trong quá trình lçy méu thăc tế thþąng dao 3.1. Kết quâ tối ưu thể tích mẫu nước bọt động tÿ 5-20ml. trong chẩn đoán ASF Để đánh giá thể tích méu nþĆc bọt tối þu cho 3.2. Kết quâ tối ưu tỷ lệ mẫu và hóa chất SAP chèn đoán ASF, ba ống méu nþĆc bọt vĆi các thể Ba ống méu nþĆc bọt cò thể tích méu giống tích khác nhau: 1ml, 5ml và 10ml đều đþĉc xā lċ nhau đþĉc trộn vĆi SAP 1X theo ba tČ lệ méu méu và chiết tách DNA theo quy trình xā lċ bìng nþĆc bọt: SAP khác nhau læn lþĉt là 1:1, 1:2 và SAP, PEG vĆi tČ lệ tþĄng đþĄng thể tích méu 1:3, sau đò đều đþĉc xā lċ méu vĆi PEG vĆi cùng nþĆc bọt giống nhau. DNA thu đþĉc tÿ các ống tČ lệ và chiết tách DNA theo quy trình giống méu cò thể tích khác nhau đþĉc sā dýng để chèn nhau. DNA thu đþĉc tÿ các ống méu cò tČ lệ đoán ASFV bìng phþĄng pháp real-time PCR. khác nhau đþĉc sā dýng để chèn đoán ASFV Hình 1 cho thçy câ ba thể tích méu đều cho bìng phþĄng pháp real-time PCR. Kết quâ tối kết quâ dþĄng tính vĆi ASFV. Tuy nhiên, ć ống þu tČ lệ méu nþĆc bọt và SAP 1X trong chèn méu cò thể tích là 5ml và 10ml cho giá trð Ct đoán ASF đþĉc thể hiện ć hình 2. Ghi chú: Đường khuếch đại màu xanh, màu đỏ và màu đen lần lượt là đường khuếch đại từ các ống mẫu có thể tích 1ml, 5ml và 10ml. Hình 1. Kết quâ tối ưu thể tích mẫu nước bọt trong chẩn đoán ASF bằng phương pháp real-time PCR 30
Lê Trần Hoàng Anh, Bùi Lệ Thủy, Đặng Thị Hằng, Trần Thị Mỹ An, Đàm Quốc Khánh, Nguyễn Thị Thảo, Mai Thị Ngân Ghi chú: Đường khuếch đại màu đen, màu xanh dương và màu xanh lá lần lượt là đường khuếch đại từ các ống mẫu có tỷ lệ thể tích mẫu với SAP lần lượt là 1:1, 1:2 và 1:3. Hình 2. Kết quâ tối ưu tỷ lệ mẫu nước bọt và hóa chất SAP trong chẩn đoán ASF bằng phương pháp real-time PCR Hình 2 cho thçy ć câ ba tČ lệ méu vĆi SAP trăc khuèn lao Mycobacterium tuberculosis tÿ đều cho kết quâ chèn đoán dþĄng tính vĆi méu nþĆc bọt, sā dýng tČ lệ méu: SAP là 1:3. ASFV. Đặc biệt, tČ lệ méu và SAP 1:3 cho kết quâ dþĄng tính sĆm nhçt vĆi giá trð Ct là 31,29 3.3. Kết quâ tối ưu tỷ lệ mẫu và hóa chất PEG (đþąng khuếch đäi màu xanh) (Hình 2), trong Để tối þu tČ lệ hòa chçt PEG, dung dðch khi tČ lệ 1:1 và 1:2 cò giá trð Ct læn lþĉt là 33,26 méu nþĆc bọt sau khi đã đþĉc xā lċ bìng SAP và 32,74. Nhþ vêy, tČ lệ méu và SAP 1:3 cho kết vĆi tČ lệ đã tối þu là 1:3 rồi tiến hành ly tåm, quâ khuếch đäi dþĄng tính sĆm hĄn so vĆi hai tČ thu dðch nổi và trộn vĆi PEG ć các tČ lệ thể tích lệ cñn läi. Do đò, tČ lệ méu và SAP tối þu trong méu và PEG khác nhau læn lþĉt là 1:0,5; 1:0,4 nghiên cĀu này là 1:3. Theo chúng tôi, tČ lệ SAP và 1:0,333. Sau đò các ống méu đều đþĉc xā lċ cao giúp làm giâm tối đa tính nhày cûa méu và chiết tách DNA theo quy trình giống nhau. nþĆc bọt do các täp chçt cò trong nþĆc bọt, vì DNA thu đþĉc tÿ các ống méu cò tČ lệ vĆi PEG vêy, đã làm tëng độ nhäy cûa phþĄng pháp chèn khác nhau đþĉc sā dýng để chèn đoán ASFV đoán. SAP cüng đã đþĉc sā dýng hiệu quâ để bìng phþĄng pháp real-time PCR. làm tëng độ nhäy cûa chèn đoán Mycobacterium tuberculosis tÿ đąm (Saitoh & Yamane, 1999; Kết quâ tối þu tČ lệ méu nþĆc bọt và dung Sakashita & cs., 2020; Wang & cs., 2020). Kết dðch PEG trong chèn đoán ASF đþĉc thể hiện ć quâ tối þu về tČ lệ méu và hoá chçt SAP trong hình 3. Tçt câ tČ lệ méu và PEG đều cho kết nghiên cĀu cûa chúng tôi cüng tþĄng đồng vĆi quâ dþĄng tính vĆi ASFV. Ống có tČ lệ méu vĆi kết quâ nghiên cĀu cûa Yamazaki & cs. (2021) PEG là 1:0,4 cho kết quâ khuếch đäi dþĄng tính trong chèn đoán SARS-CoV-2 và Sakashita & sĆm nhçt vĆi giá trð Ct là 26,2 (đþąng khuếch cs. (2020), Wang & cs. (2020) trong xét nghiệm đäi màu xanh) (Hình 3), trong khi ć ống cò tČ lệ 31
Tối ưu phương pháp xử lý mẫu nước bọt để nâng cao độ nhạy trong chẩn đoán bệnh dịch tả lợn châu Phi 1:0,5 và 1:0,333 cò giá trð Ct læn lþĉt là 27,33 và tôi đã tiến hành ly tåm thu cặn ngay sau khi 30,65. Do đò, tČ lệ méu và PEG tþĄng Āng là trộn méu vĆi PEG để tiết kiệm thąi gian cho quá 1:0,4 đþĉc xác đðnh là tČ lệ tối þu trong nghiên trình xā lċ méu nþĆc bọt. cĀu này, điều này cò thể là do ć tČ lệ 1:0,4 có lþĉng PEG vÿa đû để kết tûa lþĉng virus cò 3.4. Ứng dụng phương pháp xử lý mẫu nước trong thể tích méu nên hiệu suçt cô đặc virus bọt trong chẩn đoán ASF từ mẫu thực địa đät cao nhçt. Nghiên cĀu cûa Yamazaki & cs. Sau khi tối þu đþĉc quy trình xā lċ méu (2022) trong xét nghiệm virus SARS-CoV-2 tÿ nþĆc bọt nhìm tëng độ nhäy cûa phþĄng pháp méu nþĆc bọt cüng sā dýng tČ lệ méu nþĆc bọt chèn đoán ASF tÿ méu nþĆc bọt, chúng tôi tiến và PEG là 1:0,4. Nghiên cĀu cûa Hata & cs. hành Āng dýng phþĄng pháp xā lċ méu nþĆc (2021), Kumar & cs. (2020), Torii & cs. (2021) và bọt đã câi tiến để chèn đoán ASF tÿ 12 méu Wu & cs. (2020) cüng chî ra PEG là hòa chçt nþĆc bọt thu đþĉc tÿ träi nghi nhiễm ASF để hiệu quâ trong kết tûa virus tÿ các méu lóng để đánh giá hiệu quâ cûa quy trình tối þu. Đåy là nâng cao độ nhäy trong xét nghiệm chèn đoán. nhĂng méu đþĉc thu thêp tÿ nhĂng con lĉn Nhþ vêy, áp dýng tČ lệ này sẽ giúp tiết kiệm chþa cò triệu chĀng låm sàng cûa ASF. Mỗi méu hòa chçt và làm tëng độ nhäy cûa xét nghiệm. đþĉc chia thành hai ống khác nhau để thăc hiện Chúng tôi đã tiến hành so sánh giĂa việc trộn theo hai quy trình: quy trình chiết tách DNA méu vĆi PEG rồi ly tåm thu cặn ngay vĆi việc tham chiếu (nhòm đối chĀng) và quy trình xā lċ trộn méu vĆi PEG rồi û qua đêm ć 4C rồi mĆi méu nþĆc bọt trþĆc khi chiết tách DNA (nhóm tiến hành ly tåm thu cặn, tuy nhiên kết quâ thí nghiệm). Sau đò, DNA thu đþĉc ć câ hai khuếch đäi là tþĄng đþĄng nhau (kết quâ không nhóm đþĉc sā dýng để chèn đoán ASFV bìng hiển thð). Do vêy, trong nghiên cĀu này, chúng phþĄng pháp real-time PCR. Ghi chú: Đường khuếch đại màu tím, màu xanh và màu đỏ lần lượt là đường khuếch đại từ các ống mẫu có tỷ lệ thể tích mẫu với PEG lần lượt là 1:0,5, 1:0,4 và 1:0,333. Hình 3. Kết quâ tối ưu tỷ lệ mẫu nước bọt và hóa chất PEG trong chẩn đoán ASF bằng phương pháp real-time PCR 32
Lê Trần Hoàng Anh, Bùi Lệ Thủy, Đặng Thị Hằng, Trần Thị Mỹ An, Đàm Quốc Khánh, Nguyễn Thị Thảo, Mai Thị Ngân Bâng 1. Kết quâ chẩn đoán ASF từ mẫu nước bọt bằng phương pháp real-time PCR Mẫu Giá trị Ct của nhóm đối chứng Giá trị Ct của nhóm thí nghiệm 1 - 36,26 2 - 32,42 3 36,39 30,16 4 34,49 30,55 5 35,99 33,33 6 35,47 30,97 7 - - 8 - - 9 - - 10 - - 11 - - 12 - 34,95 Hình 4. Giá trị Ct của nhóm đối chứng và nhóm thí nghiệm trong chẩn đoán ASF từ mẫu nước bọt bằng phương pháp real-time PCR Kết quâ thu đþĉc đþĉc ć bâng 1 và hình 4 chî có méu số 5 cho giá trð Ct là 35,99 khi chþa cho thçy Ứng dýng xā lý méu nþĆc bọt trong xā lý. Trong khi méu 2 läi cho kết quâ âm tính chèn đoán ASF tÿ 12 méu thăc đða thu tÿ lĉn khi chþa xā lċ. Điều này có thể là do thao tác khoẻ mänh tÿ hai träi lĉn thðt đã cò xác nhên trong quá trình xét nghiệm cûa méu số 2 chþa nhiễm dðch tâ lĉn châu Phi cho thçy, bìng đät độ chính xác cao. Tuy vêy, có thể thçy việc phþĄng pháp real-time PCR, có 7/12 méu dþĄng Āng dýng phþĄng pháp xā lý méu nþĆc bọt đã tính khi méu nþĆc bọt đþĉc xā lý, chî có 4/12 làm tëng độ nhäy cûa phþĄng pháp real-time méu dþĄng tính bìng phþĄng pháp tham chiếu. PCR trong chèn đoán ASF. Bên cänh đò, 4/4 méu dþĄng tính ć câ hai nhóm Kết quâ Āng dýng tÿ méu thăc đða cho thçy đối chĀng và thí nghiệm cho kết quâ Ct ć nhóm hiệu quâ cûa quy trình xā lý méu nþĆc bọt trong thí nghiệm đều thçp hĄn giá trð Ct ć nhòm đối việc cô đặc lþĉng virus có trong méu, góp phæn chĀng. Méu số 2 và méu số 5 sau khi đþĉc xā lý làm tëng độ nhäy cûa phþĄng pháp real-time có giá trð Ct læn lþĉt là 32,42 và 33,33, nhþng PCR trong chèn đoán ASF. Do đò, kết quâ 33
Tối ưu phương pháp xử lý mẫu nước bọt để nâng cao độ nhạy trong chẩn đoán bệnh dịch tả lợn châu Phi nghiên cĀu cûa chúng tôi khîng đðnh tính khâ pháp xā lċ méu nþĆc bọt để chèn đoán bệnh thi cûa việc chèn đoán ASF sĆm tÿ méu nþĆc Dðch tâ lĉn chåu Phi”, mã số SV2024-06-08. bọt. Chèn đoán sĆm tÿ méu nþĆc bọt đã đþĉc Nhòm tác giâ xin chån thành câm Ąn PGS.TS. nhiều nghiên cĀu ghi nhên là một công cý hĂu Lê Vën Phan, Bộ môn Vi sinh vêt - Truyền ích để hỗ trĉ hiệu quâ cho công tác giám sát dðch nhiễm, Khoa Thú y đã cung cçp chûng virus bệnh (Mur & cs., 2013; Chung & cs., 2024; Lee Dðch tâ lĉn chåu Phi cüng nhþ méu thăc đða sā & cs., 2021), đặc biệt täi các trang träi chën dýng cho các nội dung cûa nghiên cĀu này. nuôi quy mô lĆn (Lee & cs., 2021). Điều này có ý nghïa quan trọng trong việc hỗ trĉ công tác chèn TÀI LIỆU THAM KHÂO đoán sĆm trong các chþĄng trình kiểm soát ć giai đoän tiền lâm sàng, khi nhĂng con lĉn chþa Beemer O., Remmenga M., Gustafson L., Johnson K., Hsi D. & Antognoli M.C. (2019). Assessing the có biểu hiện bệnh và vén cñn nhai dåy để thu value of PCR assays in oral fluid samples for dðch nþĆc bọt. Có nhiều chçt Āc chế khuếch đäi detecting African swine fever, classical swine DNA, trong nghiên cĀu này, chúng tôi chî tối þu fever, and foot-and-mouth disease in U.S. swine. các hoá chçt chính sā dýng để cô đặc virus, PLOS ONE. 14(7): e0219532. lþĉng các hoá chçt khác nhþ NaCl không tiến Czumbel L.M., Kiss S., Farkas N., Mandel I., Hegyi A., hành tối þu trong nghiên cĀu này. HĄn nĂa, cæn Nagy Á., Lohinai Z., Szakács Z., Hegyi P., Steward M.C. & Varga G. (2020). Saliva as a tiếp týc Āng dýng quy trình xā lý méu nþĆc bọt Candidate for COVID-19 Diagnostic Testing: A trên dung lþĉng méu lĆn để tëng độ tin cêy cûa Meta-Analysis. Front Med (Lausanne). 7: 465. phþĄng pháp xā lý méu nþĆc bọt trong chèn Dixon L.K., Chapman D.A., Netherton C.L. & Upton đoán ASF. C. (2013). African swine fever virus replication and genomics. Virus Res. 173(1): 3-14. Gallardo C., Soler A., Nurmoja I., Cano-Gómez C., 4. KẾT LUẬN Cvetkova S., Frant M., Woźniakowski G., Simón Ứng dýng các hoá chçt để xā lċ méu nþĆc A., Pérez C., Nieto R. & Arias M. (2021). bọt nhþ SAP và PEG trþĆc khi chiết tách DNA Dynamics of African swine fever virus (ASFV) infection in domestic pigs infected with virulent, là công cý hĂu hiệu giúp cô đặc virus có trong moderate virulent and attenuated genotype II méu nþĆc bọt trþĆc khi tách chiết, làm tëng độ ASFV European isolates. Transbound Emerg Dis. nhäy cûa phþĄng pháp xét nghiệm. Nghiên cĀu 68(5): 2826-2841. cûa chúng tôi chî ra rìng lþĉng méu nþĆc bọt tối Goonewardene K.B., Chung C.J., Goolia M., þu cho việc chèn đoán ASF là 10ml. Bên cänh Blakemore L., Fabian A., Mohamed F., Nfon C., đò, tČ lệ tối þu giĂa thể tích nþĆc bọt và dung Clavijo A., Dodd K. A. & Ambagala A. (2021). Evaluation of oral fluid as an aggregate sample for dðch SAP và PEG læn lþĉt là 1:3 và 1:0,4. HĄn early detection of African swine fever virus using nĂa, hiệu quâ cûa quá trình xā lċ méu nþĆc bọt four independent pen-based experimental studies. đã đþĉc xác minh thông qua xét nghiệm 12 méu Transboundary and Emerging Diseases. thăc đða, cho thçy 7/12 méu cho kết quâ dþĄng 68(5): 2867-2877. tính sau khi xā lċ, trong khi phþĄng pháp tham Gregorio Torres I. (2020). GF-TADs Global Control of African Swine Fever. Presentation at the Webinar chiếu chî ghi nhên 4/12 méu dþĄng tính. Kết on African Swine Fever: An Unprecedented Global quâ cûa chúng tôi hĀa hẹn là công cý hĂu hiêu Threat - A Challenge to Livelihoods, Food cho việc chèn đoán sĆm ASF tÿ méu không xåm Security and Biodiversity. Call for action. lçn, giúp nâng cao hiêu quâ cûa công tác phòng Retrieved from http://www.gf-tads.org/events/ chống bênh. events-detail/en/c/1152886/ on Aug 20, 2024. Hata A., Hara-Yamamura H., Meuchi Y., Imai S. & Honda R. (2021). Detection of SARS-CoV-2 in LỜI CÂM ƠN wastewater in Japan during a Covid-19 outbreak. Sci Total Environ. 758: 143578. Các nội dung trong bài báo đþĉc thăc hiện Nguyễn Hưởng (2024). Tiêm vắc-xin phòng dịch tả lợn cò sā dýng một phæn kinh phí cûa đề tài Sinh châu Phi đạt thấp, vì sao? Truy cập từ viên nghiên cĀu khoa học “Câi tiến phþĄng https://baobacgiang.vn/tiem-vac-xin-phong-dich- 34
Lê Trần Hoàng Anh, Bùi Lệ Thủy, Đặng Thị Hằng, Trần Thị Mỹ An, Đàm Quốc Khánh, Nguyễn Thị Thảo, Mai Thị Ngân ta-lon-chau-phi-dat-thap-vi-sao-073127.bbg ngày to evaluate Mycobacterium tuberculosis viability in 20/08/2024. sputum. International Journal of Infectious Joseph Chung C., Remmenga D.M., Mielke R.S., Diseases. 96: 244-253. Branan M., Daniel Mihalca A., Balmos O.-M., Tignon M., Gallardo C., Iscaro C., Hutet E., Van Der Adrian Balaban Oglan D., Supeanu A. & Farkas A. Stede Y., Kolbasov D., De Mia G. M., Le Potier (2024). Evaluation of Aggregate Oral Fluids for M. F., Bishop R. P., Arias M. & Koenen F. (2011). African Swine Fever Real-Time PCR Diagnostics Development and inter-laboratory validation study Using Samples Collected on Romanian Farms with of an improved new real-time PCR assay with an Active Outbreak. Transboundary and Emerging internal control for detection and laboratory Diseases. (1): 9142883. diagnosis of African swine fever virus. J Virol Kumar M., Patel A. K., Shah A. V., Raval J., Rajpara Methods. 178(1-2): 161-70. N., Joshi M. & Joshi C.G. (2020). First proof of the Torii S., Furumai H. & Katayama H. (2021). capability of wastewater surveillance for COVID- Applicability of polyethylene glycol precipitation 19 in India through detection of genetic material of followed by acid guanidinium thiocyanate-phenol- SARS-CoV-2. Sci Total Environ. 746: 141326. chloroform extraction for the detection of SARS- Le V.P., Jeong D.G., Yoon S.W., Kwon H.M., Trinh CoV-2 RNA from municipal wastewater. Sci Total T.B.N., Nguyen T.L., Bui T.T.N., Oh J., Kim J.B., Environ. 756: 143067. Cheong K. M., Van Tuyen N., Bae E., Vu T.T.H., Patricia Del Vigna de Almeida, Ana Maria Trindade Yeom M., Na W. & Song D. (2019). Outbreak of Grégio, Maria Angela Naval Machado, Antonio African Swine Fever, Vietnam, 2019. Emerg Infect Adilson Soares de Lima, Luciana Reis Azevedo Dis. 25(7): 1433-1435. (2008). Saliva composition and functions: a Martínez-Miró S., Tecles F., Ramón M., Escribano D., comprehensive review. J Contemp Dent Pract. Hernández F., Madrid J., Orengo J., Martínez- 9(3): 72-80. Subiela S., Manteca X. & Cerón J.J. (2016). Wang W.-H., Takeuchi R., Jain S.-H., Jiang Y.-H., Causes, consequences and biomarkers of stress in Watanuki S., Ohtaki Y., Nakaishi K., Watabe S., swine: an update. BMC Vet Res. 12(1): 171. Lu P.-L. & Ito E. (2020). A novel, rapid (within Nguyen-Thi T., Pham-Thi-Ngoc L., Nguyen-Ngoc Q., hours) culture-free diagnostic method for detecting Dang-Xuan S., Lee H. S., Nguyen-Viet H., live Mycobacterium tuberculosis with high Padungtod P., Nguyen-Thu T., Nguyen-Thi T., sensitivity. EBioMedicine. 60: 103007. Tran-Cong T. & Rich K.M. (2021). An Wu F., Zhang J., Xiao A., Gu X., Lee W. L., Armas F., Assessment of the Economic Impacts of the 2019 Kauffman K., Hanage W., Matus M., Ghaeli N., African Swine Fever Outbreaks in Vietnam. Front Endo N., Duvallet C., Poyet M., Moniz K., Vet Sci. 8: 686038. Washburne A. D., Erickson T. B., Chai P. R., Saitoh H. & Yamane N. (1999). Evaluation of a fully Thompson J. & Alm E. J. (2020). SARS-CoV-2 automated mycobacteria culture system, MB/BacT Titers in Wastewater Are Higher than Expected using a newly developed digestion- from Clinically Confirmed Cases. mSystems. 5(4). decontamination procedure, semi-alkaline Yamazaki W., Matsumura Y., Thongchankaew-Seo U., protease-N-acetyl-L-cysteine-NaOH (SAP-NALC- NaOH) method. Rinsho Biseibutshu Jinsoku Yamazaki Y. & Nagao M. (2021). Development of Shindan Kenkyukai Shi. 10(2): 103-10. a point-of-care test to detect SARS-CoV-2 from saliva which combines a simple RNA extraction Sakashita K., Takeuchi R., Takeda K., Takamori M., method with colorimetric reverse transcription Ito K., Igarashi Y., Hayashi E., Iguchi M., Ono M., loop-mediated isothermal amplification detection. J Kashiyama T., Tachibana M., Miyakoshi J., Yano Clin Virol. 136: 104760. K., Sato Y., Yamamoto M., Murata K., Wada A., Chikamatsu K., Aono A., Takaki A., Nagai H., Yamazaki Y., Thongchankaew-Seo U. & Yamazaki W. Yamane A., Kawashima M., Komatsu M., (2022). Very low likelihood that cultivated oysters Nakaishi K., Watabe S. & Mitarai S. (2020). are a vehicle for SARS-CoV-2: 2021-2022 Ultrasensitive enzyme-linked immunosorbent seasonal survey at supermarkets in Kyoto, Japan. assay for the detection of MPT64 secretory antigen Heliyon. 8(10): e10864. 35