Ạ Ọ
Đ I H C THÁI NGUYÊN ƯỜ
Ạ Ọ
Ọ
Ọ Ự Ố
TR NG Đ I H C KHOA H C B MÔN KHOA H C S S NG Ộ -----------------
PH M TH NHÀN
Ạ
Ị
Ứ
NG D NG K THU T PCR TRONG VI C Ậ
Ệ
Ỹ
PHÁT HI N CÁC GEN Đ C L C C A
Ụ Ệ GÂY TIÊU CH Y
Ủ E.COLI Ộ Ự I NG Ả Ở ƯỜ
Đ TÀI NGHIÊN C U KHOA H C SINH VIÊN
Ọ
Ứ
Ề
Ng
ng d n khoa h c: ThS. Nguy n Phú Hùng
i h ườ ướ
ọ
ễ
ẫ
THÁI NGUYÊN - 2010
Ộ
ỘN I DUNG BÁO CÁO N I DUNG BÁO CÁO
1. M đ u
ở ầ
2. Đ i t 2. Đ i t
ng và ph ng và ph
ố ượ ố ượ
ươ ươ
ng pháp nghiên c u ứ ng pháp nghiên c u ứ
3. K t qu và th o lu n ậ 3. K t qu và th o lu n ậ
ế ế
ả ả
ả ả
4. K t lu n và ki n ngh ị 4. K t lu n và ki n ngh ị
ế ế
ế ế
ậ ậ
1. M Đ UỞ Ầ 1. M Đ UỞ Ầ
Tiêu ch y là m t v n đ s c kh e toàn c u. M t trong nh ng Tiêu ch y là m t v n đ s c kh e toàn c u. M t trong nh ng ữ ữ ầ ầ ộ ộ ả ả ề ứ ề ứ ỏ ỏ
tr em là do vi khu n tr em là do vi khu n ộ ấ ộ ấ nguyên nhân ph bi n gây tiêu ch y ổ ế nguyên nhân ph bi n gây tiêu ch y ổ ế ả ở ẻ ả ở ẻ ẩ ẩ
E.coli. E.coli.
Vi c xác đ nh nhanh các nhóm Vi c xác đ nh nhanh các nhóm ệ ệ ậ ậ ằ ằ ị ị
E.coli b ng các k thu t có đ b ng các k thu t có đ ộ ỹ E.coli ỹ ộ nh y và đ đ c hi u cao s có ý nghĩa r t quan tr ng trong vi c nh y và đ đ c hi u cao s có ý nghĩa r t quan tr ng trong vi c ộ ặ ộ ặ ẽ ẽ ệ ệ ệ ệ ạ ạ ấ ấ ọ ọ
ng pháp đi u tr thích h p cho b nh nhân. ng pháp đi u tr thích h p cho b nh nhân. l a ch n ph ọ ự l a ch n ph ọ ự ươ ươ ề ề ệ ệ ợ ợ ị ị
ng pháp đ ng pháp đ ượ ử ụ ượ ử ụ Có nhi u ph ề Có nhi u ph ề ị ị
c s d ng đ xác đ nh ể c s d ng đ xác đ nh ể ng pháp đ ng pháp đ ươ ươ
ượ ử ụ ượ ử ụ ự ế ự ế ệ ệ ề ề ữ ữ ệ ệ ữ ữ ừ ừ
ộ ự ộ ự ệ ệ ệ ệ ậ ậ
ỹ ỹ gây tiêu ch y E.coli gây tiêu ch y gây tiêu E.coli gây tiêu ươ E.coli ươ ch y. Trong đó, PCR là ph c s d ng h u hi u ả ch y. Trong đó, PCR là ph c s d ng h u hi u ả Xu t phát t Xu t phát t nh ng lí do trên, chúng tôi ti n hành th c hi n đ tài ấ nh ng lí do trên, chúng tôi ti n hành th c hi n đ tài ấ nh t.ấnh t.ấ ““ ng d ng k thu t PCR trong vi c phát hi n các gen đ c l c ng d ng k thu t PCR trong vi c phát hi n các gen đ c l c ụ Ứ ụ Ứ i”. c a ủc a ủ E.coli i”. ng ả ở ườ ng ả ở ườ
Ụ Ụ
Ứ Ứ
M C TIÊU NGHIÊN C U M C TIÊU NGHIÊN C U S d ng k thu t PCR v i các c p m i đ c
ồ ặ
ử ụ
ậ
ặ
ớ
ỹ
hi u nh m phát hi n các gen đ c l c c a 5 nhóm
ộ ự
ủ
ệ
ệ
ằ
ng
E.coli gây b nh tiêu ch y ệ
ả ở
ườ
i, làm ti n đ cho ề
ề
vi c t o b sinh ph m ch n đoán các nhóm
E.coli
ệ ạ
ẩ
ẩ
ộ
gây tiêu ch y.ả
2. Đ I T 2. Đ I T NG VÀ PH NG VÀ PH Ố ƯỢ Ố ƯỢ ƯƠ ƯƠ Ứ NG PHÁP NGHIÊN C U NG PHÁP NGHIÊN C U Ứ
2.1. Đ I T 2.1. Đ I T
NG NGHIÊN C U NG NGHIÊN C U
Ố ƯỢ Ố ƯỢ
Ứ Ứ
do Phòng Vi khu n đ do Phòng Vi khu n đ
ng ru t - Vi n ng ru t - Vi n
ố ế ố ế
ẩ ẩ
ườ ườ
ệ ệ
ộ ộ
- - Các ch ng ủ Các ch ng ủ V sinh d ch t V sinh d ch t
E.coli chu n Qu c t chu n Qu c t ẩ E.coli ẩ Trung Trung
ng cung c p, g m có: EPEC, EHEC1, EHEC2, ng cung c p, g m có: EPEC, EHEC1, EHEC2,
ươ ươ
ễ ễ
ệ ệ
ị ị
ấ ấ
ồ ồ
EIEC, ETEC, EAEC và EC (ch ng đ i ch ng không có gen đ c l c). EIEC, ETEC, EAEC và EC (ch ng đ i ch ng không có gen đ c l c).
ộ ự ộ ự
ứ ứ
ủ ủ
ố ố
2.2. PH 2.2. PH
NG PHÁP NGHIÊN C U NG PHÁP NGHIÊN C U
ƯƠ ƯƠ
Ứ Ứ
Nuôi c y ấ Nuôi c y ấ qua đêm qua đêm trên trên ườ ườ
Khu ch ế đ i gen ạ b ng ằ ph n ng ả ứ PCR
Tách Tách DNA DNA tr c ti p ự ế tr c ti p ự ế ừ t t ừ khu n l c ẩ ạ khu n l c ẩ ạ
Các ch ng ủ E.coli chu n ẩ Qu c ố tế
Đi n di ệ Đi n di ệ ki m tra ể ki m tra ể s n ả s n ả ph mẩ ph mẩ trên gel trên gel agarose agarose
ng môi tr ng môi tr MPA đ c, ặ MPA đ c, ặ thu thu khu n l c ẩ ạ khu n l c ẩ ạ
Hình 2.1. S đ các b Hình 2.1. S đ các b ơ ồ ơ ồ c đ ướ ượ c đ ướ ượ c th c hi n trong quá trình nghiên c u ứ c th c hi n trong quá trình nghiên c u ứ ự ự ệ ệ
B ng 2.1. Các trình t
c s d ng trong các ph n ng
m i đ
ự ồ ượ ử ụ
ả ứ
ả PCR
C p ặ
Trình t
primer (5’ → 3’)
ự
Gen đ c l c ộ ự
m iồ (primer)
c ướ Kích th s n ph m ẩ ả PCR (bp)
vt2
298
VT2 - F VT2 - R
ACCGTTTTTCAGATTTTGCACATA TACACAGGAGCAGTTTCAGACAGT
vt1
130
VT1 - F VT1 - R
GAAGAGTCCGTGGGATTACG AGCGATGCAGCTATTAATAA
elt
322
LT - F LT - R
TCTCTATGTGCATACGGAGC CCATACTGATTGCCGCAAT
eae
376
eae - F eae - R
CACACGAATAAACTGACTAAAATG AAAAACGCTGACCCGCACCTAAAT
IpaH
620
IpaH - F IpaH - R
GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCC GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC
EAST1
630
EA - F EA - R
CTGGCGAAAGACTGTATCAT CAATGTATAGAAATCCGCTGTT
B ng 2.2. Thành ph n ph n ng PCR B ng 2.2. Thành ph n ph n ng PCR
ả ứ ả ứ
ả ả
ầ ầ
STT Th tích (µl) Thành ph nầ ể
1 N c kh ion 12,5 ướ
2 ử PCR Buffer (10X) 2,5
(25mM)
dNTPs (25mM) 2
2,5
1 3 4 MgCl2 5 M i xuôi ồ
1 (10pM/m i)ồ ư c ợ (10pM/m i)ồ
6 M i ngồ 7 DNA khuôn 3
8 Taq DNA polymerase (5 unit/µl) 0,5
T ng th tích 25 ổ ể
Ả Ả
Ả Ả
Ế Ế
Ậ 3. K T QU VÀ TH O LU N 3. K T QU VÀ TH O LU N Ậ
3.1. K T QU TÁCH DNA TR C TI P T KHU N L C 3.1. K T QU TÁCH DNA TR C TI P T KHU N L C
Ế Ừ Ế Ừ
Ự Ự
Ả Ả
Ạ Ạ
Ẩ Ẩ
Ế Ế
DNA đ
t tr c ti p t
ượ
ế
ẩ ạ E.coli b ng ph ớ
khu n l c ả ế
c tách chi ộ
ằ ợ
ự ự
ng ươ ế ừ pháp c a Cebula và c ng s (1995) có c i ti n cho phù h p v i đi u ề ủ ki n thí nghi m.
ệ
ệ
u đi m: - T ng th i gian tách DNA là 25 phút Ư ể
ổ
ờ
- Không ph i tiêu t n nhi u hóa ch t ấ ả
ề
ố
ng DNA thu đ
c là r t nh , nên nó đ ỏ
ượ ử ụ
ượ
- L tr c ti p (3
c s d ng ượ µl/1 ph n ng) mà không c n ti n hành pha loãng
ấ ế
ự ế
ả ứ
ầ
Nh
c đi m: DNA thu đ
c không đ đ phát hi n b ng ph
ng
ể
ượ
ủ ể
ệ
ằ
ươ
pháp đi n di thông th
ng
ượ ệ
ườ
3.2. KHU CH Đ I CÁC GEN Đ C L C C A CÁC NHÓM 3.2. KHU CH Đ I CÁC GEN Đ C L C C A CÁC NHÓM
E.COLI E.COLI
Ộ Ự Ủ Ộ Ự Ủ
Ạ Ạ
Ế Ế
M 1 2 3 4 5 6 7
3.2.1. Gen đ c l c 3.2.1. Gen đ c l c ộ ự eaeeae ộ ự
872 bp
603 bp
376 bp
270 bp
eaeeae Hình 3.1. K t qu khu ch đ i gen ả Hình 3.1. K t qu khu ch đ i gen ả ế ế ạ ạ
M. Marker ФX 174 c t b ng Hae III; 1. EPEC; 2. ETEC; 3. EHEC1; M. Marker ФX 174 c t b ng Hae III; 1. EPEC; 2. ETEC; 3. EHEC1; 4. EAEC; 5. EHEC2; 6. EIEC; 7. EC 4. EAEC; 5. EHEC2; 6. EIEC; 7. EC
ế ế ắ ằ ắ ằ
ộ ự 3.2.2. Gen đ c l c
vt1
M 1 2 3 4 5 6 7
130 bp
M. Marker ФX 174 c t b ng Hae III; 1. EHEC1; 2. EC; 3.
vt1 Hình 3.2. K t qu khu ch đ i gen ả ế ạ
EAEC;
4. EPEC; 5. EHEC2; 6. EIEC; 7. ETEC
ế ắ ằ
3.2.3. Gen đ c l c ộ ự vt2
M 1 2 3 4 5 6 7
298 bp
M. Marker ФX 174 c t b ng Hae III; 1. EHEC1; 2. EHEC2; 3.
vt2 Hình 3.3. K t qu khu ch đ i gen ả ế ạ
EPEC;
4. ETEC; 5. EIEC; 6. EAEC; 7. EC
ế ắ ằ
3.2.4. Gen đ c l c ộ ự elt
M 1 2 3 4 5 6 7
322 bp
elt ế ế ạ
Hình 3.4. K t qu khu ch đ i gen ả M. Marker ФX 174 c t b ng Hae III; 1. EPEC; 2. ắ ằ EHEC1; 3. EHEC2; 4. ETEC; 5. EAEA; 6. EIEC; 7. EC
3.2.5. Gen đ c l c ộ ự IpaH
M 1 2 3 4 5 6 7
620 bp
ế ế ạ
3. EHEC1; 4. EHEC2; 5. ETEC; 6. EAEC; 7. EC
Hình 3.5. K t qu khu ch đ i gen IpaH ả M. Marker ФX 174 c t b ng Hae III; 1. EPEC; 2. ắ ằ EIEC;
3.2.6. Gen đ c l c ộ ự EAST1
M 1 2 3 4 5 6 7
630 bp
EAST1 ế ế ạ
Hình 3.6. K t qu khu ch đ i gen ả ắ ằ
M. Marker ФX 174 c t b ng Hae III; 1. EPEC; 2. EHEC1; 3. EHEC2;4. EIEC; 5. ETEC, 6. EAEC; 7. EC
Tóm t t k t qu khu ch đ i các gen đ c l c c a 5 nhóm ộ ự ủ ắ ế ế ả ạ
E.coli
ộ ự ủ
ế
ế
ả
B ng 3.1. K t qu khu ch đ i các gen đ c l c c a 5 nhóm ạ ả E.coli
EPEC EHEC1 EHEC2 EAEC EIEC ETEC EC
eae
+
+
+
-
-
-
-
vt1
-
+
-
-
-
-
-
vt2
-
-
+
-
-
-
-
IpaH
-
-
-
-
+
-
-
EAST1
-
-
-
+
-
-
-
elt
-
-
-
-
-
+
-
Ghi chú: EHEC1 và EHEC2 là hai phân nhóm c a ủ
nhóm EHEC
+ : D ng tính ươ - : Âm tính
4. K T LU N VÀ KI N NGH Ị 4. K T LU N VÀ KI N NGH Ị
Ậ Ậ
Ế Ế
Ế Ế
1. K T LU N
Ậ
Ế
c DNA t ng s c a các nhóm vi khu n
ế
ượ
ố ủ
ẩ E.coli b ng ằ c nhi u th i gian
Đã tách chi ươ
ự
khu n l c, ti ẩ ạ
ế
t ki m đ ệ
ượ
ề
ờ
ph và hoá ch t nghiên c u.
t đ ổ ng pháp tách DNA tr c ti p t ế ừ ứ
ấ
Khu ch đ i thành công các gen đ c l c đ c tr ng c a 5 nhóm
E.coli là: eae,
ộ ự ặ
ủ
ư
ế
ạ vt1, vt2, IpaH, elt, EAST1.
ứ
ủ
ề
ề
ứ đ t o b sinh ph m ch n đoán tác nhân gây b nh là
ế E.coli.
K t qu nghiên c u này là ti n đ cho nghiên c u ti p theo c a chúng tôi ế ể ạ
ả ộ
ệ
ẩ
ẩ
2. KI N NGH Ị
Ế
i u hoá các ph n ng PCR đ có th ch n
Ti p t c phát tri n nghiên c u, t ể
ế ụ
ứ
ố ư
ể ẩ
ả ứ
ể
đoán E.coli tr c ti p trên các m u phân c a b nh nhân tiêu ch y. ẫ
ự ế
ủ ệ
ả
